mtLingwa
Id-dar / Għarfien / Il-kontenut

Għarfien

Ishophloroglucin A Iżolat Minn Ishige Okamurae Jrażżan Melanogenesis Indotta minn -MSH: In Vitro U In Vivo Parti 2

Apr 03, 2023

3. Diskussjoni

sdasdad

Il-kompost DPHC iżolat minn IOE diġà kien irrapporta tyrosinase inibitorjuattività u effett protettivkontra l-ħsara taċ-ċelluli kkaġunata mir-radjazzjoni UV-Bin vitro[8]; madankollu,l-effett kontra l-melanogenesistal-komponenti derivati ​​minn IOE in silico b'interazzjoni ma'tyrosinase,in vivofi studji fenotipiċi f'mudelli ta' annimali, u l-mekkaniżmi molekulari sottostanti tagħhom,għadhom ma ġewx eżaminati. Fl-istudju preżenti, iddeterminajna l-anti-melanogenesis u tyrosinaseattivitajiet inibitorji ta 'IPA, phlorotannin iżolat minn IO u IOE, f'mudell vertebrat ta' zebrafishin vivo u fiċ-ċelluli tal-melanoma B16F10 in vitro, wara induzzjoni ma -MSH.


Trattament ma -MSH huwa magħruf li jinduċi sintesi tal-melanin u attività tyrosinase [20]. Barra minn hekk, tyrosinase intwera li huwa essenzjali għall-melanoġenesi [29]. Studji preċedentiwrew li l-docking molekulari jista’ jintuża biex jevalwa l-attività inibitorja tat-tyrosinase [30,31]. Għalhekk, saru kalkoli ta 'docking molekulari biex jifhmu l-mudell ta' rbit ta 'IPAu DPHC, polyphenol magħruf iżolat minn IO, li żvela enerġija li torbot ogħla fiattività kontra l-melanogenesis minn arbutin, bħala kontroll pożittiv. Skont ir-riżultati (Figura1), IPA żvelat l-inqas punteġġi ta 'docking, li indika li l-interazzjoni ta' IPA mal-miraprotein tyrosinase kien aktar b'saħħtu miż-żewġ komposti l-oħra, DPHC, u arbutin. Madankollu,hemm limitazzjoni fil-korrelazzjoni tal-inibizzjoni tal-attività tat-tyrosinase tal-faqqiegħ ma 'dik taċ-ċellulariproduzzjoni ta’ tyrosinase jew melanin f’melanoċiti kkultivati ​​[32]. Għalhekk, l-effetti inibitorjital-IPA fuqL-attività tat-tyrosinase u l-melanoġenesi ġew eżaminati f'zebrafishin vivomudell u murina B16F10ċelluli tal-melanoma.


Il-pigmenti tal-melanin jakkumulaw fuq il-wiċċ taż-zebrafish, li jippermettu osservazzjoni mikroskopika tal-proċess ta 'pigmentazzjoni mingħajr proċeduri sperimentali kkumplikati, li jagħmluhom mudell adattatgħall-iskrinjar ta' inibituri tal-melanoġenesi [33,34]. Aħna evalwajna l-effetti inibitorji tal-melanintal-IPAu IOE f'mudell ta 'larva ta' zebrafish stimulat minn -MSH permezz tad-determinazzjoni tal-kontenut tal-melanin.Il-kampjuni ttestjati kollha eżerċitaw effetti inibitorji profondifuq il-pigmentazzjoni tal-fish zebra mingħajr ebda sinifikantitossiċità (Figura S2). L-effetti inibitorjita pigmentazzjoni kienu osservati permezz ta analiżi morfoloġika talarva zebrafish relatati mad-differentitrattamenti (Figura2). Barra minn hekk, l-użu ta 'larva ta' stadju bikriaktar milli l-istadju tal-adulti jipprovdi vantaġġ ieħor fl-ittestjar tal-effetti perkutanjital-mediċinajew komposti kosmetiċi [33,35]. F'dan il-każ, għażilna -MSH bħala induttur kemm f'zebrafish in vivou fiċ-ċelloli tal-melanoma B16F10in vitro. Skont iż-żewġ riżultati f'embrijuni ta 'zebrafish u B16F10ċelluli tal-melanoma, il-kontenut tal-melanin żdied bi -Stimolazzjoni MSH.


