studji wrew li l-awtofaġija għandha rwol importanti fir-regolamentazzjoni tad-depożizzjoni ċellulari LD Parti 2

Jekk jogħġbok ikkuntattjaoscar.xiao@wecistanche.comgħal aktar informazzjoni

2.14. Assaġġ Lactate dehydrogenase (LDH).

Skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur, iċ-ċelloli ġew ibbanjati fi 96-pjanċa bir-bir f'5000 ċellula/bir, u nġabar mezz ta 'kultura biex jitkejlu l-livelli ta' LDH b'kitt tal-analiżi (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute). Imbagħad l-assorbenza tal-kampjuni ġiet skoperta mill-Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) f'450 nm.

2.15. BODIPY493/503, BODIPY 581/591 C11, u MitoTracker tbajja aħmar skur

Ċelloli ħajjin ġew maħsula b'PBS u inkubati b'2 ug/ml BOD-IPY 493/503 (InvitrogenTM, Cat D3922) jew BODIPY 581/591 C11 (BD-C11）（2.0 μM, InvitrogenTM, Cat D3861）f'PBS għal 15min fi grad 37. Għal tbajja MitoTracker Deep Red, ċelluli ħajjin ġew inkubati b'0.5 ug/ml MitoTracker Deep Red (InvitrogenTM, Cat M22426) f'PBS għal 30 min f'37 grad. ġew maħsula darbtejn f'PBS u ffissati fi 3.5 fil-mija PFA għal 10 min segwiti minn ħasil u counterstaining b'Hoechst 3342 (Sigma, Cat B2261) għal 10 min qabel ma ġew koperti fuq slides tal-ħġieġ għall-immaġini.kemm cistanche tieħuĠew osservati stampi u ritratti nqabdu permezz ta 'mikroskopija fluworexxenti (Olympus, Tokyo, Ġappun).

Jekk jogħġbok ikklikkja hawn biex tkun taf aktar

2.16.Tbajja ta' Hoechst u PI

Iċ-ċelloli kienu mtebbgħin b'Hoechst 33,342 (1 ul dilwit f'500ul PBS, Sigma, Cat B2261) u (jew) PI (0.1 ul dilwit f'500ul PBS, Solarbio, (cistanche sleep) għal CA1020 min u) imbagħad iffissat u osservat permezz ta 'mikroskopija fluworexxenti (Olympus, Tokyo, Ġappun).

2.17.Ċitometrija tal-fluss

Iċ-ċelloli ġew diġeriti u laħlaħ b'D-hank's imbagħad imtebba' b'Annexin V-FITC（5 ul dilwit f'500ul PBS）/PI (0.1 ul dilwit f'500ul PBS) kit ta' apoptosi (CA1020, Solarbio, Beijing, Chian ) skond il-protokoll tal-manifattur. Wara, ċelluli apoptotiċi ġew analizzati bl-użu ta 'ċitometrija tal-fluss (guava easyCyterM 8, Millipore, USA). ROS mitokondrijali u kejl tal-potenzjal tal-membrana mitokondrijali twettqu kif ippubblikat 【12】. Iċ-ċelloli SH-SY5Y kienu mtebbgħin b'MitoSOX (2.5 μM, Invitrogen, USA) jew b'JC1 (10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, USA) f'37 grad għal 30 min. Wara l-ħasil b'PBS darbtejn, iċ-ċelloli mbagħad ġew sospiżi mill-ġdid f'PBS kiesaħ li kien fih 1 fil-mija FBS għall-analiżi ċitometrika tal-fluss. Id-dejta ġiet analizzata bis-softwer FCS Express (Guava Easy CyterM8, Millipore, Hayward, CA, USA).

2.18. Assays dwar ir-respirazzjoni taż-żiemel tal-baħar

Il-funzjoni respiratorja mitokondrijali fiċ-ċelluli SH-SY5Y ħajjin ġiet imkejla bl-użu tal-analizzatur tal-fluss extraċellulari Seahorse (XFe96) (Agi-lent, Santa Clara, USA) permezz ta 'bidliet fir-rata tal-konsum tal-ossiġnu (OCR). Iċ-ċelloli SH-SY5Y miżrugħa fi 3 × 10³ ċelluli/bir tħallew jaderixxu mal-pjanċi tal-kultura taċ-ċelluli Seahorse u jilħqu madwar 80 fil-mija konfluwenza fil-ħin tal-esperiment. espost għal MPP* għal 24 siegħa oħra. OCR ġie skopert taħt kundizzjonijiet bażali segwit minn żieda sekwenzjali ta '1 μM oligomycin, 1 μM FCCP, kif ukoll 1 μM rotenone & antimycin A.

