Kuntatt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Ikklikkja hawn għal informazzjoni dwar il-Parti II (Introduzzjoni, materjali, u metodi) ta' dan l-artikolu.

Profil tal-Proteomics Kważi Ċellula waħda tat-tubulari u l-glomerulus proximali tal-kliewi tal-bniedem normali

Tara K. Sigdel¹, Paul D. Piehowski², Sudeshna Roy¹, Juliane Liberto¹, Joshua R. Hansen², Adam C. Swensen², Rui Zhao³, Ying Zhu³, Priyanka Rashmi¹, Andrew Schroeder¹, Izabella Damm¹, Swastika Sur¹, Jinghui Luo4, Yingbao Yang4, Wei-Jun Qian²* u Minnie M. Sarwal¹* għall-Kidney Precision Medicine Project (KPMP) Konsorzju

¹Diviżjoni tat-Trapjant MultiOrgan, Dipartiment tal-Kirurġija, Università ta' Kalifornja, San Francisco, San Francisco, CA, l-Istati Uniti

²Laboratorju Nazzjonali tal-Majjistral tal-Paċifiku, Diviżjoni tax-Xjenzi Bijoloġiċi, Richland, WA, l-Istati Uniti

³Laboratorju tax-Xjenzi Molekulari Ambjentali, Laboratorju Nazzjonali tal-Majjistral tal-Paċifiku, Richland, WA, l-Istati Uniti

⁴Dipartiment tal-Patoloġija, Università ta 'Michigan, Ann Arbor, MI, l-Istati Uniti

Kliem ewlieni:glomerulus, spettrometrija tal-massa, analiżi ta’ ċellula waħda, proteomika,kliewi

Valutazzjonijiet molekulari fil-livell ta 'ċellula waħda jistgħu jaċċelleraw ir-riċerka bijoloġika billi jipprovdu valutazzjonijiet dettaljati tal-organizzazzjoni ċellulari u l-eteroġeneità tat-tessuti kemm fil-mard kif ukoll fis-saħħa. Il-bniedemkliewigħandha stati multi-ċellulari kumplessi b'funzjonalità li tvarja, li ħafna minnhom issa jistgħu jiġu sfruttati kompletament b'avvanzi teknoloġiċi reċenti fil-proteomika tat-tessuti f'livell qrib ta 'ċellula waħda. Aħna niddiskutu l-passi fundamentali fl-ewwel applikazzjoni ta 'dan il-metodu ta' proteomika bbażat fuq l-ispettrometrija tal-massa (MS) għall-analiżi tas-sotto-taqsimiet tal-bniedem normali.kliewi, bħala parti mill-Proġett ta 'Mediċina ta' Preċiżjoni tal-Kliewi (KPMP). Bl-użu ta '~30–40 ċelluli tal-kliewi mikro-dissected maqbudin bil-lejżer, identifikajna aktar minn 2,500 proteina umana, b'ispeċifiċità għall-tubulari prossimali(PT; n=25 proteini) u reġjuni glomerulari (Glom; n=67 proteini) tal-kliewiu l-funzjonijiet metaboliċi uniċi tagħhom. Dan l-istudju pilota jipprovdi l-pjan direzzjonali għall-applikazzjoni tal-fluss tax-xogħol tagħna tal-proteomika kważi ta’ ċellula waħda għall-analiżi ta’ mikro-kompartimenti oħra tal-kliewi, fuq skala akbar, biex jinkixfu perturbazzjonijiet tal-funzjoni subċellulari renali fil-kliewi normali kif ukoll etjoloġiji differenti. ta' akuta u kronikamard tal-kliewi.

cistanche jista 'jtejjeb il-funzjoni tal-kliewi

Introduzzjoni

Avvanzi riċenti fil-profiling molekulari, speċifikament analiżi traskrizzjoni f'livell ta 'ċellula waħda, jistgħu jikxfu popolazzjonijiet rari ta' ċelluli fi ħdan tessuti kliniċi eteroġenji, li qed jikkontribwixxi għall-fehim tagħna tal-bijoloġija tal-kliewi, u l-proċessi molekulari tagħha (1-7). Hemm ħtieġa mhux sodisfatta li jiġu żviluppati metodi li jistgħu jipprovdu informazzjoni bijoloġika komprensiva fil-livelli ta 'RNA u DNA u jippermettu wkoll analiżi ta' tessut proteomiku b'ċellula waħda.

