Interferenza ta 'Glycosides Phenylethanoid Minn Cistanche Tubulosa Bl-Assaġġ MTT

Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Yu-Jie Wang, Si-Min Zhou, Gang Xu u Yu-Qi Gao

Astratt:

L-assaġġ MTT, bħala metodu ta 'screening, intuża ħafna biex ikejjel il-vijabbiltà u l-proliferazzjoni taċ-ċelloli. Madankollu, għandu jiġi nnutat li l-assaġġ MTT jista 'ma jirriflettix b'mod preċiż l-effett ta'Cistanche tubulosaestratt etanoliku fuq il-vijabbiltà taċ-ċelloli EA.hy926. Biex tinvestiga u tidentifika l-komponenti responsabbli għall-osservazzjonijiet kontradittorji tal-assaġġ MTT, echinacoside, u acteoside, ġew iżolati żewġ glikożidi feniletanojdi ewlenin, minn estratt etanoliku ta 'C. tubulosa. Id-dejta derivata minn analiżi CCK-8, Hoechst 33342 u annexin V-FITC/PI tissuġġerixxi li l-grupp caffeoyl preżenti fiż-żewġ komposti iżolati kien responsabbli għar-riżultati konfliġġenti tal-assaġġ MTT. Din id-dejta tenfasizza l-ħtieġa li jintużaw varjetà ta 'metodi differenti biex jiġi ddeterminat l-effett ta' aġenti mediċinali fuq il-vijabbiltà taċ-ċelluli biex jiġi evitat li jiġġeneraw riżultati qarrieqa.

Kliem ewlieni: Assaġġ MTT;phenylethanoid glycoside; aċidu kafejku; vijabbiltà taċ-ċelluli; interferenza

Introduzzjoni

L-impjant parassitikuCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (familja Orobanchaceae) huwa mqassam b'mod wiesa 'fl-Afrika ta' Fuq, Għarab, u pajjiżi Asjatiċi [1]. Il tirriżulta minnCistanche tubulosauCistanche deserticolahuma importanti fil-mediċina tradizzjonali Ċiniża, billi ntużaw għat-trattament ta 'impotenza, sterilità, lumbago, u stitikezza minħabba l-inerzja tal-kolon [2]. Barra minn hekk, l-estratt etanoliku ta 'Cistanche tubulosa intwera li għandu effett protettiv sinifikanti kontra l-ipoksja ċerebrali fil-ġrieden [3].

Iċ-ċelloli endoteljali għandhom rwol kruċjali fil-patoġenesi ta 'pressjoni għolja pulmonari iposika. Il-linja taċ-ċelluli endoteljali EA.hy926 hija konsiderevolment simili għal ċelloli endoteljali primarji. Matul l-istudju tagħna stess ta 'l-effett anti-hypoxic ta'Cistanche tubulosaestratt etanoliku fuq iċ-ċellula endoteljali EA.hy926, aħna ndunajna li l-3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assaġġ, li huwa komunement użat biex jevalwa l-vijabbiltà taċ-ċelluli fi studji ta 'ċitotossiċità u attività ċitostatika, iġġenerat riżultati konfliġġenti billi wera żieda fil-vijabbiltà taċ-ċelluli EA.hy926 wara t-trattament.

Valutazzjoni preċiża tal-vijabbiltà taċ-ċelluli hija essenzjali biex jiġu identifikati effetti potenzjali ċitotossiċi jew ċitoprotettivi ta' aġent mediċinali. Aħna, għalhekk, investigajna liema komponenti preżenti fl-estratt etanoliku ta 'C. tubulosa jistgħu jkunu responsabbli għar-riżultati konfliġġenti osservati bl-assaġġ MTT. Aħna iżolati żewġ phenylethanoid glycosides (PhGs) ewlenin minn estratt etanoliku ta 'C. tubulosa, echinacoside (minn hawn 'il quddiem kompost 1) u acteoside (minn hawn 'il quddiem kompost 2), u ddeterminajna l-effett tagħhom fuq il-vijabbiltà taċ-ċelluli EA.hy926 bl-użu ta' varjetà ta 'metodi. Barra minn hekk, sabiex niċċaraw aktar liema sostituent tal-komposti 1 u 2 jista' jkun responsabbli għar-riżultati kontradittorji, aħna ttestjajna l-aglycones, l-aċidu caffeic (minn hawn 'il quddiem kompost 3) u 3,4-dihydroxylphenylethanol (minn hawn 'il quddiem il-kompost 4), fuq il-vijabilità taċ-ċelluli EA.hy926 bl-użu tal-istess metodi.

