L-attivazzjoni ta' TLR9 Induċi Glycosylation IgA Aberranti permezz ta' Mogħdijiet medjati minn APRIL- U IL-6 fin-Nefropatija IgA
Mar 11, 2022
Kuntatt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Yuko Makita1 , Hitoshi Suzuki1 , Toshiki Kano1 , Akiko Takahata1 , Bruce A. Julian2,3 , Jan Novak3 u Yusuke Suzuki1
KELMI EWLENIN: APRIL; IgA1 defiċjenti ta' galactose; nefropatija IgA; IL-6; kumpless immuni
IgA1 defiċjenti ta’ galattożju (Gd-IgA1) għandu rwol kruċjali fl-iżvilupp ta’Nefropatija IgA(IgAN). Madankollu, il-mekkaniżmi patoġeniċi li jmexxu l-produzzjoni ta 'Gd-IgA1 ma ġewx ċari għal kollox. Attivazzjoni innata-immuni permezz tar-riċettur Toll-like 9 (TLR9) hija magħrufa li hija involuta fil-produzzjoni ta 'Gd-IgA1. Ligand li jinduċi l-proliferazzjoni (APRIL) u IL-6 huma magħrufa wkoll li jtejbu s-sintesi ta' Gd-IgA1 f'IgAN. B'dan bħala sfond, investigajna kif l-attivazzjoni ta' TLR9 fiċ-ċelluli li jnixxu l-IgA tirriżulta fi produzzjoni żejda ta' IgA nefritoġenika fil-ġurdien ddY suxxettibbli għal IgAN u fiċ-ċelloli umani li jissekretaw IgA1-. L-injezzjoni tal-ligand TLR9 CpG-oligonukleotidi żiedet il-produzzjoni ta 'kumplessi immuni IgA u IgG-IgA glikosilati b'mod aberranti fil-ġrieden ddY li, imbagħad, aggravawkorriment fil-kliewi. Ġrieden stimulati minn CpG-oligonukleotidi kellhom livelli elevati tas-serum ta 'APRIL li kkorrelataw ma' dawk ta 'kumplessi immuni IgA u IgG-IgA glikosilati b'mod aberranti. In vitro,Attivazzjoni TLR9tejbet il-produzzjoni tal-IgA nefritoġenika kif ukoll APRIL u IL-6 fi splenoċiti tal-ġrieden ddY u fiċ-ċelloli umani li jxerrdu l-IgA1-. Madankollu, il-knock-down ta 'siRNA ta' APRIL irażżan kompletament il-produzzjoni żejda ta 'Gd-IgA1 indotta minn IL-6. In-newtralizzazzjoni ta' IL-6 naqqset il-produzzjoni żejda ta' Gd-IgA1 indotta minn CpG-oligonucleotide. Barra minn hekk, il-mogħdijiet APRIL u IL-6 kull wieħed medjat b'mod indipendenti TLR9-indotta produzzjoni żejda ta' Gd-IgA1. Għalhekk, l-attivazzjoni ta 'TLR9 tejbet is-sintesi ta' IgA glikosilata b'mod aberranti li, f'mudell tal-ġurdien ta 'IgAN, tejbet aktar il-ħsara fil-kliewi. Għalhekk, APRIL u IL-6 b'mod sinerġiku, kif ukoll b'mod indipendenti, itejbu s-sintesi ta' Gd-IgA1.
Dikjarazzjoni Translazzjonali
Terapija speċifika għall-mard li timmira IgA1 defiċjenti ta’ galactose tista’ tikkostitwixxi trattament futur ta’Nefropatija IgA. Ir-riżultati minn dan l-istudju, li wrew l-involviment ta’ ligand li jinduċi l-proliferazzjoni (APRIL) u interleukin-6 (IL{-6) fil-produzzjoni żejda ta’ IgA glikosilata b’mod aberranti, jappoġġjaw ir-raġuni għall-immirar ta’ APRIL u IL{ {3}} fin-nefropatija IgA (IgAN). Fil-fatt, studju reċenti wera effetti pożittivi tal-antikorp monoklonali anti-APRIL f'IgAN murini,1 u studju kliniku b'antikorp newtralizzanti APRIL bħalissa għaddej f'pazjenti b'IgAN.
Nefropatija IgA (IgAN), l-aktar glomerulonefrite primarja komuni,2 tikkawża mard tal-kliewi fl-aħħar stadju f'20 fil-mija sa 40 fil-mija tal-pazjenti fi żmien 20 sena wara l-bidu ta 'din il-marda. ematurja makroskopika fl-istess ħin ma' infezzjoni tal-passaġġ respiratorju ta' fuq tissuġġerixxi li s-sistema immuni tal-mukuża għandha rwol importanti fil-manifestazzjonijiet kliniċi ta' IgAN.4
Cistanchetubulosajipprevjenikliewimard, ikklikkja hawn biex tikseb il-kampjun
Glikosilazzjoni aberranti ta 'IgAhuwa ċentrali fil-patoġenesi ta 'IgAN. IgA glomerulari f'pazjenti b'IgAN hija ristretta għas-subklassi IgA1 u hija arrikkita għal molekuli li għandhom xi O-glycans tar-reġjun taċ-ċappetta defiċjenti fil-galactose (IgA1 [Gd-IgA1] defiċjenti fil-galactose).5,6 Barra minn hekk, il-livelli tas-serum ta' Gd -IgA1 u IgA1-li fihomkumplessi immuni(ICs) b'awtoantikorpi speċifiċi għal Gd-IgA1 huma elevati f'pazjenti b'IgAN.7-9 Madankollu, il-mekkaniżmi għall-produzzjoni ta 'Gd-IgA1 għadhom mhumiex mifhuma bis-sħiħ.
Aħna użajna l-mudell tal-ġurdien ddY suxxettibbli għal IgAN f'dan l-istudju. Il-ġrieden ddY jiżviluppaw korrimenti glomerulari li jimitaw dawk tal-bnedmin b'IgAN.10 Għalkemm il-ġrieden m'għandhomx molekuli IgA b'O-glycans tipiċi għall-IgA1 tal-bniedem, l-IgAN uman u dan il-mudell tal-ġurdien ddY suxxettibbli għal IgAN jaqsmu xi karatteristiċi speċifiċi għall-mard, bħall-elevazzjoni tas-serum. ta 'IgA u IgG-IgA aberranti glikosilati IC.6,11 Fil-fatt, glikosilazzjoni IgA aberranti minħabba defiċjenza ta' b1,4-galactosylation ta 'N-glycans jinduċi IgAN murina minħabba l-elevazzjoni tal-livelli tas-serum ta' piż molekulari għoli IC li fihom IgA u IgA bid-depożizzjoni tal-kliewi sussegwenti tagħhom u l-ħsara glomerulari.12 ġrieden ddY juru proteinurja u glomerulonefrite proliferattiva mesanġjali b'ko-depożizzjoni ta 'IgA u C3 fil-glomeruli. Studju ta’ assoċjazzjoni mal-ġenoma kollu identifika loci kandidati marbuta mal-progressjoni ta’ IgAN fil-ġrieden ddY.13 Il-loċi jinkludu ġeni funzjonalment simili għal dawk assoċjati ma’ IgAN uman.14,15 Dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li IgAN fil-ġrieden ddY u fil-bnedmin jistgħu jiġu affettwati. mill-inqas parzjalment mill-istess ġeni ta’ suxxettibbiltà. Għalkemm il-karatteristiċi molekulari ta 'l-IgA murina u l-IgA1 umana huma differenti, l-IgA glycosylated b'mod aberranti għandu t-tendenza li jiffurmaw ICs polimeriċi IgA u IgG-IgA li sussegwentement imexxu l-progressjoni tal-ħsara renali fil-mudell murini ddY ta' IgAN, kif ukoll f'IgAN uman. Għalhekk il-mudell tal-ġrieden ddY għandu xi karatteristiċi komuni ma 'IgAN uman u jista' jkun għodda utli għall-analiżi ta 'karatteristiċi patoġenetiċi varji ta' IgAN.