Il-kontenut ta’ melanin jikkorrelata direttament mal-livelli ta’ attività u proteini ta’ tyrosinase.36]. Għalhekk,iddeterminajna l-effetti inibitorjita 'IPA u IOE fuq l-attività tyrosinase indotta minn -MSH fuqĊelloli B16F10. Sibna li l-grupp ittrattat bl-IPA kellu attività tyrosinase mnaqqsa u melaninkontenut stimulat minn -MSH, bi tnaqqis ta 'madwar 35 fil-mija attività tyrosinase u 40 fil-mijaKontenut tal-melanin (Figura4A, C). IOE inibixxi l-attività ta 'tyrosinase b'mod dipendenti mid-doża unaqas b'mod sinifikanti l-melanoġenesi fiċ-ċelloli B16F10 (Figura4B, D). Meta mqabbel ma 'arbutin, IPA uIOE għandhom effetti inibitorji sinifikantifuq il-produzzjoni tal-melanin u l-attività tyrosinase, li kien liir-riżultati ta 'studji ta' docking molekulari preċedenti.


Biex tinvestiga l-mekkaniżmu ta 'l-effetti inibitorjifuq -Sinteżi tal-melanin indotta mill-MSH fiċelluli, Western blotting sar. Il-livelli ta 'espressjoni ta' proteini relatati mal-melanin, inklużiERK, JNK, u p38, wara trattament b'IPA jew IOE, ġew evalwati. Fosforilazzjoni attivatata 'ERK jista' jippromwovi d-degradazzjoni tal-MITF permezz tal-mogħdija dipendenti fuq ubiquitin-proteasome [28]. Dan jissuġġerixxi li l-inibituri potenzjali tal-melanogenesis jistgħu jrażżnu s-sintesi tal-melanin billi jippromwovuid-degradazzjoni proteasomal tal-MITF, li kienet relatata mal-attivazzjoni tas-sinjalar ERKmogħdijiet [37]. Il-MAPKs ERK, JNK, u p38 jappartjenu għall-familja MAPK [38–40]. Barra minn hekk,attivazzjoni tal-mogħdija p38 MAPK indotta espressjoni MITF [41]. F'dan l-istudju, Western blotanaliżi wriet li l-IPA jippromwovi p-JNK u p-p38 (Figura5B, Ċ). B'kuntrast, il-livelli ta 'p-ERKma nbidilx bit-trattament ta 'IPA u IOE (Figura5A). Dawn ir-riżultati jimplikaw li l-effetti inibitorjita 'IPA u IOE fuq l-attività tyrosinase u melanogenesis jistgħu jkunu relatati mal-JNK u p38mogħdijiet tas-sinjalar.

4. Materjali u Metodi

4.1. Kimiċi u Reaġenti

Dimethylsulfoxide (DMSO), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT),L-DOPA, ormon li jistimula l-alfa-melanocyte ( -MSH) u buffered bil-fosfatsalina (PBS)inxtraw minn Sigma–Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Dulbecco's modifikatIl-medju tal-Ajkla (DMEM) u s-serum bovin tal-fetu (FBS) inkisbu minn Invitrogen–Gibco(Grand Island, NY, USA). Il-kinażi regolata mis-sinjali extraċellulari (ERK1/2), ERK1 fosforilati/2 (p-ERK1/2), c-Jun N-terminal kinase (JNK), JNK fosforilata (p-JNK), p38, fosforilatap38 (p-p38), proteina li torbot l-element tar-rispons cAMP (CREB), CREB fosforilata (p-CREB),fattur tat-traskrizzjoni assoċjat mal-mikroftalmja (MITF), proteina relatata mat-tyrosinase-1 (Trp-2),proteina relatata mat-tyrosinase-1 (Trp-1), tyrosinase (TYR), antikorpi IgG kontra l-ġrieden u l-fenekinxtraw minn Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Ir-reaġenti l-oħra kollha, inklużi -MSH, inxtraw minn Sigma–Aldrich Chemical Co.