Riżultati u diskussjoni

Identifikazzjoni ta' Komposti

L-istrutturi taż-żewġ komposti iżolati mill-estratt etanoliku ta’ C. tubulosa ġew identifikati permezz ta’ analiżi ta’ reżonanza manjetika nukleari (NMR) u spettrometrija tal-massa (MS) u huma murija fil-Figura 1. Il-kompost 1 ġie identifikat bħala echinacoside meta mqabbel ma’ NMR irrappurtat qabel (Tabella 1) u MS (m/z 785 [M−H]− ) data [4]. L-ispettri tal-NMR tal-kompost 2 kienu simili ħafna għal dawk tal-kompost 1, ħlief għan-nuqqas ta 'grupp -D-glucopyranosyl (Tabella 1). Il-kompost 2 (m/z 623 [M−H]− ) ġie identifikat bħala acteoside [5]. Importanti, iż-żewġ komposti għandhom l-istess aglycone, li jinkludi l-aċidu caffeic (kompost 3) u 3,4-dihydroxylphenylethanol (kompost 4).

Assaġġi tal-Vijabilità taċ-Ċelloli

Intużaw analiżi MTT u CCK{{0}} biex janalizzaw l-effett tal-komposti 1-4 fuq il-vijabbiltà taċ-ċelluli EA.hy926. L-assaġġ MTT wera li l-vijabbiltà taċ-ċelloli EA.hy926 żdiedet b'mod sinifikanti wara t-trattament b'25 u 50 μM kompost 1, 2, jew 3 (166.3 fil-mija u 174.1 fil-mija għall-kompost 1, 205.8 fil-mija u 224.3 fil-mija għall-kompost). 2, u 164.8 fil-mija u 189.6 fil-mija għall-kompost 3, rispettivament; p <0.05), meta="" mqabbla="" maċ-ċelloli="" ta="" 'kontroll="" (figura="" 2a).="" barra="" minn="" hekk,="" spezzjoni="" morfoloġika="" taċ-ċelloli="" ddeterminat="" li="" t-trattament="" b'50="" μm="" kompost="" 1,="" 2,="" jew="" 3="" żied="" il-formazzjoni="" ta="" 'kristalli="" tal-formazan="" vjola,="" li="" huma="" kkunsidrati="" bħala="" indikazzjoni="" diretta="" tal-proporzjon="" ta'="" ċelluli="" ħajjin="" (figura="" 3).="" bil-maqlub,="" l-assaġġ="" cck-8="" issuġġerixxa="" li="" l-vijabbiltà="" taċ-ċelluli="" naqset="" b'mod="" sinifikanti="" wara="" t-trattament="" bi="" 12.5,="" 25,="" u="" 50="" μm="" kompost="" 1,="" 2,="" jew="" 3="" (75.5="" fil-mija,="" 45.1="" fil-mija,="" u="" 43.7="" fil-mija="" għall-kompost="" 1,="" 85.5="" fil-mija,="" 51.8="" fil-mija,="" u="" 34.3="" fil-mija="" għall-kompost="" 2,="" u="" 64.5="" fil-mija,="" 48.2="" fil-mija,="" u="" 36.4="" fil-mija="" għall-kompost="" 3,="" rispettivament;="" p=""><0.05), meta="" mqabbla="" ma="" 'ċelluli="" ta'="" kontroll="" (figura="" 2b).="" il-kompost="" 4="" ma="" affettwax="" il-vijabbiltà="" taċ-ċelluli="" la="" fl-assaġġ="" mtt="" jew="" cck-8.="" id-diskrepanza="" bejn="" ir-riżultati="" miksuba="" biż-żewġ="" analiżi="" tissuġġerixxi="" li="" wieħed="" miż-żewġ="" analiżi="" jista="" 'ma="" jirriflettix="" b'mod="" preċiż="" l-effetti="" tal-komposti="" 1="" u="" 2="" fuq="" il-vijabbiltà="" taċ-ċelluli="">

