Rispons Immuni Innat Għas-Sawm U r-Reeeding Fil-Kliewi Zebrafish

Kuntatt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Zongzhen Liao, Dihang Lin, Jirong Jia, Ran Cai, Yang Yu u Wensheng Li *

Laboratorju Ewlenin tal-Istat tal-Bijokontroll, Laboratorju Ewlenin tal-Provinċja ta 'Guangdong għall-Annimali Ekonomiċi Akwatiċi, Ċentru ta' Riċerka tat-Teknoloġija tal-Inġinerija Provinċjali ta 'Guangdong għal Tgħammir B'saħħtu ta' Ħut Ekonomiku Importanti, Skola tax-Xjenzi tal-Ħajja, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510275, Ċina;

liaozzh@mail2.sysu.edu.cn (ZL); lindihang2018@sibcb.ac.cn (DL); jiajr3@mail.sysu.edu.cn (JJ); Alan6382@163.com (RC); yuyang65@mail2.sysu.edu.cn (YY)

* Korrispondenza: lsslws@mail.sysu.edu.cn

Cistanche huwa tajjeb ħafna għall-funzjoni tal-kliewi

Astratt: L-annimali jiksbu nutrijenti u enerġija permezz tal-għalf biex jiksbu bilanċ bejn it-tkabbir u s-saħħa tal-organiżmi. Meta jkun hemm bidla fl-akkwist tan-nutrijenti, l-istat tat-tkabbir jinbidel u jista 'wkoll jikkawża bidliet fis-sistema immuni intrinsika. It-tkabbir kumpensatorju (CG), fenomenu ta' tkabbir speċifiku, jinvolvi l-kwistjoni dwar jekk il-bidliet fit-tkabbir jistgħux ikunu akkumpanjati minn bidliet fl-immunità intrinsika. Iż-zebrafish (Danio rerio), organiżmu mudell tal-ħut magħruf, jista' jservi bħala mudell xieraq. F'dan l-istudju, iż-zebrafish għadda minn 3 ġimgħat ta' sawm u għalf mill-ġdid għal perjodi ta' 3 sa 7 ijiem. Instab li CG jista 'jinkiseb f'zebrafish. Is-suxxettibilità taż-żebra għal Streptococcus agalactiae żdiedet wara l-ġuħ. Barra minn hekk, in-numru ta 'ċentri ta' melanomacrophage żdied wara s-sawm u l-proporzjon ta 'tubuli feruti żdied wara l-għalf mill-ġdid għal 3 u 5 ijiem, rispettivament. Barra minn hekk, il-kliewita 'zebrafish li jbatu mill-ġuħ kienu taħt stress ossidattiv, u l-attività ta' bosta enzimi antiossidanti żdiedet wara l-ġuħ, inklużi catalase, glutathione peroxidases, u superoxide dismutase. Il-parametri immuni naturali ġew influwenzati mill-ġuħ. Barra minn hekk, l-attività ta 'alkaline phosphatase u lysozyme żdiedet wara l-ġuħ. L-espressjoni tal-mRNA ta' ġeni relatati mal-immunità bħal il-1 ġiet elevata sa punt differenti wara sawm bi jew mingħajr l-isfida tal-lipopolysaccharides (LPS). Dan l-istudju wera li l-funzjoni tas-sistema immuni intrinsika fiż-żebrafish tista' tiġi influwenzata mill-istat tan-nutrizzjoni.

Kliem ewlieni: sistema immuni intrinsika; kliewi; stress ossidattiv; tkabbir kumpensatorju; zebrafish

1. Introduzzjoni

L-attivitajiet bażiċi tal-ħajja huma dipendenti fuq il-provvista tal-enerġija tal-organiżmu. L-istat tan-nutrijent tal-ġisem tal-annimali jista' jinfluwenza l-funzjonament tas-sistema immuni [1,2]. It-tkabbir kumpensatorju (CG) huwa perjodu ta 'tkabbir mgħaġġel wara fażi ta' trażżin tat-tkabbir, li jista 'jkun ikkawżat minn nuqqas ta' ikel u fatturi ambjentali oħra [3,4]. Dan il-fenomenu kien irreġistrat għall-ewwel darba fil-mammiferi u eventwalment instab fl-għasafar [3] u teleosti [5]. CG huwa maqsum f'żewġ fażijiet: il-fażi katabolika u l-fażi iper anabolika [6]. Wieħed mill-mudelli bażiċi ta 'CG huwa sawm u reeeding. Wara l-għalf mill-ġdid, il-ħut jista' jesperjenza kumpens parzjali, sħiħ, żejjed jew l-ebda kumpens [4]. Ir-reġim ta' għalf speċjali ta' CG huwa meqjus bħala mod potenzjali biex tittejjeb l-effiċjenza tal-produzzjoni fi speċi mrobbija [7].

