Arkitettura tridimensjonali ta 'nephrons fil-kliewi normali u ċistika

Kuntatt: emily.li@wecistanche.com

Thomas Blanc1,2,7 , Nicolas Goudin3,7 , Mohamad Zaidan1,4,7 , Meriem Garfa Traore3 , Frank Bienaime1,5, Lisa Turinsky1 , Serge Garbay1 , Cle´ment Nguyen1 , Martine Burtin1 , Gerard Friedlander1,6 , Fabiola Terzi1,8 u Marco Pontoglio1,8

Cistanche huwa tajjeb għall-kliewi

KELMI EWLENIN: mard tal-kliewi ċistika; kliewi; nephron; nephronophthisis;tindif tat-tessuti

Il-funzjoni tal-kliewi hija dipendenti b'mod kruċjali fuq l-istruttura tridimensjonali kumplessa tan-nephrons. Kwalunkwe distorsjoni tal-forma tagħhom tista 'twassal għaldisfunzjoni tal-kliewi. Metodi istoloġiċi tradizzjonali jippreżentaw limitazzjonijiet kbar għar-rikostruzzjoni tat-tessuti tridimensjonali. Hawnhekk, għaqqadna l-ikklerjar tat-tessuti, il-mikroskopija b'ħafna fotoni u t-traċċar diġitali għar-rikostruzzjoni ta 'nephrons singoli taħt kundizzjonijiet fiżjoloġiċi u patoloġiċi. Settijiet ta'nephronsġew identifikati differenti fil-post, forma u daqs skond il-funzjoni tagħhom. Interessanti, in-nephrons għandhom it-tendenza li jinsabu fl-ajruplani. Meta din it-teknika ġiet applikata għal mudell tamard tal-kliewi ċistika, Instab li ċ-ċisti jiżviluppaw biss f'segmenti speċifiċi tan-nephron. Tul l-istess segment, iċ-ċisti huma kontigwi fi ħdan tubuli normali mhux dilatati. Barra minn hekk, il-forom taċ-ċisti varjaw skont is-segment tan-nephron. Għalhekk, is-sejbiet tagħna jipprovdu strateġija siewja għall-viżwalizzazzjoni tal-istruttura kumplessa tal-kliewi fil-livell ta 'nephron wieħed u, aktar importanti minn hekk, jipprovdu bażi għall-fehim ta' proċessi patoloġiċi bħaċ-ċistoġenesi.

Dikjarazzjoni Translazzjonali

Il-metodi tal-ikklerjar jipprovdu għodda unika biex wieħed jifhem kif il-bidliet morfoloġiċi jwasslu għal konsegwenzi patoloġiċi. Il-kliewi huma organi kritiċi li jżommu l-omeostażi tal-ġisem permezz tal-immaniġġjar tal-ilma, tal-metaboliti u tal-elettroliti, li huma dipendenti b'mod kruċjali fuq l-istruttura 3-dimensjonali kumplessa tan-nephrons. Meta din l-organizzazzjoni strutturali tinbidel, isseħħ patofiżjoloġija renali. Fl-istudju preżenti, żviluppajna metodu qawwi bbażat fuq l-ikklerjar ottiku,

mikroskopija multifoton, u traċċar diġitali biex tistudja l-kliewi fil-livell ta 'nephron wieħed taħt kundizzjonijiet fiżjoloġiċi u patoloġiċi. B'mod partikolari, aħna nipprovdu l-ewwel 3-rikostruzzjoni dimensjonali ta' kilwa poliċistika fuq l-iskala ta 'nephrons singoli. Dan il-metodu jista 'jiġi applikat għal diversi kuntesti patoloġiċi, li jippermettilna nifhmu aħjar il-proċess kumpless ta' deterjorament tal-kliewi u, konsegwentement, biex niżviluppaw strateġiji terapewtiċi aktar immirati.

Il-kliewi żżomm l-omeostażi tal-ġisem permezz tal-istruttura kumplessa ta' nephron 3-dimensjonali (3D). Meta din l-organizzazzjoni strutturali tinbidel, isseħħ patofiżjoloġija renali.Mard kroniku tal-kliewihuma kkaratterizzati mill-iżvilupp ta 'leżjonijiet renali. B'mod intriganti, patoloġisti rrappurtaw eteroġeneità wiesgħa fid-distribuzzjoni tal-leżjonijiet waqt mard kroniku tal-kliewi.1,2 Jekk dan jirriflettix il-fatt li segmenti speċifiċi tan-nephron jistgħu jiġu mħassra b'mod differenti, jew alternattivament, li xi nephrons għandhom suxxettibiltajiet differenti biex jiġu mweġġa' kollha. , mhux magħruf. Biex tiġi indirizzata din il-kwistjoni, huwa obbligatorju li tinbena mill-ġdid il-forma 3D tan-nephrons f'kuntesti patoloġiċi.

Sa fejn nafu,nephronsġew rikostruwiti bis-sħiħ biss bl-użu ta 'sezzjonijiet 2D serjali.3–5 Għalkemm is-sezzjoni istoloġika standard tipprovdi riżoluzzjoni għolja, rikostruzzjonijiet 3D huma impenjattivi u diffiċli biex jinkisbu. Dan huwa primarjament dovut għal distorsjonijiet mekkaniċi, li huwa effett inevitabbli tal-proċedura tat-tqattigħ. Barra minn hekk, rikostruzzjoni 3D minn immaġini 2D ma tippermettix immaġini diretti ta 'strutturi 3D f'tessuti immuntati sħaħ.

Il-mikroskopija multifoton tejbet il-kapaċità tagħna li niskopru bidliet morfoloġiċi f'taqsimiet ħoxnin. Madankollu, limitazzjoni sinifikanti hija l-fond aċċessibbli baxx minħabba t-tifrix tad-dawl. Billi jimminimizzaw id-differenzi fl-indiċi ta’ rifrazzjoni, l-aġenti tal-ikklerjar tejbu b’mod drammatiku l-abbiltà li jagħmlu immaġni tal-fond. .9–17 Studji reċenti wrew il-potenzjal tagħhom għall-immaġini ta’ organi solidi oħra, bħall-fwied, il-frixa jew il-kliewi.18–26

cistanche għal mard tal-kliewi

Mard poliċistiku tal-kliewi, disturb ġenetikament eteroġenju li jinvolvi mutazzjonijiet f'diversi ġeni ċiljari, huwa l-aktar mard tal-kliewi ereditarju komuni.27,28 Il-mard tal-kliewi poliċistiku huwa kkaratterizzat mill-iżvilupp ta 'ċisti li jwasslu għall-qerda sħiħa tal-kliewi.28 Studji ta' mikrodissezzjoni ssuġġerew li ċ-ċisti jistgħu tiżviluppa jew bħala "out pushing" ta 'segment nephron, bħal fil-poliċistiku awtosomali dominantimard tal-kliewi; bħala espansjoni ektatika tal-kanali tal-ġbir (CDs), bħal fil-poliċistiku awtosomali reċessivmard tal-kliewi; jew esklussivament fit-tubuli medullari, bħal fin-nephronophthisis (NPHP).27,29 Madankollu, kif iċ-ċisti jiżviluppaw fi 3D u jorganizzaw bejniethom u tubuli ġirien normali għadu mhux magħruf.

Hawnhekk, għaqqadna l-ikklerjar ottiku ma 'mikroskopija multifoton biex nipprovdu għarfien ġdid dwar kifnephronshuma ffurmati u organizzati f'kundizzjonijiet fiżjoloġiċi u kif huma modifikati waqt il-mard, bħaċ-ċistoġenesi. Ir-riżultati tagħna juru li hemm 3 tipi ta 'nephrons u li l-bastimenti jistgħu jinfluwenzaw l-organizzazzjoni spazjali tan-nephron. Interessanti, osservajna li n-nephrons għandhom it-tendenza li jinsabu fi pjani speċifiċi. B'mod mhux mistenni, meta applikajna din it-teknika għall-ġrieden jck, osservajna li ċ-ċisti żviluppaw biss f'segmenti speċifiċi ta 'nephron b'ċisti fusiform imħallta ma' tubuli normali.

RIŻULTATI

Setup sperimentali

Biex tistudja l-forma ta 'sħiħnephronsfir-rigward tal-ambjent tagħhom, adottajna teknika bbażata fuq ikklerjar ottiku u mikroskopija multifoton (Figura Supplimentari S1A). Billi qabblu protokolli ta 'clearing ottiku differenti, iddeterminajna li għall-kliewi, l-alkoħol tal-benżil / benżil benzoate (BABB) kien l-aktar xieraq f'termini ta' effiċjenza (Figura Supplimentari S1B u C u Tabella Supplimentari S1).