Cistanche jista 'jtejjeb l-immunità

2.19. Analiżi statistika

Id-dejta ġiet ippreżentata bħala medja ± SEM. Is-sinifikat tad-differenza kien determinat mit-test t ta' Student, analiżi tal-varjanza f'żewġ direzzjonijiet, jew analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda (ANOVA) segwit mit-test post hoc ta 'Tukey. Id-differenza tqieset sinifikanti fi P<>

3. Riżultati

Riżultat1. Ka jerġa' jġib disfunzjoni tal-mutur u jżid il-livelli ta' dopamina fl-istriatum tal-ġrieden mudell MPTP/p PD

Biex tinvestiga l-effett newroprotettiv tal-patoġenesi Kaon PD, ġrieden maskili C57BL/6 ta' xahar 4- ġew injettati bin-newrotossina MPTP biex jistabbilixxu l-mudell MPTP/p PD u ġew ittrattati b'Ka (Fig. la). Wara l-induzzjoni tal-mudell, it-test rotarod u t-test tal-arblu ntużaw biex jevalwaw il-prestazzjoni tal-mutur u tal-imġieba tal-ġrieden fil-gruppi differenti. Kif muri, il-ħin tal-prestazzjoni ta 'rotarod kien imnaqqas b'mod sinifikanti fil-ġrieden ittrattati b'MPTP, u dan l-effett ġie evitat minn Ka (Fig.1b). (benefiċċji cistanche tubulosa) Ka rrestawra wkoll id-defiċits fl-imġieba indotti minn MPTP, kif indikat mit-tnaqqis fil-ħin tat-tidwir u l-ħin totali fit-test tal-arblu (Fig. 1c u d), mingħajr ma jaffettwa l-piżijiet tal-ġisem tal-ġrieden (Fig. le). Barra minn hekk, l-analiżi HPLC wriet li l-livell ta 'dopamine fl-istriatum naqas b'mod sinifikanti fil-ġrieden MPTP/p-challenged, u dan il-livell ġie rrestawrat permezz ta' trattament Ka (Fig. 1f). tnaqqis ikkawżat minn p fil-livelli ta 'dihydroxy-phenyl acetic acid (DOPAC, metabolit ta' dopamine) fl-istriatum (Fig.1g).superman ħwawar cistancheDawn ir-riżultati jissuġġerixxu li Ka jerġa 'jġib disfunzjoni tal-mutur u jżid il-livelli ta' dopamine fl-istriatum fi ġrieden PD indotti minn MPTP.

Riżultat 2. Ka jtaffi t-telf tan-newroni DA fl-SNpc tal-ġrieden mudell MPTP/p PD

Sussegwentement, biex nevalwaw aktar l-effett newroprotettiv ta 'indeboliment newronali DA indott minn Kaon MPTP/p, eżaminajna newroni tyrosine hydroxylase (TH) fl-SNpc murina permezz ta' immunostaining. Kif muri f'Fig.2a u b, MPTP/p wassal għal tnaqqis sinifikanti fin-numru ta 'newroni TH, li ġie mtaffi bit-trattament Ka. Barra minn hekk, għadd sterjoloġiku tan-newroni totali fl-SNpc, kif definit minn Nissl

Fig.1. It-trattament Ka ttaffi d-disfunzjoni tal-mutur u jżid il-livelli ta 'dopamine fl-istriatum tal-ġrieden mudell MPTP/p PD.