Ir-rispons immuni intrinsiku huwa l-ewwel limitu tad-difiża tal-host, li jipproteġi l-organiżmi mill-patoġeni. Fil-ħut, l-organi tas-sistema immuni jinkludu t-timu,raskliewi, kliewi kawdali, garġi, fwied,u l-imsaren [8,9]. Firxa wiesgħa ta' tipi ta' ċelluli tieħu sehem f'risponsi ta' difiża ċellulari mhux speċifiċi fil-ħut, inklużi monoċiti/makrofaġi, ċelluli ċitotossiċi mhux speċifiċi, u granuloċiti (newtrofili). L-immunometaboliżmu huwa l-interazzjoni bejn il-proċessi immunoloġiċi u metaboliċi [10]. L-istatus metaboliku tal-ħut jista 'jaffettwa l-funzjoni immuni tagħhom. Fil-bnedmin, l-istat nutrittiv jinfluwenza l-għadd taċ-ċelluli immuni—u l-attività tagħhom [11]. Instab li l-funzjoni tas-sistema immuni fil-ġrieden tista 'tiġi affettwata mill-istat metaboliku tagħhom [12-14]. Is-sawm intermittenti fil-karpjun crucian (Carassius auratus) biddel il-komunitajiet batterjali tal-imsaren u żied l-attività ta 'superoxide dismutase (SOD) u lysozyme [15]. Il-ġuħ ibiddel ukoll l-espressjoni tal-ġeni tar-risponsi immuni intrinsiċi fil-fwied tas-salamun [16]. Barra minn hekk, studji dwar l-effetti tal-istat metaboliku fuq is-sistema immuni jistgħu jinstabu f'teleosti oħra [17-19]. Madankollu, l-influwenza tal-istat metaboliku fuq is-sistema immuni fit-teleosti għadha mhix mifhuma ħażin. L-istress ossidattiv jista' jillimita l-funzjonalità tas-sistema immuni intrinsika u jinduċi komponenti bħal riċetturi li jixbħu n-noll [20,21]. Sadanittant, il-ġuħ jista 'jżid il-produzzjoni ta' ROS u jikkawża awtofaġija [22,23]. Ikun ta 'min jesplora jekk l-istress ossidattiv jimmedjax ir-relazzjoni bejn il-ġuħ u l-immunità.

Żona taż-żebra (Danio rerio) mudell applikat b'mod wiesa 'fl-istudju tal-immunità u l-mard. Is-sistemi immuni intrinsiċi ta 'zebrafish jibdew jiżviluppaw fl-1 jum ta' embrijoġenesi, u s-sistema immuni adattiva hija assenti sa 4-6 ġimgħat wara l-fertilizzazzjoni. Dan jagħmel lill-zebrafish mudell kbir għal studji tas-sistema immuni intrinsika [9]. Il-kilwa hija l-organu limfojde primarju fiż-zebrafish [24]. Il-ġene havcr1 jikkodifika proteina tubulari transmembrana msejħamolekula ta' ħsara fil-kliewi-1 (KIM-1) [25]. KIM-1 huwa l-indikatur ta' ħsara fit-tessuti fil-kliewi, u l-espressjoni żejda ta' KIM-1 tikkawża ħsara fil-kliewi fiż-zebrafish [26]. Instab li s-sawm jista’ jibdel l-istat metaboliku fiż-zebrafish [27]. Is-sawm wassal għal tnaqqis fil-konsum tal-ossiġnu u l-kontenut tal-lipidi tal-fwied u l-glikoġenu. Żied ukoll l-attività ta' 8-ossidazzjoni u glukoneġenesi fil-fwied. Sadanittant, speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS) ħadu sehem fis-CG f'zebrafish [28]. ROS, prodotti fil-fwied, kienu meħtieġa għal CG fiż-zebrafish minħabba li kkaġunaw il-mogħdija AMPK. Fl-istudju preżenti, adottajna strateġija ta 'sawm u reeeding biex tesplora l-mudell ta' CG fiż-zebrafish. Streptococcus agalactiae ikkawża sepsis u meninġite severa fiż-zebrafish u seta' jinfetta aktar minn 30 speċi ta' ħut [29]. Aħna għażilna Streptococcus agalactiae u lipopolysaccharides (LPS) għall-injezzjoni biex nesploraw l-influwenza ta 'CG fuq is-sistema immuni intrinsika, flimkien ma' bidliet fil-parametri relatati mal-immunità u l-espressjoni tal-ġeni.