4.2. Docking Molekulari ta' Tyrosinase

Għall-istudju tad-docking, l-istruttura tal-kristall ta 'tyrosinase (PDB: 3NM8) inkisbet mill-Bank tad-Data tal-Proteini. L-istudji ta' docking saru bl-użu ta' CDOCKERf'Accelrys Discovery Studio 3.0 (Accelrys, Inc., San Diego, CA, USA). Meta nukleotide sħiħis-sekwenza hija koperta mill-grid tar-riċettur, il-ligandi huma preżunti li jagħżlu l-aħjar pożizzjoni ta’ docking [42]. Il-proċedura ta 'docking kienet imsemmija fl-istudju preċedenti. Fil-qosor, ġew segwiti tliet passi: (1)konverżjoni tal-istruttura 2D fi struttura 3D; (2) kalkolu tal-ħlasijiet; u (3) żieda ta’atomi tal-idroġenu bl-użu tal-programm ta' docking flessibbli [31,43]. 

4.3. Preparazzjoni tal-IOE u l-Iżolament tal-IPA

IO inħasad f'Ġunju 2018 tul il-kosta tal-lvant tal-Gżira ta' Jeju, il-Korea. L-alga inħaslet darbtejnbl-ilma tal-vit biex tneħħi l-melħ, epiphytes, u ramel imwaħħla mal-wiċċ. Sussegwentement, kien bir-reqqalaħlaħ bl-ilma ħelu u nżamm fi friġġ mediku fi−20 ◦C. Wara dan, il-iffriżatalga ġiet lajofilizzata u omoġenizzata bi grinder qabel l-estrazzjoni. L-IOE ġie estratt f'50 fil-mijaetanol (v/v, fl-ilma) taħt tħawwad għal 24 siegħa f'temperatura tal-kamra, imbagħad ġie ffiltrat. Il-filtratestratt kien ikkonċentrat taħt dekompressjoni u mnixxef bil-friża għal trab (IOE). A 50 fil-mija etanolestratt ta' IO tmexxa minn Shinwoo Co. Ltd. (Lott Nru SW9E29SA, Gyeonggi-do, Korea). IPA kieniżolat minn IOE kif deskritt qabel [9]. Fil-qosor, l-IOE ġie frazzjonat bl-użu ċentrifugalikromatografija tal-qsim. Il-frazzjonijiet kollha nġabru u l-IPA eventwalment ġiet ippurifikata minn akolonna semi-preparattiva HPLC (YMC-Pack ODS-A, 10 mm, 250 mm, 5 m). IPA kien determinat bħala apolifenol u l-istruttura kimika tiegħu (Figura S1, Materjali Supplimentari) ġew identifikati permezz ta 'LC/SINJORINAanaliżi b'massam/z ta' 992.1315, u b'hekk tindika formula molekulari ta' C96H66O48 (1986.26 ta'piż molekulari kkalkulat,∆0.6, [M − 2H] 2−). 

4.4. Oriġini u Manutenzjoni ta 'Ġenituri Zebrafish

Zebrafish adulti nkisbu minn negozjant kummerċjali (Seoul Aquarium, Seoul, Korea) u 10ħut kien ippreservat f'tank akriliku 3-L f'28.5◦C, b'dawl 14:10 h: ċiklu skur. Zebrafish kienumitmugħa darbtejn kuljum, għal 6 ijiem⁄ġimgħa, b'ikel supplimentari ta' Tetramin flake (SEWHAPET Food Co.,Seoul, Korea). L-embrijuni nġabru fi żmien 30 minuta permezz ta' riproduzzjoni naturali u indotti filgħodubilli tixgħel id-dawl. L-esperiment zebrafish irċieva approvazzjoni mill-Kura u l-Użu tal-AnnimaliKumitat tal-Università Nazzjonali ta' Jeju (Nru ta' Approvazzjoni 2017-0001).

