L-investigazzjoni tat-tossiċità ta' Ifosfamide tinduċi Regolatur Upstream Komuni fil-fwied u l-kliewi

Kuntatt: emily.li@wecistanche.com

Hyoung-Yun Han, et al

Astratt:

Ifosfamide huwa aġent alkylating, analogu sintetiku ta 'cyclophosphamide, użat biex jikkura kanċer solidu varji. F'dan l-istudju, it-tossiċità ta 'ifosfamide ġiet evalwata bl-użu ta' amministrazzjoni intraperitoneali ta 'doża waħda u multipla fil-firien taħt linji gwida ta' Prattika Tajba tal-Laboratorju, u ġie segwit esperiment ta 'microarray addizzjonali biex jappoġġja sejbiet tossikoloġiċi. Doża waħda ta' ifosfamide (50 mg/kg) ma induċiet l-ebda tibdil patoloġiku. Sadanittant, kienet osservata tossiċità renali severa fil-gruppi ta' 7 u 28 jum konsekuttivament amministrati, b'żidiet sinifikanti fil-livelli ta' nitroġenu urea fid-demm u kreatinina. Fl-analiżi tal-lista tat-tossiċi, il-ġeni relatati mas-sinteżi tal-kolesterol kienu affettwati l-aktar fil-fwied u l-ġeni relatati mal-insuffiċjenza renali ġew affettwati fil-kliewiwara l-għoti ta’ ifosfamide. Barra minn hekk, il-fattur regolatorju tal-interferon 7 intgħażel bħala r-regolatur prinċipali upstream li nbidel fiż-żewġfwiedukliewi, u nstab li jinteraġixxi ma 'ġeni fil-mira oħra, bħal peptidase speċifiku ta' ubiquitin 18, dominju radikali S-adenosyl methionine li fih 2, u ġene stimulat bl-interferon 15, li kien ikkonfermat aktar b'analiżi RT-PCR f'ħin reali. Bħala konklużjoni, ikkonfermat mill-ġdid it-tossiċità tal-organi ifosfamide preġudikata mill-kliewi u identifikati ġeni mibdula b’mod identiku fiż-żewġfwiedukliewi. Huma meħtieġa aktar studji tossikoġenoloġiċi komprensivi biex jiżvelaw ir-relazzjoni eżatta bejn il-ġeni indotti mill-ifosfamide u t-tossiċità tal-organi.

Kliem ewlieni:ifosfamide; epatotossiċità; nefrotossiċità; tossiċità intraperitoneali

Cistanche huwa tajjeb għall-fwied u l-kliewi

1. Introduzzjoni

Ifosfamide huwa aġent alkylating, analogu sintetiku ta 'cyclophosphamide, użat biex jikkura kanċer solidu varji, inklużi sarkomi u limfomi. Ifosfamide huwa mediċina kontra l-kanċer mhux speċifika taċ-ċiklu taċ-ċelluli li tinterferixxi mar-replikazzjoni tad-DNA u l-produzzjoni tal-RNA [1]. Għalkemm ifosfamide huwa relattivament ittollerat tajjeb meta mqabbel ma 'aġenti tossiċi alkylating oħra, huwa magħruf li huwa assoċjat ma' bosta effetti avversi ta 'theddida għall-ħajja li jillimitaw l-użu kliniku tiegħu [2]. L-effetti sekondarji ewlenin ta’ ifosfamide jinkludu korriment renali sever li jirriżulta minn speċi tossiċi reattivi minn ifosfamide, inkluża akutakliewi korriment, nefrite interstizjali, ċistite emorraġika, u sindromu ta 'Fanconi [3]. Fil-kliniċi, ġiet irrappurtata tossiċità severa ta' organi multipli f'pazjenti li esperjenzaw tossiċità renali bikrija u doża għolja ripetuta ta' ifosfamide indotta insuffiċjenza waħda ta' organu li wasslet għal insuffiċjenza sussegwenti ta' organi [4,5].

Il-metabolit tossiku ta' ifosfamide, acrolein, u chloroacetaldehyde, huwa fattur responsabbli ewlieni għat-tossiċità ta' l-organi ta' ifosfamide. Studji preċedenti ffukaw prinċipalment fuq il-fatturi li jaffettwaw il-konverżjoni ta 'ifosfamide għal metaboliti tossiċi, partikolarment cytochrome P450 (CYP) [6]. CYP3A4 u CYP3A5 relattivament abbundanti fil-kliewi jwasslu għal bidliet tossiċi fl-ifosfamide u jinduċu nefrotossiċità [7]. Acrolein huwa aldehyde reattiv ħafna li jista 'jattiva mogħdija ta' ġeni ossidattivi reattivi intraċellulari u jagħmel ħsara lill-organelle taċ-ċelluli. Chloroacetaldehyde irrapporta s-soppressjoni tal-attivazzjoni tal-kumpless I fil-katina respiratorja mitokondrijali li tista 'twassal għal tnaqqis fil-glutathione intraċellulari (GSH) u mewt taċ-ċelluli [8].

Studju tossikoloġiku ta' organi multipli huwa aktar ta' għajnuna biex wieħed jifhem l-effetti sistemiċi tad-drogi milli jimmira lejn organi speċifiċi għal studji tat-tossiċità. Il-fwied u l-kliewi huma organi ewlenin li jipparteċipaw fil-metaboliżmu u l-eskrezzjoni tad-droga, u dawn l-organi ewlenin huma predisposti għal reazzjonijiet avversi tal-mediċina; tossiċità tal-organi spiss issegwi. Barra minn hekk, evalwazzjoni tossikoloġika integrattiva tista' tippreżenta diversi sejbiet patoloġiċi li jistgħu jgħinu biex jifhmu u jbassru t-tossiċità kkaġunata mid-droga fis-sistema.