It-teknoloġiji proteomiċi, b'differenza mill-ġenomika, jistgħu jipprovdu informazzjoni funzjonali dwar stati ċellulari u netwerks regolatorji (2). Sfida teknoloġika għall-proteomika bbażata fuq l-ispettroskopija tal-massa (MS) hija l-limitazzjoni tal-materjal tal-bidu. B'differenza mit-traskriptomika, il-proteomika ma tippermettix amplifikazzjoni molekulari. Dan il-fattoid irriżulta fi sforzi sostantivi biex tittejjeb is-sensittività analitika tal-proteomika bbażata fuq l-SM, inkluża l-minjaturizzazzjoni tat-teknoloġija u effiċjenzi ogħla fis-sors tal-jonizzazzjoni tal-elettrospray (8, 9), b'tali mod li s-sensittività analitika issa hija biżżejjed biex tiskopri proteini f'mammiferi waħdieni. ċelloli. Minkejja li għandhom sensittività analitika għolja, applikazzjonijiet proteomiċi għal volumi żgħar ta 'kampjuni introduċew sfidi addizzjonali, bħal assorbiment mhux speċifiku ta' proteini u peptidi fuq l-uċuħ ta 'tubi ta' reazzjoni, kinetika ta 'diġestjoni ineffiċjenti, il-ħtieġa għal tindif, u sfidi bil-kunsinna. Il-grupp tagħna reċentement irrapporta dwar il-metodu ta 'proteomics kważi ta' ċellula waħda (nscProteomics) fiċ-ċelloli HeLa, li jipprovdi teknoloġija innovattiva ħafna u sensittiva għal kejl ta 'proteome ta' kampjuni b'ammonti sub-nanogram ta 'proteina minn numru żgħir ta' ċelloli (10). Dan il-metodu jeħtieġ tagħmir għall-ipproċessar tal-kampjuni apposta ħafna u huwa diffiċli li jiġi trasferit għal laboratorji oħra ta 'riċerka fl-istat attwali ta' żvilupp tiegħu. Ipproċessar tal-bniedemkliewitessuti permezz ta 'dan il-pipeline kienu jeħtieġu attenzjoni mill-qrib għall-iżvilupp tal-protokoll sabiex jottimizzaw il-preservazzjoni tat-tessuti u l-qbid taċ-ċelluli.

F'dan l-istudju, iffukajna fuq li nipprovdu pjan direzzjonali għal kejl b'suċċess ta 'interrogazzjoni proteomika ta' diversi subkompartimenti ta 'kliewi, fil-livell ta' kważi ċellula waħda, bir-riżultati li ġejjin: (i) Valutazzjoni tal-ġbir u l-ħażna ottimali tat-tessut tal-kliewi għal nscProteomics; (ii) Identifikazzjoni tal-istandard ta' referenza xieraq għall-nscProteomics; (iii) Ottimizzazzjoni tal-ħxuna tat-tessut tal-kliewi għal mikrodissezzjoni tal-qbid bil-lejżer (LCM); (iv) Ottimizzazzjoni tal-parametri LCM; (v) Deskrizzjoni tal-metodu nscProteomics bl-użu ta' metodu mikro POTS kompletament awtomatizzat ibbażat fuq LC-MS (μPOTS; Processing in One pot for Trace Samples) (11); (vi) Analitika tad-dejta għal nscProteomics.