4.5. Kejl tal-Kontenut ta' Melanin f'Larva tal-Ħut Żebra

IPA u IOE u stimulatur -Konċentrazzjonijiet MSH intużaw biex jeżaminaw l-effettitakonċentrazzjoni fuq l-iżvilupp tal-embrijuni. Ħmistax-il embrijun ta 'zebrafish (3-4 hpf) ġew miżrugħa f'kull wieħedtajjeb, li jinkludi 1.9 mL medju tal-embrijun, fi 12-platt li jinżera sew. Il-kampjuni tat-test ġew maħlulaf'1 fil-mija DMSO b'1× PBS u mħallat sew. Kull filgħodu għall-ewwel 5 pdf, embrijuni vijabbli kienuenumerati biex tinkiseb miżura ta’ sopravivenza. Biex tiddetermina l-kontenut tal-melanin, embrijuni at7–9 hpf ġew miżrugħa fi pjanċa ta' 6-bir bi 30 embrijoni f'kull bir f'medja ta' embrijuni ta' 2.7-mL.Wara 3 ijiem, il-larva tlaħlaħ darbtejn b'1× PBS biex tneħħi kwalunkwe reaġenti residwi jewpartiċelli, u ammonti simili ta 'larva tqiegħdu fis-e-tubi. Qabel ma tkejjel il-melaninkontenut, diversi larvi ta 'kull grupp inqabdu b'mikroskopju, u l-bqija ġew ċentrifugati.


Wara ċ-ċentrifugazzjoni, il-pellet ġie maħlul f'1 mL ta '1 N NaOH f'90◦C għal 60 min. It-taħlitaimbagħad kien imħawwad b'mod vigoruż biex solubilizza l-pigment tal-melanin. L-Assorbenza tas-supernatant kienetimkejjel f'490 nm. Ir-riżultat tqabbel mal-kontroll li kien ikkunsidrat li jirrappreżenta wieħedmija. Il-kontenut ta 'melanin ġie kkalibrat bl-ammont ta' proteina, u l-osservazzjonijiet ġew ripetutifi tliet kopji.

4.6. Ċitossiċità ta 'IPA u IOE fiċ-Ċelloli B16F10

Ċelloli tal-melanoma tal-ġrieden B16F10 inkisbu minn ATCC (American Type Culture Collection,Manassas, VA, USA). Iċ-ċelloli B16F10 ġew ikkultivati ​​f'DMEM supplimentat b'100 U/mL ta' peniċillina,100 µg/mL ta 'streptomycin, u 10 fil-mija FBS. Iċ-ċelloli mbagħad ġew inkubati f'atmosfera ta '5 fil-mija CO2 fi37 ◦C u mbagħad ġew subkultivati ​​kull 3-5 ijiem. Iċ-ċitotossiċità ta 'IPA u IOE kontra B16F10ċelluli ġiet investigata permezz ta 'assaġġ MTT kolorimetriku. Fil-qosor, iċ-ċelluli ġew miżrugħa fi 24-pjanċi tal-bir f'a

konċentrazzjoni ta '2× 104ċelloli/mL. Madwar 16-il siegħa wara ż-żrigħ, iċ-ċelloli ġew inkubati b'IPA u IOEfil differentikonċentrazzjonijiet għal 72 siegħa, u l-vijabbiltà tagħhom ġiet iddeterminata.

4.7. Determinazzjoni tal-Kontenut Ċellulari ta' Melanin

Il-kontenut ta' melanin ċellulari tkejjel bl-użu ta' metodu deskritt qabel [33]. Iċ-ċelloli(2 × 104 ċelloli/mL) ġew inkubati b'diversi konċentrazzjonijiet ta 'IPA u IOE għal 72 siegħa; għalhekk,inħaslu f'PBS kiesaħ bis-silġ. Fil-qosor, iċ-ċelloli ġew inkubati fi 80◦C għal siegħa f'1 mL ta' 1 NNaOH/10 fil-mija DMSO u mbagħad ġew vortexed biex solubilize l-melanin: l-assorbenza kienet imkejla fi450 nm. Id-densità ottika tal-inibizzjoni fil-kontroll kienet ikkunsidrata bħala 100 fil-mija. Id-data humaippreżentati fil-forma ta' persentaġġi medji u r-riżultati ġew ripetuti fi tliet kopji.

















Tista 'Tħobb ukoll