(a) Dijagramma skematika tad-disinn sperimentali.(cistanche tubulosa reddit) (b) Il-ħin fuq il-virga tkejjel għat-test rotarod fuq tlett ijiem konsekuttivi. (cd) Il-ħin jittieħed biex iduru (ħin tat-tidwir) u jinżel arblu (ħin tat-tixbit) ġie rreġistrat għat-test tal-arblu. (e) Il-piżijiet tal-ġisem tal-ġurdien ġew imkejla fl-aħħar tal-istudju. (fg) Dopamine (DA) u dihydroxy-phenyl acetic acid (DOPAC) fl-istriatum ġew analizzati permezz ta 'kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja. Id-dejta hija espressa bħala l-medja±SEM.n=9-10 għal kull grupp f'(b,c,d);n=6-8 għal kull grupp f'(f,g).ns, mhux sinifikanti,* P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,kaempferol.="" staining,="" verified="" that="" the="" loss="" of="" th+="" cells="" reflected="" cellular="" death="" but="" not="" the="" downregulation="" of="" th="" expression="" and="" showed="" that="" ka="" treatment="" restored="" the="" decrease="" in="" the="" number="" of="" nissl-positive="" neurons="" in="" the="" snpc="" of="" mptp-treated="" mice="" from="" 43.3%="" to="" 25.4%="" (fig.="" 2c="" and="" d).in="" addition,="">benefiċċji tal-bijoflavonoidsKa tjieb b'mod sinifikanti t-tnaqqis indott mill-MPTP fl-espressjoni tal-proteini TH u DAT, kif imkejjel minn Western blotting (Fig.2e-g). Din l-evidenza tikkonferma l-effett newroprotettiv ta 'Kaon fil-mudell tal-ġurdien PD.

Riżultat 3. Ka inaqqas l-akkumulazzjoni ta 'vakuoli LD u stress ossidattiv fl-SNpc ta' ġrieden ittrattati b'MPTP/p

Żieda fl-evidenza wriet l-involviment ta 'LDs fl-NDDs [10], b'mod konsistenti, ix-xogħol preċedenti tagħna identifika LDs miżjuda fl-SNpc ta' ġrieden PD indotti minn MPTP [12].LDs jistgħu jiġu identifikati faċilment u juru strutturi tondi, ta 'densità baxxa b'omoġenji. kontenut amorfu [28]. Normalment, LDs jistgħu jiġu degradati permezz tal-awtofaġija biex tiġi evitata l-akkumulazzjoni [29].jixtru cistancheBiex tinvestiga jekk Ka setax jirregola LDs fil-PD, l-akkumulazzjoni ta 'LDs ġiet analizzata permezz ta' mikroskopija elettronika ta 'trażmissjoni (TEM) fl-SNpc ta' kontroll, MPTP/p, u MPTP/p ＋ ġrieden Ka. Kif muri fix-xogħol preċedenti tagħna [12], in-numru u d-daqs ta 'LDs kienu

żdiedu fil-ġrieden MPTP/p meta mqabbla mal-kontrolli ttrattati bil-melħ (Fig. 3a u b) u tnaqqsu b'mod sinifikanti fil-ġrieden ittrattati Ka (Fig. 3c-e). Barra minn hekk, fil-ġrieden ittrattati bil-Ka, LDs kienu osservati aktar ta 'spiss fil-qrib ukoll, magħluqa fi, jew degradati minn autolysosomes, li kienu definiti bħala granuli lipofuscin densi fl-elettroni. Tbajja istoloġika ulterjuri ta 'newroni TH b'BODIPY, żebgħa li tikkettja speċifikament lipidi newtrali u hija komunement użata biex tiskopri LDs [30], wera li kemm in-numru kif ukoll id-daqs ta' BODIPY flimkien ma 'LDs fl-SNpc kienu ogħla fil-ġrieden PD milli fil-kontrolli, u naqsu b'mod sinifikanti bit-trattament Ka (Fig.3f-h).

Jekk l-LDs ma jistgħux jiġu degradati fil-ħin, l-LDs akkumulati jistgħu jgħaddu minn perossidazzjoni u jikkontribwixxu għal stress medjat minn ROS mitokondrijali [4],distanzali jamplifika n-newrotossiċità u l-progressjoni tal-mard. Għalhekk, eżaminajna aktar il-profili tal-espressjoni tal-ġeni assoċjati mal-protezzjoni kontra t-tossiċità tal-FA ħielsa (Gpx8), speċi ossidattivi newtralizzanti, radikali superossidi (Sod3) u perossidu tal-idroġenu (Cat), u metaboliżmu tal-FA (Acsbg1 u Dbi) kif irrappurtat [31] , li kollha kienu naqsu b'mod impressjonanti fl-SNpc tal-ġrieden ittrattati bl-MPTP meta mqabbla mal-kontrolli, u dawn l-effetti ġew imtejba fil-ġrieden PD ittrattati b'Ka (Fig. 3i). Bl-istess mod, MPTP/p żied ukoll il-livelli ta 'espressjoni ta' mRNA

Fig.2. Ka jtejjeb it-telf ta 'newroni DA fl-SNpc tal-ġrieden mudell MPTP/p PD.