Ir-rikostruzzjoni 3D u t-traċċar diġitali jeħtieġu immaġini ta 'kwalità għolja b'riżoluzzjoni għolja u proporzjon għoli ta' sinjal għall-isfond. Aħna osservajna li s-sinjal ottiku pprovdut minn flfluworexxenza nattiva ma kienx uniformi fuq sezzjonijiet tal-kliewi. B'mod partikolari, l-immaġini mill-medulla kienu kkuntrastati ħażin ma 'proporzjon baxx tas-sinjal għall-isfond (Figura Supplimentari S2). Biex intejbu l-proporzjon tas-sinjal għall-isfond, imtebbajna sezzjonijiet b'aċidu perjodiku-Schiff (Figura Supplimentari S1D), għax innutajna empirikament li din it-tbajja wasslet għal kuntrast għoli f'sezzjonijiet irqaq matul 2-florexxenza tal-fotoni. Madankollu, is-sinjal ma kienx uniformi matul is-sezzjonijiet tal-kliewi perjodiċi ħoxnin mtebbgħin bl-aċidu Schiff (Figura Supplimentari S1E). Għalhekk, aħna mtebbgħin sezzjonijiet tal-kliewi bil-lectins flfluorochrome akkoppjati: agglutinin tal-karawett u agglutinin tar-raħs tal-qamħ, li tebgħa glomeruli u tubuli, u Griffonia simplicifolia agglutinin, li jimmarka l-vini tad-demm. proporzjon tal-isfond żdied b'mod drammatiku kollusezzjonijiet tal-kliewi, b'titjib sinifikanti kemm fil-pjan xy kif ukoll fl-assi z (Figura Supplimentari S1E u Film Supplimentari S1).

Viżwalizzazzjoni 3D tas-segment tan-nephron

Biex Ħares il-forma ta 'nephrons sħaħ, aħna ntraċċaw il-mogħdijiet tagħhom, li jibdew mill-arblu tal-awrina tal-glomerulus u jispiċċaw fil-junction CD (Supplimentary Movie S2). Minkejja l-fatt li l-lectins użati globalment jorbtu s-segmenti kollha tan-nephron, aħna ndunajna li meta ġew spezzjonati bir-reqqa, dawn il-lectins kienu kkaratterizzati minn mudell speċifiku fil-mod kif imtebbgħin membrani bażali jew luminali fis-segmenti differenti tan-nephron. Fi kliem ieħor, ħadna vantaġġ mill-mudell sterjotipiku tat-tbajja tal-lectin biex nidentifikaw is-segmenti differenti tan-nephron. B'dan il-mod, nistgħu faċilment nidentifikaw 6 entitajiet: tubuli prossimali (PT), riġlejn irqiq (TL) tal-linja Henle (HL), riġlejn axxendenti oħxon (TAL) ta 'HL, tubuli konvoluti distali (DCT), tubuli ta' konnessjoni (CNT). ), u CD. It-tranżizzjoni bejn PT u TL kienet ikkaratterizzata mit-telf f'daqqa tas-sinjal tipiku tal-fruntiera tal-pinzell PT u bit-tnaqqis fil-wisa 'tal-lumen, li kien kważi prattikament assenti f'TL (Figura 1a). Bil-maqlub, it-tranżizzjoni bejn TL u TAL kienet ikkaratterizzata minn żieda sinifikanti fid-dijametru tubulari estern u wisa 'lumen relattivament kostanti (Figura 1b). F'kolloxnephrons, it-tranżizzjoni ta 'TAL għal DCT instabet b'mod sistematiku fil-arblu vaskulari tal-glomerulus. Din it-tranżizzjoni kienet ikkaratterizzata minn tkabbir f'daqqa ta 'dijametru tubulari estern li kien prinċipalment dovut għal żieda sinifikanti fid-dijametru tal-lumen (Figura 1c). It-tranżizzjoni bejn DCT u CNT kienet ikkaratterizzata minn tnaqqis kemm fid-dijametru tubulari kif ukoll fil-lumen (Figura 1d). Fl-aħħarnett, il-konnessjoni bejn CNT u CD kortikali kienet ikkaratterizzata minn żieda f'daqqa kemm fid-dijametru tubulari kif ukoll fil-lumen (Figura 1e). Il-kwantifikazzjoni ta 'dawn it-tranżizzjonijiet morfoloġiċi kienet statistikament sinifikanti (Figura 1f), u l-pertinenza tagħha ġiet ivverifikata bi tbajja' b'markaturi tubulari speċifiċi (Figuri Supplimentari S3-S5 u Movie Supplimentari S3-S5).

Il-forma u d-daqs tal-PTs ivarjaw skond il-fond tagħhom

It-tbajja 'ta' oħxonsezzjonijiet tal-kliewiippermettilna ntraċċaw il-koordinati tal-evoluzzjoni spazjali ta 'segmenti PT sħaħ. Interessanti, skoprejna li l-forma tagħhom kienet estremament varjabbli u determinata mill-pożizzjoni tal-glomeruli tagħhom fil-kortiċi. Globalment, identifikajna 3 mudelli. L-ewwel kor wieġbet għall-aktar nephrons superfiċjali (SNs) (Figura 2a; Film Supplimentari S6), li okkupaw l-aktar parti esterna tal-kortiċi (l-aktar 30 fil-mija esterni qrib il-kapsula renali). Il-partijiet konvoluti tagħhom iffurmaw strutturi kompatti b'6 sa 7 konvoluzzjonijiet biss madwar il-glomerulus tagħhom stess, li jokkupaw spazji żgħar ħafna u ppakkjati sewwa. Il-konvoluzzjoni ta 'dawn l-SNs spiċċat f'pars recta twila u dritta li niżlet fil-medulla. Fit-tarf oppost ta 'dan l-ispettru, osservajna t-tieni mudell ta'nephronsli jinsab fl-aktar parti fonda tal-kortiċi (40 fil-mija aktar fond intern), ħdejn il-medulla (juxtamedulary nephrons [JNs]) (Figura 2a; Figura Supplimentari S6 u Movie Supplimentari S6). Il-PTs tagħhom kienu kkaratterizzati minn linja qasira inizjali li niżlet sistematikament lejn il-papilla u mbagħad U daret biex titla' lejn il-kapsula renali. B'kuntrast mal-SNs, it-tubuli konvoluti prossimali JN kienu kkaratterizzati minn kolji kbar li evolvew madwar il-glomerulus tagħhom stess u okkupaw oqsma kbar, ippakkjati b'mod laxk fil-kortiċi juxtamedullary. Il-parti konvoluta tal-PT ta 'JNs kellha 10 sa 15-il konvoluzzjoni, li jiffurmaw oqsma kbar. Fl-aħħarnett, it-tielet mudell inkluda nephrons li jinsabu fil-porzjon tan-nofs tal-kortiċi (nephrons tan-nofs [MNs]) (Figura 2a; Film Supplimentari S6). Interessanti, dawn it-tubuli kellhom forma u orjentazzjoni spazjali li rrappreżentaw transizzjoni bejn SNs u JNs. Fil-fatt, kien fihom 8 sa 9 konvo luzzjonijiet b'koljaturi li kienu akbar minn SNs, iżda iżgħar minn JNs. Barra minn hekk, MNs kellhom pars recta itwal minn JNs. Interessanti, paragun globali tal-forom tal-PTs wera li SNs u MNs kellhom mudell omoġenju filwaqt li JNs kienu estremament eteroġenji (Figura Supplimentari S6). Barra minn hekk, ir-rikostruzzjoni spazjali ta 'diversi nephrons żvelat li l-PTs qatt ma jitħalltu (Supplimentary Movie S6), li jindika li kull nephron jokkupa l-ispazju individwali tiegħu stess fil-kortiċi.

Analiżi morfometriċi kkonfermaw id-differenzi kbar fid-daqs u l-forma ta 'SNs u JNs, b'aspett intermedju għall-MNs. Il-PT ta' JNs kien aktar minn 2-darbiet itwal mill-PT ta' SNs (Figura 2b); madankollu, id-dritta kienet akbar fl-SNs milli f'JNs (Figura 2c), konsistenti mal-osservazzjoni li t-tubuli JN kienu ħafna aktar tortuous (Figura 2a; Figura Supplimentari S6).