Biex niksbu l-kompiti msemmija hawn fuq, ipproċessajna 11-il bniedem unikukliewibijopsiji u protokolli u metodoloġiji żviluppati biex jiġbru, jipproċessaw, u jinterrogaw l-espressjoni proteomika tal-bniedemkliewikampjuni minn μPOTS. Meta flimkien ma 'LC-MS sensittivi ħafna, aħna juru metodu μPOTS kompletament awtomatizzat li jippermetti riproduċibbiltà u jipprovdi kejl proteomic kwantitattiv ta' ~3,000 proteini minn 10 sa 100 ċelluli tal-kliewi mikro-dissected (LCM) tal-qbid bil-laser, a livell ta 'kopertura miksub qabel biss għal eluf ta' ċelluli (12-17). Dan l-istudju se jgħin għall-karatterizzazzjoni molekulari tal-eteroġeneità u l-patoloġija ċellulari tat-tessut f'bijopsiji tal-kliewi minn pazjenti b'kawżi differenti ta 'mard tal-kliewi akut u kroniku. Din it-teknoloġija unika għandha l-potenzjal li tiżvela l-eteroġeneità proteomika u l-markaturi uniċi tal-proteini f'diversikliewisottotipi u sottostrutturi tal-mard li se jikkorrelataw mal-patoġenesi tal-mard, pronjosi, u stratifikazzjoni tar-riskju. L-istudju huwa miġbur fil-qosor fil-Figura 1.

Figura 1. Il-fluss tax-xogħol tal-proteomika ta' ċellula waħda qrib (nscProteomics) huwa ottimizzat għall-ipproċessar tal-bniedemkliewitessuti. Il-fluss tax-xogħol jinkludi l-identifikazzjoni tal-aħjarkliewiġbir u ħażna tat-tessuti, il-kontrolli tal-kwalità għall-istabbiliment tal-mikrodissezzjoni tal-qbid bil-lejżer tal-metodu nscProteomics għaċ-ċelloli tal-kliewi.

Proċeduri Sperimentali

Disinn ta' Studju

Ir-rappreżentazzjoni skematika tal-istudji proteomiċi mwettqa fuq 11 normali umani unikukliewihuwa muri fil-Figura 2A. Twettqu total ta '28 ġirja ta' spettrometrija tal-massa (MS) għal nscProteomics micro-dissected (LCM) tal-qbid bl-ingrossa u bil-lejżer fuq sezzjonijiet ta 'tubulari konvoluti (PT) ta' glomerular (Glom) u proximal. Tessuti mill-ewwel tnejnkliewiġew ippreservati bħala FFPE u f'medju kompost tat-temperatura tal-qtugħ ottimali (OCT). Il-kwistjonijiet tat-tessuti tal-kliewi minn 9 kliewi oħra ġew ipproċessati biss f'OCT (Figura 2A).

Figura 2. (A) Sommarju tal-kampjuni tal-istudju u l-analiżi. (B) Il-plott QC għar-riproduċibbiltà tal-proċess bl-użu tat-tessut OCT. Id-differenzi fl-għadd spettrali bejn il-proteini għal 2 ġirjiet separati bl-użu ta 'tessut OCT ġew impinġi kontra l-għadd spettrali medju tal-proteini għal 1,257 proteina. Fil-plott, il-linja blu turi differenza fil-medja; il-linji ħomor u ħodor juru 2 limiti SD u 3 SD rispettivament. 97.96 fil-mija tal-proteini huma fil-limitu ta 'riproduċibbiltà kkalkulat ta' 13.52 li jindika grad għoli ta 'riproduċibbiltà. Jidher ukoll li l-varjabbiltà inter-run tal-proċess li jinvolvi tessut OCT hija aktar baxxa minn dik tal-proċess li jinvolvi tessut FFPE (limitu ta' riproduċibbiltà kkalkulat: 24.43). (C) Tqabbil ta 'distribuzzjonijiet ta' għadd spettrali ta '374 proteina komuni f'OCT u FFPE. Numru akbar ta 'proteini minn tessut OCT juru għadd spettrali għoli filwaqt li preponderanza ogħla ta' għadd spettrali baxx tidher għal proteini minn tessut FFPE. (D) Tqabbil ta 'distribuzzjonijiet ta' għadd spettrali ta '76 proteina unika f'FFPE u 244 proteina unika f'OCT. Il-preponderanza ogħla ta 'proteini ta' għadd spettrali baxx tidher fit-tessut OCT. Dan jista 'jindika li t-teknika tat-tessuti OCT hija aħjar għall-iskoperta ta' proteini baxxi abbundanti fix-xenarju attwali. Il-koeffiċjent ta' korrelazzjoni bejn il-proteini identifikati minn 2 tessuti ffriżati OCT kien 0.96 (P <>