Bosta studji użaw profili tal-espressjoni tal-ġeni biex ibassru l-effetti negattivi potenzjali tas-sustanzi kimiċi. Madankollu, il-biċċa l-kbira tal-istudji preċedenti ffukaw fuq l-evalwazzjoni tat-tossiċità ta' organu wieħed fil-mira, b'sintomi patoloġiċi limitati biss [9]. Barra minn hekk, flimkien ma 'profili tal-ġeni bbażati fuq mikroarray, se jipproduċi fehim komprensiv fil-livell tas-sistema tat-tossiċità li jista' jipprevjeni tossiċità potenzjali relatata mad-droga [10]. F'dan ir-rigward, approċċi tossikoloġiċi integrati b'ħafna organi bi profili tal-espressjoni tal-ġeni intużaw fi studji ta 'mudelli ta' tbassir tat-tossiċità biex tingħeleb id-dejta tat-tossiċità derivata mill-evalwazzjoni tat-tossiċità ta 'organu wieħed, li mhix biżżejjed biex tifhem il-mekkaniżmi tossiċi tad-drogi fis-sistema [11].

F'dan l-istudju, aħna niddeskrivu t-tossiċità ta 'ifosfamide fil-kliewiufwiedwara espożizzjoni akuta u ripetuta fil-firien Sprague–Dawley (SD). Twettqu analiżi tal-profil tal-espressjoni tal-ġeni ta’ appoġġ biex jiżvelaw il-ġene fil-mira komuni li nbidel minn ifosfamide kemm fil-fwied kif ukollkliewi, li jissuġġerixxi ħarsa lejn it-tossiċità integrattiva ta 'ifosfamide.

2. Riżultati

2.1. Studju ta' Tossiċità ta' Doża Unika

L-ebda tossiċità ma ġiet osservata fil-gruppi ta '12.5, 25, u 50 mg/kg ifosfamide—mhux mewt, sintomi tossiċi, bidliet fil-piż tal-ġisem, jew sejbiet istopatoloġiċi.

Sadanittant, fl-istudju ematoloġija, l-għadd relattiv ta 'reticulocytes (RET) u l-għadd assolut ta' newtrofili (NEUA) u limfoċiti (LYMA) naqsu b'mod dipendenti mid-doża.

2.2. Studju ta' Tossiċità ta' Doża Ripetuta ta' Ġimgħa

Il-piż totali tal-ġisem naqas wara ġimgħa ta' għoti ta' ifosfamide, u l-valuri medji ta' telf ta' piż tal-ġisem fil-grupp ta' 100 mg/kg kienu ogħla minn dawk fil-grupp ta' 75 mg/kg (Tabella 1). Sadanittant, il-piż relattiv tal-organi żdied gradwalment fi gruppi kkurati b'ifosfamide (Tabella 2).

Ġimgħa ta' amministrazzjoni konsekuttiva ta' ifosfamide IP irażżan l-indiċi ematoloġija, inklużi RBC, HGB, HCT, MCV, u PLT, b'mod dipendenti mid-doża (Tabella 3). Barra minn hekk, BUN u CREA żdiedu 1.2 darbiet fil-grupp ta 'kontroll meta mqabbla mal-grupp ta' ifosfamide (Tabella 4).Kilwakorrimentkien appoġġjat aktar minn studju istopatoloġiku.

L-ebda sinjali istopatoloġiċi ma ġew osservati fil-fwied tal-ġrieden fil-gruppi ta' ifosfamide ta' 75 u 100 mg/kg (Figura 1A). Sadanittant, il-kliewimill-gruppi ta' ifosfamide ta' 75 u 100 mg/kg instabu li kellhom grad minimu sa żgħir ta' alterazzjoni patoloġika, inkluż deġenerazzjoni/dilatazzjoni tubulari (1 moderata fi grupp ta' 100 mg/kg), nekrożi ta' ċellula waħda, iperplażja tal-urotelju, u emorraġija fokali /konġestjoni (Tabella 5). Barra minn hekk, żieda evidenti fl-espressjoni KIM-1 fiż-żona tat-tubuli renali kienet osservata fil-kliewital-grupp ta' 100 mg/kg (Figura 1B).

2.3. Studju ta' Tossiċità ta' Doża Ripetuta ta' Erba' Ġimgħat

Il-mortalità kienet osservata fil-gruppi kkurati b'50 (5/10) u 70 (10/10) mg/kg wara 21 u 10 ijiem ta' amministrazzjoni konsekuttiva, rispettivament. Barra minn hekk, it-tnaqqis fil-piż tal-ġisem b'żieda fil-piż relattiv tal-organi,fwied, ukliewi, fil-gruppi kollha kkurati b'ifosfamide, jappoġġja 4-tossiċità ta' doża ripetuta ta' ġimgħa.

Saru analiżi ematoloġiċi u bijokimiċi tas-serum fuq is-suġġetti li baqgħu ħajjin. Diversi parametri tad-demm, inklużi RET, RBC, MONA, EOSA, u LUCA, naqsu b'mod sinifikanti wara 4 ġimgħat ta' għoti ta' ifosfamide.

Meta mqabbla mal-grupp ta' kontroll, analiżi bijokimiċi wrew differenzi statistiċi wara 4 ġimgħat ta' amministrazzjoni ta' ifosfamide. Pereżempju, il-livelli ta' AST u CK żdiedu b'mod sinifikanti, u l-proporzjon A/G, GLU, u GGT naqsu (p <0.01) fil-grupp="" ikkurat="" ta'="" 50="" mg/kg,="" meta="" mqabbel="" mal-kontroll.="">

2.4. Analiżi tal-Espressjoni tal-Ġene Indotta minn Ifosfamide

Id-DEGs indotti minn ifosfamide ġew identifikati fil-fwied ukliewitessuti (Tabella 6). Għall-fwied, il-ġeni espressi b'mod differenzjat kienu jinkludu 2672 ġeni f'100 mg/kg BW/jum, 1283 ġeni kienu regolati 'l fuq, u 1389 ġeni kienu regolati 'l isfel. Fil-kliewi, 401 ġeni kienu espressi b'mod differenzjat f'100 mg/kg BW/jum — 149 ġeni kienu regolati 'l fuq, u 252 ġeni ġew regolati 'l isfel. Kemm fil-fwied kif ukoll fil-kliewi, in-numru ta 'ġeni regolati 'l isfel kien akbar min-numru ta' ġeni regolati 'l fuq. Dan jista 'jissuġġerixxi li t-trattament ifosfamide jidher li jinibixxi l-espressjoni tal-ġeni.