2. Materjali u Metodi

2.1. Ħut taż-Żebra, Reġimi ta' Tmigħ, u Piż tal-Ġisem

Iż-zebrafish adulti użati fl-esperiment inxtraw mis-suq Yuehe Fish-Bird- Flower (Guangzhou, iċ-Ċina) u akklimatizzati għal ġimgħatejn. It-trobbija kollha tal-ħut saret fl-istazzjon tal-esperiment tal-kultura tal-ħut fl-Università ta 'Sun Yat-sen, Provinċja ta' Guangdong, iċ-Ċina. L-esperimenti kollha fuq l-annimali twettqu skont il-linji gwida u l-approvazzjoni tal-Kumitat għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Università Sun Yat-Sen. Matul il-perjodu sperimentali, il-pH varja minn 7.8 sa 7.9, l-ossiġnu maħlul varja minn 6.95 sa 7.23 mg/L, u t-temperatura tal-ilma varjat minn 26.5 sa 28 oC. Konċentrazzjonijiet ta' ammonja-N u nitroġenu tan-nitrat inżammu aktar baxxi minn 0.2 u 0.{{2{0}}05 mg/L, rispettivament. Is-salinità tal-ilma kienet 0.2 ppt. Zebrafish inżamm f'ċiklu ta' 12:12-h dawl-dlam. Biex tesplora l-bidliet fil-piż tal-ġisem waqt is-sawm u t-tmigħ mill-ġdid, il-piż tal-ġisem ġie rreġistrat darba fil-ġimgħa. Il-piż inizjali tal-ġisem taż-zebrafish fl-esperiment kien 0.35 ± 0.06 g, u kellhom età bejn wieħed u ieħor 3 xhur. Iż-zebrafish kienu separati b'mod każwali f'tankijiet ta '24 L, u kull tank kien fih 30 ħuta. Huma ġew offruti dieta kummerċjali darbtejn kuljum b'għalf sati. Ir-reġimi ta' tmigħ għal kull esperiment huma murija fit-Tabella 1. Wara t-trattament, il-ħut taż-żebra ġew anestetizzati b'doża eċċessiva ta' MS-222 (Sigma, Burlington, MA, USA) u ssagrifikati. Imbagħad, il-kliewi tneħħa fit-tubu Eppendorf u mqiegħda fin-nitroġenu likwidu immedjatament. Il-kampjun ġie trasferit min-nitroġenu likwidu u maħżun fi -80 oC.

2.2. Isfida Streptococcus agalactiae

Iż-zebrafish li kienu għaddejjin minn sawm u għalf mill-ġdid ġew ikkontestati bi Streptococcus agalactiae. Ir-razza Streptococcus agalactiae ġiet ġentilment ipprovduta mill-Professur Anxing Li, l-Iskola tax-Xjenzi tal-Ħajja, l-Università ta 'Sun Yat-sen [30]. Iż-zebrafish f'kull grupp ġew separati aktar f'erba' gruppi żgħar, bi 15-il ħuta f'kull grupp żgħir. Iż-zebrafish fi tlieta minn dawn il-gruppi ġew anestetizzati b'80 mg/L MS-222 u injettati intraperitonealment b'5 uL li fihom 5 × 106 unitajiet li jiffurmaw kolonji ta' Streptococcus agalactiae. Iż-zebrafish li kien fadal ġew injettati b'5 uL ta' PBS. Iż-zebrafish kollha ġew osservati għal 4 ijiem mingħajr għalf. Ir-rata tal-mortalità ġiet irreġistrata.