Figura 1|Kriterji morfoloġiċi użati biex jiġu identifikati s-segmenti tan-nephron. (a–e) Morfoloġija tas-segmenti differenti tan-nephron fil-ġrieden ta 'kontroll. In-nephrons ġew rintraċċati mill-arblu tal-awrina tal-glomerulus sal-kanal tal-ġbir (tubuli prossimali [PT]: lewn; riġlejn irqiq [TL] tal-linja Henle: griż ċar; riġlejn axxendenti oħxon [TAL] tal-linja Henle: griż skur; tubuli konvoluti distali [DCT]: roża; tubuli li jgħaqqdu [CNT]: isfar; kanal tal-ġbir kortikali [CCD]: oranġjo). Il-vleġeġ jindikaw id-dijametru tas-segmenti differenti tan-nephron. (Ikompli)

Figura 1|(Ikompli) (f) Kwantifikazzjoni tad-dijametru tubulari ta' barra tas-segmenti differenti tan-nephron. Id-dejta hija espressa bħala SEM medju. Analiżi tal-varjanza segwita mit-test Tukey-Kramer: **P < 0.01,="" ***p=""><>

Figura 3|Ir-rikostruzzjoni ta 'nephron tridimensjonali (3D) tiżvela 3 tipi differenti ta' nephrons. (a) Immaġini 3D rappreżentattivi ta 'nephron sħiħ (pannelli tax-xellug) minn glomeruli sa katusa tal-ġbir fil-kortiċi superfiċjali (blu), kortiċi tan-nofs (aħdar) u reġjun juxtamedullari (aħmar) fil-ġrieden ta' kontroll. Segmentazzjoni tan-nephron (pannelli tal-lemin) għat-3 tipi differenti ta 'nephrons. Bar ¼ 150 mm. (b) Kwantifikazzjoni tal-interdistanza bejn iż-żewġ riġlejn tal-linja Henle għat-3 tipi ta 'nephrons. (c) Kwantifikazzjoni tat-tul tan-nephron għall-(ikompli)

Figura 3|(ikompli) 3 tipi ta' nephrons. (d) Kwantifikazzjoni tat-tul tas-segmenti differenti tan-nephron skond it-tip ta' nephron. Id-dejta hija espressa bħala -SEM medju. Analiżi tal-varjanza segwita mit-test Tukey-Kramer: juxtamedullary nephron (JN) versus superfificial nephron (SN): ###P < 0.001;="" jn="" kontra="" nephron="" tan-nofs="" (mn):="" *="" p=""><0.05, **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001.="" cnt,="" tubuli="" li="" jgħaqqdu;="" dct,="" tubuli="" konvoluti="" distali;="" pt,="" tubuli="" prossimali;="" tal,="" parti="" oħxon="" axxendenti="" tal-linja="" henle;="" tl,="" parti="" rqiqa="" tal-linja="">

Id-daqs glomerulari jvarja skond il-fond

Imbagħad analizzajna l-fond u d-dijametru tal-glomeruli magħżula b'mod każwali minn kull waħda mit-3 żoni. Analiżi morfometriċi wrew li glomeruli kienu jinsabu fuq medja 783 u 355 mm mill-kapsula renali f'JNs u SNs, rispettivament. Kif irrappurtat qabel, osservajna li d-daqs tal-glomeruli varja skond il-fond tagħhom. B'mod partikolari, il-volum glomerulari ta 'JNs kien 3 darbiet akbar minn dak ta' SNs u MNs (Figura 2d).

Rikostruzzjoni nephron 3D

Imbagħad intraċċajna l-evoluzzjoni spazjali ta 'nephrons sħaħ minn PT għal CNT. Il-veduta globali tar-rikostruzzjoni 3D tagħhom ikkonfermat li l-forma ta 'nephron kienet differenti fost SNs, MNs, u JNs (Figura 3a; Movie S7 Supplimentari). Din id-differenza kienet prinċipalment dovuta għall-istruttura tal-PT. Barra minn hekk, osservajna li HL kellu organizzazzjoni spazjali 3D differenti. B'mod partikolari, TL u TAL kienu separati aktar 'il bogħod f'JNs milli f'SNs u MNs (Figura 3b). Analiżi morfometriċi wrew li JNs kienu globalment 2-darbiet itwal minn SNs (Figura 3c). It-tul miżjud kien imqassam proporzjonalment fis-segmenti kollha, ħlief għal TAL u DCT, li kellhom it-tendenza li jkollhom tul assolut simili fit-tipi kollha ta 'nephron (Figura 3d). Dan issuġġerixxa li t-titwil tan-nephron huwa proċess b'disinn sorprendentement omoġenju.

Il-bastimenti arkuati jinfluwenzaw il-konvoluzzjoni PT juxtamedullari

Biex tikseb perspettiva aktar komprensiva tal-struttura tal-kliewi, Ħadna vantaġġ mit-tbajja 'agglutinin ta' Griffonia simplicifolia, li ppermettietna ntraċċaw il-bastimenti arkuati u l-fergħat tagħhom fil-bastimenti radiate kortikali (Figura 4a; Movie S8 Supplimentari). Interessanti, ir-rikostruzzjoni 3D konkomitanti tan-nephrons u l-bastimenti wriet li l-bastimenti arcuate għandhom it-tendenza li jkunu f'organizzazzjoni spazjali parallela sorprendenti b'tubuli fil-qrib. B'mod partikolari, osservajna li l-mogħdija segwita minn JNs speċifiċi (JNs kostretti) għandha t-tendenza li ssegwi l-mogħdija tal-bastiment fil-qrib (Figura 4b; Movie S9 Supplimentari). B'mod notevoli, dan il-preġudizzju (osservat biss f'subsett ta 'nephrons JN) ammonta għall-eteroġeneità kbira fil-forom ta' PT (Figura Supplimentari S6). Analiżi morfometriċi wrew li l-PTs "kostretti" kienu b'mod sinifikanti itwal u aktar tortuous (dritta mnaqqsa) minn dawk "mhux kostretti" (Figura 4c u d). Ta 'min jinnota li l-partijiet konvoluti ta' kemm SNs kif ukoll MNs kienu pożizzjonati 'l fuq mill-bastimenti arkwati u ma kinux kostretti.

It-tubuli għandhom tendenza li jinsabu fl-ajruplani

Interessanti, l-ispezzjoni tal-forom 3D tan-nephrons indikat li dawn għandhom tendenza li jinsabu fi pjani (Figura 5a; Film Supplimentari S1 0). Biex tikkwantifika dan il-parametru u biex tevalwa l-preġudizzju statistiku possibbli ta 'din il-konformazzjoni, kejlna t-tendenza ġenerali tat-tubuli li jitgħawweġ 'il barra mill-pjan definit mill-linji tagħhom. Il-kejl tagħna wera li meta mqabbel ma 'mudell simulat ta' mixi bl-addoċċ iġġenerat bl-istess sett ta 'angoli mkejla konsekuttivi u tul bejn punti konsekuttivi (Figura 5b), it-tubuli kellhom it-tendenza li jevolvu b'devjazzjoni iżgħar minn pjan (Figura 5c). Dan indika li t-tubuli kellhom it-tendenza li jirrestrinġu l-passaġġ tagħhom tul pjan. Id-differenzi osservati kienu statistikament sinifikanti ħafna (P <>

cistanche jista 'jtejjeb il-funzjoni tal-kliewi

Ir-rikostruzzjoni ta 'nephron 3D tiżvela mudell speċifiku għall-iżvilupp taċ-ċisti