Ir-riżultati tal-analiżi tal-funzjoni bijoloġika huma elenkati fit-Tabella 7. L-amministrazzjoni ta' 1-ġimgħa ifosfamide instabet li tbiddel il-ġeni relatati mal-iżvilupp tal-organi, l-aktar fil-fwied. Ġolkliewi, ġie kkonfermat li l-ġeni relatati mal-lokalizzazzjoni taċ-ċelluli immuni kienu affettwati l-aktar.

Fl-analiżi tal-mogħdija kanonika tad-DEGs, bidliet fis-sintesi tal-kolesterol u l-ġeni relatati mal-mogħdija tal-preżentazzjoni tal-antiġeni kienu evidenti fil-fwiedukliewitessuti, rispettivament (Figura 2). Barra minn hekk, LXE/RXR u s-sinjalar tar-rispons tal-fażi akuta kienu l-mogħdija kanonika regolata mill-ogħla livell komuni fil-fwiedukliewi, li kienu implikati fl-omeostażi tal-lipidi u s-sinjalar taċ-ċitokini infjammatorji, rispettivament.

Fl-analiżi tal-lista tat-tossiċi tal-fwied, il-ġeni relatati mas-sinteżi tal-kolesterol kienu l-aktar affettwati, segwiti mill-proteini ta 'rispons tal-fażi akuta pożittiva u l-pannell ta' insuffiċjenza renali akuta (Tabella 8). Barra minn hekk, ir-riżultati tal-lista tal-kliewi wrew li l-ġeni relatati mal-insuffiċjenza renali kienu ġeneralment affettwati minn ifosfamide, inklużi bijomarkaturi riversibbli tal-glomerulonefrite u panel ta 'insuffiċjenza renali akuta.

Ibbażat fuq il-bażi ta 'għarfien IPA, regolatur upstream komuni jirregola l-espressjoni tal-ġeni fil-fwied u l-kliewi wara t-trattament ta' ifosfamide (Figura 3). IRF7 kien ir-regolatur ewlieni li nbidel kemm fil-fwied kif ukoll fil-kliewi u nstab li jinteraġixxi ma 'ġeni fil-mira oħra bħal USP18, RSAD2, u ISG15. Barra minn hekk, analiżi RT-PCR f'ħin reali kkonfermat l-espressjoni ta 'IRF7, USP18, RSAD2, u ISG15. Għalkemm il-firxa tal-bidliet f'kull ġene kienet differenti bejn il-fwied u l-kliewi, l-espressjoni kienet mrażżna kemm fit-tessuti tal-fwied kif ukoll tal-kliewi wara ġimgħa ta' amministrazzjoni ta' ifosfamide. L-RSAD2 u l-USP18 l-aktar biddlu ġeni permezz ta' trattament ta' ifosfamide fil-fwied u fil-kliewi, rispettivament.

3. Diskussjoni

F'dan l-istudju, it-tossiċità komprensiva ta' ifosfamide f'organi multipli ġiet esplorata b'dożi u termini ta' espożizzjoni differenti permezz tar-rotta IP fil-firien taħt l-istandard GLP. Fil-kliniċi, ifosfamide jista' jeżerċita azzjoni bimodali kontra t-tumur b'effetti ċitotossiċi u immunomodulatorji flimkien ma' immunoterapija adottiva [12]. Ifosfamide huwa magħruf li jiġi eliminat prinċipalment bir-rotta renali u madwar 80 fil-mija tad-doża hija fil-forma mhux mibdula, in-nefrotossiċità hija effett sekondarju magħruf komunement ta 'ifosfamide, u metaboliti bħal chloroacetaldehyde u acrolein huma responsabbli għall-użu kliniku tiegħu [13, 14].

Fl-istudju preżenti, studju ta' tossiċità ripetut ta' 1-ġimgħa kien adattat biex tiġi esplorata t-tossiċità ta' organi derivati ​​minn ifosfamide. Ġimgħa ta' għoti ta' ifosfamide ssopprimiet l-indiċi tad-demm b'mod dipendenti fuq id-doża, li jista' jirrifletti majelosoppressjoni tipika derivata minn ifosfamide. Flimkien man-nefrotossiċità, bosta rapporti indikaw li majelosoppressjoni hija waħda mit-tossiċità ifosfamide maġġuri li jillimitaw id-doża, u l-lewkopenja hija ġeneralment aktar severa mit-tromboċitopenija [15,16]. In-nefrotossiċità ta' ifosfamide tista' twassal għas-sindromu ta' Fanconi, li fih ikun hemm indeboliment tal-funzjoni tat-tubuli prossimali li jirriżulta f'ħsara irriversibbli, u l-metabolit tossiku acrolein jipprovoka urotossiċità b'ċistite emorraġika [17]. Dan huwa skont ir-riżultati tal-istudju preżenti. Fl-istudju istopatoloġiku, il-kliewi u l-fwied ġew eżaminati biex jiġu esplorati alterazzjonijiet patoloġiċi derivati ​​minn ifosfamide. Kemm fil-gruppi ta' ifosfamide ta' 75 kif ukoll ta' 100 mg/kg, ġew osservati żoni kbar ta' deġenerazzjoni tubulari u dilatazzjoni b'iperplażja tal-urotelju fiż-żona tal-pelvi renali. Barra minn hekk, l-espressjoni ta' KIM-1, molekula ta' ħsara fit-tubuli prossimali renali, appoġġat il-preżenza ta' nefrotossiċità relatata ma' ifosfamide. Sadanittant, fil-fwied kienet osservata biss vakuolazzjoni periportali minima. Barra minn hekk, għalkemm il-valuri AST u ALT naqsu b'mod dipendenti mid-doża, il-bidliet kienu fil-medda ta' referenza [18]. Raġunijiet aktar profondi għal livelli mnaqqsa tal-enżimi tal-fwied se jkollhom bżonn jiġu studjati aktar. Huwa ġeneralment aċċettat li ifosfamide huwa aġent alkylating li mhux frekwenti ma 'l-epatotossiċità, u ftit każijiet biss ġew irrappurtati li jinduċu ħsara fil-fwied, speċjalment meta kkombinat ma' mediċini kimoterapewtiċi oħra bħal doxorubicin [19].