(ab) Mikrofotografi ta 'newroni pożittivi ta' tyrosine hydroxylase (TH) (a) u għadd sterjoloġiku ta 'newroni TH-pożittivi fis-substantia nigra pars compacta (SNpc) (b). Il-vireg tal-iskala huma kif indikat. (cd) Mikrofotografi ta' ċelloli pożittivi għall-vjola cresyl (c) u għadd sterjoloġiku ta' ċelloli pożittivi għall-vjola cresyl fl-SNpc (d). Skala bar, 120 um. (eż.) Analiżi Western blot tal-espressjoni tal-proteini TH u DAT fl-SNpc (e) u analiżi kwantitattiva (f,g). Id-dejta kwantifikata hija normalizzata għall-grupp ta' kontroll tal-melħ. Id-dejta hija espressa bħala l-medja ± SEM.*P<><0.01, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.n="4-5" for="" each="" group.="" ve,="" vehicle,="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydroloyridine..="" (for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="" article.="" of="" nadph="" oxidase="" subunits="" such="" as="" nox1,="" nox2,="" and="" nox4="" in="" the="" snpc="" of="" mptp/p="" mice,="" which="" were="" further="" blunted="" by="" ka="" treatment="" (fig.="" 3j).="" taken="" together,="" these="" data="" suggest="" that="" ka="" alleviates="" mptp/p-induced="" ld="" accumulation,="" peroxidation,="" and="" ros-mediated="">

Riżultat 4. Ka jipproteġi ċ-ċelloli SH-SY5Y kontra l-apoptosi indotta MPP plus

MPP, il-metabolit attiv tal-MPTP, jinibixxi l-enzimi kumplessi mitokondrijali u jikkawża l-mewt taċ-ċelluli li hija assoċjata direttament mal-PD [32]. Imbagħad investigajna jekk Ka jistax jipprevjeni l-apoptosi newronali indotta minn MPPt in vitro. Kif muri f'Fig. 4a u b, MPPt (40 uM, 24h) indotta r-rilaxx ta 'LDH minn ċelluli SH-SY5Y, u Ka (30 u 60 uM) attenwat b'mod sinifikanti r-rilaxx ta' LDH mingħajr ma affettwa s-sopravivenza taċ-ċelluli (Fig. 4a). Peress li Ka indotta effett protettiv sostanzjali f'konċentrazzjoni ta '30 μM (Fig. 4b）, użajna din il-konċentrazzjoni f'esperimenti sussegwenti. Ir-riżultati tat-tbajja 'Hoechst/PI wrew ukoll li Ka naqqas b'mod sinifikanti l-perċentwal ta' ċelloli b'kondensazzjoni tal-kromatina indotta minn MPPt (Fig. 4c u d) u apoptożi ċellulari, kif muri mill-intensità tal-fluworexxenza Hoechst miżjuda (Fig. 4c) u l-perċentwal ta ' Ċelloli Hoechst/Mtebbgħin PI (Hoechst plus /PI') (Fig. 4e). Ukoll, kif misjuba miċ-ċitometrija tal-fluss, MPP flimkien ma 'apoptożi taċ-ċelluli indotta, evidenzjata mill-persentaġġ miżjud ta' ċelluli mtebbgħin b'Annexin V (AV / PI u AV plus / PI plus ) kien protett minn Ka (Fig. 4f u g). Barra minn hekk, Ka notevolment reġġa' lura l-bidliet indotti mill-MPP fl-espressjoni tal-proteina relatata mal-apoptożi, kif jidher mir-regolazzjoni 'l fuq ta' Bcl-2, ir-regolazzjoni 'l isfel ta' Bax (Fig. 4hi-j), u qsim imnaqqas ta 'caspase-3 (Fig. 4h, k). Din id-dejta tissuġġerixxi li Ka jista 'jabolixxi l-effetti detrimentali ta' MPPt fuq is-sopravivenza taċ-ċelluli.