Toll-like receptors (TLRs) huma molekuli ewlenin fis-sistema immuni intrinsika u ġew implikati fil-patoġenesi ta’ IgAN.16–20 Antiġeni eżoġeni derivati minn patoġeni jattivaw il-passaġġ tas-sinjalar TLR9-MyD88.21 Dan il-proċess iwassal għal żiedet b'mod sinifikanti s-sintesi ta' ċitokini infjammatorji, bħal interferon tat-tip 1 u interleukin-6 (IL{-6).22 Riċentement urejna li l-attivazzjoni ta' TLR9 aggravatkorriment fil-kliewifi ġrieden ddY suxxettibbli għal IgAN, b'elevazzjoni tal-livelli tas-serum ta' IgA u IgG-IgA ICs.16 Barra minn hekk, polimorfiżmi speċifiċi TLR9 huma assoċjati mal-progressjoni tal-marda f'pazjenti b'IgAN.16 Livelli fis-serum ta 'fattur ta' nekrożi tat-tumur-a u IL{{ 6}} huma elevati f'pazjenti b'IgAN.23 Barra minn hekk, IL-6 u IL-4 iżidu l-produzzjoni ta' IgA1 u jaċċentwaw il-grad ta' defiċjenza ta' galactose, u jżidu s-sintesi ta' Gd-IgA1 minn IgA{{13} }tnixxija ta' linji ta' ċelluli minn pazjenti b'IgAN.24 Dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li IL-6 jista' jkun medjatur ewlieni ta' dan il-proċess.24,25.
Il-ġene tal-membru tas-superfamilja ligand tal-fattur tan-nekrożi tat-tumur 13 (TNFSF13) jikkodifika ligand li jinduċi l-proliferazzjoni (APRIL) li huwa ċitokin ċentrali għall-maturazzjoni u s-sopravivenza taċ-ċelluli B.26 APRIL jaqsam xi riċetturi ta’ sinjalazzjoni importanti għall-iżvilupp taċ-ċelluli B ma’ ieħor. Ligand superfamilja TNF, fattur attivatur taċ-ċelluli B (BAFF). BAFF huwa involut ukoll fil-maturazzjoni tal-affinità taċ-ċelluli B. Studju ta’ assoċjazzjoni mal-ġenoma kollu identifika lil TNFSF13 bħala wieħed mill-ġeni kandidati assoċjati ma’ IgAN.27 Tabilħaqq, f’pazjenti b’IgAN, il-livelli fis-serum ta’ APRIL huma elevati28 u l-livelli huma assoċjati ma’ pronjosi renali.28
Biex niksbu għarfien aħjar tal-mekkaniżmi sottostanti involuti fil-produzzjoni żejda ta 'IgA glikosilata b'mod aberranti permezz ta' attivazzjoni TLR9 mill-ligand CpG oligodeoxynucleotides (ODNs), użajna ġrieden ddY suxxettibbli għal IgAN u ċelluli umani li jxerrdu IgA1-.
RIŻULTATI
L-attivazzjoni ta’ TLR9 aggravat il-ħsara renali fil-ġrieden ddY permezz ta’ żieda fil-produzzjoni ta’ IgA nefritoġenika
TLR9 jista 'jiġi attivat mil-ligands korrispondenti, bħal CpG-ODN. Biex tittestja l-effett tal-attivazzjoni ta 'TLR9 f'mudell murin ta' IgAN, użajna injezzjoni tal-ligand fi ġrieden ddY suxxettibbli għal IgAN. Ġrieden injettati b'CpG-ODN żviluppaw proliferazzjoni mezanġjali u espansjoni tal-matriċi extraċellulari (Figura 1a). Il-punteġġi istoloġiċi renali bbażati fuq il-proliferazzjoni tal-mesanġjali u l-espansjoni tal-matriċi tal-mesanġjali fil-ġrieden injettati b'CpG-ODN kienu ogħla b'mod sinifikanti minn dawk fil-ġrieden tal-kontroll (P <0.01; figura="" 1a).="" il-livelli="" ta'="" albumina="" urinarja="" fil-ġrieden="" injettati="" b'cpg-odn="" kienu="" elevati="" b'mod="" sinifikanti="" meta="" mqabbla="" ma'="" dawk="" tal-ġrieden="" ta'="" kontroll="" (p=""><0.{{20}}1; figura="" 1a).="" il-ġrieden="" biss="" injettati="" b'cpg-odn="" żviluppaw="" depożiti="" mezanjali="" ta="" 'iga,="" igg,="" u="" jikkumplimentaw="" c3="" (figura="" 1b).="" ġrieden="" injettati="" b'cpg-odn="" urew="" livelli="" ogħla="" ta'="" iga="" (p="">< 0.01)="" u="" igg="" (p="">< 0.01)="" fis-serum="" minn="" dawk="" ta'="" kontroll="" (figura="" 1c).="" iga="" fis-serum="" minn="" ġrieden="" injettati="" bi="" ġrieden="" cpg-odn="" kellhom="" reattività="" aktar="" baxxa="" ma="" 'ricinus="" communis="" agglutinin-i="" (rca-i)="" u="" sambucus="" nigra="" agglutinin="" lectins="" minn="" dak="" minn="" ġrieden="" ta'="" kontroll="" (figura="" 1c),="" li="" jindika="" kontenut="" aktar="" baxx="" ta="" 'galactose="" u="" aċidu="" sialiku="" fuq="" n.="" -glycans="" ta'="" iga="" murina.="" barra="" minn="" hekk,="" il-livell="" tas-serum="" ta="" 'igg-iga="" ic="" fil-ġrieden="" injettati="" b'cpg-odn="" kien="" ogħla="" b'mod="" sinifikanti="" minn="" dak="" fil-ġrieden="" ta'="" kontroll="" (p=""><0.05; figura="" 1c).="" dawn="" is-sejbiet="" indikaw="">Attivazzjoni TLR9minn CpG-ODN irriżulta fil-produzzjoni żejda ta 'IgA u IgG-IgA IC glikosilati b'mod aberranti, li wasslu għalkumplessi immunidepożizzjoni u korriment renali.
Iċ-ċelloli B u ċ-ċelloli dendritiċi kienu involuti fir-risponsi CpG-ODN
Aħna investigajna liema tipi ta 'ċelluli huma involuti fl-induzzjoni ta' produzzjoni żejda ta 'IgA glycosylated b'mod aberranti b'rispons għal CpG-ODN. Iċ-ċelloli B u ċ-ċelloli dendritiċi (DCs) ġew iżolati mill-milsa tal-ġrieden ddY bl-użu ta 'antikorpi CD19 u CD11c kontra l-ġurdien permezz ta' għażla taċ-ċelluli attivati bil-fluworexxenza FL, rispettivament. L-istimulazzjoni CpG-ODN ta 'ċelluli B iżolati indotta produzzjoni żejda ta' IgA. Barra minn hekk, CpG-ODN żied b'mod sinifikanti l-produzzjoni ta 'IgA meta ċ-ċelluli B kienu kkultivati flimkien ma' DCs (Figura Supplimentari S1). Dawn ir-riżultati ssuġġerew li CpG-ODN attivat direttament iċ-ċelluli B u li d-DCS tejbet aktar il-produzzjoni ta 'IgA mal-attivazzjoni ta' TLR9.
Produzzjoni eċċessiva ta' sinteżi msaħħa APRIL ta' ICs IgA u IgG-IgA glikosilati b'mod aberranti
Aħna vvalutajna jekk APRIL u/jew BAFF kinux involuti fis-sintesi ta 'IgA nefritoġenika indotta mill-attivazzjoni ta' TLR9. Injezzjoni ta 'CpG-ODN fil-ġrieden ddY elevati b'mod sinifikanti l-livelli tas-serum ta' APRIL u BAFF (Figura 2a). Livelli ta 'espressjoni ta' APRIL fl-isplenoċiti kkorrelati mal-produzzjoni ta 'IgA glycosylated b'mod aberranti u formazzjoni ta' IgG-IgA IC (Figura 2b). Livelli ta 'espressjoni ta' BAFF fl-isplenoċiti kkorrelati mal-produzzjoni ta 'IgA glycosylated aberranti iżda mhux mal-formazzjoni ta' IgG-IgA IC (Figura 2b). Barra minn hekk, il-livelli tas-serum ta 'APRIL iżda mhux BAFF ikkorrelataw b'mod sinifikanti ma' livelli tas-serum elevati ta 'IgA u IgG-IgA IC glikosilati b'mod aberranti fil-ġrieden injettati b'CpG-ODN (Figura 2c). Dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li kemm APRIL kif ukoll BAFF jistgħu jkunu involuti fil-produzzjoni ta 'IgA glycosylated b'mod aberranti, għalkemm APRIL jista' jkun aktar involut fil-produzzjoni ta 'IgG-IgA IC.