Riċentement, progress notevoli fid-dejta tal-espressjoni tal-ġeni fit-tossikoloġija b'teknoloġiji b'rendiment għoli wassal għall-ġenerazzjoni ta 'settijiet ta' dejta kbar biżżejjed fi studji dwar it-tossiċità, u saru ħafna tentattivi biex jiġi applikat il-profil tal-ġeni għat-tbassir tat-tossiċità kimika [10,20]. F'dan l-istudju, saret analiżi tal-mikroarray biex tanalizza r-rispons tat-traskriptome indott mill-amministrazzjoni ta' ifosfamide, u DEGs b'bidla ta' darbiet akbar minn jew ugwali għal 1.5 ġew magħżula bħala l-ġene fil-mira u ntużaw il-funzjoni bijoloġika, il-mogħdija kanonika u l-analiżi tal-lista Tox. biex tifhem il-funzjoni tal-ġeni indotti minn ifosfamide. Twettqet analiżi tar-regolatur upstream addizzjonali biex tiġi evalwata l-possibbiltà ta 'tossiċità multi-organi fil-fwied u l-kliewi.

F'dan l-istudju, DEGs mibdula 1. 5-darbiet ġew magħżula, u l-ġeni downregulated kienu kemmxejn aktar dominanti mill-ġeni upregulated kemm fil-fwied (52 fil-mija) u fil-kliewi (62 fil-mija). Ir-riżultati tal-analiżi tal-funzjoni bijoloġika indikaw li ifosfamide jibdel il-ġeni, b'funzjonijiet bijoloġiċi relatati mal-iżvilupp tat-tessuti li huma osservati b'mod komuni kemm fil-fwied kif ukoll fil-kliewi.

Studju preċedenti minn Snouber et al. [21] instab li trattament ifosfamide irrapportat jirregola 'l isfel il-mogħdijiet ta' rispons ossidattiv tal-istress medjat minn Nrf-2 fil-kultura mikrofluwidika [21]. B'mod konsistenti mal-istudji preċedenti, il-mogħdija ta 'rispons għall-istress ossidattiv medjat mill-NRF2-kienet modulata b'mod sinifikanti minn netwerks ta' fuq, li kienet ikkonfermata kemm mill-mogħdija kanonika preżenti kif ukoll mill-analiżi tal-lista tat-tox. Il-mogħdijiet preżenti ta' rispons ossidattiv għall-istress medjat minn Nrf-2 mibdula jistgħu jkunu relatati mill-qrib mal-metabolit tossiku ifosfamide. Metaboliti tossiċi ta' ifosfamide multipli jistgħu jirreaġixxu ma' GSH, antiossidant qawwi, biex jiffurmaw konjugati f'siti differenti tul il-mogħdija, u tnaqqis fil-livell ta' GSH jirriżulta f'tossiċità akbar, li tindika l-implikazzjoni ta' stress ossidattiv fit-tossiċità ta' l-organi ta' ifosfamide [8,22] ]. F'dan ir-rigward, mesna u N-acetylcysteine ​​intużaw biex itaffu t-tossiċità tal-organi ifosfamide. Mesna jservi bħala ditossifikant reġjonali billi jorbot mal-metabolit tossiku ta' ifosfamide, prinċipalment kontra l-akroleina, permezz ta' żieda ta' Michael biex tifforma sustanza inqas ta' ħsara [23]. Barra minn hekk, N-acetylcysteine ​​huwa rrappurtat li għandu attività antiossidant u jtejjeb it-tnaqqis tal-GSH taħt kundizzjonijiet ta 'stress ossidattiv [24]. Hemm bżonn ta' aktar studji biex tiġi elucidata r-relazzjoni eżatta bejn l-antidotu ta' ifosfamide u l-passaġġ regolat taħt kundizzjonijiet nefrotossiċi. Nistgħu nispekulaw li t-titjib tat-tossiċità ta' ifosfamide minn mesna jew N-acetylcysteine ​​jista' jiġi segwit minn mogħdijiet imtejba ta' rispons ossidattiv għall-istress medjat minn Nrf-2-.

F'dan l-istudju, is-sinjali relatati ma 'l-infjammazzjoni kienu komunement upregulated kemm fil-fwied kif ukoll fil-kliewi, li jistgħu jiġu rikonoxxuti permezz ta' sinjalazzjoni ta 'fażi akuta fl-analiżi tal-mogħdija kanonika. Dan ir-riżultat indika l-implikazzjoni ta 'reazzjoni infjammatorja fil-patofiżjoloġija tat-tossiċità ta' l-organi ifosfamide fiż-żewġ tessuti, li kienet appoġġjata aktar mill-analiżi tar-regolatur upstream. Fl-analiżi tar-regolatur upstream, ġeni relatati mas-sinjal IRF7 u interferon (IFN), inklużi USP18, RSAD2, u ISG15, intgħażlu bħala regolaturi upstream komuni fil-fwied u fil-kliewi. IRF7 huwa fattur speċifiku għal-limfoid, li huwa espress b'mod kostituttiv fiċ-ċitoplasma taċ-ċellula immuni, u jista 'jiġi indott ukoll minn interferon tat-tip I, infezzjoni tal-virus, u stimuli esterni f'diversi ċelloli [25]. Studju preċedenti rrapporta proprjetajiet kontroversjali pro- jew anti-onkoġeniċi ta 'IRF7 f'diversi ċelluli tat-tumur, u l-bidliet fl-espressjoni ta' IRF7 kienu assoċjati ma 'ħsara fid-DNA [26-28].