2.3. Injezzjoni LPS

Iż-zebrafish li għaddejjin minn sawm u għalf mill-ġdid (F24, S24, u F21R3) ġew sfidati bl-LPS (Sigma, Burlington, MA, USA). Trab LPS ġie maħlul f'ilma sterili għal konċentrazzjoni finali ta '1 mg/mL. Qabel l-użu, 1 mg/mL LPS ġie dilwit b'PBS, u l-konċentrazzjoni finali kienet 20 ug/mL. Iż-zebrafish f'kull grupp kienu separati f'żewġ gruppi żgħar, u kien hemm 12-il ħut f'kull grupp żgħir. Il-ħut fiż-żewġ gruppi ġie injettat b'LPS u PBS. Iż-zebrafish ġew anestetizzati b'MS-222 u injettati intraperitonealment b'5 uL ta' 20 ug/mL LPS jew PBS. Wara 3 sigħat, il-ħut taż-żebra ġie anestetizzat u ssagrifikat. Wara dan, il-kliewi tneħħa u nżammet fi -80 oC.

2.4. Istopatoloġija

Iż-zebrafish inżammu b'għalf mill-ġdid għal 14-il jum wara l-ġuħ għal 21 jum. Ittieħdu kampjuni fil-jiem 21, 24, 28, u 35. Wara s-sagrifiċċju, il-kliewi taż-żebrafish tneħħew u mgħaddsa f'4 fil-mija formaldehyde. Imbagħad, il-kliewi għaddew minn taqsimiet tal-paraffin. Is-sezzjonijiet kienu mtebbgħin b'ematossilin-eosina (HE) (Beyotime, Shanghai, iċ-Ċina) u osservati b'mikroskopju tad-dawl (Olympus, Tokyo, Ġappun). Biex tikkwantifika l-bidla ta 'tubuli feruti u ċentri melano-makrofaġi (MMCs), 5 stampi li ma jikkoinċidux inqabdu minn kull slide. Iż-żoni tat-tubuli midruba u l-kampjun kollu tkejlu bl-użu ta 'softwer Cellsens (Olympus, Tokyo, Ġappun). Minn kull stampa, il-proporzjon ta 'tubuli feruti ġie kkalkolat billi diviż iż-żona ta' tubuli feruti bl-erja tal-kampjun kollu. Il-kwantità ta 'MMCs kienet magħduda f'kull stampa, imbagħad diviż bl-erja tal-kampjun kollu. Imbagħad, il-bidliet darbiet tal-MMCs ġew ikkalkulati bil-grupp F21 bħala l-istandard.