Figura 1|Produzzjoni indotta mill-istimulazzjoni CpG-oligodeoxynucleotide (ODN) ta 'IgA nefritoġenika. Injezzjoni b'CpG-ODN żiedet il-livelli tad-demm ta 'kumpless immuni IgA u IgG-IgA glikosilati b'mod aberranti (IC) u aggravat ħsara fil-kliewi fil-ġrieden ddY. (a) ġrieden ddY qabel l-iżvilupp taNefropatija IgA(IgAN) ġew injettati ip b'CpG-ODN tliet darbiet fil-ġimgħa għal 12-il ġimgħa. F'analiżi istoloġika ta 'leżjonijiet glomerulari, ġrieden injettati b'CpG-ODN urew proliferazzjoni taċ-ċelluli mesanġjali u espansjoni tal-matriċi extraċellulari. Il-pannell tal-lemin juri l-evalwazzjoni ta 'korrimenti renali permezz ta' punteġġ semikwantitattiv. Punteġġi istoloġiċi renali, evalwati b'perċentwali ta' glomeruli bil-leżjonijiet imsemmija hawn fuq, urew li l-ħsara fil-kliewi fil-ġrieden injettati b'CpG-ODN kienet aggravata. Livelli ta 'albumina urinarja fil-ġrieden injettati b'CpG-ODN kienu elevati b'mod sinifikanti meta mqabbla ma' dawk tal-ġrieden ta 'kontroll. Bars fil-pannelli tal-qiegħ ¼ tfisser ± SEM. (b) Analiżi immunoistokimika tad-depożiti glomerulari IgA, IgG, u C3. Ġrieden biss injettati b'CpG-ODN żviluppaw depożiti mezanjali ta 'IgA, IgG, u C3. (c) Il-livelli tas-serum ta 'IgA, IgG, u IgG-IgA ICs żdiedu b'mod sinifikanti wara trattament CpG-ODN għal 12-il ġimgħa. IgA fis-serum fil-ġrieden injettati b'CpG-ODN wera reattività aktar baxxa b'mod sinifikanti ma' lectins ta' Ricinus communis agglutinin-I (RCA-I) u Sambucus nigra agglutinin (SNA) milli għamlet IgA fil-ġrieden ta 'kontroll. Dawn ir-riżultati jindikaw li l-injezzjoni ta 'CpG-ODN żiedet il-livelli tas-serum ta' IgA glycosylated b'mod aberranti. Punti individwali huma murija. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01.="" od,="" densità="" ottika.="" biex="" tottimizza="" l-wiri="" ta="" 'din="" l-immaġni,="" jekk="" jogħġbok="" ara="" l-verżjoni="" onlajn="" ta'="" dan="" l-artikolu="" fuq="">
Figura 2|Il-korrelazzjoni bejn il-produzzjoni żejda ta 'ligand li jinduċi l-proliferazzjoni (APRIL) u IgA glycosylated b'mod aberranti fil-ġrieden injettati b'CpG-oligodeoxynucleotide (ODN). (a) L-injezzjoni ta 'ġrieden ddY b'CpG-ODN żiedet il-livelli tas-serum ta' fattur attivatur taċ-ċelluli B (BAFF) u APRIL. (b) Il-livelli ta 'espressjoni ta' BAFF fl-isplenoċiti sħaħ ikkorrelataw ma 'reattività mnaqqsa ma' lectin Ricinus communis agglutinin-I (RCA-I) iżda ma kkorlatawx mal-formazzjoni tal-kumpless immuni IgG-IgA (IC). Sadanittant, il-livelli ta 'espressjoni ta' APRIL kienu assoċjati mal-produzzjoni ta 'IgA glycosylated b'mod aberranti u l-formazzjoni ta' IgG-IgA IC. (c) Fil-ġrieden injettati b'CpG-ODN, il-livelli tas-serum ta 'APRIL kienu assoċjati ma' reattività mnaqqsa ta 'IgA ma' lectin RCA-I u livelli elevati ta 'IgG-IgA IC. Il-livelli tas-serum ta' BAFF ma kinux jikkorrelataw mal-produzzjoni ta' IgA glycosylated u l-formazzjoni ta' IgG-IgA IC. Bars ¼ medja - SEM. *P < 0.05.="" od,="" densità="">
IL-6 indotta produzzjoni ta' IgA glikosilata b'mod aberranti
Livelli tas-serum ta 'IL{{0}} fil-ġrieden injettati b'CpG-ODN kienu ogħla b'mod sinifikanti meta mqabbla mal-ġrieden ta' kontroll (P <0.05; figura="" 3a).="" bl-użu="" ta'="" splenoċiti="" ta'="" ġrieden="" ddy="" suxxettibbli="" għal="" igan,="" eżaminajna="" jekk="" attivazzjoni="" ċellulari="" indotta="" minn="" tlr9-u="" produzzjoni="" żejda="" ta'="" iga="" glikosilata="" b'mod="" aberranti="" kinux="" medjati="" minn="" il-6.="" l-istimulazzjoni="" cpg-odn="" tejbet="" il-produzzjoni="" ta'="" il-6="" mill-isplenoċiti="" in="" vitro.="" iż-żieda="" ta'="" il-6="" mal-mezz="" ta'="" kultura="" ta'="" splenoċiti="" żiedet="" il-produzzjoni="" ta'="" iga.="" barra="" minn="" hekk,="" il-6="" tejbet="" is-sinteżi="" ta="" 'iga="" glikosilata="" b'mod="" aberranti="" u="" l-formazzjoni="" ta'="" igg-iga="" ic="" u="" żiedet="" il-produzzjoni="" ta="" 'april="" (figura="" 3a).="" il-6–antikorp="" newtralizzanti="" mnaqqas="" cpg-odn–="" indott="" iga="" totali,="" produzzjoni="" ta="" 'iga="" glikosilata="" b'mod="" aberranti,="" u="" formazzjoni="" ta'="" igg-iga="" ic="" (figura="" 3b).="" dawn="" is-sejbiet="" jindikaw="" li="" l-attivazzjoni="" tat-tlr9="" kienet="" medjata,="" għall-inqas="" parzjalment,="" minn="" il-="" 6.="" barra="" minn="" hekk,="" passaġġ(i)="" ieħor="" medjat(i)="" minn="" tlr9-jistgħu="" jkunu="" involuti="" fil-produzzjoni="" ta'="" iga="" glikosilata="" b'mod="">
cistanchejistgħu jitjiebukliewifunzjoni
APRIL u IL-6 tejbu s-sinteżi ta' Gd-IgA1 fiċ-ċelloli umani li jxerrdu l-IgA1-
Komplejna ttestjajna jekk APRIL u IL-6 humiex komuni għal medjaturi ewlenin li jtejbu l-produzzjoni ta' IgA nefritoġenika fiċ-ċelloli umani li jxerrdu l-IgA1-. Is-supplimentazzjoni ta 'CpG-ODN tejbet iż-żieda ta' IL-6, espressjoni ta 'APRIL, produzzjoni ta' proteina APRIL, u produzzjoni ta 'IgA u Gd-IgA1 (Figura 4a). L-istimulazzjoni b'IL-6 u b'APRIL tejbet il-produzzjoni ta' IgA u Gd-IgA1 (Figura 4b, c). L-effetti tal-istimulazzjoni CpG-ODN fuq il-produzzjoni ta 'IgA u Gd-IgA1 tnaqqsu parzjalment minn antikorpi li jinnewtralizzaw IL-6- (Figura 4d). Barra minn hekk, il-knockdown (si)RNA żgħir u li jinterferixxi ta' APRIL naqqas ukoll il-produzzjoni ta' IgA u Gd-IgA1 indotta mill-istimulazzjoni ta' IL-6 (Figura 4b), li jindika li APRIL u IL-6 jippromwovu b'mod sinerġiku l-ġenerazzjoni ta' Gd -IgA1.
DISKUSSJONI
IgA mesanjali fl-IgAN umana hija esklussiva mis-subklassi IgA1 li turi O-glycosylation anormali. 29,30 L-IgA1 tal-Bniedem għandha reġjun taċ-ċappetta b'O-glycans li huwa nieqes mill-IgA tal-ġrieden. elevazzjoni ta' IgA glikosilati b'mod aberranti u IC li fihom IgA.11,12 Modifiki aberranti ta 'karboidrati IgA f'O- jew N-glycans huma proprjetajiet karatteristiċi ta' IC li jkun fih IgA nephritogenic.
Diversi studji wrew l-attivazzjoni ta 'TLR9 fil-progressjoni ta' IgAN.17-19 Fl-istudju preżenti, wrejna li l-attivazzjoni ta 'TLR9 permezz ta' injezzjoni ip ta 'CpG-ODN fil-ġrieden ddY aggravat korrimenti renali akkumpanjati minn depożiti glomerulari ta' IgA u IgG, probabbli minħabba li ta 'livelli miżjuda fis-serum ta' IgA u IgG-IgA IC glikosilati b'mod aberranti. Barra minn hekk, urejna li l-attivazzjoni ta' TLR9 kienet involuta fis-sintesi ta' Gd-IgA1 f'linji ta' ċelluli li sekretaw IgA1-umani.