Minbarra r-rwol regolatorju importanti tiegħu fl-IFN tat-tip I għal funzjonijiet antivirali, IRF7 ġie rrappurtat li jrażżan ir-risponsi infjammatorji permezz tal-mogħdija ta 'sinjalazzjoni TLR4 [29]. Barra minn hekk, Stout-Delgado et al. [30] irrapporta li l-inkrement ossidattiv ikkawżat mit-tixjiħ ifixkel l-attività tal-IRF7, filwaqt li t-tnaqqis tal-istress minn aġenti antiossidanti tejbet l-attività tal-IRF7. F'dan l-istudju, l-amministrazzjoni ta 'ifosfamide soppressa l-espressjoni ta' regolaturi upstream, u l-mudelli ta 'espressjoni kienu identiċi kemm fil-fwied kif ukoll fil-kliewi. Il-bidliet preżenti fl-espressjoni tal-IRF7 jistgħu jirrelataw mar-reazzjoni infjammatorja u l-proprjetà tal-aġent alkylating ċitotossiku tal-ifosfamide, li jistgħu jissuġġerixxu IRF7 bħala mira promettenti għat-tossiċità tal-organi tal-ifosfamide.

F'dan l-istudju, sibna ġene li kien inibit b'mod identiku kemm fil-fwied kif ukoll fil-kliewi wara l-amministrazzjoni ta 'ifosfamide, iżda l-interpretazzjoni tas-sinifikat tossikoloġiku tagħha kienet iffukata biss fuq il-kliewi, li tillimita l-iskoperta attwali. Barra minn hekk, studji konfermatorji ulterjuri relatati mal-effett tal-antidotu ifosfamide disponibbli kummerċjalment fuq il-ġene mibdula bħalissa jistgħu jappoġġjaw is-sejbiet preżenti.

Bħala konklużjoni, studju ripetut ta' tossiċità (ġimgħa) ta' amministrazzjoni ta' ifosfamide instab li kellu nefrotossiċità preġudikata aktar milli epatotossiċità. Barra minn hekk, ir-riżultati preżenti jipprovdu evidenza għal epatotossiċità u nefrotossiċità indotta minn ifosfamide li jinvolvi l-inibizzjoni tal-IRF-7. Hemm bżonn ta' aktar studji tossikoġeniċi ta' organi relatati mal-immunità biex jiġi eluċidat il-mekkaniżmu tossikoloġiku sistemiku ta' ifosfamide, u biex isostnu r-relazzjoni bejn it-tossiċità tal-ġeni u l-organi.

4. Materjali u Metodi

4.1. Studju fuq l-Annimali

Firien Sprague–Dawley (SD) ta' tmien ġimgħat speċifiċi għall-irġiel (n=140) inkisbu minn Orient Bio Inc. (Seongnam, Korea). L-annimali ġew eżaminati u akklimatizzati għal kundizzjonijiet ambjentali tal-laboratorju għal ġimgħa qabel l-esperiment. L-annimali kollha kienu miżmuma f'gaġeġ tal-plastik taħt kundizzjonijiet kontrollati tal-laboratorju (temperatura, 23 ± 3 ◦C; umdità, 55 ± 10 fil-mija; u ċiklu ta 'dawl/dlam 12/12-h) b'chow tal-laboratorju u ilma ad libitum. L-istudju tal-annimali ġie approvat mill-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Istitut tat-Tossikoloġija tal-Korea (Daejeon, Korea), u l-proċeduri kollha twettqu f'konformità mal-Linji Gwida tal-Ittestjar għall-Evalwazzjoni tas-Sigurtà tad-Drogi mill-Amministrazzjoni tal-Ikel u d-Droga tal-Korea. L-istudju fuq l-annimali kien maqsum fi tliet sezzjonijiet: doża waħda (akuta) u doża ripetuta (ġimgħa u 4 ġimgħat) studju ta’ tossiċità ta’ amministrazzjoni konsekuttiva. Erbgħin firien ġew assenjati b'mod każwali għal erba 'gruppi (kontroll, t1,t2, u t3) bl-użu tas-sistema Path/Tox (verżjoni. 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA) f'kull studju tat-tossiċità.

4.2. Esperiment ta' Tossiċità

L-istudju dwar it-tossiċità kien maqsum fi tliet sezzjonijiet: studji dwar it-tossiċità ta' doża waħda (akuta) u żewġ dożi ripetuti (doża konsekuttiva ta' ġimgħa jew 4 ġimgħat). Għal kull studju ta' tossiċità, il-firien ġew assenjati b'mod każwali fi gruppi adegwati (kontroll, doża 1, doża 2, u doża 3 għal studji ta' tossiċità waħda u ta' 4-ġimgħa; kontroll, doża 1, u doża 2 għal 1- studju tat-tossiċità tal-ġimgħa) billi tuża s-sistema Path/Tox (verżjoni. 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA). Fl-istudju dwar it-tossiċità, ifosfamide ġie amministrat permezz tar-rotta intraperitoneali (IP), u l-grupp ta' kontroll irċieva ilma distillat (DW). Id-doża ta' ifosfamide użata fl-istudju dwar it-tossiċità kienet kif ġej: studju dwar it-tossiċità akuta (12.5, 25, u 50 mg/kg), 1-studju dwar it-tossiċità fil-ġimgħa (75 u 100 mg/kg BW/jum), u {{19 }}studju ta' tossiċità fil-ġimgħa (25, 50, u 70 mg/kg BW/jum). Is-sintomi kliniċi ġenerali tal-annimali, il-piż tal-ġisem, u l-mortalità ġew irreġistrati kuljum waqt l-amministrazzjoni, u l-annimali kollha ġew sagrifikati 24 siegħa wara l-aħħar amministrazzjoni ta’ ifosfamide. Inġabru kampjuni tad-demm u tqiegħdu f'tubi mikroċentrifugi u tubi EDTA-K2 għall-bijokimika tas-serum u analiżi ematoloġika, rispettivament. It-tessuti tal-fwied u tal-kliewi ġew iffissati f'formaldehyde u suġġetti għal analiżi istopatoloġika. Twettqu immunoistokimika addizzjonali, analiżi tal-mikroarray, u RT-PCR f'ħin reali fuq it-tessuti tal-fwied u tal-kliewi mill-istudju tat-tossiċità subakuta (100 mg/kg BW/jum).