Valutazzjoni tal-apoptożi permezz ta' Tbajja ta' Hoechst

Hoechst 33342 hija tebgħa tad-DNA permeabbli għaċ-ċelluli li hija eċitata minn dawl ultravjola u temetti fluworexxenza blu f'460 sa 490 nm. Il-kromatina kkondensata taċ-ċelloli apoptotiċi tebgħa b'mod aktar qawwi mill-kromatina taċ-ċelloli normali [6]. Billi ċ-ċelluli ta 'kontroll esibew kromatin imxerrda b'mod uniformi, organelli normali, u membrani taċ-ċelluli intatti, ċelluli inkubati b'komposti ta' 50 μM 1, 2, jew 3 għal 48 siegħa wrew it-tbajja tipika ta 'ċelluli apoptotiċi (Figura 4A). Bil-maqlub, l-espożizzjoni taċ-ċelloli għal 50 μM tal-kompost 4 ma żiedx in-numru ta 'nuklei apoptotiċi meta mqabbel mat-trattament ta' kontroll.

Analiżi Ċitometrika tal-Fluss taċ-Ċelloli Apoptotiċi

L-assaġġ ta 'tebgħa doppja tal-annexin V-FITC/PI jidentifika ċelluli apoptotiċi bit-twaħħil b'affinità għolja ta' annexin V-FITC mal-fosfatidilserina, li hija esternalizzata f'ċelloli li għaddejjin minn apoptożi [7]. F'dan l-assaġġ, ċelluli vijabbli ma jorbtux la ma' annexin V u lanqas ma PI u għalhekk mhumiex imtebba' (kwadrant t'isfel tax-xellug), ċelluli apoptotiċi bikrija huma mtebbgħin aħdar bit-twaħħil ta 'annexin V-FITC (kwadrant t'isfel tal-lemin), u ċelluli apoptotiċi tard. huma mtebbgħin ħodor u ħomor bl-irbit ta' annexin V-FITC ma' fosfatidilserina u PI ma' ċelluli nekrotiċi, rispettivament (kwadrant ta' fuq tal-lemin). Kif muri fil-Figura 4B, ċelluli inkubati b'50 μM komposti 1, 2, jew 3 għal 48 siegħa, il-persentaġġ ta 'ċelluli apoptotiċi żdied minn 3.74 fil-mija (ċelluli ta' kontroll) għal 10.32 fil-mija, 12.95 fil-mija u 11.30 fil-mija, rispettivament. Meta mqabbel maċ-ċelloli ta 'kontroll, il-kompost 4 ma żiedx il-perċentwal ta' ċelloli apoptotiċi EA.hy926.

B'konsistenza mar-riżultati miksuba bl-assaġġ CCK-8 u bit-tbajja' ta' Hoechst 33342, l-assaġġ taċ-ċitometrija tal-fluss wera li l-komposti 1, 2, u 3 indoxxew apoptożi fiċ-ċelloli EA.hy926. B'kollox, dawn l-osservazzjonijiet jissuġġerixxu li ż-żieda fil-vijabbiltà taċ-ċelluli EA.hy926 osservata bl-assaġġ MTT wara trattament b'komposti 1-3 irrappreżentat riżultat pożittiv falz.

Diskussjoni

Fl-1983, Mosmann żviluppa analiżi kolorimetrika tal-mikroplate MTT għall-kejl tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli u ċ-ċitotossiċità [8]. Dan l-assaġġ sempliċi, u l-modifiki tiegħu, issa jintużaw b'mod estensiv fil-laboratorji tal-bijoloġija taċ-ċelluli madwar id-dinja. Studji ta 'frazzjonament fiċ-ċelloli tal-mammiferi indikaw li l-kofattur tan-nukleotidi tal-piridina mnaqqas, NADH, huwa responsabbli għall-biċċa l-kbira tat-tnaqqis tal-MTT. Dan kien appoġġjat minn studji li użaw ċelloli sħaħ [9]. It-tnaqqis tal-MTT huwa għalhekk assoċjat ma 'ċelluli metabolikament attivi u mhux biss akkoppjat ma' respirazzjoni mitokondrijali, iżda wkoll maċ-ċitoplasma u membrani mhux mitokondrijali inklużi l-kompartiment endosome/lysosome u l-membrana tal-plażma [10]. Il-piż nett pożittiv fuq il-molekula MTT huwa l-fattur primarju għall-assorbiment ċellulari tagħha permezz tal-potenzjal tal-membrana tal-plażma.