Akkwist tal-Kampjun tat-Tessut tal-Kliewi

Umantessuti tal-kliewiinġabru minn total ta’ 11-il nefrectomija parzjali de-identifikata, miksuba mill-Università ta’ California San Francisco (UCSF) u mill-Università ta’ Michigan (UM), b’IRB approvat, bħala parti minn studju ta’ fattibilità tat-teknoloġija pilota fil-Kidney Precision Medicine tal-NIH Proġett (KPMP). Biss iż-żona b'saħħitha tal-kliewikif determinat minn patologu mħarreġ intuża għal dan il-għan. Il-kampjuni ġew anonimizzati bl-unika twissija tkun li t-tessuti nġabru mill-adulti. Biex jiġi vvalutat l-aħjar protokoll ta' ġbir ta' kampjuni għat-teknoloġija, inizjalment, ~100 mg ta' tessut minn 2 kliewi ġie diviż indaqs u jew ippreparat bħala sezzjonijiet tat-tessuti inkorporati fil-paraffin iffissati fil-formalin (FFPE) jew ġew iffriżati fil- Tissue-Plus™ OCT Kompost (Fisher Xjentifiku). Sezzjoni waħda konsekuttiva ta’ 5 μm u tliet sezzjonijiet ħoxnin ta’ 10 μm inqatgħu minn kull blokka OCT bi krijo-mikrotomu u mmuntati fuq slides tal-membrana 1.0 polyethylene terephthalate (PET) (Zeiss) għal glomerulari utubuli prossimalidissezzjoni. Is-sezzjoni ħoxna ta '5 μm kienet imtebba' H&E għall-viżwalizzazzjoni ta' strutturi istoloġiċi ewlenin. Is-sezzjonijiet ta 'ħxuna ta' 10 μm li jifdal tħallew mhux imtebba. Il-pjastri kollha ġew maħżuna f'-80 grad sakemm id-dissezzjoni.

Cistanche għat-titjib tal-funzjoni ħażina tal-kliewi

Valutazzjoni tal-Impatt tal-Ġarr u l-Ipproċessar tat-Tessuti fuq il-Proteomic Output

Biex jiġi vvalutat l-impatt tad-dewmien fuq l-analiżi proteomika tat-tessut iffriżat OCT,kliewitissue samples were collected at one center, shipped to a second site >4 h jivvjaġġaw 'il bogħod, u pproċessati fit-tieni ċentru, u viċi versa. Proteomics bl-ingrossa twettqet fuq żewġ 2 uniċikliewi(kliewi #3, #4), akkwistati fl-Università ta 'Michigan, u mibgħuta lejn 2 postijiet differenti (Ohio State University u UCSF) għall-analiżi MS, bl-użu tal-istess protokoll u parametri MS fiż-żewġ siti. Ir-riżultati tal-ġirjiet tal-MS imbagħad tqabblu bejn iż-żewġ siti.