Figura 3|L-effett ta 'CpG-oligodeoxynucleotide (ODN) u interleukin (IL)-6 fuq splenocytes kkultivati ta' ġrieden ddY. (a) Il-livelli tas-serum ta 'IL-6 fil-ġrieden injettati b'CpG-ODN kienu ogħla b'mod sinifikanti meta mqabbla mal-ġrieden ta' kontroll. L-istimulazzjoni CpG-ODN żiedet il-produzzjoni ta 'IL-6 ta' splenocytes ta 'ġrieden ddY fil-kultura. L-inkubazzjoni ta' splenocytes ta' ġrieden ddY b'IL-6 rikombinanti żiedet il-produzzjoni ta' IgA totali u IgA glikosilata b'mod aberranti, li rriżultat fil-formazzjoni tal-kumpless immuni IgG-IgA (IC). IL-6 rikombinanti żied il-produzzjoni żejda ta' ligand li jinduċi l-proliferazzjoni (APRIL). (b) L-isplenoċiti fil-kultura ġew stimulati b'CpG-ODN fil-preżenza jew in-nuqqas ta' antikorp newtralizzanti IL-6. Antikorp anti-IL-6 naqqas il-produzzjoni ta 'IgA totali u IgA glikosilata b'mod aberranti u, konsegwentement, naqqas il-formazzjoni ta' IgG-IgA IC indotta minn CpG-ODN. Bars ¼ medja ± SEM. * P < 0.05,="" **p="">< 0.01.="" od,="" densità="" ottika;="" pbs,="" soluzzjoni="" salina="" buffered="" bil-fosfat;="" rca-i,="" ricinus="" communis="" agglutinin-i;="" sna,="" sambucus="" nigra="">
Figura 4|L-effett ta 'CpG-oligodeoxynucleotide (ODN) jew supplimentazzjoni ta' ligand li jinduċi l-proliferazzjoni (APRIL) fuq linji taċ-ċelluli li jinkrew IgA umana1-fuq IgA1, IgA1 defiċjenti ta' galactose (Gd-IgA1), u interleukin (IL){{ 9}} produzzjoni. (a) Is-supplimentazzjoni ta' CpG-ODN tejbet il-produzzjoni ta' IL-6. CpG-ODN tejjeb l-espressjoni tal-ġeni ta 'APRIL. Analiżi Western blot wriet li CpG-ODN żied il-livelli ta 'proteina ta' APRIL. Ir-riżultati ġew evalwati b'mod densitometriku. L-istimulazzjoni b'CpG-ODN indotta l-produzzjoni ta 'IgA u Gd-IgA1. (b) Il-knockdown żgħir ta' APRIL ta' RNA li jinterferixxi (siRNA) naqqas il-produzzjoni żejda indotta minn IL-6 ta' IgA u Gd-IgA1. (c) IgA{{2{{30}}}}ċelluli li jipproduċu l-IgA stimulati b'APRIL rikombinanti pproduċew aktar IgA u Gd-IgA1. (d) IgA1-ċelluli li sekretaw ġew inkubati b'antikorp anti-IL-6 wara stimulazzjoni CpG-ODN. Il-produzzjoni msaħħa ta' IgA u Gd-IgA1 indotta minn CpG-ODN tnaqqset b'antikorp anti-IL-6 u permezz ta' knockdown ta' siRNA ta' APRIL. Bars ¼ medja ± SEM. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01.="" gadph,="" glyceraldehyde-3-phosphate="" dehydrogenase;="" pbs,="" soluzzjoni="" salina="" buffered="">
Aħna vvalutajna l-mekkaniżmu li bih l-attivazzjoni ta 'TLR9 medjat produzzjoni msaħħa ta' IgA glycosylated b'mod aberranti. BAFF u APRIL huma magħrufa għar-rwoli tagħhom fis-sopravivenza u d-divrenzjar taċ-ċelluli B. McCarthy et al.33 wrew li l-ġrieden transġeniċi li jesprimu żejjed BAFF jiżviluppaw depożiti ta 'IgA mesanjali b'korriment renali u anormalitajiet urinarji.33 Riċentement urejna li l-espressjoni tal-ġeni ta' APRIL hija elevata f'ċentri ġerminali tonsillari ta 'pazjenti b'IgAN. Barra minn hekk, espressjoni żejda ta 'APRIL fiċ-ċentri ġerminali tat-tunsillari kkorrelata mal-livelli tas-serum ta' Gd-IgA1 u s-severità tal-marda f'pazjenti b'IgAN.34 Dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li kemm BAFF kif ukoll APRIL jistgħu jkunu involuti fil-patoġenesi ta 'IgAN. Madankollu, l-assoċjazzjoni bejn l-attivazzjoni ta 'BAFF/APRIL u TLR9 mhix ċara. Fl-istudju preżenti, l-attivazzjoni ta 'TLR9 żiedet l-espressjoni tal-ġeni u l-livelli tas-serum ta' APRIL. Livelli fis-serum ta 'IgA glycosylated b'mod aberranti korrelatati mal-livelli ta' espressjoni ta 'BAFF u APRIL fl-isplenoċiti. Madankollu, il-livelli tas-serum ta 'IgG-IgA IC ikkorrelataw mal-livelli ta' espressjoni ta 'APRIL iżda mhux BAFF. Barra minn hekk, il-livelli tas-serum ta' APRIL kienu assoċjati mal-produzzjoni żejda ta' IgA u IgG-IgA IC glikosilati b'mod aberranti fil-ġrieden attivati TLR9-. Fiċ-ċelloli li jxerrdu l-IgA1-, l-attivazzjoni ta' TLR9 indotta wkoll produzzjoni żejda ta' Gd-IgA1 permezz ta' APRIL. Dawn ir-riżultati ssuġġerew li APRIL għandu rwol importanti fil-produzzjoni żejda indotta minn TLR9-ta' IgA nefritoġenika u l-formazzjoni ta' IgG-IgA IC.
Ir-rispons skont it-tip ta 'ċellula biex jiġi ddeterminat ir-rwol taċ-ċelluli B u T u DCs għandu jiġi ċċarat. Fl-istudju preżenti, aħna vvalutajna r-rwol taċ-ċelluli B u d-DCs plasmacytoid. TLR9 huwa espress minn DCs, ċelluli B u makrofaġi iżda mhux minn ċelluli T.35-37 Il-kontribut ta 'BAFF/APRIL għar-rispons ta' antikorpi indipendenti miċ-ċelluli T hija magħrufa.38,39 Hawnhekk ittestjajna jekk l-attivazzjoni ta 'TLR9 tistax ittejjeb is-sintesi ta' TLR9. IgA glikosilata b'mod aberranti u formazzjoni ta' IgG-IgA IC permezz ta' APRIL b'mod indipendenti miċ-ċelluli T. Aħna użajna wkoll linji taċ-ċelluli kklonati ta' IgA1- tal-bniedem u wrew li l-attivazzjoni ta' TLR9 żiedet il-produzzjoni ta' Gd-IgA1 permezz ta' APRIL u IL-6, li tissuġġerixxi li l-proċess huwa indipendenti miċ-ċelluli T. Barra minn hekk, aħna evalwajna r-rwoli taċ-ċelluli B u DCs. Aħna wrejna li CpG-ODN speċifiku għal ċelluli B u DCs żied il-produzzjoni ta 'IgA glikosilati b'mod aberranti fi splenocytes sħaħ. Barra minn hekk, investigajna jekk l-istimulazzjoni CpG-ODN in vitro tistax ittejjeb il-produzzjoni ta 'IgA. L-istimulazzjoni CpG-ODN ta 'ċelluli B iżolati indotta produzzjoni żejda ta' IgA. Barra minn hekk, CpG-ODN żied b'mod sinifikanti l-produzzjoni ta 'IgA meta ċ-ċelluli B kienu kkultivati flimkien ma' DCs (Figura Supplimentari S1). Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-attivazzjoni CpG-ODN tirriżulta f'akbarProduzzjoni ta 'IgA u glycosylation aberrantihija medjata minn TLR9 b'mod indipendenti miċ-ċelluli T.
IL-6 huwa magħruf li jaċċentwa l-proliferazzjoni taċ-ċelluli li jipproduċu l-immunoglobulina u d-differenzjazzjoni terminali taċ-ċelluli tal-plażma.40–42 Barra minn hekk, IL-6 jista’ wkoll ikun ċitokin primarju kandidat għad-divrenzjar taċ-ċelluli helper follikulari T. .43,44 Iċ-ċelloli helper follikulari T huma essenzjali għall-maturazzjoni tal-affinità taċ-ċelluli B, ir-rikombinazzjoni tal-iswiċċ tal-klassi, u l-ġenerazzjoni taċ-ċelluli B tal-memorja u tal-plażma fiċ-ċentru ġerminali.43,44 F'mudell tal-ġurdien lupus, IL-6 defiċjenza impedixxa d-differenzjazzjoni taċ-ċelluli helper follikulari T u l-espansjoni taċ-ċelluli B taċ-ċentru ġerminali, li rriżultat fi produzzjoni mnaqqsa ta 'awtoantikorpi. IL-6 indotta produzzjoni żejda ta 'IgA u IgG-IgA IC glikosilati b'mod aberranti f'mudell murini ta' IgAN. Fiċ-ċelloli umani li jxerrdu IgA1-, aħna kkonfermajna li IL-6 tejbet il-produzzjoni ta' Gd-IgA1.24 Is-sejbiet tagħna jissuġġerixxu li IL-6 jista' jkun wieħed mill-molekuli ewlenin li jinduċu produzzjoni żejda ta' IgA nefritoġenika medjat mill-attivazzjoni TLR9.