Notevolment, l-assaġġ MTT jista 'xi kultant ma jirriflettix b'mod preċiż l-effett attwali li kompost ittestjat għandu fuq ċelloli speċifiċi. Madankollu, l-istrutturi jew il-gruppi kimiċi li jistgħu jikkawżaw riżultati konfliġġenti fl-assaġġ MTT ma ġewx identifikati. Studji reċenti wrew li l-assaġġ MTT jista' jissottovaluta l-effett anti-proliferattiv ta' (-)-epigallocatechin-3-gallate, l-aktar polifenol abbundanti fit-tè aħdar [11]. Fi studji li użaw l-assaġġ MTT biex jiskopru kimosensittività tat-tumur, aġenti kimoterapewtiċi kontra l-kanċer, bħal epirubicin, paclitaxel, docetaxel, u imatinib mesylate (Gleevec), urew żieda fil-vijabbiltà taċ-ċelluli [12,13]. Barra minn hekk, għadd ta 'studji rrappurtaw li ċerti estratti tal-pjanti u polifenoli attivi redox jistgħu jinterferixxu mal-assaġġ MTT peress li jnaqqsu direttament il-melħ tat-tetrazolium MTT fin-nuqqas ta' ċelloli [14].

Il-ħtieġa li jiġu solubilizzati l-kristalli MTT formazan qabel l-analiżi spettrofotometrika f'qarrej tal-mikroplate u n-natura inerenti tal-endpoint tar-reazzjoni jillimitaw l-użu tal-assaġġ MTT għal ċerti applikazzjonijiet. Dan wassal għall-iżvilupp ta' analogi tat-tetrazolium li fihom il-frak tal-fenil ġew imżejna b'gruppi ta' sulfonat iċċarġjati b'mod negattiv, bħal 2,3-bis-(2-metossi-4-nitro- 5- sulfofenil)-2H-tetrazolium-5-carboxamide (XTT), melħ intern [15] ikkargat negattivament u 3-(4,5-dimethylthiazol-2-il) -5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-({4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS), melħ ta' ġewwa dgħajjef aċiduż relatat mill-qrib mal-MTT [16] . Dawn il-modifiki rriżultaw fil-produzzjoni ta 'prodotti ta' formazan li jinħall fil-medja tal-kultura li eliminaw ir-rekwiżit ta 'pass ta' solubilizzazzjoni qabel il-kwantifikazzjoni. B'mod korrispondenti, peress li ż-żieda fil-ħlas negattiv fuq dawn il-molekuli naqqset il-kapaċità tagħhom li jiċċaqilqu bejn il-membrani taċ-ċelluli [17], aċċettaturi tal-elettroni intermedji (IEA), bħal 1-methoxy-5-methyl phenazinium methyl sulfate ({{25} }}methoxy PMS) kienu meħtieġa biex jiffaċilitaw it-tnaqqis taż-żebgħa tat-tetrazole jew biex itejbu r-rata tat-tnaqqis.

Aktar reċentement, ġiet żviluppata ġenerazzjoni ġdida ta' melħ tat-tetrazolium solubbli fl-ilma li minnhom WST-1 huwa l-prototip [18]. WST-1, melħ intern disulfonated iċċarġjat b'mod negattiv li fih residwu tal-jodju, huwa aktar stabbli minn XTT u MTS fil-preżenza ta' 1-methoxy PMS, l-IEA obbligatorja tiegħu. Dan wassal għall-kummerċjalizzazzjoni ta' WST-1/1-methoxy PMS bħala kit konvenjenti għall-proliferazzjoni taċ-ċelluli ta' reaġent wieħed. Ġew żviluppati diversi melħ tat-tetrazolium oħra fis-serje WST, li l-aktar utli minnhom forsi jkun WST-8 [19]. WST-8 jidher li għandu proprjetajiet ta' tnaqqis ċellulari simili ħafna għal WST-1 u qed jiġi kkummerċjalizzat b'mod indipendenti bħala l-assaġġ CCK-8. WST-8 huwa impermeabbli għaċ-ċelluli u għalhekk jitnaqqas b'mod extraċellulari, permezz tat-trasport tal-elettroni minn NADH intraċellulari għal WST-8 tul il-membrana tal-plażma medjat minn 1-metossi PMS. Għalkemm it-tnaqqis kemm MTT kif ukoll WST-8/1-metossi PMS huma mmexxija minn NADH intraċellulari, is-sors ta 'NADH jidher li jvarja f'dawn iż-żewġ metodi. It-tnaqqis tal-WST-8/{1-methoxy PMS huwa aktar dipendenti fuq ix-shuttle malate/aspartate li jgħaqqad iċ-ċiklu tal-aċidu trikarbossiliku mitokondrijali-NADH mal-ispazju ekstramitokondrijali [20].