Estrazzjoni u Preċipitazzjoni tal-proteini

Dan sar kemm fuq il-metodi tal-preparazzjoni tat-tessuti OCT kif ukoll tal-FFPE għall-għażla tal-metodu ottimali għall-proteomika tat-tessuti. It-tessut OCT kien maqsum f'sezzjonijiet ħoxnin ta '10 μm bl-użu ta' cryomicrotome. Biex jintgħażel l-ammont minimu ta’ tessut meħtieġ għall-estrazzjoni tal-proteini għall-MS, tliet curls (sezzjoni li titpoġġa f’tubu Eppendorf minflok ma tinfirex fuq il-pjastra), u 5 curls ta’ tessut iffriżat ġew maqtugħa, imdewweb, u ttrasferiti għal tubi mikroċentrifugali. li jkun fiha xoffa ta 'l-istainless steel ta' 5 mm (Qiagen), esposta għal Buffer tal-Liżi taċ-Ċelluli tal-Mammiferi (inkluża Soluzzjoni ta 'Inibitur ta' Benzonase® Nuclease u Protease; Qiagen), u omoġenizzata f'TissueLyser LT (Qiagen) f'50 r/s għal 3 min. Il-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet ikkwantifikata (assaġġ Bradford; Thermo Scientific) u maħżuna f'-20 grad sal-użu. Tessut maħżun għal<2 months="" in="" ffpe="" was="" sectioned="" into="" ten="" 10="" μm="" thick="" sections="" using="" a="" microtome.="" three="" and="" five="" curls="" of="" tissue="" were="" cut,="" deparaffinized="" in="" xylene,="" centrifuged,="" and="" incubated="" in="" extraction="" buffer="" exb1="" (qiagen)="" supplemented="" with="" β-mercaptoethanol.="" samples="" were="" incubated="" on="" ice,="" followed="" by="" incubation="" at="" 80°c="" for="" 2="" h.="" protein="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" further="" use.="" protein="" was="" precipitated="" by="" the="" addition="" of="" cold="" acetone,="" followed="" by="" centrifugation="" to="" pellet="" and="" dry="" the="" precipitated="" protein.="" the="" pellet="" was="" re-suspended="" in="" 6="" m="" urea/100="" mm="" tris-hcl="" ph="" 7.8,="" and="" protein="" concentration="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" trypsin="">

Diġestjoni Tripsin

Madwar 15 0 ug ta 'proteina totali (~ 15 fil-mija tal-input disponibbli) kienet esposta għal aġenti ta' tnaqqis (200 mM DTT u 100 mM Tris-HCl) u reaġenti alkylating (200 mM iodoacetamide u 100 mM Tris-HCl) u mbagħad dilwit b'ilma ħieles minn RNAse/DNAse biex titnaqqas il-konċentrazzjoni ta 'Urea għal 0.6 M. Erba' ug ta 'Trypsin porċini (Sigma) ġew miżjuda u l-kampjun diġerit f'37 grad. Il-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet ikkwantifikata (assaġġ Bradford; ThermoScientific) u ntużat 10 ug ta 'proteina għall-MS.

MS għal Bulk Proteomics biex Tivvaluta l-Metodu Ottimu tal-Ipproċessar tat-Tessut tal-Kliewi

It-taħlita tal-peptide tryptic ġiet aċidifikata b'aċidu formiku, imnaddfa b'kolonni C18 Monospin, u analizzata fuq l-Orbitrap Q Exactive HF-X (Thermo Scientific). MS/MS twettqet bl-użu ta 'Higher-Energy C-Trap Dissociation (HCD). L-ispettri tal-massa ġew analizzati bl-użu ta 'Byonic v2.14.27 (Metriċi tal-Protein) li jippermettu tolleranzi tal-massa ta' 12 ppm. Kienu permessi modifiki varjabbli ta 'wara t-traduzzjoni, inklużi ossidazzjoni, metilazzjoni, carbamylation, u fosforilazzjoni. Il-proteini kienu limitati għal dawk li skorjaw aħjar minn rata ta 'skoperta falza ta' 1 fil-mija (FDR). Saru tqabbil tal-abbundanza tal-proteini u d-dejta tal-MS biex jintgħażel l-aħjar metodu għalihkliewiġbir tat-tessuti bejn FFPE u OCT.