Biex niddeterminaw jekk il-protokoll tagħna jippermettix li jintraċċaw nephrons f'tessuti patoloġiċi diżorganizzati, aħna kkaratterizzajna l-forom u d-distribuzzjoni spazjali taċ-ċisti fil-ġrieden jck, mudell użat ħafna ta 'NPHP u mard ċstiku.31–33 3D immaġini wrew li minkejja tad-dehra ta 'ċisti prominenti, il-kors ġenerali 3D ta' nephrons ma kienx differenti b'mod sinifikanti minn dak tal-ġrieden ta 'kontroll (Film Supplimentari S11). Bl-istess mod, analiżi morfometriċi kkonfermaw li t-tul globali tan-nephrons, il-volum glomerulari, u t-tul ta’ kullnephronsegment kienu komparabbli ma 'dawk tal-ġrieden ta' kontroll (Figura Supplimentari S7). Ta 'min jinnota, minħabba l-iżvilupp taċ-ċisti, ma stajniex niddistingwu TL minn TAL f'HL. In-nephrons kollha żviluppaw ċisti fusiformi (Films Supplimentari S11 u S12). Waħda mill-aktar karatteristiċi impressjonanti kienet l-osservazzjoni li dilations ċistika fusiform seħħew f'postijiet multipli tul l-istessnephronsegment (Films Supplimentari S12 u S13). B'mod intriganti, osservajna li ċ-ċisti qatt ma żviluppaw f'riġlejn dixxendenti PTs u HL (Figura 6a; Film Supplimentari S12). B'kuntrast, kienu skoperti b'mod predominanti f'riġlejn axxendenti HL, DCTs, CNTs, u fil-parti ta 'fuq tas-CDs, b'mod kontinwu ma' CNT (Figura 6a; Movie S12 Supplimentari). B'mod partikolari, osservajna li d-DCT, kif ukoll is-segmenti CNT, kellhom probabbiltà miżjuda b'mod partikolari li jiżviluppaw ċisti fil-partijiet aktar distali rispettivi tagħhom (Figura 6b). Analiżi morfometriċi kwantitattivi ta 'immaġini ta' rikostruzzjoni 3D wrew li l-volum totali taċ-ċisti kullnephronkien partikolarment għoli fis-CNT (Figura 7a). Barra minn hekk, osservajna li l-kbarijiet taċ-ċisti f'HL u DCT kienu akbar f'JNs milli f'SNs u MNs (Figura 7a; Movie S12 Supplimentari). Barra minn hekk, l-inċidenza taċ-ċisti kienet ogħla b'mod sinifikanti f'JNs milli fit-tipi l-oħra ta 'nephrons (Figura 7b). Osservajna wkoll li l-interdistanza glomerulari medja (ikkalkulata fuq l-eqreb 5 glomeruli) kellha t-tendenza li tiżdied b'mod partikolari fil-ġrieden ċistiċi, speċjalment fil-kortiċi aktar superfiċjali (Figura Supplimentari S8).

Rikostruzzjoni 3D ta 'bosta ċisti żvelat li kienu estremament varjabbli fil-forma u l-volum (Figura 6c; Films Supplimentari S11 u S13). Fil-parti axxendenti HL, iċ-ċisti kellhom forma fusiform b'dijametru żgħir. Fid-DCT, iċ-ċisti kellhom forma pjuttost sferika u akbar u kienu mxerrda fost tubuli mhux dilatati. Interessanti, it-tranżizzjoni bejn DCT u CNT kienet sistematikament ikkaratterizzata minn struttura normali mhux dilatata. B'kuntrast, f'CNT, osservajna sistematikament struttura ċistika dilatata kontigwa direttament f'kuntatt mas-CD. Interessanti, f'CD, din l-istruttura naqset progressivament għal daqs normali tat-tubuli. Aktar distalment, l-ebda ċisti oħra ma setgħu jiġu skoperti fil-parti kontigwa tas-CD. Karatteristika konsistenti oħra kienet l-organizzazzjoni spazjali partikolari taċ-ċisti fil-parti axxendenti HL. Fil-fatt, għalkemm iċ-ċisti kienu aktar profondi u eqreb lejn il-linja fl-SNs, kienu aktar superfiċjali u eqreb lejn DCT f'JNs (Figura 6c). Għal darb'oħra, iċ-ċisti okkupaw pożizzjoni intermedja f'MNs (Figura 6c).

Figura 5|Nephron tubuli għandhom it-tendenza li jevolvu bħala struttura flflat. (a) Mogħdija tipika ta 'tubuli prossimali tan-nephron. Din it-triq turi t-tendenza tagħha li tinsab fi pjan. Il-planarità tal-evoluzzjoni tal-mogħdija tista 'tidher aħjar meta mdawwar sew u allinjata mal-perspettiva tal-osservatur (ara r-rappreżentazzjoni tal-lemin tal-istess segment tubulari, li, fuq in-naħa tax-xellug, hija rappreżentata fuq naħa differenti angolu). (b) Rappreżentazzjoni skematika ta' passaġġ tubulari magħmul minn 4 segmenti (bejn 5 punti li jiddefinixxu mogħdija tubulari partikolari murija bħala eżempju). Il-grad li fih il-mogħdijiet għandhom tendenza li jmorru "barra mill-pjan tagħhom" jista 'jiġi rappreżentat mill-angolu indikat hawn bħala "beta." (Ikompli)

Figura 5|(Ikompli) Dan l-angolu jitkejjel bejn is-segment p3-p4 fir-rigward tal-pjan (definit mill-punti immedjatament preċedenti p3, p2, u p1) u rappreżentat minn rettangolu griż skur fl-iskema. Il-kalkolu tal-angoli beta mbagħad ġie kkalkulat b'mod rikorsiv tul is-sett ta 'punti f'mogħdija tubulari. Biex nevalwaw il-firxa tal-preġudizzju ta 'dawn l-angoli beta, aħna simulajna mixi bl-addoċċ (simulazzjoni Monte Carlo [MCs]) billi nużaw l-istess sett ta' angoli alfa konsekuttivi ta 'kull mogħdija tubulari (imkejla bejn is-segmenti konsekuttivi kollha). Dan il-mixi bl-addoċċ iġġenera mogħdija b'sett identiku ta' angoli alfa u angoli beta randomised. (c) Plottijiet tal-vjolin tad-distribuzzjoni globali ta 'angoli beta u r-riżultat ta' MCs fit-tubuli prossimali (PT), riġlejn irqiq (TL) tal-linja Henle, riġlejn axxendenti oħxon (TAL) tal-linja Henle, tubuli konvoluti distali ( DCT), u tubuli konnettivi (CNT). MCs, P <>

DISKUSSJONI

Metodi istoloġiċi tradizzjonali huma limitati fil-kapaċità tagħhom li jiskopru bidliet patoloġiċi li jaffettwaw il-forma globali tan-nephrons. Hawnhekk, aħna nippreżentaw approċċ qawwi bbażat fuq l-ikklerjar tat-tessuti li għandu l-potenzjal li jindirizza mistoqsijiet kruċjali dwar l-arkitettura tal-kliewi b'dettall spazjali mingħajr preċedent taħt kundizzjonijiet normali u patoloġiċi. Ir-riżultati tagħna kkonfermaw l-eżistenza ta '3 tipi ta' nephrons, li huma differenti fil-post, fil-forma u fid-daqs tagħhom, konsistenti mal-ispeċifiċitajiet funzjonali tagħhom. Barra minn hekk, urejna li n-nephrons għandhom it-tendenza li jinsabu fl-ajruplani u jadattaw għall-organizzazzjoni spazjali tal-bastiment. B'mod intriganti, meta applikajna din it-teknika għal mudell ta'mard tal-kliewi ċistika, osservajna li ċ-ċisti jiżviluppaw b'kollox

nephrons, iżda biss f'segmenti speċifiċi. Interessanti, urejna li l-forma taċ-ċisti tvarja skont is-segment tan-nephron, u li tul l-istess nephron, iċ-ċisti jinterkalizzaw ma 'tubuli normali nondilated. B'kollox, dawn ir-riżultati jipprovdu l-ewwel karatterizzazzjoni 3D tal-arranġament spazjali ta 'nephrons u bastimenti u importanti jipprovdu l-bażi għall-fehim ta' proċess patoloġiku, bħaċ-ċistoġenesi.

L-ikklerjar ottiku tal-kliewi huwa ta 'sfida minħabba livelli għoljin ta' awtofluworexxenza u densità taċ-ċelluli. Billi qabblu protokolli ta’ ikklerjar differenti, identifikajna f’BABB teknika qawwija għall-implimentazzjoni tal-viżwalizzazzjoni u r-rikostruzzjoni ta’ strutturi li jinsabu fl-aktar parti fonda tal-kliewi, jiġifieri, il-medulla. Barra minn hekk, BABB huwa rapidu u skalabbli u, ladarba jitneħħa, il-kampjuni jistgħu jinħażnu għal xhur qabel l-akkwist tal-immaġni. Vantaġġ ewlieni ieħor ta 'din it-teknika huwa l-ispiża baxxa tagħha. L-aġenti tal-ikklerjar jistgħu jirriżultaw fi tnaqqis jew tkabbir tal-istrutturi.9–17 Madankollu, minħabba li dawn il-modifikazzjonijiet tad-daqs tal-kliewi huma iżotropiċi, il-kejl relattiv mhux mistenni li jiġi affettwat jew jippreġudika l-interpretazzjoni tagħhom. Waħda mill-limitazzjonijiet l-aktar importanti hija l-annotazzjoni ta 'strutturi li tieħu ħafna ħin. Madankollu, hemm numru dejjem jikber ta’ tekniki bbażati fuq tagħlim profond li għandhom jegħlbu malajr din il-limitazzjoni.