F'esperimenti preliminari, ikkonfermajna li l-komposti 1, 2, 3, u 4 ma setgħux inaqqsu direttament il-melħ tat-tetrazolio MTT (mhux murija). Fl-istudju preżenti, l-influwenza diretta tal-komposti nfushom bir-reaġent ġiet eliminata bil-ħasil bir-reqqa tal-mikroplates b'saline buffered b'fosfat (PBS) qabel ma ġiet miżjuda soluzzjoni MTT jew CCK-8, kif indikat fil-protokolli tal-manifattur. Madankollu, ir-riżultati miksuba bl-użu taż-żewġ metodi kienu għadhom kontradittorji (Figura 2). Kif mistenni, l-inkubazzjoni ta 'ċelluli bil-komposti 1, 2, u 3 żiedet it-tnaqqis tal-melħ tat-tetrazolju f'formazan vjola, meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll (Figura 3), li tissuġġerixxi li sempliċi tnaqqis tal-melħ tat-tetrazolju fil-preżenza ta 'kompost speċifiku mhix biżżejjed biex tiġġudika l-abbiltà tal-kompost li jinterferixxi mal-assaġġ MTT.

Biex jiġi ddeterminat jekk il-komposti 1, 2, 3, u 4 setgħux jinduċu apoptożi fiċ-ċelloli EA.hy926, ġew evalwati bidliet morfoloġiċi ċellulari u esternalizzazzjoni tal-fosfatidilserina. B'mod konsistenti mat-tnaqqis fil-vijabbiltà ċellulari osservata bl-assaġġ CCK-8, ir-riżultati tat-tebgħa ta' Hoechst u l-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss bl-użu ta' annexin V-FITC/PI ssuġġerew li l-inibizzjoni tat-tkabbir osservata wara t-trattament tal-kompost 1, 2 u 3 kienet minħabba, mill-inqas parzjalment, l-apoptosi taċ-ċelluli EA.hy926. Ir-riżultati tagħna appoġġaw ukoll l-idea li l-grupp caffeoyl preżenti fiż-żewġ komposti 1 u 2 kien responsabbli għar-riżultati kontradittorji miksuba bl-assaġġ MTT.

Simili għas-sejbiet tagħna, Rottlerin, opener qawwi tal-kanal tal-potassju ta 'konduttanza kbira, ma werax reattività lejn MTT in vitro. Madankollu, tejbet bil-qawwa l-formazzjoni ta 'kristalli ta' formazan ġewwa ċ-ċelloli, riżultat li kien f'kunflitt evidenti mal-inibizzjoni ta 'Rottlerin ta' NF-κB u l-proliferazzjoni taċ-ċelluli osservati b'analiżi tal-inkorporazzjoni ta '[3 H]-thymidine fid-DNA [21]. Il-mekkaniżmu li bih Rottlerin saħħaħ it-tnaqqis tal-MTT kien attribwit għall-effett ta 'uncoupling mitokondrijali tiegħu [22]. Rottlerin għandu grupp sostituent ta 'aċidu cinnamoyl. Meta mqabbel ma 'l-aċidu cinnamoyl, il-kompost 3 jippossjedi żewġ residwi ta' hydroxyl addizzjonali, li jinsabu f'C-3 u C-4. Għalhekk, aħna nispekulaw li l-mekkaniżmu li bih il-komposti 1 u 2 jikkawżaw riżultati konfliġġenti fl-assaġġ MTT jista 'jkun assoċjat ukoll mal-effetti ta' diżakkoppjar mitokondrijali tagħhom. Biex tittestja din l-ipoteżi, huma meħtieġa studji komparattivi fost il-komposti 1, 2, u uncoupler kimiku, bħal trifluorocarbonylcyanide phenylhydrazone (FCCP).