Laser Qbid Mikrodissezzjoni

Sezzjonijiet ħoxnin ta '5, 10, u 20 μM mhux imtebba immuntati fuq slides tal-PET tqiegħdu fuq l-istadju tas-sistema Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection (Zeiss) biex tittestja l-aħjar ħxuna tat-tqattigħ. Glomerulari utubuli prossimalireġjuni ntgħażlu bl-użu ta 'l-għodda ta' freehand u d-dissezzjonijiet saru f'10X għan. Inqabdu taqsimiet b'erja ta '~4,580 μm2 u ħxuna ta' 10 uM, li kienu jammontaw għal ~ 40 ċellula glomerulari bbażati fuq il-formula ppubblikata qabel għall-istima ta 'ċelluli glomerulari f'adult b'saħħtu.kliewi(18). Ghaltubulari prossimaliċelluli, aħna maqbuda ~ 2,900 μm2 tatubulari prossimaliċelluli, li ammontaw għal ~ 36 ċellula. Is-sezzjonijiet maqtugħin ġew ikkatapultati f'għatu adeżiv opak ta '200 μL (Zeiss) (LPC Energy, 66; LPC Focus, 79) u maħżuna f'-80 grad.

Proteomika Kważi Ċellula Unika (nscProteomics)

Biex solubilizza l-proteini miġbura f'tappijiet ta 'qbid b'LCM, qtar ta' 10 μL ta '0.1 fil-mija DDM 50 mM Tris pH 8 ġiet miżjuda direttament mal-kappa. Il-kampjuni ġew inkubati għal 30 minuta f'37 grad f'thermomixer Eppendorf ThermoTop biex titnaqqas l-evaporazzjoni, segwit minn ċentrifugazzjoni f'2,000 × g għal 1 min biex tittrasferixxi l-lisat għall-kunjett. Il-proteini tnaqqsu b'5 mM dithiothreitol u inkubati fi 37 grad għal 30 min. L-alkilazzjoni saret f'10 mM iodoacetamide b'inkubazzjoni ta' 45 min fid-dlam f'25 grad. Sussegwentement, ġiet miżjuda alikwot ta '10 ng ta' Ls-C segwit minn inkubazzjoni ta '3 sigħat f'25 grad. Imbagħad ġie miżjud alikwott ta' 10 ng ta' tripsin segwit minn diġestjoni matul il-lejl f'25 grad. Il-peptidi diġeriti tħalltu ma 'alikwot ta' 15 μL ta 'ilma ta' 18 MΩ.

Pjattaforma LC-MS għall-Kampjuni Ultra-Żgħar

Kampjuni ta 'peptidi (25 μL) ġew separati bl-użu ta' kolonna ta '60 ċm, b'dijametru ta' ġewwa ta '50 μm u emitter integrat (Objettiv Ġdid). Il-kolonni kienu ppakkjati internament b'dijametru ta '1.7 μm Waters BEH media. Ġie prodott gradjent 100-min bl-użu ta' nanopompa Dionex Ultimate 3000 RSLC (Thermo Scientific). Din is-sistema kienet akkoppjata ma' spettrometru tal-massa QExactive Plus (Thermo Scientific). L-ispettri tal-massa nġabru minn 300 sa 1,800 m/z, bl-użu ta 'l-aqwa 12-il metodu ta' akkwist dipendenti fuq id-dejta. L-ispettri MS1 inġabru b'riżoluzzjoni tal-massa ta '35K u MS2 b'17.5K. Intuża IT massimu ta' 100 ms biex jiżdiedu l-identifikazzjonijiet minn jonji ta' abbundanza baxxa.

Estrazzjoni tad-Dejta Proteomika

Il-fajls mhux ipproċessati kollha ġew ipproċessati bl-użu ta 'MaxQuant (verżjoni 1.5.3.30) għal skoperta ta' karatteristiċi, tfittxija ta 'database u kwantifikazzjoni ta' proteini / peptidi (19) wara settings deskritti qabel (10). L-ispettri tal-massa tandem ġew imfittxija fid-database tal-bniedem UniProtKB/Swiss-Prot (imniżżla fid-29 ta' Diċembru 2018 u li fiha 20,417 dħul rivedut). Id-dejta tal-proteomika tal-MS għal nscProteomics ġiet iddepożitata lill-Konsorzju ProteomeXchange permezz tar-repożitorju tal-imsieħba PRIDE (20) bl-identifikatur tas-sett tad-dejta PXD015058 u 10.6019/PXD015058.