Riżultat 5. Ka jrażżan l-akkumulazzjoni LD indotta minn MPPt u l-perossidazzjoni tal-lipidi, li jimmedjaw il-ħsara mitokondrijali fiċ-ċelloli SH-SY5Y

Studji reċenti wrew li akkumulazzjoni mhux mistennija ta 'LD tista' tirriżulta f'żieda fl-istress medjat mill-perossidazzjoni tal-lipidi u taċċellera disfunzjoni mitokondrijali, li tippromwovi n-newrodeġenerazzjoni [10]. Ix-xogħol preċedenti tagħna wera wkoll li l-LDs miżjuda fl-SNpc kienu assoċjati mal-patoloġija tal-PD fil-ġrieden [12]. Biex ninvestigaw jekk l-effett protettiv ta 'Ka kienx relatat ma' akkumulazzjoni ta 'LD in vitro, l-ewwel wettaqna tbajja speċifika għal LD ​​f'ċelloli SH-SY5Y bl-użu ta' BODIPY 493/503 u osservajna żieda fid-depożizzjoni LD (livelli mtejba ta 'lipidi newtrali)

Riżultat 6. Ka jippromwovi l-awtofaġija u jnaqqas il-produzzjoni ta' mtROS f'ċelloli SH-SY5Y trattati MPP flimkien ma'

Normalment, LDs huma kkunsinnati lil liżosomi permezz ta 'awtofaġija u jistgħu jinqasmu f'FAs biex tiġi evitata l-perossidazzjoni. Madankollu, l-evidenza tindika li l-awtofaġija hija indebolita, li għandha rwol kruċjali fil-PD [2]. Meta l-awtofaġija tinvolvi LDs porzjonati biex jitkissru f'liżosomi (Fig. 6a), il-proċess jissejjaħ speċifikament lipofaġija [2]. Biex tinvestiga jekk l-awtofaġija hijiex involuta fl-effett newroprotettiv ta 'Ka, eżaminajna l-livelli ta' proteini assoċjati mal-awtofaġija. Kif muri f'Fig. 6b-d, f'ċelluli SH-SY5Y kkultivati, il-livell ta 'katina ħafifa ta' proteina assoċjata mal-mikrotubuli 3 (LC3)-II tnaqqas b'mod notevoli, filwaqt li l-espressjoni ta 'p62 żdiedet b'mod notevoli f'ċelluli trattati MPP plus, kif imkejjel permezz ta 'immunoblotting, u dan l-effett kien imreġġa' lura b'mod sinifikanti minn Ka. Aħna eżaminajna aktar il-bidliet fl-awtofaġija permezz ta 'immunostaining għal LC3. Biex tippermetti li l-awtofagosomi jakkumulaw fiċ-ċelloli, bafilomycin ġie miżjud biex jipprevjeni l-fużjoni tal-awtofagożomi mal-liżosomi. Kif muri, ġew skoperti numri miżjuda ta 'LC3b puncta f'ċelluli ttrattati b'MPP *, li jindikaw degradazzjoni awtofaġika indebolita, u dan l-effett kien imreġġa' lura wkoll minn Ka (Fig. 6e u f). Dawn ir-riżultati jindikaw li LDs fiċ-ċelloli SH-SY5Y huma mobilizzati permezz ta 'awtofaġija għal tneħħija eventwali u li Ka jista' jippromwovi awtofaġija biex inaqqas l-akkumulazzjoni tal-lipidi ossidizzati. Żieda fil-perossidazzjoni tal-lipidi tista 'taggrava l-ħsara mitokondrijali billi żżid l-istress ossidattiv mitokondrijali [4]. Barra minn hekk, it-trattament Ka naqqas b'mod sinifikanti l-ġenerazzjoni robusta ta 'mtROS, kif determinat mit-tbajja' ta' MitoSOX (Fig. 6g u h), u naqqas in-numru ta 'mitokondrija li ma jiffunzjonawx, kif determinat minn tikketti speċifiċi għall-mitokondrija biex jiddistingwu respiring (MitoTracker aħmar skur) u totali ( MitoTracker aħdar) mitokondrija (Fig. 6i u j). Barra minn hekk, biex ikollna ħarsa diretta tal-alterazzjonijiet mitokondrijali, skoprejna aktar ir-rata tal-konsum tal-ossiġnu (OCR) mill-analizzatur Seahorse XF. Kif muri f'Fig. 6k, ir-respirazzjoni tal-mitokondrija tnaqqset f'ċelloli ttrattati b'MPPt, filwaqt li t-trattament Ka ovvjament ireġġa 'lura din il-ħsara kkawżata minn MPP plus (Fig. 6k).