4.3. Analiżi Ematoloġika u Bijokimika tas-Serum

Twettqu testijiet ematoloġiċi standard bl-użu ta 'sistema ematoloġija ADVIA 120 (Bayer, Fernwald, il-Ġermanja). Intużaw l-indikaturi li ġejjin: għadd taċ-ċelluli bojod tad-demm (WBC), għadd taċ-ċelluli ħomor tad-demm (RBC), ematokrit (HCT), konċentrazzjoni tal-emoglobina, volum korpuskulari medju (MCV), emoglobina korpuskulari medja (MCH), għadd tal-plejtlits (PLT), għadd ta' limfoċiti (LYM), monoċiti (MON), newtrofili (NEU), basofili (BAS), eosinofili (EOS), u ċelluli kbar mhux imtebba (LUC), u reticulocyte (RET).

L-assaġġ tal-bijokimika twettaq bl-użu ta 'analizzatur awtomatiku (TBA 120FRNEO; Toshiba Corp., Tokyo, Ġappun) b'serum ċentrifugat. L-indikaturi bijokimiċi ewlenin kienu alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP), nitroġenu tal-awrina tad-demm (BUN), kreatinina (CREA), glukosju (GLU), kolesterol totali (TCHO), proporzjon albumina/globulina (A/G), trigliċeridi (TG), bilirubin totali (TB), gamma-glutamyl transferase (GGT), fosfolipidi (PL), kalċju, klorur, sodju inorganiku, fosfru u potassju.

4.4. Eżami istopatoloġiku u Immunoistokimika

Tessuti inkorporati fil-paraffin ġew qasmu bi ħxuna ta' 5-µm, imtebba' b'ematossilina u eosina (H&E), u eżaminati mikroskopikament.

It-tessut tal-kliewi kien soġġett għal immunoistokimika. Is-sezzjonijiet deparaffinizzati u maħsula ġew preinkubati b'10 fil-mija serum tal-mogħoż biex jimblokka t-tbajja' mhux speċifika. Il-pjastri mbagħad ġew inkubati matul il-lejl bl-antikorp primarju anti-KIM1 (1:750; Santa Cruz, CA, USA). Wara t-tneħħija ta 'antikorpi primarji, it-taqsimiet ġew ipproċessati b'VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Vector Laboratories, Peterborough, UK), u KIM1expression ġiet eżaminata taħt mikroskopju tad-dawl.

4.5. Analiżi ta' Microarray u Analiżi ta' Interazzjoni Proteina-Proteina (PPI).

Il-fwied u l-kliewi mill-grupp 1-ġimgħa (100 mg/kg) ġew omoġenizzati, u l-RNA totali ġie estratt b'kitt mini RNase (Qiagen). Is-sinteżi ta 'cDNA inkisbet bl-użu ta' Kit ta 'Sinteżi ta' cDNA (Affymetrix, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) u suġġetta għal analiżi ta 'microarray u PPI.

Analiżi tal-mikroarray saret bl-użu ta' Affymetrix GeneChip Rat {{0}}.0 ma' GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix Santa Clara, CA, USA), u l- ir-riżultati ġew ipproċessati bl-użu ta 'softwer ta' analiżi GeneSpring GX v13.0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Il-ġeni espressi b'mod differenzjali (DEGs), li nbidlu aktar minn 1.5-darbiet wara l-għoti ta' ifosfamide, intgħażlu bl-użu ta' analiżi ta' varjanza f'direzzjoni waħda (ANOVA) bit-test post hoc ta' Tukey. Il-funzjonijiet bijoloġiċi u l-mogħdijiet kanoniċi tad-DEG magħżula ġew analizzati bl-użu tas-softwer Ingenuity Pathway Analysis (IPA, ver. 9.0; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA), u saret analiżi tar-regolatur upstream biex tidentifika r-regolaturi upstream li jistgħu ikun responsabbli għad-DEGs derivati ​​mit-tossiċità ta' ifosfamide. Analiżi addizzjonali tan-netwerk tal-interazzjoni proteina-proteina (PPI) tad-DEGs saret bl-użu ta 'softwer STRING (verżjoni 10), u l-interazzjoni ġiet ikkonfermata meta l-punteġġ ta' kunfidenza medju kien aktar minn 0.4. L-interazzjoni tal-proteini hija l-probabbiltà approssimattiva li teżisti rabta mbassra bejn żewġ proteini fil-mogħdija tal-Enċiklopedija ta 'Kyoto tal-Ġeni u l-Ġenomi.

4.6. Studju kwantitattiv ta' RT-PCR f'ħin reali

L-espressjoni ta 'ġeni regolaturi komuni fl-istudju tal-mikroarray ġiet ikkonfermata bl-użu ta' RT-PCR kwantitattiv f'ħin reali. Primers speċifiċi għall-ġeni nkisbu minn Bioneer (Daejeon, Korea). Is-sekwenzi tal-primer kienu kif ġej: fattur regolatorju tal-interferon 7 (IRF7): 'il quddiem, 5-TGCTTGTCTAGCACCAATAG-3 u lura, 5-CACAAGGTCCACTAGAGATG-3; Ubiquitin peptidase 18 speċifiku (USP18): 'il quddiem, 5-CTGTAGTTTGTCTCCCAACA-3 u reverse 5-GAACTGATTACCTCCCACTG-3; dominju radikali S-adenosyl methionine li fih 2(RSAD2): 'il quddiem, 5-ACCAATCATCAGAGGTTGAC-3 u lura, 5-CTGCATGATTGTTCTTGGAC-3; ġene stimulat bl-interferon 15 (ISG15): 'il quddiem, 5-AAGTCTCCCAAGACCAATTC-3u lura, 5-CTACATTGGCTCTGGATAGG-30.

L-RNA totali ġie traskritt b'lura għal cDNA bl-użu ta 'SuperScript II (Invitrogen, Carls bad, CA, USA) u primers oligo-dT, skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Livelli ta 'espressjoni ta' mRNA ta 'ġeni relatati ma' regolazzjoni upstream ġew analizzati bl-użu tas-Sistema ta 'PCR theStepOnePlus Real-Time (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) b'taħlita prinċipali anSYBR Green (Bijosistemi Applikati), skond il-protokoll tal-manifattur. Il-primer tal-RNA ribosomali 18S intuża bħala kontroll intern, u r-riżultati ġew espressi bħala bidla darbiet relattiva għall-grupp ta 'kontroll normali.