2.5. Assaġġ tal-Parametru Bijokimiku Relatat

Il-kontenuti ta 'malondialdehyde (MDA) u nitric oxide (NO) u l-attivitajiet enżimatiċi ta' SOD, alkaline phosphatase (ALP), catalase (CAT), glutathione peroxidases (GSH-Px), u lysozyme fil-kliewi tkejlu b'kits kummerċjali korrispondenti skond il-protokolli tal-manifattur. Fil-qosor,kliewiimneħħija minn zebrafish tqiegħdu f'nitroġenu likwidu u maħżuna fi -80 oC. Qabel l-ittestjar, kull kilwa ttieħdet u saret f'omoġenat f'PBS pre-kesħa b'disruptor tat-tessuti.Omoġenat tal-kliewiġie ċentrifugat f'4 oC u 12,000× g għal 10 min u s-supernatant ittieħed bħalakliewiestratt għall-iskoperta. Il-kontenut ta 'MDA ġie skopert b'Lipid Peroxidation MDA Assay Kit (Beyotime, Shanghai, iċ-Ċina) u l-iskoperta kienet ibbażata fuq ir-reazzjoni tal-kulur bejn l-MDA u l-aċidu thiobarbituric. Il-wavelength użat kien 535 nm. Il-kontenut NO tkejjel b'sistema ta' reaġent Griess (Promega, Madison, WI, USA). Is-sistema tar-reaġent Griess hija bbażata fuq ir-reazzjoni tan-nitrit mas-sulfanilamide u N-1-naphthyl ethylenediamine dihydrochloride taħt kundizzjonijiet aċidużi. Il-kontenut ta 'NO ġie kkalkulat permezz ta' standard ta 'nitritu tas-sodju u normalizzat għal kontenut ta' proteina. L-assorbiment tkejjel b'filtru f'490 nm. L-attività tal-lysozyme ġiet skoperta b'Lysozyme Assay Kit (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) wara l-protokoll tal-manifattur. L-estratt tal-kliewi ġie inkubat b'ħajt taċ-ċelluli Micrococcus lysodeikticus konjugat mal-fluorescein. Il-fluworexxenza tkejjel wara 45 min ta' inkubazzjoni f'37 oC, f'tul ta' mewġ ta' eċitazzjoni u emissjoni ta' 485 u 535 nm. Il-valur tal-lysozyme ġie kkalkulat permezz ta 'kurva standard u normalizzat għal kontenut ta' proteina. L-attivitajiet enżimatiċi ta 'SOD, ALP, CAT, u GSH-Px ġew skoperti separatament b'kits ta' analiżi tat-tip SOD, kits ta 'assaġġ ta' fosfatażi alkalina, kits ta 'assaġġ ta' catalase, u kits ta 'assaġġ ta' glutathione peroxidase (Nanjing Jiancheng, Nanjing, China). Unità ta' attività ta' SOD kienet definita bħala l-ammont ta' SOD li jikkorrispondi għal inibizzjoni ta' 50 fil-mija tar-rata ta' tnaqqis tat-tetrazolium nitro blue għal kull mg ta' proteina f'sistema ta' 1 mL. Il-wavelength użat kien 570 nm. Unità ta' attività ALP ġiet iddefinita bħala l-volum ta' enzima li rreaġixxiet mas-sottostrat biex tipproduċi 1 mg ta' fenol fi 30 min f'37 oC u normalizzata għal kontenut ta' proteina. Il-wavelength użat kien 490 nm. L-attività CAT kienet ibbażata fuq il-konsum tal-perossidu tal-idroġenu. Il-wavelength użat kien 405 nm. L-attività ta 'GSH-Px kienet imkejla bir-rata ta' reazzjoni katalizzanti bejn il-perossidu tal-idroġenu u l-GSH. Meta titnaqqas ir-reazzjoni mhux enżimatika, unità ta' attività GSH-Px ġiet iddefinita bħala t-tnaqqis ta' 1 mol/L f'konċentrazzjoni ta' GSH f'kull sistema. Il-wavelength użat kien 405 nm. Il-konċentrazzjoni tal-proteina kienet imkejla b'Kit tal-Assaġġ tal-Proteina BCA (Beyotime, Shanghai, iċ-Ċina). Il-wavelength użat kien 570 nm.

2.6. Produzzjoni ROS

Il-kontenut ta 'ROS fil-kliewiġie determinat bis-sonda fluworexxenti 2/,7/- dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA) (Sigma, Burlington, MA, USA) kif deskritt qabel [28]. Fil-qosor, il-kliewi mneħħija minn zebrafish tqiegħdet f'100 uL PBS qabel kiesaħ u saret f'omoġenat b'disruptor tat-tessuti. Wara ċ-ċentrifugazzjoni għal 10 min b'10,000 × g f'4 oC, 20 uL ta'kliewiestrattġie miżjud ma '{0}}mikroplates sewda sew, u 25 uM ta' DCF-DA ġew miżjuda ma 'kull bir. Il-mikroplate ġiet inkubata f'37 oC għal 30 min. Il-fluworexxenza kienet imkejla f'qarrej tal-pjanċa b'ħafna tikketti (PerkinElmer Victor X5, Waltham, MA, USA) b'filtri ta' eċċitazzjoni u emissjoni stabbiliti f'485 u 535 nm. Il-kontenut tal-proteina tal-estratt tal-kliewi kien imkejjel b'Kit tal-Assaġġ tal-Proteina BCA. Il-kontenut ta 'ROS għal kull kampjun ġie kkalkulat billi nnormalizza l-valur tal-fluworexxenza għall-kontenut ta' proteina. Il-konċentrazzjoni tal-proteina kienet imkejla b'Kit tal-Assaġġ tal-Proteina BCA (Beyotime, Shanghai, iċ-Ċina). Il-wavelength użat kien 570 nm.