Riżultat7. L-inibizzjoni tal-awtofaġija ireġġa' lura l-effett soppressiv tal-akkumulazzjoni ta' Kaon LD, disfunzjoni mitokondrijali, u ħsara newronali DA in vitro

Biex jiġi eżaminat jekk l-awtofaġija hijiex wieħed mill-mekkaniżmi ewlenin li bihom Ka jimmedja n-newroprotezzjoni DA, intuża l-inibitur tal-awtofaġija 3-MA. Sibna li l-effetti inibitorji ta’ Ka fuq korriment indott minn MPP#, inkluż tnaqqis fl-akkumulazzjoni ta’ LD (Fig. 7a u b), naqqsu l-produzzjoni ta’ mtROS (Fig. 7c u d), u ttaffi d-disfunzjoni mitokondrijali (Fig. 7e u f) f’ Iċ-ċelloli SH-SY5Y, ġew imblukkati b'mod sinifikanti minn 3-MA. Peress li l-ossidazzjoni LD u disfunzjoni mitokondrijali huma assoċjati mill-qrib mal-mewt newronali DA, aħna mbagħad eżaminajna newroni DA kkultivati ​​primarji. Aħna kkurajna mesencephalon kkultivati ​​TH flimkien ma 'newroni b'Ka u/jew MPPf u kkwantifikajna n-numru u t-tul ta' TH flimkien ma 'proċessi newronali permezz ta' immunostaining. L-analiżi morfoloġika wriet li n-numru u t-tul tal-proċessi newronali naqsu b'mod notevoli b'MPP plus u protetti minn Ka, u din il-protezzjoni ġiet imreġġa lura aktar minn 3-MA (Fig.7g-i). Din id-dejta tindika li Ka ttaffi l-ħsara newronali DA billi tippromwovi l-awtofaġija.

Riżultat 8. Is-sikket Atg5 abolixxa l-prevenzjoni medjata mill-Ka tat-telf newronali in vivo

Biex tikkonferma aktar li Ka jipproteġi kontra TH indott minn MPTP/p flimkien ma’ telf newronali b’mod dipendenti fuq l-awtofaġija, aħna sikket Atg5 billi mikroinjettajna virus adeno-assoċjat (AAV) li jesprimi shRNA ikkaratterizzat qabel kontra Atg5 fil-mesencephalon bilaterali (Fig. .8a) kif deskritt qabel [25].F'esperimenti preliminari, osservajna li t-trasfezzjoni ta 'Atg5 shRNA għal ġimgħatejn kisbet espressjoni GFP suffiċjenti f'TH plus newroni (Fig. 8b) u inibixxa l-espressjoni ATG5 fl-SNpc tal-ġrieden injettati (Fig. 8c). Sibna li Atg5-knockdown reġġa' lura l-effett newroprotettiv ta 'Ka, kif muri mill-espressjoni tal-proteina regolata 'l fuq ta' TH (Fig. 8d u e) u numru akbar ta 'TH plus newroni (Fig. 8f u g). Din id-dejta tkompli tappoġġja l-kontribut tal-awtofaġija għall-effett protettiv tal-Ka fil-ġrieden PD. Bħala konklużjoni, aħna kkonfermajna li Ka jipproteġi kontra l-ħsara kkawżata minn MPTP/p billi jnaqqas l-ossidazzjoni LD u disfunzjoni mitokondrijali billi tippromwovi l-awtofaġija.