4.7. Analiżi Statistika

Id-dejta ġiet analizzata statistikament bl-użu ta' metodi ta' tqabbil multipli. Meta t-test ta 'Bartlett ma wera l-ebda devjazzjonijiet sinifikanti mill-omoġeneità tal-varjanza, intużat analiżi tal-varjanza (ANOVA) biex tiddetermina jekk xi waħda mill-medja tal-grupp kinitx differenti fil-livell ta' sinifikat ta 'p <{{0}}.05. barra="" minn="" hekk,="" it-test="" ta="" 'dunnett="" intuża="" biex="" jiddetermina="" differenzi="" fid-dejta="" bejn="" il-gruppi="" ta'="" kontroll="" u="" ta="" 'trattament="" meta="" d-dejta="" nstabet="" li="" kienet="" sinifikanti="" mit-test="" anova.="" barra="" minn="" hekk,="" meta="" ġew="" osservati="" devjazzjonijiet="" sinifikanti="" mill-omoġeneità="" tal-varjanza="" mit-test="" ta="" 'bartlett,="" sar="" test="" ta'="" paragun="" mhux="" parametriku,="" it-test="" kruskal-wallis="" (h),="" biex="" jiddetermina="" jekk="" xi="" waħda="" mill-mezzi="" tal-grupp="" kienx="" differenti="" fil-p="">< 0.05.="" meta="" ġiet="" osservata="" differenza="" sinifikanti="" fit-test="" kruskal–wallis="" (h),="" sar="" is-subtest="" tar-rank="" ta'="" dunn="" biex="" jikkwantifika="" l-pari="" speċifiċi="" ta'="" data="" tal-grupp="" li="" kienu="" differenti="" b'mod="" sinifikanti="" mill-medja.="" it-test="" eżatt="" ta'="" fisher="" sar="" biex="" iqabbel="" pari="" ta'="" data="" (inklużi="" l-prevalenza="" u="" l-perċentwali).="" il-livell="" ta'="" probabbiltà="" ġie="" stabbilit="" għal="" 1="" jew="" 5="" fil-mija.="" analiżi="" statistiċi="" saru="" billi="" tqabbel="" id-dejta="" mill-gruppi="" ta="" 'trattament="" differenti="" ma'="" dawk="" tal-grupp="" ta="" 'kontroll="" bl-użu="" ta'="" path="" tox="" (verżjoni.="" 4.2.2,="" xybion="" medical="" systems="" corporation,="" lawrenceville,="" nj,="">

Dikjarazzjoni tad-Disponibbiltà tad-Data:

Id-dejta tinsab fl-artikolu jew Materjali Supplimentari.

Kunflitti ta' Interess:

L-awturi jiddikjaraw li m'għandhom l-ebda interessi li jikkompetu.