Konsistenti mar-riżultati miksuba minn tekniki klassiċi, l-istudju tagħna wera li n-nephrons ivarjaw fil-forma u t-tul tagħhom skond il-pożizzjoni tagħhom. B'mod partikolari, osservajna li JNs għandhom PTs konvoluti aktar żviluppati u glomeruli akbar u huma 2 darbiet itwal minn SNs. It-tul miżjud huwa r-riżultat ta 'proċess armonjuż minħabba li t-titwil jaffettwa proporzjonalment is-segmenti kollha tan-nephron. Osservajna wkoll li JNs għandhom HL akbar. B'kollox, din id-dejta turi biċ-ċar li l-mikroanatomija ta 'SNs u JNs hija differenti b'mod sinifikanti u li l-MNs juru karatteristiċi intermedji. Interessanti, studji fiżjoloġiċi wrew li n-nephrons huma wkoll funzjonalment differenti.2 L-avvenimenti morfoġenetiċi li huma l-bażi ta 'dawn id-differenzi għadhom mhumiex magħrufa. Għalhekk huwa jitħajjar li wieħed jispekula li l-istruttura partikolari tal-JNs tista' tagħti kunsiderazzjoni għall-ispeċifiċità tal-funzjonijiet tagħhom.

Interessanti, billi pprovdew għall-ewwel darba r-rikostruzzjoni 3D tan-nephrons u l-bastimenti tal-madwar tagħhom, skoprejna restrizzjoni spazjali bejn il-bastimenti arcuate u sottogrupp ta 'nephrons. Għalhekk, huwa konċepibbli li wieħed jaħseb li l-bastimenti jistgħu jiddettaw it-triqnephronsjittawwal matul l-iżvilupp.34,35 L-ispezzjoni tal-forom 3D ta 'nephrons flimkien ma' simulazzjonijiet komputazzjonali wriet ukoll li n-nephrons qatt ma jitħalltu u li kull nephron għandu tendenza li jimtedd fi pjan. Is-sinifikat funzjonali ta' din l-osservazzjoni għad irid jiġi eluċidat.

Żvilupp taċ-ċisti matulmard poliċistiku tal-kliewigħadu proċess intriganti. NPHP, kundizzjoni patoloġika kkaratterizzata mill-iżvilupp taċ-ċisti, hija l-iktar marda ġenetika komuni li tikkawża mard tal-kliewi fl-aħħar stadju fit-tfal u fl-adoloxxenti. S'issa ġew identifikati għoxrin ġene NPHP.36 Fost dawn, NEK8 jikkodifika membru tal-familja kinase relatata ma qatt fil-mitosi A, li għandha rwol fil-funzjoni taċ-ċilja u fil-progressjoni taċ-ċiklu taċ-ċelluli.37 Nek8 kien oriġinarjament ikkaratterizzat bħala l-ġene mutat f' jck mice.32 Notevolment, mutazzjoni fl-istess dominju tal-proteini intweriet li twassal għal NPHP9 fil-bnedmin.38 2D studji ssuġġerew li l-iżvilupp taċ-ċisti jvarja b'mod drammatiku fost il-forom differenti ta' mard poliċistiku tal-kliewi.27,29 B'mod partikolari , f'NPHP, iċ-ċisti jidhru li huma derivati ​​esklussivament minn CD u DCT.31 Għalkemm informattivi, dawn l-istudji immunoistokimiċi ma jistgħux jargumentaw kontra l-possibbiltà li t-telf ta 'markaturi tubulari speċifiċi39 artifiċjalment responsabbli għal din l-osservazzjoni. Għalhekk, l-istudju 3D tagħna jipprovdi l-ewwel evidenza ċara li l-iżvilupp taċ-ċisti huwa proċess li jista 'jinvolvi biss segmenti speċifiċi tan-nephron. Interessanti, għalkemm NIMA (Never In mitosi gene A)-Related Kinase 8 (NEK8) hija espressa fiċ-ċitoplasma tas-segmenti kollha tan-nephron, l-espressjoni tagħha f'cilia hija ristretta għal DCT u CD. Minħabba li dawn is-segmenti biss huma suxxettibbli li jiżviluppaw ċisti,31 nistgħu nippopolaw li t-tfixkil tal-funzjoni ċiljari NEK8 huwa l-avveniment kruċjali għall-formazzjoni taċ-ċisti. B'mod intriganti, osservajna wkoll li ċ-ċisti fusiformi huma f'kontinwità ma 'tubuli normali mhux dilatati. Il-fatt li mutazzjoni reċessiva tal-linja ġerminali twassal għal fenotip patoloġiku f'subsett ta' ċelluli biss jissuġġerixxi li t-tieni avveniment jista' jwassal għall-iżvilupp taċ-ċisti f'dawn iċ-ċelloli, kif issuġġerit għal poliċistiċi awtosomali dominanti.mard tal-kliewi.40,41

Osservajna wkoll li t-tkabbir taċ-ċisti huwa aktar pre dominanti f'JNs milli fl-SNs, għall-inqas meta wieħed iqis iċ-ċisti li jinstabu bejn PT u CNT. B'mod konsistenti, ġie rrappurtat li fil-kuntest tal-glomerulosclerosis, leżjonijiet glomerulari jinstabu b'mod aktar frekwenti f'JNs milli f'SNs.1,21,42 Jekk xogħol żejjed minħabba ż-żieda waħdanephronrati ta 'fifiltrazzjoni glomerulari u attivitajiet ta' trasport / enżimatiċi jammontaw għaż-żieda fis-suxxettibilità ta 'JNs biex jiddeterjoraw hija ipoteżi interessanti li jistħoqqilha aktar investigazzjoni.

Fil-qosor, aħna niddeskrivu teknika ġdida għall-immaġni tal-kliewi fi 3D b'ispeċifiċità u riżoluzzjoni molekulari suffiċjenti biex tirreġistra direttament id-distribuzzjoni spazjali u kwantitattiva ta 'strutturi interni ttikkettjati speċifikament (nephrons, bastimenti, u ċisti). Minħabba l-konvenjenza, il-veloċità, u l-abbiltà għall-kwantifikazzjoni diretta, aħna nantiċipaw li din it-teknika se ssir għodda qawwija biex nifhmu l-patofiżjoloġija tal-kliewi.

Figura 6|Ir-rikostruzzjoni ta 'nephron tridimensjonali (3D) tiżvela li ċ-ċisti jiżviluppaw biss f'segmenti speċifiċi tan-nephron. (a) Immaġini 3D rappreżentattivi b'rendiment tal-volum taċ-ċisti ta 'nephron sħiħ (pannelli tax-xellug) mill-glomeruli sa katusa tal-ġbir fil-kortiċi superfiċjali (blu), kortiċi tan-nofs (aħdar) u reġjun juxtamedullary (aħmar) fil-ġrieden jck. Segmentazzjoni tan-nephron (pannelli tal-lemin) għat-3 tipi differenti ta 'nephrons. Bar ¼ 150 mm. (b) Probabbiltà li jiġu żviluppati ċisti fis-segmenti differenti tan-nephron fil-ġrieden jck. (Ikompli)

Figura 6|(Ikompli) L-assi orizzontali huwa tul normalizzat ta 'nephrons li jikkorrispondi għal 50 bins (tubuli prossimali [PT], lewn; Henle loop [HL], abjad; tubuli konvoluti distali [DCT], roża; tubuli li jgħaqqdu [CNT], isfar) . (c) Immaġini rappreżentattivi ta' rikostruzzjoni taċ-ċisti 3D b'rendi tal-volum taċ-ċisti tar-riġlejn axxendenti ta' HL (pannelli tax-xellug), DCTs (pannelli tan-nofs), u CNTs u kanali tal-ġbir tal-kortiċi (CCDs) (pannelli tal-lemin) f'superfiċjali (pannelli ta 'fuq), tan-nofs (pannelli tan-nofs), u juxtamedullary (pannelli t'isfel) nephrons fil-ġrieden jck. Bar ¼ 50 mm.