4. Diskussjoni

L-istudju preżenti wera li l-molekula żgħira naturali Ka kienet fattur ewlieni li bih is-sinjalar awtofaġiku jista 'jinibixxi t-tossiċità ossidattiva tal-lipidi. Ir-riżultati tagħna wrew li l-mogħdija tal-awtofaġija hija linja regolatorja ewlenija li permezz tagħha Ka ttaffi l-perossidazzjoni tal-LD u l-ħsara mitokondrijali sussegwenti u ffoka fuq ir-rwol tat-tossiċità tal-LD regolata mill-awtofaġija biex ittaffi l-ħsara mitokondrijali filwaqt li tipprevjeni n-newrodeġenerazzjoni minħabba stress ossidattiv eċċessiv (Fig. 9).

L-LDs huma s-siti intraċellulari tal-ħażna newtrali tal-lipidi [5] u huma kritiċi għall-metaboliżmu tal-lipidi u l-omeostażi tal-enerġija, filwaqt li l-disfunzjoni tal-LD ġiet marbuta ma 'ħafna mard [16]. L-evidenza akkumulata ssuġġeriet li r-rwoli li għandhom l-LDs fil-bijoloġija u l-patoloġija huma aktar wiesgħa b'mod sinifikanti milli kien maħsub qabel. Fis-CNS, l-evidenza wriet li LDs miżjuda fin-newroni u l-glia huma implikati fil-patoloġija newrodeġenerattiva [10,36]. Fid-dettall, LDs ġew skoperti kemm fl-axons ta 'newroni Aplysia kkultivati ​​in vitro [37] kif ukoll f'sezzjonijiet tal-moħħ minn Mudelli tal-marda ta 'Huntington [38].Barra minn hekk, intwera li n-newroni huma partikolarment sensittivi għat-tossiċità tal-lipidi, u l-akkumulazzjoni ta' LDs li ma jistgħux jitneħħew f'waqthom twassal għal perossidazzjoni LD aċċellerata u tista 'twassal għal newrodeġenerazzjoni [17].

L-akkumulazzjoni tal-lipidi fin-newroni iperattivi hija tossika mhux biss minħabba s-suxxettibilità ta 'dawn il-lipidi għall-perossidazzjoni. Barra minn hekk, il-kontenuti tal-LDs żejda jistgħu jidħlu f'mogħdijiet metaboliċi mhux ossidattivi, li jikkawżaw produzzjoni eċċessiva ta 'ċeramide, li hija tossika għaċ-ċelloli [39]. Studji reċenti wrew ukoll li f'ċelloli difettużi LD, FAs jistgħu jiġu kkonvertiti f'acylcarnitines, li mbagħad jikkawżaw disfunzjoni mitokondrijali u produzzjoni ta 'ROS [40]. Dawn il-proċessi x'aktarx ikollhom konsegwenzi speċifiċi u profondi fin-newroni iperattivi minħabba li mitokondrija disfunzjonali tikkomprometti l-kapaċità għall-konsum tal-FA, u l-produzzjoni ta 'mtROS tkompli tikkawża perossidazzjoni tal-lipidi tal-membrana.

Għalhekk, l-omeostażi LD għandha tkun ikkontrollata tajjeb fin-newroni, li hija kritika biex tiġi evitata t-tossiċità u fl-aħħar mill-aħħar tinżamm is-saħħa tal-moħħ. Fl-istudju preżenti, sibna li l-molekula naturali żgħira Ka tinibixxi t-tossiċità newronali LD li manifestat bħala żieda fl-akkumulazzjoni ta 'LD, perossidazzjoni elevata tal-lipidi, u espressjoni tal-ġeni relatata mat-tossiċità tal-lipidi regolata 'l fuq f'ċelluli SH-SY5Y insultati MPP#. Aktar importanti minn hekk, aħna wrejna wkoll li t-trattament Ka jnaqqas il-45]. Fl-istudju preżenti, osservajna awtofaġija/lipofaġija difettużi f’ċelloli newronali mweġġa’ b’MPPt, inklużi livelli mnaqqsa ta’ LC3-II u espressjoni p62 elevata, u numru akbar ta' LC3B puncta depożitati fiċ-ċelloli. Lipofaġija difettuża fiċ-ċelluli SH-SY5Y midruba ġiet imreġġa 'lura permezz ta' trattament b'Ka. Bħala konsegwenza, Ka naqqas l-akkumulazzjoni ta 'LDs ossidizzati, mitokondrija bil-ħsara, u ġenerazzjoni ta' mtROS f'ċelloli SH-SY5Y ittrattati b'MPP#. Importanti, l-inibizzjoni ta 'awtofaġija minn 3-MA abolit l-eliminazzjoni medjata mill-Ka ta' LDs ossidizzati u mitokondrija bil-ħsara u t-taffija tal-ħsara tan-newroni DA in vitro. Barra minn hekk, l-inibizzjoni ta 'l-awtofaġija permezz ta' knockdown ta 'Atg5 in vivo reġġa' lura l-effetti protettivi tad-deġenerazzjoni newronali Kaon DA fil-mudell tal-ġurdien PD indott minn MPTP. B'mod kollettiv, dawn is-sejbiet jindikaw li Ka jinibixxi l-ħsara mitokondrijali relatata mat-tossiċità LD billi tippromwovi l-awtofaġija f'mudell PD sperimentali.