Referenzi

1. Palmerini, E.; Setola, E.; Grignani, G.; D'Ambrosio, L.; Comandone, A.; Righi, A.; Longhi, A.; Cesari, M.; Paioli, A.; Hakim, R.; et al. Doża għolja ta' ifosfamide f'pazjenti b'osteosarkoma ta' grad għoli li rkadew u li ma jistgħux jiġu rtirati: Serje retrospettiva. Cells 2020, 9, 2389. [CrossRef]
2. Klastersky, J. Effetti sekondarji ta 'ifosfamide. Onkoloġija 2003, 65, 7–10. [CrossRef]
3. Sprangers, B.; Lapman, S. L-uġigħ li qed jikber ta 'ifosfamide. Clin. Kidney J. 2020, 13, 500–503. [CrossRef]
4. Elija, AD; Ayash, LJ; Wheeler, C.; Schwartz, G.; Tepler, I.; McCauley, M.; Mazanet, R.; Schnipper, L.; Frei, E., 3rd; Antman, KH Ifosfamide/carboplatin/etoposide b'doża għolja b'appoġġ awtologu taċ-ċelloli staminali ematopojetiċi: Sigurtà u direzzjonijiet futuri. Semin. Oncol. 1994, 21, 83–85. [PubMed]
5. Mollenkopf, A.; Du Bois, A.; Meerpohl, HG Kors sekwenzjali u ġestjoni prospettiva tat-tossiċità multi-organi indotta minn ifosfamide. Geburtshilfe Frauenheilkd. 1996, 56, 525–528. [CrossRef]
6. Aleksa, K.; Matsell, D.; Krausz, K.; Gelboin, H.; Ito, S.; Koren, G. Cytochrome P450 3A u 2B6 fil-kilwa li qed tiżviluppa: Implikazzjonijiet għan-nefrotossiċità ta' ifosfamide. Pediatr. Nephrol. 2005, 20, 872–885. [CrossRef] [PubMed]
7. Lowenberg, D.; Thorn, CF; Desta, Z.; Flockhart, DA; Altman, RB; Klein, TE PharmGKB sommarju: Mogħdijiet ta' Ifosfamide, farmakokinetiċi u farmakodinamiċi. Pharmacogenet. Genom. 2014, 24, 133. [CrossRef] [PubMed]
8. MacAllister, SL; Martin-Brisac, N.; Lau, V.; Yang, K.; O'Brien, PJ Acrolein u chloroacetaldehyde: Eżami tal-bijomarkaturi tat-tossiċità mingħajr ċelluli u mingħajr ċelluli. Chem. Biol. Interaġixxi. 2013, 202, 259–266. [CrossRef]
9. Kim, J.; Shin, M. Mudell integrattiv ta 'previżjoni tat-tossiċità kkaġunata minn mediċini multi-organi bl-użu ta' data ta 'espressjoni tal-ġeni. BMC Bioinform. 2014, 15, S2. [CrossRef]
10. Alexander-Dann, B.; Pruteanu, LL; Oerton, E.; Sharma, N.; Berindan-Neagoe, I.; Módos, D.; Bender, A. Żviluppi fit-tossikoġenomika: Fehim u tbassir tat-tossiċità indotta mill-kompost mid-dejta tal-espressjoni tal-ġeni. Mol. Omics 2018, 14, 218–236. [CrossRef]
11. An, YR; Kim, JY; Kim, YS Kostruzzjoni ta' mudell ta' tbassir għall-evalwazzjoni tat-tossiċità ta' organi multipli. Mol. Cell Toxicol. 2016, 12, 1–6. [CrossRef]
12. Binotto, G.; Trentin, L.; Semenzato, G. Ifosfamide u cyclophosphamide: Effetti fuq l-immunosorveljanza. Onkoloġija 2003, 65, 17–20. [CrossRef]
13. Schwerdt, G.; Gordjani, N.; Benesic, A.; Freudinger, R.; Wollny, B.; Kirchhoff, A.; Gekle, M. Chloroacetaldehyde- u acroleininduced mewt taċ-ċelluli tat-tubuli prossimali tal-bniedem. Pediatr. Nephrol. 2006, 21, 60–67. [CrossRef]
14. Energueix, G.; Pallet, N.; Joly, D.; Levi, C.; Chauvet, S.; Trivin, C.; Augusto, JF; Boudet, R.; Aboudagga, H.; Touchard, G.; et al. Nefrotossiċità ta' ifosfamide f'pazjenti adulti. Clin. Kidney J. 2020, 13, 660–665. [CrossRef]
15. Dechant, KL; Brogden, RN; Pilkington, T.; Faulds, D. Ifosfamide/mesna. Reviżjoni tal-attività antineoplastika tagħha, il-proprjetajiet farmakokinetiċi, u l-effikaċja terapewtika fil-kanċer. Drogi 1991, 42, 428–467. [CrossRef]
16. Pronk, LC; Schrijvers, D.; Schellens, JHM; De Bruijn, EA; Tħawwil, A.; Locci-Tonelli, D.; Groult, V.; Verweij, J.; Van Oosterom, AT Fażi I studju fuq docetaxel u ifosfamide f'pazjenti b'tumuri solidi avvanzati. Br. J. Kanċer. 1998, 77, 153–158. [CrossRef] [PubMed]
17. Skinner, R. Nefrotossiċità kronika ta' ifosfamide fit-tfal. Med. Pediatr Oncol. 2003, 41, 190–197. [CrossRef]
18. Sharp, P.; Vilano, JS Il-Firien tal-Laboratorju; CRC Press: Boca Raton, FL, USA, 2012.
19. Cheung, MC; Jones, RL; Judson, I. Tossiċità akuta tal-fwied b'ifosfamide fit-trattament ta 'sarkoma: Rapport ta' każ. J. Med. Kawża Rep 2011, 5, 180. [CrossRef]
20. Cui, Y.; Paules, RS Użu ta 'traskriptomika biex jifhmu mekkaniżmi ta' tossiċità indotta mid-droga. Pharmacogenomics 2010, 11, 573–585. [CrossRef]
21. Snouber, LC; Jacques, S.; Monge, M.; Legallais, C.; Leclerc, E. Analiżi transcriptomic ta 'l-effett ta' ifosfamide fuq ċelluli MDCK ikkultivati ​​f'biochips mikrofluwidi. Genomics 2012, 100, 27–34. [CrossRef] [PubMed]
22. Dirven, HA; Megens, L.; Oudshoorn, MJ; Dingemanse, MA; van Ommen, B.; Van Bladeren, PJ Glutathione konjugazzjoni tal-mediċina ċitostatika ifosfamide u r-rwol tal-glutathione S-transferases tal-bniedem. Chem. Riż. Tossikol. 1995, 8, 979–986. [CrossRef]
23. Jeelani, R.; Jahanbakhsh, S.; Kohan-Ghadr, HR; Thakur, M.; Khan, S.; Aldhaheri, SR; Yang, Z.; Andreana, P.; Morris, R.; Abu-Soud, HM Mesna (2-mercaptoethane sodium sulfonate) jiffunzjona bħala regolatur tal-myeloperoxidase. Free Radic. Biol. Med. 2017, 110, 54–62. [CrossRef]

24. Alnahdi, A.; John, A.; Raza, H. N-acetyl cysteine ​​jnaqqas l-istress ossidattiv u l-iżbilanċ redox dipendenti fuq il-glutathione ikkawżat minn trattament għoli ta 'glucose/aċidu palmitiku għoli fiċ-ċelloli Rin-5F pankreatiċi. PLoS ONE 2019, 14, e0226696. [CrossRef]

25. Zhang, L.; Pagano, JS IRF-7, fattur regolatorju tal-interferon ġdid assoċjat mal-latenza tal-virus Epstein–Barr. Mol. Cell Biol. 1997, 17, 5748–5757. [CrossRef]
26. Pagano, JS Viruses u limfomi. N. Engl. J. Med. 2002, 347, 78–79. [CrossRef]
27. Romieu-Mourez, R.; Solis, M.; Nardin, A.; Goubau, D.; Barun-Bodo, V.; Lin, R.; Massie, B.; Salcedo, M.; Hiscott, J. Rwoli distinti għall-fattur regolatorju IFN (IRF)-3 u IRF-7 fl-attivazzjoni tal-proprjetajiet antitumorali tal-makrofaġi umani. Cancer Res. 2006, 66, 10576–10585. [CrossRef]
28. Ning, S.; Pagano, JS; Barber, GN IRF7: Attivazzjoni, regolazzjoni, modifika, u funzjoni. Genes Immun. 2011, 12, 399–414. [CrossRef]
29. Chen, PG; Guan, YJ; Zha, GM; Jiao, XQ; Zhu, HS; Zhang, CY; Wang, YY; Li, HP Swine IRF3/IRF7 attenwa r-risponsi infjammatorji permezz ta 'passaġġ ta' sinjalazzjoni TLR4. Oncotarget 2017, 8, 61958. [CrossRef]
30. Stout-Delgado, HW; Yang, X.; Walker, WE; Tesar, BM; Goldstein, DR It-tixjiħ ifixkel ir-regolazzjoni 'l fuq tal-fattur regolatorju 7 ta' IFN fiċ-ċelloli dendritiċi tal-plażmaċitoid waqt l-attivazzjoni ta' TLR9. J. Immunol. Riż. 2008, 181, 6747–6756. [CrossRef]