Taqsima Sperimentali

Reaġenti u Kimiċi

Kompost 3 (aċidu kaffejku-trab, purità=98.6 fil-mija) inxtara minn Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, iċ-Ċina). Kompost 4 (3,4-dihydroxylphenylethanol–żejt, purità=98.5 fil-mija) inkiseb minn Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, iċ-Ċina). MTT u dimethyl sulfoxide (DMSO) inkisbu minn Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). L-assaġġ CCK-8 inxtara minn Dojin Laboratories (Kumamoto, il-Ġappun). Hoechst 33342 u kits għall-iskoperta tal-apoptosi tal-annexin V-FITC/PI inxtraw mill-Istitut tal-Bijoteknoloġija Beyotime (Haimen, iċ-Ċina)

Materjal tal-Pjanti

Zkuk ta 'C. tubulosa inġabru mill-Prefettura ta' Yutian, ir-Reġjun Awtonomu ta 'Xinjiang Uygur, iċ-Ċina. Kampjuni ta' vawċer ġew depożitati fil-Laboratorju Ewlenin tal-Mediċina ta' Altitudni Għolja, it-Tielet Università Medika Militari (Chongqing, iċ-Ċina) u awtentikati minn Yi Zhang mill-Università ta' Chengdu tal-Mediċina Tradizzjonali Ċiniża (Chengdu, iċ-Ċina)

Estrazzjoni u Iżolament ta 'Materjal tal-Pjanti

Zkuk imnixxfa bl-arja ta 'C. tubulosa (0.6 kg) ġew trab u estratti b'50 fil-mija etanol għal 2 sigħat f'70 grad. Wara t-tneħħija tas-solvent taħt pressjoni mnaqqsa, l-estratt etanoliku (212.5 g) ġie maħlul u sospiż fl-ilma (2 L) u estratt b'n-butanol (2 L × 3). L-estratt n-butanoliku (110 g) ġie kromatografiku fuq kolonna tal-poliamide u eluwit b'etanol/ilma (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) li jipproduċu ħames frazzjonijiet (A-E) . Il-Frazzjoni B (65 g) ġiet frazzjonata fuq kolonna ODS; eluzzjoni bl-etanol: ilma (1:9) kompost separat 1 (3 g). Il-Frazzjoni D (10.5 g) ġiet frazzjonata fuq kolonna ODS; eluzzjoni b'etanol/ilma (1:4) kompost separat 2 (1 g).

L-ispettri NMR ġew irreġistrati fuq spettrometru Bruker Avance 600 f'CD3OD b'Tetramethylsilane (TMS) bħala standard intern. L-ispettri tal-massa twettqu fuq spettrometru tal-massa BioTOF-Q.

Kultura taċ-Ċelloli

Il-linji taċ-ċelluli EA.hy926 inkisbu mill-Ġbir tal-Kultura tat-Tip Amerikan (Manassas, VA, USA). Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​f'medja RPMI 1640, supplimentati b'10 fil-mija (v/v) serum bovin tal-fetu u 1 fil-mija (v/v) penicillin-streptomycin f'ambjent umidifikat b'5 fil-mija CO2 f'37 grad.

Vijabilità taċ-Ċelloli

Il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet ivvalutata bl-użu tal-analiżi MTT u CCK{{0}}. Il-komposti 1 u 2, u l-aglycones tagħhom, l-aċidu caffeic (3) u 3,4-dihydroxylphenylethanol (4) ġew maħlul f'DMSO sal-konċentrazzjoni finali ta 'DMSO < 0.1="" fil-mija="" (v/v)="" fil-midja="">

Iċ-ċelloli EA.hy926 ġew miżrugħa fuq 96-pjanċi bir-bir f'4 × 103 ċelluli/bir. Wara l-inkubazzjoni għal 24 siegħa, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'6.25-50 μM kompost 1, 2, 3, jew 4 għal 24 siegħa. Il-medju tal-kultura tneħħa u ċ-ċelloli ġew maħsula darbtejn b'salina buffered bil-fosfat (PBS). Alikwoti (10 μL) ta 'soluzzjoni MTT stokk (5 mg · mL-1) ġew miżjuda ma' kull bir li kien fih 100 μL ta 'medja u inkubati maċ-ċelloli għal 4 sigħat. Wara l-inkubazzjoni, il-medju tneħħa u 150 μL alikwoti ta 'DMSO ġew miżjuda ma' kull bir biex jissolvew il-kristalli formazan. L-assorbiment tkejjel f'490 nm bl-użu ta 'mikroplate reader (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, USA). Il-vijabbiltà taċ-ċelluli kienet espressa bħala l-perċentwal tat-tnaqqis tal-MTT, li jassenja l-valur ta '100 fil-mija għall-assorbiment taċ-ċelloli ta' kontroll. L-esperimenti kollha saru tliet darbiet u ġew ippreżentati bħala medja ± devjazzjoni standard (SD).