METODI

Annimali

Il-proċeduri kollha tal-annimali ġew approvati mis-"Services Vétérinaires de la Préfecture de Police de Paris" u mill-kumitat etiku tal-Université Paris Descartes. Ġrieden FVB/N ta’ xahrejn (n¼ 20) intużaw biex titwaqqaf il-kundizzjoni sperimentali għall-ikklerjar tal-kliewi. L-istudju mbagħad sar f'2-ġrieden maskili jck ta' ġimgħa (n ¼ 4) u sħabi ta' kontroll (n ¼ 3).

Preparazzjoni tat-tessuti tal-kliewi

Qabel il-qtil, il-ġrieden kienu mxerrda, permezz ta 'kateterizzazzjoni intrakardijaka, b'25 ml ta' salina eparinizzata (1000 IU/l) segwit minn 75 ml ta '4 fil-mija paraformaldehyde f'salina buffered b'fosfat (PBS). L-esperimenti saru taħt anestesija ta 'xylazine (Rompun 2 fil-mija, Bayer, Leverkusen, Ġermanja, 6 mg/g ta' piż tal-ġisem) u ketamina (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Franza, 120 mg/g ta 'piż tal-ġisem).

Għal studji ta 'clearing, il-kliewi ġew imwaħħla f'4 fil-mija paraformaldehyde għal 4 sigħat u inkorporati f'4 fil-mija agarose u sezzjonijiet ħxuna ta' 1.5-mm madwar il-hilum renali ġew maqtugħa u maħżuna f'PBS f'4 C.Sezzjonijiet tal-kliewil-ewwel kienu mtebbgħin u mbagħad imneħħija.

Għal studji immunoistokimiċi fuq sezzjonijiet irqaq,kliewiġew iffissati f'4 fil-mija paraformaldehyde matul il-lejl u sezzjonijiet inkorporati fil-paraffifin u 4-mm inqatgħu.

Tbajja

Aċidu perjodiku-tbajja Schiff. Is-sezzjonijiet tal-kliewi ta' 1.5-mm ġew inkubati f'aċidu perjodiku pur jew 1:100 dilwit b'PBS–Schiff għal 5 minuti f'temperatura tal-kamra qabel ma jitneħħew.

Immunoistokimika fuq sezzjonijiet irqaq inkorporati fil-paraffina. Sezzjonijiet ta’ erba’ mikrometri ta’ kliewi inkorporati fil-paraffina ġew imsaħħna għall-irkupru ta’ l-antiġen u inkubati matul il-lejl f’4 C b’lectins akkoppjati ma’ flfluorokrom biex jiġu rintraċċati t-tubuli (agglutinin tal-karawett rhodamine [RL-1072-5] u agglutinin tar-raħs tal-qamħ tar-rhodamine [RL{{{{ 6}}], Vector Laboratories, Burlingame, CA, dilwit f'1:200) u antikorp primarju speċifiku għas-segment biex juri segmenti tubulari distinti (Lotus tetragonolobus lectin bijotinilat [B-1325], Vector Laboratories, dilwit f'1: 100; ġrieden kontra l-Calbindin D28K [D-4], Santa Cruz, Heidelberg, il-Ġermanja, dilwit f'1:200; mogħoż kontra AQP2 [C{-17], Santa Cruz, dilwit f'1:200) . L-għada, is-sezzjonijiet ġew inkubati bl-antikorp sekondarju għal siegħa f'temperatura tal-kamra (Alexa Fluor 488 konjugate [S32354], Invitrogen; antimoat Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; anti-mause Alexa Fluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA; kollha dilwit f'1:500) qabel ma jiġu kkuluriti b'40,6-diamidino-2-phenylindole. L-immaġini kollha ġew akkwistati b'mikroskopju Nikon Eclipse E800 (Champigny sur Marne, Franza) u ppreparati bl-użu ta 'softwer FiJi (verżjoni 1.50).

Tbajja tal-lectin fuq sezzjonijiet ħoxnin. Is-sezzjonijiet tal-kliewi b'ħxuna ta' 1.5-mm ġew inkubati f'temperatura ta' 4 C għal xahar f'lectini akkoppjati bl-isothiocyanate ta' Texas Red jew flfluorescein isothiocyanate: agglutinin tal-karawett (RL-1072-5) u agglutinin tar-raħs tal-qamħ (RL{{6} }), dilwit f'1:100 f'0.1 fil-mija PBS azide u 0.1 fil-mija Triton-X. It-taqsimiet imbagħad inħaslu kuljum għal ġimgħatejn bil-PBS qabel ma jitneħħew.

Clearing ottiku

Għat-tneħħija ta' Skala, sezzjonijiet tal-kliewi ta' 1.5-mm ġew inkubati fi ScaleA2 (4 M urea, 0.1 fil-mija Triton X{-100, 10 fil-mija gliċerol) jew ScaleB4 (8 M urea, 0.1 fil-mija Triton X-100) għal ġimagħtejn, sa sena, f'4 C.

Għall-ikklerjar tal-BABB, sezzjonijiet tal-kliewi ta' 1.5-mm ġew deidratati fi tlaħliħ sekwenzjali ta' etanol f'temperatura tal-kamra. Il-kampjuni mbagħad ġew inkubati f'BABB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) fi proporzjon 1:2 għal mill-inqas jumejn f'4 C.

Akkwist ta 'immaġni ta' mikroskopija b'żewġ fotoni

It-tessuti ġew immaġinati b'ġel milwiema fuq mikroskopju multiphoton invertit (LaVision BioTec) mgħammar b'Laser Mai Tai HP Titanium-Sapphire (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) (Figura Supplimentari S1A). Il-wavelength ta 'eċitazzjoni kien 815 nm fi 8 fil-mija tal-qawwa. Aħna użajna objettiv ta' immersjoni fl-ilma ta' 20 (XLUMPLFL20XW, Olympus [Tokyo, Ġappun]; apertura numerika, 0.95; distanza ta' ħidma, 2.0 mm). Għall-akkwist tal-fluworexxenza, użajna detector mhux deskannjat fi 80 fil-mija b'fifilter bandpass 593/40 nm.

L-ewwel pass kien jikkonsisti f'akkwist ta' immaġni tal-mużajk 2D fin-nofs z-munzell bl-użu ta' parametri ta' akkwist subottimali (400 mm 400 mm u 1011 1011 pixels, b'10 fil-mija koinċidenza u linja b'medja ta' 2) biex tiggwida l-għażla tal-fifields ċentrali l-aktar rilevanti. (Figura Supplimentari S9A). Ladarba l-grid xy u z fifields ta 'interess ġew definiti, il-parametri ġew aġġustati biex jiksbu immaġini ta' kwalità għolja. Tali approċċ naqqas ir-reġjun ta 'interess għal 5 12 fifields kull z munzell. Imbagħad, akkwistajna 850 z munzelli/flieli ottiċi (1-mm daqs tal-pass) madwar il-hilum renali fil-parti tan-nofs tal-sezzjoni tal-kliewi.

Ħjata, ipproċessar u traċċar tal-immaġni

Kull munzell kien bil-madum skond il-metodu żviluppat minn Preibisch et al., 43 li jippermetti l-ħjata ta 'kollezzjoni kbira ta' immaġini bl-użu tal-plugin "Grid/Collection stitching" tas-softwer Fiji (http://fifiji.sc/Fiji) . Minħabba li osservajna bidla importanti bejn 2 immaġini biswit wara l-ħjata, ktibna programm ta 'tqabbil apposta f'Python. Dan il-programm jikkumpensa ċ-ċaqliq tal-immaġini, u jippermettilna li tallinja l-immaġini b'mod korrett (Figura Supplimentari S9B). Immaġini kkoreġuti meħjutin ġew analizzati bl-użu ta 'Imaris verżjoni 8.4.2 (Bitplane, Zurich, l-Isvizzera). It-tubuli u l-bastimenti ġew traċċati bl-użu tal-mod manwali tal-pakkett tal-intraċċar tal-fifilament ta 'Imaris u magħquda minn Imaris Xtension li żviluppajna ma' MATLAB (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Ingħaqad{{12) }} Filament_Tool.zip?dl¼0) (Figura Supplimentari S9C). Glomeruli u ċisti ġew rikostruwiti 3D bl-użu tal-mod manwali tal-pakkett tal-wiċċ ta 'Imaris. L-organizzazzjoni spazjali tal-glomeruli 3D intweriet bl-użu tal-mod manwali tal-pakkett spots ta 'Imaris.