L-evidenza akkumulata tindika li ż-żieda fil-ġenerazzjoni ta 'mtROS hija karatteristika primarja ta' newroni ta 'attività għolja u ġiet osservata f'ħafna NDDs, inkluż PD [46]. Rapporti dwar jekk ROS hijiex kawża jew konsegwenza tal-formazzjoni ta 'LD huma kontradittorji [47,48]. Interessanti, ir-riżultati in vitro tagħna wrew li l-inibizzjoni farmakoloġika tal-perossidazzjoni LD b'o-tokoferol ipprevjeniet il-ġenerazzjoni tal-mtROS u l-anormalitajiet potenzjali tal-membrana mitokondrijali u ttaffi t-tnaqqis mitokondrijali, kif muri minn tbajja Tomm20 fiċ-ċelloli SH-SY5Y, li tappoġġja l-idea li l-perossidazzjoni LD għandha rwol kawżali f'disfunzjoni mitokondrijali indotta mill-MPP u l-ġenerazzjoni ta 'mtROS. Madankollu, huwa possibbli li ROS elevati inizjalment jaċċelleraw il-formazzjoni ta 'LD, u sussegwentement, LDs jinduċu aktar ġenerazzjoni ta' ROS u jaggravaw il-livelli ta 'ROS intraċellulari u mitokondrijali.

Fl-istudju preżenti, urejna li ġrieden b'PD indott minn MPTP kellhom livelli għoljin ta 'akkumulazzjoni ta' LD, li kienet akkumpanjata minn żieda fit-telf ta 'newroni DA, stress aċċellerat medjat minn ROS, u defiċits fl-imġieba. It-trattament b'Ka waqqaf it-tossiċità LD in vitro u tejjeb it-telf tan-newroni DA u d-defiċits fl-imġieba fil-mudell tal-ġrieden PD, u dawn l-effetti kienu dipendenti fuq l-awtofaġija. Għalhekk, huwa raġonevoli li jiġi konkluż li Ka jippromwovi l-awtofaġija, u din l-awtofaġija msaħħa tnaqqas l-akkumulazzjoni LD ossidizzata, tnaqqas il-produzzjoni ta 'mtROS, u ttaffi l-ħsara mitokondrijali fin-newroni DA, li tikkontribwixxi għall-inibizzjoni tat-tossiċità LD, u b'hekk ittaffi l-patoloġija tal-PD (Fig. . 9).

Finanzjament

Din ir-riċerka kienet appoġġata minn għotjiet mill-Fondazzjoni Nazzjonali tax-Xjenza Naturali taċ-Ċina (Nru. 81903587), il-Proġett iffinanzjat mill-Fondazzjoni tax-Xjenza Postdottorat taċ-Ċina (Nru.2019M661807), il-Fondazzjoni tax-Xjenza Naturali tal-Provinċja ta 'Jiangsu (Nru. BK20190120), u l- Proġett Miftuħ tad-Dixxiplina tal-Ewwel Klassi tal-Materia Medica Ċiniża tal-Università ta 'Nanjing tal-Mediċina Ċiniża (Nru. 2020YLXK006), u l-Proġett Maġġuri tal-Innovazzjoni tad-Droga (Nru.2018ZX09711001-003-007).

Dan l-artikolu huwa estratt minn Redox Biology 41 (2021) 101911