APRIL għandu rwol importanti fil-bdil tal-klassi IgA u d-differenzjazzjoni tal-plażmaċitoid.46,47 IL-6 jippromwovi d-differenzjazzjoni terminali taċ-ċelluli B għal ċelluli tal-plażma li jxerrdu l-IgA.41,42 L-istudju preżenti wera li IL{{7} } stimulazzjoni indotta l-produzzjoni ta 'APRIL. Imbagħad ipoteżijna li kien hemm assoċjazzjoni bejn APRIL u IL-6 medjata minn attivazzjoni ta 'TLR9 li indotta produzzjoni ta' IgA glikosilata b'mod aberranti. Aħna sibna li IL-6-antikorp newtralizzanti ma imblukkax kompletament il-produzzjoni żejda indotta minn CpG-ODN ta 'Gd-IgA1 u li t-tnaqqis tas-siRNA ta' APRIL naqqas il-produzzjoni żejda ta 'Gd-IgA1 indotta minn IL-6. Din id-dejta ssuġġeriet li APRIL u IL-6 promossi b'mod sinerġiku l-produzzjoni ta' Gd-IgA1 medjata mill-attivazzjoni ta' TLR9. Barra minn hekk, kemm IL-6–antikorp newtralizzanti kif ukoll knockdown ta’ siRNA ta’ APRIL naqqsu l-produzzjoni ta’ IgA u Gd-IgA1 aktar milli għamel IL-6–antikorp newtralizzanti waħdu. Għalhekk il-mogħdija ta 'attivazzjoni TLR9 tinvolvi effetti sinerġistiċi ta' IL-6 u APRIL fuq il-produzzjoni ta 'antikorpi u glikosilazzjoni (Figura 5). Studji reċenti indikaw ukoll li IL-6, flimkien ma' APRIL, indotta ġenerazzjoni u sopravivenza taċ-ċelluli tal-plażma.48,49 Madankollu, studji futuri huma meħtieġa biex jiċċaraw mogħdijiet ta' sinjalazzjoni interċellulari bejn APRIL u IL-6 f' il-produzzjoni ta 'IgA nefritoġeniċi.
cistanchegħalkliewiinfezzjoni
Fil-konklużjoni,Attivazzjoni TLR9korriment tal-kliewi aggravat f'mudell murin ta 'IgAN billi ssaħħaħ il-produzzjoni ta' IgA glycosylated b'mod aberranti u l-formazzjoni ta 'IgG-IgA IC. F'dan il-proċess, il-produzzjoni żejda ta 'APRIL u IL-6 indotta mill-attivazzjoni ta' TLR9 tejbet il-produzzjoni ta 'IgA nefritoġenika. Barra minn hekk, l-istudju preżenti ċċara li APRIL u IL-6 jiffunzjonaw b'mod sinerġiku, kif ukoll b'mod indipendenti, biex jipproduċu IgA glikosilata b'mod aberranti. Dawn is-sejbiet jistgħu jinfurmaw l-iżvilupp futur ta' approċċi terapewtiċi ġodda għall-IgAN.
Figura 5|Ir-rwol sinerġistiku bejn ir-riċettur 9 bħal Toll (TLR9), ligand li jinduċi l-proliferazzjoni (APRIL), u interleukin (IL) -6 fiċ-ċelloli li jipproduċu IgA fin-nefropatija IgA (IgAN). L-attivazzjoni ta 'TLR9 indotta l-produzzjoni ta' APRIL u IL-6, li tirriżulta fi
il-produzzjoni żejda ta 'IgA glycosylated aberranti. APRIL u IL-6 jiffunzjonaw b'mod sinerġiku biex jippromwovu l-ġenerazzjoni ta' IgA glikosilata b'mod aberranti. Minbarra li APRIL jinduċi l-produzzjoni ta' IL-6, kif irrappurtat qabel, IL-6 jista' wkoll itejjeb is-sintesi ta' APRIL. Barra minn hekk, APRIL u IL-6 jippromwovu b'mod indipendenti l-produzzjoni ta' IgA glikosilata b'mod aberranti. NF-kB, fattur nukleari-kB.
METODI
Annimali u protokolli sperimentali
Il-ġurdien ddY suxxettibbli għal IgAN huwa mudell magħruf ta 'IgAN spontanju b'inċidenza varjabbli u firxa ta' korriment glomerulari li jimitaw IgAN uman.10 ġrieden ddY huma maqsuma fi 3 gruppi bbażati fuq il-manifestazzjoni ta 'ħsara fil-kliewi: ġrieden bi ġrieden bikrija jew tard u ġrieden quiescent. Mard ta 'bidu bikri fil-ġrieden ddY jippreżenta depożiti ta' proteinurja u IgA glomerulari wara 20 ġimgħa ta 'età.13 Għalhekk, użajna ġrieden ddY fi żmien 18-il ġimgħa biex nevalwaw jekk l-attivazzjoni ta' TLR9 aggravatx IgAN f'dan il-mudell. Total ta '30 ġrieden ddY femminili (SLC Japan, Shizuoka, Japan) inżammu fil-faċilità tal-annimali ta' Juntendo University, Tokyo, Ġappun. Ġrieden kienu mitmugħa chow regolari (Oriental Yeast Co., Tokyo, Ġappun) u ilma ad libitum u kienu miżmuma f'kamra speċifika ħielsa mill-patoġeni. Il-protokoll sperimentali ġie approvat mill-Kumitat ta 'Reviżjoni tal-Etika għall-Esperimentazzjoni tal-Annimali tal-Fakultà tal-Mediċina tal-Università ta' Juntendo. Fl-età ta '6 ġimgħat, il-ġrieden kienu maqsuma b'mod każwali f'2 gruppi. Grupp wieħed irċieva CpG-ODN injettat ip 3 darbiet fil-ġimgħa għal 12-il ġimgħa; it-tieni grupp (kontroll) ġie injettat b'non-CpG-ODN. CpG-ODN u non-CpG-ODN ġew sintetizzati kimikament (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Kanagawa, Ġappun). Is-sekwenzi tal-ODN huma TCGTCGTT TTCGGCGCGCGCCG jew TGCTGCTTTTGGGGGGCCCCCC (50/30 ) għal ODNs CpG jew mhux CpG, rispettivament.
Determinazzjoni ta' IgA, IgG, IgG-IgA IC, u IgA glikosilata b'mod aberranti fis-serum tal-marieni
Inġabru kampjuni tad-demm mill-vina buckali. IgA, IgG, u IgG-IgA IC fis-serum tkejlu b'assaġġ immunosorbenti marbut ma' enzimi sandwich (ELISA; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) bl-użu tal-metodu modifikat ibbażat fuq ir-rapport preċedenti tagħna.50 Assaġġ ta' rbit ta' lectin kienu użati biex jaċċessaw il-glikoforma ta 'IgA. RCA-I biotinylated (Vector Laboratories, Burlingame, CA) u Sambucus nigra bark lectin (Vector Laboratories) li rrikonoxxew il-galactose u l-aċidu sialic imwaħħla mal-galactose (b'mod predominanti f'rabta a2,6), rispettivament, intużaw f'dan l-assaġġ.51 Serum dilwiti ġew miżjuda f'100 ng ta' IgA għal kull bir. Pjanċi ta 'mikrotiter miksija b'1 mg/ ml mogħoż kontra l-ġurdien IgA (100 ml/bir) għall-kwantifikazzjoni ta' IgA fis-serum ġew inkubati b'dawn il-kampjuni, u mbagħad ġie miżjud Sambucus nigra agglutinin jew RCA-I bijotinilat. Ġie applikat konjugat Avidin–horseradish peroxidase (ExtrAvidin; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Livelli fis-serum ta 'IgA marbuta b'mod aberranti glikosilati kienu espressi f'unitajiet (unità 1 bħala densità ottika 1.0 imkejla f'490 nm). Il-livelli tas-serum ta 'APRIL u BAFF tkejlu bl-użu ta' kit APRIL ELISA tal-ġurdien (MyBioSource, San Diego, CA) u kit ELISA tal-ġurdien BAFF (R&D Systems, Minneapolis, MN), skont il-protokolli tal-manifattur.