Morfometrija

It-tul tas-segment tubulari, it-tul tan-nephron, u d-dritta ġew determinati bl-użu tal-pakkett ta 'tracer tal-fifilament ta' Imaris. Skont is-softwer Imaris, id-dritta kienet ikkwantifikata bħala l-proporzjon bejn id-distanza bejn 2 punti u t-tul tal-mogħdija tas-segment tan-nephron. Wieħed u tletin PT u 12-il nephrons sħaħ ġew rikostitwiti u mkejla fi 3 ġrieden tat-tip selvaġġ, filwaqt li 37 PT u 17-il nephrons sħaħ ġew rikostitwiti u mkejla f'4 ġrieden jck. Ċisti u

volumi glomerulari ġew determinati bl-użu tal-"pakkett tal-wiċċ" ta' Imaris. Wieħed u tletin u 34 glomeruli ġew imkejla fi ġrieden wild-type u jck, rispettivament. Erbgħa u sebgħin ċisti ġew imkejla b'kollox.

L-angoli "barra mill-pjan" ta 'dawriet tubulari (indikati bħala "beta") ġew imkejla bejn il-pjan (definit minn 3 punti konsekuttivi) u d-direzzjoni bir-raba' punt konsekuttiv li jmiss fl-ispazju (Figura 5b). Biex tevalwa s-sinifikat statistiku tal-preġudizzju osservat, aħna simulajna d-distribuzzjoni ta 'angoli beta b'rotazzjoni każwali ta' angoli beta (simulazzjoni Monte Carlo) fi strutturi li kienu komposti mill-istess segmenti bl-istess sett ta 'angoli alfa.

Għall-kalkolu tal-probabbiltà li tiżviluppa leżjoni ċistika flimkiennephronsegmenti, aħna rappreżentati kull nephron b'sett ta 'punti fl-ispazju. Kull punt kien annotat fir-rigward tal-preżenza ta 'ċisti kontra l-istruttura normali u t-tip ta' segment. Il-probabbiltà f'kull tul standardizzat (settjat għal 50 bins) ġiet ikkalkulata bħala l-proporzjon bejn in-numri ta 'punti b'annotazzjoni ċistika u n-numru totali ta' punti fil-bin.

Għall-kalkolu tal-interdistanza glomerulari medja, ikkunsidrajna għal kull glomerulus l-interdistanza glomerulari medja kkalkulata fuq l-eqreb 5 glomeruli.

Analiżi tad-dejta u statistika

Id-dejta hija espressa bħala SEM medju. Id-differenzi bejn il-gruppi sperimentali ġew evalwati bl-użu ta' analiżi tal-varjanza segwita, meta sinifikanti (P ​​<{{0}}.05), mit-test="" tukey-kramer.="" meta="" tqabblu="" 2="" gruppi="" biss,="" intuża="" t-test="" mann-whitney.="" analiżi="" statistiċi="" saru="" bl-użu="" tas-softwer="" graph="" prism="" (san="" diego,="" ca,="" verżjoni="">

ŻVELAR

L-awturi kollha ddikjaraw l-ebda interessi konkorrenti.

RIKONOXXIMENTI

Nirringrazzjaw lill-Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese (LEAT), Histology and Imaging Platforms of Structure Federative de Recherche Necker għall-assistenza teknika. Nirringrazzjaw lil Pierre Isnard, Marie-Claire Gubler, u Nicolas Kuperwasser għall-qari kritiku tal-manuskritt. Dan ix-xogħol kien appoġġjat minn Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de la Recherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Min jien, Roche Pharma Riċerka u Żvilupp Bikri (Basel , l-Isvizzera), u l-Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Pariġi, Franza).

KONTRIBUZZJONIJIET TA' L-AWTUR

TB, NG, u MZ iddisinjaw u wettqu l-esperimenti u analizzaw id-dejta. FB, LT, MGT, u SG wettqu wkoll xi esperimenti u analizzaw id-dejta. MB u CN wettqu l-esperimenti tal-ġurdien. TB u MZ ikkontribwew ukoll għall-kitba tal-manuskritt. GF irreveda l-manuskritt. FT u MP ipprovdew il-qafas kunċettwali u ddisinjaw l-istudju, issorveljaw il-proġett, u kitbu l-karta.

cistanche jista 'tonify kliewi

MATERJAL SUPPLIMENTARI

Fajl Supplimentari (PDF)

Figura S1. Setup sperimentali, proċedura ta 'akkwist, u proċessar ta' immaġni.

Figura S2. Limiti tas-sinjal awtofluworexxenti f'riżoluzzjonijiet xy u z.

Figura S3. Immaġini bidimensjonali tat-tranżizzjoni bejn PT u TL fuq sezzjonijiet tal-kliewi inkorporati fil-paraffina ta' 4-mm.

Figura S4. Immaġini bidimensjonali tat-tranżizzjoni bejn TAL u DCT fuq sezzjonijiet tal-kliewi inkorporati fil-paraffina ta' 4-mm.

Figura S5. Immaġini bidimensjonali tat-tranżizzjoni bejn DCT u CNT fuq sezzjonijiet tal-kliewi ta' 4-mm inkorporati fil-paraffin.

Figura S6. Rikostruzzjoni tridimensjonali tiżvela 3 forom differenti ta 'tubuli prossimali.

Figura S7. Rikostruzzjoni tridimensjonali tiżvela li t-tul u s-segmentazzjoni tan-nephrons mhumiex affettwati minn ċisti.

Figura S8. Densità tal-glomeruli fil-kontroll u kliewi ċistika.

Figura S9. Proċedura ta' akkwist u proċessar ta' immaġni ta' wara t-trattament.

Tabella S1. Tqabbil tal-metodi tal-ikklerjar. Fajl Supplimentari (Films)

Film S1. It-tebgħa tal-lectin ittejjeb b'mod notevoli r-riżoluzzjoni u l-proporzjon tas-sinjal għall-isfond.

Film S2. Traċċar tal-mogħdija ta 'tubuli.

Film S3. Rikostruzzjoni tridimensjonali ta 'kilwa mneħħija li turi l-junction bejn it-tubuli prossimali u r-riġlejn irqiq tal-linja Henle.

Film S4. Rikostruzzjoni tridimensjonali ta 'kilwa mneħħija li turi l-junction bejn il-parti oħxon axxendenti tal-linja Henle u t-tubuli konvolut distali.

Film S5. Rikostruzzjoni tridimensjonali ta 'kilwa mneħħija li turi l-junction bejn it-tubuli konvoluti distali u t-tubuli li jgħaqqdu.

Film S6. Il-forma u d-daqs tat-tubuli prossimali jvarjaw skond il-fond tagħhom.

Film S7. Rikostruzzjoni ta 'nephron tridimensjonali fil-ġrieden ta' kontroll.

Film S8. It-traċċar tal-mogħdija ta' bastiment minn bastiment arkuat għal bastiment radjat kortikali.

Film S9. Il-bastimenti arkuati jimmudellaw il-forma tat-tubuli prossimali juxtamedullary.

Film S10. Nephrons għandhom tendenza li jimteddu fi pjan.

Film S11. Rikostruzzjoni ta 'nephron tridimensjonali turi mudell speċifiku għall-iżvilupp taċ-ċisti.

Film S12. Is-segmentazzjoni tridimensjonali tan-nephron turi li ċ-ċisti jiżviluppaw f'segmenti speċifiċi tan-nephron.

Film S13. Arranġament spazjali u interrelazzjoni ta 'nephrons u bastimenti f'kilwa poliċistika

REFERENZI

1. Rich AR. Vulnerabilità mhux deskritta s'issa tal-glomeruli juxtamedullary fin-nefrożi tal-lipojdi. Bull Johns Hopkins Hosp. 1957;100:173–186.

2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. Eteroġeneità ta 'anatomija nephron. Kidney Int Suppl. 1987;20:S25–S39.

3. Christensen EI, Grann B, Kristoffersen IB, et al. Rikostruzzjoni tridimensjonali tan-nephron tal-firien. Am J Physiol Physiol. 2014;306:F664–F671.

4. Zhai XY, Birn H, Jensen KB, et al. Rikostruzzjoni diġitali tridimensjonali u ultrastruttura tat-tubuli prossimali tal-ġurdien. J Am Soc Nephrol. 2003;14:611–619.