Analiżi tad-Dejta

Id-dejta tal-MS inkisbet minn ġirjiet imwettqa fil-PNNL (nscProteomics) u l-Università ta 'Stanford (proteomika bl-ingrossa). Għal proteomika bl-ingrossa. Il-metodi statistiċi li ġejjin intużaw għall-għażla tal-aħjarkliewimetodu ta' ġbir tat-tessuti, jew iffriżat f'OCT jew ipproċessat bħala FFPE, kif evalwat minn proteomika kwantitattiva tat-tessuti bl-ingrossa, (i) Ġiet ikkalkulata l-produzzjoni ta' proteini/mg ta' tessut input ekwivalenti; (ii) Ir-riproduċibilità tal-MS ġiet ittestjata fuq l-output tal-MS minn sezzjonijiet FFPE u OCT minn kull waħda minn 2 kliewi, ippreparati mill-istess individwu bl-użu tal-istess protokoll, analizzati fuq l-istess strument MS bl-użu ta 'protokoll stabbilit, ftit jiem 'il bogħod minn xulxin (21). Intuża limitu ta' riproduċibbiltà (22) biex jipprovdi limitu approssimattiv fuq differenzi ta' kejl bejn ġirjiet suċċessivi ta' proċess wieħed kif ukoll stima ta' preċiżjoni għal tqabbil bejn proċessi. Il-koeffiċjent ta 'korrelazzjoni, li pprovda l-grad ta' qbil bejn ġirjiet suċċessivi (bl-użu tal-istess tessut), ġie kkalkulat; (iii) L-abbundanza tal-proteini u d-distribuzzjoni tad-daqs tal-frammenti tal-peptidi ġew ikkalkulati biex jiġu vvalutati varjazzjonijiet oriġinaw mid-degradazzjoni tal-proteini, crosslinking minħabba formalin, eċċ.kliewireferenza u (v) kalkolu tal-preġudizzju. Analiżi kwantitattiva stretti u identifikazzjoni ta 'proteini uniċi utilizzati data biss bi proteini b'għadd spettrali Akbar minn jew ugwali għal 5 (23). It-test eżatt ta' Fisher intuża biex jivvaluta l-arrikkiment ta' proteini komuni u uniċi mmarkati bejn żewġ kliewi umani normali, (#1 u #2). Ibbażat fuq l-analiżi ta 'hawn fuq (ara r-riżultati), tessut iffriżat OCT intgħażel bħala l-metodu ta' ġbir għall-analiżi sussegwenti kollha.

Il-pass li jmiss tal-fokus tal-analiżi tad-dejta kien li jidentifika, jikkwantifika u jivvalida settijiet ta’ proteini arrikkit jew speċifiċi għall-~10–100 ċellula miksuba minn kull waħda miż-żewġ magħżula.kliewisub-kompartimenti—Reġjuni Glom u PT, miksuba mill-istesskliewi, bil-massa u LCM ta' OCT iffriżattessut tal-kliewi(n=9; kliewi #3–11) u mmexxi minn nscProteomics.