Assaġġ għal Gd-IgA1 prodott minn ċelluli umani li jxerrdu IgA1-
Inbena ELISA sandwich għal Gd-IgA1 bl-użu ta' Gd-IgA1-antikorp speċifiku (IBL, Ġappun).52 Antikorp speċifiku ta' Gd-IgA1 (7.5 mg/ ml) dilwit f'soluzzjoni salina buffered bil-fosfat ġie miksi fuq pjanċa ELISA għal 18. sigħat f'temperatura tal-kamra. Il-kampjuni ġew applikati u inkubati għal sagħtejn f'temperatura tal-kamra. Il-pjanċi ġew maħsula u inkubati għal sagħtejn f'temperatura ambjentali b'1:1000- antikorp monoklonali speċifiku għall-katina ta' IgA1 a1-ġurdien konjugat bil-perossidasi taż-żwiemel dilwit (Southern Biotech, Birmingham, AL). Wara l-ħasil, il-pjanċi ġew żviluppati b'soluzzjoni SIG-MAFAST o-phenylenediamine (Sigma-Aldrich), u r-reazzjoni twaqqfet biż-żieda ta 'aċidu sulfuriku 1 M (Wako, Osaka, Ġappun). Il-livelli ta' Gd-IgA1 ġew estrapolati b'referenza għal kurva standard (4-parametru ta' twaħħil tal-kurva loġistika) ta' densità ottika f'490 nm u espressa f'unitajiet. Gd-IgA1 iġġenerat enżimatikament mill-plażma umana IgA152 ġie dilwit serjament (1.37–1000 ng/ml) biex jiġġenera kurva standard. F'dan l-istudju, unità 1 kienet definita bħala 1 ng/mL tal-istandard Gd-IgA1.52
Evalwazzjoni ta 'ħsara fil-kliewi fil-ġrieden ddY
Kliewiwere removed after perfusion with normal saline solution. Renal tissue specimens for microscopic examination were fixed in 20% formaldehyde, embedded in paraffin, cut into 3-mm-thick sections, and then stained with periodic acid–Schiff. Specimens were quantitatively analyzed to determine the percentage of glomeruli with segmental and global sclerosis and/or mesangial cell proliferation and/or increase in the mesangial matrix. Each section was scored semiquantitatively for percentages of glomeruli with aforementioned lesions (0, 0%; 1, 1% to 24%; 2, 25% to 49%; and 3, >50 fil-mija ta’ 20 glomeruli).13,53,54 Il-punteġġ massimu totali għal kull taqsima kien 9. Kampjuni tal-kliewi għall-immunofluworexxenza ġew mgħaddsa f’kompost tat-temperatura ottimali tat-tqattigħ (Sakura Finetek Japan Co., Tokyo, Japan) u maħżuna fi –80 grad Il-kampjuni nqatgħu f'sezzjonijiet ħxuna ta' 3-mm, iffissati b'aċetun f'-20 grad għal 5 minuti, maħsula b'soluzzjoni salina buffered bil-fosfat, imblukkata b'aġent imblukkar (DS Pharma Biomedical Co., Osaka, Ġappun) f'temperatura tal-kamra għal 30 minuta, u mbagħad inkubat f'temperatura tal-kamra għal sagħtejn bl-antikorpi primarji li ġejjin: mogħoż anti-murine IgA, mogħoż konjugat Alexa anti-murine IgG, u far anti-C3 (Bethyl Laboratories). Wara 3 ħasliet oħra b'soluzzjoni salina buffered bil-fosfat, il-pjastri ġew immuntati b'mezz ta 'immuntar (Dako, Tokyo, Ġappun). Il-kampjuni ġew analizzati u immaġini bl-użu ta 'mikroskopija tal-laser konfokali (Olympus Corporation, Tokyo, Ġappun).
Reazzjoni kwantitattiva fil-katina tal-polimerażi f'ħin reali
RNA miċ-ċelloli tal-milsa ġie estratt bl-użu ta 'soluzzjoni Torizol (Invitrogen, Tokyo, Ġappun) u ppurifikat b'RNeasy Mini Kit (74106; Qiagen, Valencia, CA). Ir-reazzjoni tal-katina tal-polimerażi kwantitattiva f'ħin reali twettqet bl-użu tas-sistema ta 'reazzjoni tal-katina tal-polimerażi Applied Biosystems 7500 Real-Time bl-użu ta' SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) u primers speċifiċi: ġurdien TLR9 forward primer TCTCCCAACATGGTTCTCCGTCG, reverse primer TGCAGTCCAGGCCATGA; ġurdien MyD88 quddiem primer GCACCTGTGTCTGGTCCATT, reverse primer CTGTTGGA CACCTGGAGACA; u l-ġene housekeeping glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase forward primer CATTGTGGAAG GGCTCATGA, reverse primer TCTTCTGGGTGGCAGTGATG. Il-kundizzjonijiet ta 'amplifikazzjoni kienu kif ġej: tisħin minn qabel f'95 grad għal 20 sekonda u mbagħad 40 ċiklu ta' denaturazzjoni f'95 grad għal 3 sekondi, u ittemprar u estensjoni f'60 grad għal 30 sekonda. Assays tal-espressjoni tal-ġeni TaqMan speċifiċi għall-Homo sapiens (Life Technologies, Carlsbad, CA) inxtraw għall-primer ta' APRIL, Hs00601664_g1, Mm03809849-s1, u BAFF, Mm01168134-m1 . Il-kundizzjonijiet taċ-ċikli tar-reazzjoni tal-katina tal-polimerażi TaqMan kienu kif ġej: tisħin minn qabel f'95 grad għal 20 sekonda u mbagħad 40 ċiklu ta 'denaturazzjoni f'95 grad għal 3 sekondi, u ittemprar u estensjoni f'60 grad għal 30 sekonda
Studji in vitro bi splenoċiti ta' ġrieden ddY
Splenocytes ġew ikkultivati f'Roswell Park Memorial Institute–1640 medium supplimentat b'serum tal-għoġol tal-fetu 20 fil-mija, 100 mg/ml streptomycin, u 100 U/ml peniċillina. Iċ-ċelluli ħomor tad-demm ġew lysed f'Red Blood Cell Lysing Buffer (R7757; Sigma-Aldrich) f'temperatura tal-kamra għal minuta, segwit minn ħasil f'Roswell Park Memorial Institute–1640 medium.50 Il-kulturi taċ-ċelluli nżammu f'inkubatur umidifikat f'37 grad b' 5 fil-mija CO2. Klassi C CpG-ODN (TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG) intużat bħala l-ligand TLR9. IL-6 rikombinanti, antikorp anti-IL-6, u kontroll tal-isotip IgG1 tal-firien inkisbu minn Sistemi R&D. Iċ-ċelloli ġew ikkultivati b'konċentrazzjonijiet medji jew rakkomandati ta' CpG-ODN, 10 ng/ml IL-6 rikombinanti, u 100 ng/ml antikorp anti-IL6. IgA, IgA glycosylated b'mod aberranti, IgG-IgA IC, u APRIL prodotti minn splenocytes tkejlu b'ELISA wara 72-siegħa inkubazzjoni in vitro.
Studji in vitro b'linji ta' ċelluli li jxerrdu IgA1-bniedem
Iċ-ċelluli B mid-demm ta' persuna b'saħħitha ġew immortalizzati bil-virus Epstein-Barr, subklonati biex jagħtu linji ta' ċelluli li sekretaw IgA1-, u kkultivati kif deskritt.9 Barra minn hekk, ikkonfermajna l-espressjoni tar-riċetturi għal APRIL/BAFF u IL -6. Iċ-ċelloli ġew ikkultivati f'Roswell Park Memorial Institute–1640 medium supplimentat b'20 fil-mija serum tal-għoġol tal-fetu, streptomycin, u peniċillina f'inkubatur umidifikat f'37 grad b'5 fil-mija CO2. Klassi B CpG-ODN (TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT) intużat bħala l-ligand TLR9. Antikorp IL-6 rikombinanti, APRIL rikombinanti, anti-IL-6, u antikorp ta' kontroll IgG tal-mogħoż inkisbu minn Sistemi R&D. Iċ-ċelloli ġew ikkultivati jew b'konċentrazzjonijiet medji jew rakkomandati ta' CpG-ODN, 50 ng/ml rikombinanti IL-6, 40 ng/ml rikombinanti APRIL, u 100 ng/ml anti-IL-6 antikorp għal 72 siegħa
Western blotting
Is-supernatanti miċ-ċelloli li jxerrdu l-IgA1-kienu separati b'elettroforesi tal-ġel tas-sodju dodecyl sulfate-polyacrylamide taħt kundizzjonijiet ta' tnaqqis bl-użu ta' ġels ta' ċangaturi gradjent ta' 5 fil-mija sa 15 fil-mija. Il-ġels ġew trasferiti għal membrani polyvinylidene difluoride u inkubati b'antikorpi speċifiċi għal APRIL (Abcam Inc., Cambridge, MA) u glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Abcam Inc). Blots ġew viżwalizzati permezz ta 'kimiluminixxenza bl-użu ta' kimiluminixxenza mtejba (GE Healthcare, Tokyo, Ġappun) u detector ta 'luminixxenza (Konica Minolta Healthcare, Tokyo, Ġappun). Ir-riżultati ġew evalwati b'mod densitometriku.