L-assaġġ CCK-8 sar wara l-letteratura b'modifiki ħfief [23]. Speċifikament, iċ-ċelluli ġew ittrattati b'6.25-50 μM komposti 1, 2, 3, jew 4 għal 24 siegħa u maħsula darbtejn b'PBS qabel iż-żieda ta 'soluzzjoni ta' 10 μL CCK-8 u 100 μL ta 'midja tal-kultura. Wara l-inkubazzjoni tal-mikroplate f'37 grad għal 2 sigħat, l-assorbiment tkejjel f'450 nm bl-użu ta 'microplate reader. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli kienet espressa bħala l-perċentwal ta 'ċelluli vijabbli relattiv għal ċelloli ta' kontroll (100 fil-mija). L-esperimenti kollha saru tliet darbiet u espressi bħala medja ± SD.

Valutazzjoni tal-apoptożi minn Hoechst 33342 Tbajja

Bidliet morfoloġiċi apoptotiċi ġew osservati permezz ta 'tbajja' Hoechst 33342. Fil-qosor, iċ-ċelloli EA.hy926 ġew miżrugħa fuq 48-pjanċi bir-bir (2 × 104 ċelluli/bir) u ttrattati b'50 μM kompost 1, 2, 3, jew 4 għal 48 siegħa f'37 grad, maħsula darbtejn b'PBS, u ffissat b'4 fil-mija (v/v) paraformaldehyde għal 15-il minuta f'temperatura tal-kamra. Wara li tlaħlaħ darbtejn bil-PBS, iċ-ċelloli ġew imtebba 'b'Hoechst 33342 (10 ug · mL-1) għal 5 min f'temperatura tal-kamra u maħsula darbtejn b'PBS. Nuklei mtebbgħin b'Hoechst ġew viżwalizzati permezz ta 'mikroskopju fluworexxenti (Olympus, Tokyo, Ġappun).

Analiżi tal-apoptożi permezz taċ-Ċitometrija tal-Fluss

Ċelloli apoptotiċi ġew skoperti mill-annexin V-FITC/PI double-tbajja u analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss. Fil-qosor, wara t-trattament b'50 μM kompost 1, 2, 3, jew 4 għal 48 siegħa, iċ-ċelloli ġew maħsuda u sospiżi mill-ġdid f'PBS f'1 × 105 ċelluli · mL-1. Wara ċ-ċentrifugazzjoni f'500 × g għal 5 min f'25 grad, ġew miżjuda 195 μL ta 'annexin V-FITC buffer vinkolanti u 5 μL ta' annexin V-FITC. Wara taħlit bil-vortiċi ġentili, it-taħlita ġiet inkubata għal 10 minuti f'temperatura tal-kamra fid-dlam. Wara ċ-ċentrifugazzjoni f'500 × g għal 5 min f'25 grad, ġew miżjuda 190 μL ta' buffer ta' rbit ta' annexin V konjugat bil-FITC u 10 μL PI. Wara taħlit ġentili tal-vortiċi, il-kampjuni ġew analizzati bl-użu ta 'ċitometru tal-fluss FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) fi żmien 30 min.

Analiżi Statistika

Id-dejta sperimentali kollha ġiet espressa bħala medja ± SD. Is-sinifikat tad-differenzi bejn il-kampjuni sperimentali u l-kontroll korrispondenti ġie vvalutat b'analiżi one-way ta 'varjanza (ANOVA) bl-użu tas-softwer SPSS (verżjoni 11.5). Is-sinifikat statistiku ġie stabbilit għal p <>

Konklużjonijiet

Ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu li l-istima eċċessiva tan-numru ta 'ċelluli vijabbli osservati fl-assaġġ MTT tista' taħbi ċ-ċitotossiċità ta 'ċerti komposti. Għalhekk, waqt il-proċessi ta 'screening tad-droga, nirrakkomandaw li tuża varjetà ta' metodi biex tiddetermina l-effett tal-kompost speċifiku fil-vijabbiltà taċ-ċelluli (bħal analiżi CCK-8 u 3 H-TdR) biex tevita li tiġġenera riżultati qarrieqa.