5. Zhai XY, Thomsen JS, Birn H, et al. Rikostruzzjoni tridimensjonali tan-nephron tal-ġurdien. J Am Soc Nephrol. 2006;17:77–88.

6. Puelles VG, Moeller MJ, Bertram JF. Nistgħu naraw b'mod ċar issa: clearing ottiku u morfometrija tal-kliewi. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2017;26:179–186.

7. Seo J, Choe M, Kim SY. Tekniki ta' clearing u tikkettar għal tessuti bijoloġiċi fuq skala kbira. Ċelluli Mol. 2016;39:439–446.

8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. Leipzig, il-Ġermanja: S. Hierzel; 1914.

9. Hama H, Kurokawa H, Kawano H, et al. Skala: approċċ kimiku għal immaġini ta 'fluworexxenza FL u rikostruzzjoni ta' moħħ tal-ġurdien trasparenti. Nat Neurosci. 2011;14:1481–1488.

10. Ertürk A, Becker K, Jährling N, et al. Immaġini tridimensjonali ta 'organi mneħħija bis-solvent bl-użu ta' 3DISCO. Nat Protoc. 2012;7:1983–1995.

11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P, et al. ClearT: metodu ta 'clearing mingħajr deterġent u solvent għal tessut newronali u mhux newronali. Żvilupp. 2013;140:1364–1368.

12. Ke MT, Imai T. Clearing ottiku ta 'kampjuni tal-moħħ fifissi bl-użu ta' SeeDB. Curr Protoc Neurosci. 2014;66:2.22.1–2.22.19.

13. Chung K, Deisseroth K. CLARITY għall-immappjar tas-sistema nervuża. Metodi Nat. 2013;10:508–513.

14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. CLARITY Avvanzata għal immaġni rapida u b'riżoluzzjoni għolja ta 'tessuti intatti. Nat Protoc. 2014;9:1682–1697.

15. Yang B, Treweek JB, Kulkarni RP, et al. Fenotipi ta' ċellula waħda fi ħdan tessut intatt trasparenti permezz ta' clearing tal-ġisem kollu. Ċellula. 2014;158: 945–958.

16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, et al. Immaġini tal-moħħ kollu b'riżoluzzjoni ta 'ċellula waħda bl-użu ta' cocktails kimiċi u analiżi komputazzjonali. Ċellula. 2014;157:726–739.

17. Alaentalo T, Asayesh A, Morrison H, et al. Immaġini molekulari tomografiċi u kwantifikazzjoni 3D fi ħdan organi tal-ġurdien adulti. Metodi Nat. 2007;4:31–33.

18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP, et al. Mikroskopija multifoton ta' organi tal-ġurdien ikklerjati. J Biomed Opt. 2010;15:036017.

19. Renier N, Wu Z, Simon DJ, et al. iDISCO: metodu sempliċi u rapidu biex immunolatikkettjar kampjuni kbar tat-tessuti għall-immaġni tal-volum. Ċellula. 2014;159: 896–910.

20. Lee H, Park JH, Seo I, et al. Applikazzjoni mtejba tat-teknoloġija tal-ikklerjar tat-tessuti elettroforetiċi, CLARITY, għal organi solidi intatti inklużi l-moħħ, il-frixa, il-fwied, il-kliewi, il-pulmun u l-imsaren. BMC Dev Biol. 2014;14:1–7.

21. Iversen BM, Amann K, Kvam FI, et al. Żieda fil-pressjoni kapillari glomerulari u d-daqs medjatur glomerulosclerosis fil-kortiċi juxtamedulari SHR. Am J Physiol Physiol. 1998;274:F365–F373.

22. Angelotti ML, Antonelli G, Conte C, Romagnani P. Imaging the kidney: from light to super-resolution microscopy. Nephrol Dial Trapjant. 2021;36:19–28.

23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al. Validazzjoni ta' metodu tridimensjonali għall-għadd u d-daqs tal-podoċiti fi glomeruli sħaħ. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3093–3104.

24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. Rwol ta 'arkitettura tridimensjonali fil-mekkaniżmu li jikkonċentra l-awrina tal-medulla interna tal-kliewi tal-firien. Am J Physiol Physiol. 2008;295:F1271–F1285.

25. Saritas T, Puelles VG, Su XT, et al. L-ikklerjar ottiku fil-kliewi juri remodeling tat-tubuli medjat mill-potassju. Ċellula Rep 2018;25:2668–2675.e3.

26. Schuh CD, Polesel M, Platonova E, et al. Immaġini strutturali u funzjonali kkombinati tal-kliewi jiżvelaw differenzi assjali kbar fl-endoċitosi tat-tubuli prossimali. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2696–2712.

27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopathies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017;9:a028191.

28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, et al. Mard poliċistiku tal-kliewi. Nat Rev Dis Prim. 2018;4:50.

29. Wilson PD. Mard poliċistiku tal-kliewi. N Engl J Med. 2004;350:151–164.

30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Bidliet fil-mudell ta 'glycosylation matul l-iżvilupp embrijoniku tal-kliewi tal-ġurdien kif żvelat b'konjugati tal-lectin. J Histochem Cytochem. 1987;35:55–65.

31. Smith LA, Bukanov NO, Husson H, et al. Żvilupp ta 'mard tal-kliewi poliċistiċi fil-ġrieden tal-kliewi ċistiċi minorenni: għarfien dwar patoġenesi, anormalitajiet ċiljari, u karatteristiċi komuni mal-mard tal-bniedem. J Am Soc Nephrol. 2006;17:2821–2831.

32. Liu S, Lu W, Obara T, et al. Difett f'kinase ġdida tal-familja Nek jikkawża mard tal-kliewi ċistika fil-ġurdien u fiż-żebrafish. Żvilupp. 2002;129:5839–5846.

33. Franke M, Baeßler B, Vechtel J, et al. Immappjar ta 'reżonanza manjetika T2 u immaġini b'piż diffużjoni għal skoperta bikrija ta' ċistoġenesi u rispons għal terapija f'mudell tal-ġurdien ta 'mard poliċistiku tal-kliewi. Kidney Int. 2017;92:1544–1554. 34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B, et al. Determinanti molekulari ta 'speċjalizzazzjoni vaskulari nephron fil-kliewi. Nat Commun. 2019;10: 5705.

35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Komunikazzjoni endoteljali-epiteljali f'mard tal-kliewi poliċistiku: rwol tas-sinjalar tal-fattur tat-tkabbir endoteljali vaskulari. Sinjal taċ-Ċellola. 2020;72:109624.

36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. Ħafna ġeni-marda waħda? Ġenetika ta 'nephronophthisis (NPHP) u disturbi assoċjati ma' NPHP. Front Pediatr. 2017;5:287.

37. Fry AM, O'Regan L, Sabir SR, Bayliss R. Ir-regolazzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelluli mill-familja NEK ta 'protein kinases. J Cell Sci. 2012;125:4423–4433.

38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss UT, et al. Mutazzjonijiet NEK8 jaffettwaw il-lokalizzazzjoni ċiljari u ċentriżomali u jistgħu jikkawżaw nephronophthisis. J Am Soc Nephrol. 2008;19:587–592.

39. Wilson PD. Polarità apiko-bażali fl-epitelja tal-mard poliċistiku tal-kliewi. Biochim Biophys Acta. 2011;1812:1239–1248.

40. Happé H, Leonhard WN, van der Wal A, et al. Korriment tubulari tossiku fil-kliewi minn ġrieden tat-tħassir ta' Pkd1-taċċellera ċ-ċistoġenesi akkumpanjata minn polarità ċellola planari disregolata u mogħdijiet ta' sinjalazzjoni Wnt kanoniċi. Hum Mol Genet. 2009;18: 2532–2542.

41. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, et al. Swiċċ ta 'żvilupp kritiku jiddefinixxi l-kinetika tal-formazzjoni taċ-ċisti fil-kliewi wara telf ta' Pkd1. Nat Med. 2007;13:1490–1495.

42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. Mekkaniżmu tas-suxxettibilità unika ta 'glomeruli kortikali fil-fond ta' kliewi li jimmaturaw għal sklerożi glomerulari fokali severa. Pediatr Res. 1990;28:270–276.

43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomancak P. Ħjata ottimali globalment ta 'akkwisti ta' immaġni mikroskopiċi 3D bil-madum. Bijoinformatika. 2009;25: 1463–1465.