2.7. Assaġġ tal-Fqigħ Respiratorju

Il-ħut taż-żebra li għaddej minn sawm u għalf mill-ġdid (F24, S24, u F21R3) intużaw biex titkejjel l-attività tal-fqigħ respiratorju. Il-protokoll għall-assaġġ tal-fqigħ respiratorju sar skont metodu ppubblikat qabel [31,32]. Fil-qosor, il-kliewiġew separati miż-zebrafish anestetizzat u mqiegħda fi {{0}}mikroplates sew b'100 uL ta' Dulbecco's modifikat Eagle's medium (DMEM)/F-12. Wara l-inkubazzjoni tal-pjanċa għal 30 min fi 28 oC, 100 uL ta’ DMEM/F-12 li fihom DCF-DA, dimethylsulfoxide (DMSO) u phorbol myristate acetate (PMA) (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) kien miżjuda ma' kull bir misjub. Sadanittant, 100 uL ta 'DMEM/F-12 li fihom DMSO ġew miżjuda ma' kull bir ta 'kontroll. Il-konċentrazzjonijiet finali tas-soluzzjonijiet differenti kienu kif ġej: 500 ng/mL DCF-DA, 0.2 fil-mija DMSO u 200 ng/mL PMA. Il-fluworexxenza ġiet imkejla f'qarrej ta' pjanċa b'ħafna tikketti b'filtri ta' eċċitazzjoni u emissjoni stabbiliti f'485 u 535 nm. Il-fluworexxenza ta' kull bir

tkejjel immedjatament wara ż-żieda tas-soluzzjonijiet fil-bir u kull 15-il minuta wara għal 150 min. Il-punt tal-ħin biex jitqabblu l-valuri tal-fluworexxenza kien 150 min. Il-valuri tal-fluworexxenza tal-grupp ta 'kontroll mhux indott tnaqqsu mill-fluworexxenza

valuri tal-gruppi individwali indotti mill-PMA. Ġew ikkalkulati l-valuri normalizzati tal-fluworexxenza. Dawn il-valuri normalizzati tal-fluworexxenza ġew magħżula fi tliet kolonni.

2.8. Estrazzjoni tal-RNA u PCR f'ħin reali

Il-iffriżatkliewikienu mitħunin fi TRIzol (Omega, Norcross, GA, USA) u l-RNA totali ġie separat skont il-protokoll [33]. Wara d-diġestjoni b'DNase1 (NEB, Ipswich, MA, USA), cDNA ġie prodott minn RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) ma Random Hexamer Primer. qRT-PCR ġie stabbilit f'taħlitiet ta 'reazzjoni ta' 10 uL li fihom 5 uL ta '2 × SYBR Green qPCR Master Mix (Bike, Houston, TX, USA). Il-kampjuni kollha tmexxew f'żewġ kopji u nnormalizzati għall-espressjoni eEF1a1a. Is-sekwenzi tal-primers tal-oligonukleotidi użati fl-istudju preżenti huma deskritti fit-Tabella Supplimentari S1. Il-kwantifikazzjoni relattiva tal-mRNA tal-mira għar-referenza ġiet iddeterminata bl-użu tal-metodu 2-AACT [34].

2.9. Analiżi Statistika

Data kwantitattiva hija murija bħala l-valur medju ± SD. Analiżi statistiċi saru bl-SPSS verżjoni 24 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Il-paraguni statistiċi bejn żewġ gruppi twettqu bl-użu tat-test t tal-Istudent jew test mhux parametriku, skont ir-riżultat tat-test tan-normalità. L-analiżi għal gruppi multipli b'distribuzzjoni normali twettqu bl-użu ta 'ANOVA one-way, u l-bqija saru bl-użu ta' testijiet mhux parametriċi. Id-dejta u l-metodi statistiċi kollha jistgħu jiġu ċċekkjati fit-Tabella S2.