APRIL siRNA knockdown
IgA{0}}ċelluli tal-bniedem li sekretaw ġew ikkultivati fi 24-pjanċi ta' kultura sew u trasfettati b'siRNA speċifiku għall-APRIL (GS8741, Qiagen) jew kontroll nontargeting ta' siRNA (GS10673, Qiagen) bl-użu tal-protokoll ta' trasfezzjoni skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur . Wara inkubazzjoni għal 24 siegħa, iċ-ċelloli ġew inkubati b'50 ng/ml IL-6 rikombinanti (R&D Systems) għal 72 siegħa. Wara l-inkubazzjoni, ċelluli u supernatanti ġew maħsuda għall-kejl ta 'IgA u Gd-IgA1.
Analiżi statistika
Il-korrelazzjoni bejn parametri differenti ġiet analizzata bl-użu ta 'analiżi tal-varjanza. Id-dejta kienet espressa bħala l-medja ± SD jew il-valuri medjani. Valuri P < {{0}}.05="" tqiesu="" statistikament="" sinifikanti.="" l-analiżi="" statistiċi="" kollha="" saru="" bl-użu="" tal-verżjoni="" graphpad="" prism="" 6.0="" għall-windows="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="">
cistanchegħalkliewisintomi tal-mard
ŻVELAR
L-awturi kollha ddikjaraw l-ebda interessi konkorrenti.
RIKONOXXIMENTI
Dan l-istudju kien appoġġjat parzjalment minn JSPS KAKENHI Għotja Nru 18K08252 u l-Proġett ta 'Riċerka Prattika għall-Mard tal-Kliwi mill-Aġenzija tal-Ġappun għar-Riċerka u l-Iżvilupp Mediku, AMED. JN u BAJ ġew appoġġjati parzjalment minn għotjiet tal-Istituti Nazzjonali tas-Saħħa DK078244 u DK082753. Nirringrazzjaw lis-Sinjura Terumi Shibata għall-assistenza teknika eċċellenti tagħha. Nirringrazzjaw ukoll lis-Sinjura Takako Ikegami u lis-Sinjura Tomomi Ikeda (Diviżjoni tar-Riċerka Molekulari u Bijokimika, Juntendo University Graduate School of Medicine) u Ms Tamami Sakanishi (Diviżjoni tal-Bijoloġija Ċelluli, Juntendo University Graduate School of Medicine) għall-assistenza teknika eċċellenti tagħhom .
MATERJAL SUPPLIMENTARI
Fajl Supplimentari (PDF)
Figura S1. CpG-oligodeoxynucleotide (ODN) – ċelluli B attivati u ċelluli dendritiċi (DCs) itejbu aktar il-produzzjoni IgA. Iċ-ċelloli B u d-DCs ġew iżolati mill-milsa tal-ġrieden ddY. L-istimulazzjoni CpG-ODN żiedet il-produzzjoni ta 'IgA fiċ-ċelluli B iżolati. Din iż-żieda kompliet tissaħħaħ permezz ta' ko-kultivazzjoni ta' ċelluli B b'DCs. *P < 0.05.="" il-metodi="" dettaljati="" huma="" pprovduti="" fil-metodi="" supplimentari.="" metodi="">
REFERENZI
1. Myette JR, Kano T, Suzuki H, et al. Antikorp immirat għal Ligand li Induċi l-Proliferazzjoni (APRIL) huwa trattament sikur u effettiv tan-nefropatija murina IgA. Kidney Int. 2019;96:104–116.
2. Levy M, Berger J. Perspettiva dinjija tan-nefropatija IgA. Am J Kidney Dis. 1988;12:340–347.
3. D'Amico G. L-aktar glomerulonefrite komuni fid-dinja: nefropatija IgA. QJ Med. 1987;64:709–727.
4. Feehally J, Beattie TJ, Brenchley PE, et al. Studju sekwenzjali tas-sistema IgA fin-nefropatija IgA li tirkadi. Kidney Int. 1986;30:924–931.
5. Wyatt RJ, Julian BA. Nefropatija IgA. N Engl J Med. 2013;368:2402–2414.
6. Suzuki H, Yasutake J, Makita Y, et al. Nefropatija IgA u vaskulite IgA b'nefrite għandhom karatteristika kondiviża li tinvolvi patoġenesi orjentata lejn IgA1- defiċjenti ta' galactose. Kidney Int. 2018;93:700–705.
7. Glassock RJ. L-analiżi tal-attività tal-antikorpi fin-nefropatija IgA. J Clin Invest. 2009;119:1450–1452.
8. Moldoveanu Z, Wyatt RJ, Lee JY, et al. Pazjenti b'nefropatija IgA żdiedu fil-livelli ta' IgA1 defiċjenti ta' galactose fis-serum. Kidney Int. 2007;71: 1148–1154.
9. Suzuki H, Moldoveanu Z, Hall S, et al. Linji taċ-ċelluli li jxerrdu IgA1-minn pazjenti b'nefropatija IgA jipproduċu IgA1 glikosilat b'mod aberranti. J Clin Invest. 2008;118:629–639.
10. Imai H, Nakamoto Y, Asakura K, et al. Depożizzjoni glomerulari IgA spontanja fil-ġrieden ddY: mudell ta 'annimal ta' nefrite IgA. Kidney Int. 1985;27:756–761.
11. Okazaki K, Suzuki Y, Otsuji M, et al. Żvilupp ta 'mudell ta' nefropatija IgA li tibda bikrija. J Am Soc Nephrol. 2012;23:1364–1374.
12. Nishie T, Miyaishi O, Azuma H, et al. Żvilupp ta' mard bħal nefropatija ta' immunoglobulina A fi ġrieden b'defiċjenza ta' beta-1,4-galactosyltransferase-I. Am J Pathol. 2007;170:447–456.
13. Suzuki H, Suzuki Y, Yamanaka T, et al. Skennjar tal-ġenoma kollu f'mudell ġdid ta' nefropatija IgA jidentifika locus ta' suxxettibilità fuq il-kromożomi murini 10, f'reġjun sinteniku għal IGAN1 uman fuq il-kromożomi 6q22-23. J Am Soc Nephrol. 2005;16:1289–1299.
14. Takei T, Iida A, Nitta K, et al. Assoċjazzjoni bejn polimorfiżmi ta 'nukleotide wieħed f'ġeni selettivi u nefropatija ta' immunoglobulina A. Am J Hum Genet. 2002;70:781–786.
15. Gharavi AG, Yan Y, Scolari F, et al. In-nefropatija IgA, l-aktar kawża komuni ta' glomerulonefrite, hija marbuta ma' 6q22-23. Nat Genet. 2000;26:354–357.
16. Suzuki H, Suzuki Y, Narita I, et al. Ir-riċettur 9 bħal toll jaffettwa s-severità tan-nefropatija IgA. J Am Soc Nephrol. 2008;19:2384–2395.
17. Nakata J, Suzuki Y, Suzuki H, et al. Bidliet f'IgA1 defiċjenti ta' galactose fis-serum nefritoġeniku fin-nefropatija IgA wara tonsillektomija u terapija sterojdi. PLoS Wieħed. 2014;9:e89707.
18. Sato D, Suzuki Y, Kano T, et al. Espressjoni tat-tonsillari TLR9 u effikaċja tat-tonsillektomija b'terapija tal-polz sterojdi f'pazjenti b'nefropatija IgA. Nephrol Dial Trapjant. 2012;27:1090–1097.
19. Coppo R, Camilla R, Amore A, et al. L-espressjonijiet tar-riċettur 4 simili għal toll huma miżjuda fiċ-ċelloli mononukleari li jiċċirkolaw ta 'pazjenti b'nefropatija ta' immunoglobulina A. Clin Exp Immunol. 2010;159:73–81.
20. Maiguma M, Suzuki Y, Suzuki H, et al. Iż-żingu tad-dieta huwa modifikatur ambjentali ewlieni fil-progressjoni tan-nefropatija IgA. PLoS Wieħed. 2014;9: e90558.