Ġie adottat approċċ ta' filtrazzjoni semi-konservattiv ta' {{{0}}pass biex jittratta kwistjonijiet ta' dejta nieqsa/mhux kompluta, u t-test G (24) intuża biex jiġi identifikat jekk id-dejta kinitx nieqsa bl-addoċċ (MAR) jew Nieqsa Mhux bl-Awtorazzjoni (MNAR). Valutazzjoni addizzjonali tal-affidabbiltà tad-dejta saret billi ntgħażlu b'mod strett proteini osservati f'Aktar minn jew ugwali għal 50 fil-mija tal-kampjuni kollha. It-test T intuża biex jidentifika għall-proteini arrikkiment sinifikanti fil-glomming jew PT u ġiet applikata korrezzjoni ta 'ttestjar multiplu (Benjamini-Hochberg FDR) b'limitu ta' sinifikat ta '0.1. Għall-finijiet tal-analiżi, id-dejta tal-MS tal-intensità relattiva (log 2 trasformata) miksuba minn Glom, PT, u frazzjonijiet tal-massa minn frazzjonijiet wieħedkliewikienu kkunsidrati bħala paired. Aħna identifikajna proteini arrikkit fi Glom (b'livelli baxxi fi PT/bulk), u uniċi għal Glom (assenti fi PT) kif ukoll proteini arrikkit fi PT (b'livelli baxxi fi Glom/bulk) u uniċi għal PT (assenti fi Glom) . Analiżi ta 'arrikkiment saret biss fuq data mingħajr valuri neqsin f'kull grupp biex tiżdied il-kunfidenza. Il-korrelazzjoni bejn il-valuri ta 'abbundanza ta' proteini komuni ntużat biex jiġi vvalutat il-grad ta 'qbil bejn proteini arrikkit tas-sottokompartiment bejn ġirjiet separati tal-istess esperiment. Aħna wettaqna wkoll validazzjoni inkroċjata ta 'proteini arrikkit b'mod sinifikanti f'kull kompartiment billi analizzaw dawn il-paraguni minn settijiet ta' kampjuni uniċi bejn 2 ġirjiet differenti, Run 1 u Run 2. Il-validazzjoni bijoloġika għal settijiet ta 'proteini ta' subkompartiment arrikkit (Glom u PT) saret minn jistaqsi jekk proteini arrikkiti f'subkompartimenti magħrufa jistgħux jiġu lokalizzati lura għar-reġjuni speċifiċi tagħhom f'dejta pubblika mill-Atlas tal-Proteini Umani (https://www.proteinatlas.org/) (25).

Cistanche għal sintomi ta' insuffiċjenza tal-kliewi

Tqabbil/Integrazzjoni tad-Data Cross-Omics

Biex tiġi vvalutata l-konkordanza tal-espressjoni tal-proteini fil-livell tal-RNA, ġiet utilizzata dejta ġġenerata minn sekwenzar tal-RNA b'ċellula waħda (scRNA Seq) imwettqa fuq 10 nefrectomiji indiġeni, li 9 minnhom kienu jikkoinċidu mal-kliewiużati fl-nscProteomics. Għal dan, intużat pjattaforma 10x Genomics Chromium b'kimika v3 bl-użu tal-metodu ottimizzat fil-laboratorju Sarwal bħala Sit ta 'Interrogazzjoni tat-Tessuti (TIS) tal-Konsorzju KPMP (manuskritt li jagħti dettalji tal-metodu u r-riżultati qiegħed jitħejja). Għal din l-analiżi cross-omics, użajna dejta tat-traskriptome minn 45,411kliewiċelluli riżolti f’disa’ tipi ewlenin ta’ ċelluli: Podoċiti, ċelluli mezanġjali, endotelju glomerulari, stroma/interstizju, ċelluli immuni,tubuli prossimali, riġlejn axxendenti ħoxna tal-linja ta 'Henle, tubuli distali / li jgħaqqdu, u kanal tal-ġbir. L-analiżi tad-dejta b'ċellula waħda saret bl-użu tal-verżjoni tal-pakkett Seurat R 2.3.4. Analiżi aktar fil-fond ta' din id-dejta tinsab fl-iżvilupp (26).

Minn: 'Profiling tal-Proteomics Near-Single-Cell of theTubulari ProssimiliuGlomerulustal-Bniedem NormaliKilwa' minn Tara K. Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Juliane Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Izabella Damm1, Swastika Sur1, Jinghui Luo4, Yinghui Luo4, Yang4, Wei-Jun Qian2* u Minnie M. Sarwal1* għall-KilwaKonsorzju tal-Proġett ta' Mediċina ta' Preċiżjoni (KPMP).

---artiklu RIĊERKA ORIĠINALI Quddiem. Med., 17 ta’ Settembru 2020 |