21. Kawai T, Akira S. Sinjali lil NF-kappaB minn riċetturi li jixbħu Toll. Xejriet Mol Med. 2007;13:460–469.
22. Kuwata H, Matsumoto M, Atarashi K, et al. IkappaBNS jinibixxi l-induzzjoni ta' subsett ta' ġeni li jiddependu fuq ir-riċettur simili għal Toll u jillimita l-infjammazzjoni. Immunità. 2006;24:41–51.
23. Rostoker G, Rymer JC, Barnard G, et al. Żbilanċi fiċ-ċitokini proinfjammatorji tas-serum u r-riċetturi solubbli tagħhom: rwol putattiv fil-progressjoni ta 'nefropatija IgA idjopatika (IgAN) u Henoch Schönlein purpura nefrite, u mira potenzjali ta' terapija immunoglobulina? Clin Exp Immunol. 1998;114:468–476.
24. Suzuki H, Raska M, Yamada K, et al. Iċ-ċitokini jbiddlu IgA1 O-glycosylation billi jirregolaw l-enzimi C1GalT1 u ST6GalNAc-II. J Biol Chem. 2014;289:5330–5339.
25. Yamada K, Huang ZQ, Raska M, et al. L-inibizzjoni tas-sinjalar STAT3 tnaqqas il-produzzjoni tal-awtoantiġen IgA1 fin-nefropatija IgA. Kidney Int Rep 2017;2:1194–1207.
26. Schneider P, MacKay F, Steiner V, et al. BAFF, ligand ġdid tal-familja tal-fattur tan-nekrożi tat-tumur, jistimula t-tkabbir taċ-ċelluli B. J Exp Med. 1999;189: 1747–1756.
27. Kiryluk K, Li Y, Scolari F, et al. L-iskoperta ta' loci ta' riskju ġodda għan-nefropatija IgA timplika ġeni involuti fl-immunità kontra patoġeni intestinali. Nat Genet. 2014;46:1187–1196.
28. Han SS, Yang SH, Choi M, et al. Ir-rwol tal-membru tas-superfamilja TNF 13 fil-progressjoni tan-nefropatija IgA. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3430– 3439.
29. Hiki Y, Odani H, Takahashi M, et al. L-ispettrometrija tal-massa turi glycosylation taħt O ta 'IgA1 glomerulari fin-nefropatija IgA. Kidney Int. 2001;59: 1077–1085.
30. Allen AC, Bailey EM, Brenchley PE, et al. IgA1 mesanjali fin-nefropatija IgA juri O-glycosylation aberranti: osservazzjonijiet fi tliet pazjenti. Kidney Int. 2001;60:969–973.
31. Hiki Y. Oligosaccharides O-linked tar-reġjun taċ-ċappetta IgA1: rwoli tal-istruttura aberranti tagħha fl-okkorrenza u/jew il-progressjoni tan-nefropatija IgA. Clin Exp Nephrol. 2009;13:415–423.
32. Mestecky J, Tomana M, Moldoveanu Z, et al. Rwol ta 'glycosylation aberranti ta' molekuli IgA1 fil-patoġenesi tan-nefropatija IgA. Kidney Blood Press Res. 2008;31:29–37.
33. McCarthy DD, Kujawa J, Wilson C, et al. Il-ġrieden li jesprimu żejjed il-BAFF jiżviluppaw nefropatija assoċjata ma' IgA li tiddependi mill-flaflora commensal. J Clin Invest. 2011;121:3991–4002.
34. Muto M, Manfroi B, Suzuki H, et al. L-istimulazzjoni tar-riċettur 9 bħal toll tinduċi espressjoni aberranti ta 'ligand li jinduċi l-proliferazzjoni minn ċelluli B taċ-ċentru ġerminali tat-tonsillari fin-nefropatija IgA. J Am Soc Nephrol. 2017;28:1227–1238.
35. Latz E, Schoenemeyer A, Visintin A, et al. Sinjali TLR9 wara li jittraslokaw mill-ER għal CpG DNA fil-liżosoma. Nat Immunol. 2004;5:190–198.
36. Hornung V, Rothenfusser S, Britsch S, et al. Espressjoni kwantitattiva ta' mRNA tar-riċettur li jixbaħ toll 1-10 f'sottogruppi ċellulari ta' ċelluli mononukleari tad-demm periferali tal-bniedem u sensittività għal oligodeoxynucleotides CpG. J Immunol. 2002;168:4531–4537.
37. Kadowaki N, Ho S, Antonenko S, et al. Sottogruppi ta 'prekursuri ta' ċelluli dendritiċi umani jesprimu riċetturi differenti li jixbħu lill-pedaġġ u jirrispondu għal antiġeni mikrobjali differenti. J Exp Med. 2001;194:863–869.
38. He B, Xu W, Santini PA, et al. Il-batterji intestinali jikkawżaw bidla fil-klassi ta' immunoglobulina A(2) indipendenti miċ-ċelluli T billi tinduċi sekrezzjoni taċ-ċelluli epiteljali taċ-ċitokin APRIL. Immunità. 2007;26:812–826.
39. Mackay F, Schneider P. Tkissir tal-kodiċi BAFF. Nat Rev Immunol. 2009;9: 491–502.
40. Kunimoto DY, Nordan RP, Strober W. IL-6 huwa kofattur qawwi ta' IL-1 fis-sintesi ta' IgM u ta' IL-5 fis-sintesi ta' IgA. J Immunol. 1989;143:2230–2235.
41. Beagley KW, Eldridge JH, Lee F, et al. Interleukins u sinteżi IgA. L-interleukin 6 uman u murini jinduċi sekrezzjoni ta' IgA b'rata għolja fiċ-ċelluli B impenjati minn IgA. J Exp Med. 1989;169:2133–2148.
42. Ramsay AJ, Husband AJ, Ramshaw IA, et al. Ir-rwol tal-interleukin-6 fir-risponsi tal-antikorpi IgA mukosali in vivo. Xjenza. 1994;264:561– 563.
43. Nurieva RI, Chung Y, Martinez GJ, et al. Bcl6 jimmedja l-iżvilupp taċ-ċelluli T helper follikulari. Xjenza. 2009;325:1001–1005.
44. Poholek AC, Hansen K, Hernandez SG, et al. Regolazzjoni in vivo tal-iżvilupp taċ-ċelluli helper follikulari Bcl6 u T. J Immunol. 2010;185: 313–326.
45. Jain S, Park G, Sproule TJ, et al. Interleukin 6 taċċellera l-mortalità billi tippromwovi l-progressjoni tal-marda sistemika bħal lupus erythematosus tal-ġrieden BXSB.Yaa. PLoS Wieħed. 2016;11:e0153059.
46. Litinskiy MB, Nardelli B, Hilbert DM, et al. DCs jinduċu swiċċjar tal-klassi ta' immunoglobulina CD40-indipendenti permezz ta' BLyS u APRIL. Nat Immunol. 2002;3:822–829.
47. Castigli E, Wilson SA, Scott S, et al. TACI u BAFF-R jimmedjaw il-bidla tal-isotip fiċ-ċelloli B. J Exp Med. 2005;201:35–39.
48. Jourdan M, Chen M, Robert N, et al. IL-6 jappoġġja l-ġenerazzjoni ta' ċelluli tal-plażma tal-bniedem b'ħajja twila flimkien ma' fatturi jew APRIL jew stromali li jinħallu fiċ-ċelluli. Lewkimja. 2014;28:1647–1656.
49. Chu VT, Fröhlich A, Steinhauser G, et al. L-eosinofili huma meħtieġa għaż-żamma taċ-ċelloli tal-plażma fil-mudullun. Nat Immunol. 2011;12: 151–159.
50. Suzuki H, Suzuki Y, Aizawa M, et al. Polarizzazzjoni Th1 fin-nefropatija murina IgA diretta minn ċelluli derivati mill-mudullun. Kidney Int. 2007;72: 319–327.
51. Chintalacharuvu SR, Emancipator SN. Il-glikosilazzjoni ta 'IgA prodotta minn ċelluli B tal-marieni hija mibdula minn ċitokini Th2. J Immunol. 1997;159:2327– 2333.
52. Yasutake J, Suzuki Y, Suzuki H, et al. Approċċ ġdid indipendenti mil-lectin biex jinstab IgA1 defiċjenti ta 'galactose fin-nefropatija ta' IgA. Nephrol Dial Trapjant. 2015;30:1315–1321.
53. Katafuchi R, Kiyoshi Y, Oh Y, et al. Punteġġ glomerulari bħala pronjostikatur fin-nefropatija IgA: l-utilità u l-limitazzjoni tagħha. Clin Nephrol. 1998;49:1–8.
54. Ballardie FW, Roberts IS. Prova prospettiva kkontrollata ta 'prednisolone u ċitotossiċi f'nefropatija progressiva ta' IgA. J Am Soc Nephrol. 2002;13: 142–148.