3. Riżultati

3.1. Bidliet fil-Piż tal-Ġisem u l-Proprjetajiet Antibatteriċi taż-Żebrafish waqt is-Sawm u t-Tkebbija mill-ġdid

Tkabbir kumpensatorju sħiħ ġie realizzat fiż-żebrafish. Wara s-sawm għal 7 sa 14-il jum, iż-żebra tilef mill-inqas 15 fil-mija tal-piż tal-ġisem. Wara 14-il jum ta 'riforniment, il-piż tal-ġisem taż-zebrafish fil-grupp tas-sawm laħaq dak tal-grupp ta' kontroll (Figura 1A-C). Wara s-sawm u l-ikel mill-ġdid, sabiex tiġi esplorata r-reżistenza taż-zebrafish għall-patoġeni, ġew injettati intraperitonealment bi Streptococcus agalactiae. Iż-żebra fil-grupp tas-sawm kellu rata ta' mortalità miżjuda meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll. Bl-estensjoni tar-riforniment, ir-rata tal-mortalità kompliet tonqos (Figura 1D).

Figura 1. Il-mudell ta 'tkabbir kumpensatorju fiż-zebrafish. A sa C: il-bidla fil-piż tal-ġisem taż-zebrafish waqt is-sawm u l-għalf mill-ġdid. (A) Iż-zebrafish kienu sajmu għal 7 ijiem u refed għal 28 jum. (B) Iż-zebrafish kienu sajmu għal 14-il jum u refed għal 21 jum. (C) Iż-zebrafish kienu sajmu għal 21 jum u refed għal 14-il jum. n=21–22. (D) Ir-rata ta' sopravivenza ta' zebrafish li ġew injettati intraperitonealment b'S. agalactiae; F: tmigħ; S: ġuħ; R: riforniment. n=3, *: p < {{10}}.05,="" **:="" p="">< 0.01;="" ***:="" p=""><>

3.2. Alterazzjonijiet Morfoloġiċi tal-Kliewi taż-Żebrafish waqt is-Sawm u l-Reeeding

Il-kliewihuwa t-tessut immuni ewlieni fiż-zebrafish. Il-ġuħ ikkawża bidliet morfoloġiċi fil-kliewi. Wara 21 jum ta' sawm, il-kilwa wriet bidliet morfoloġiċi ovvji. Sibna li aktar tubuli feruti bi qtar hyalin dehru wara li reeedgħu għal 3 u 5 ijiem. Din is-sitwazzjoni tjiebet f'7 ijiem. Barra minn hekk, ġie osservat li n-numru ta 'ċentri melanomacrophage (MMCs) fil-kliewiżdied wara l-ġuħ (Figura 2A–C). Flimkien mar-riforniment, dan is-sintomu ġie salvat. L-espressjoni tal-mRNA ta’ havcr1 żdiedet wara s-sawm (Figura 2D), li turi li l-ġuħ jista’ jikkawżakliewikorriment.

Figura 2. Bidliet morfoloġiċi fil-kliewitaż-zebrafish waqt is-sawm u l-ikel mill-ġdid. (A) HE-tbajja ta'kliewifiż-zebrafish waqt is-sawm u l-ikel mill-ġdid. Trijangolu iswed jindika tubuli feruti. Il-vleġġa ħamra tindika MMCs. Stilla ħamra tindika qtar hyalin. (B) Analiżi statistika tal-proporzjon ta 'tubuli feruti fil-kliewi. (C) Analiżi statistika ta 'MMCs fil-kliewi. n=3–4. (D) L-espressjoni relattiva tal-mRNA tal-ġene havcr1 fil-kliewitaż-zebrafish waqt is-sawm u l-ikel mill-ġdid. n {{0}}–10. F: tmigħ; S: ġuħ; R: riforniment. *: p <>

3.3. Stress Ossidattiv Tqanqal waqt is-Sawm u t-Tkebbija mill-ġdid

Il-kontenut tal-MDA tjieb b'mod sinifikanti wara s-sawm għal 21 u 24 jum u naqas wara 3 ijiem ta 'riforniment (Figura 3A). Madankollu, il-kontenut ta 'ROS naqas b'24 jum ta' ġuħ u rkupra b'reeeding għal 7 ijiem (Figura 3B). Il-kontenut ta 'NO żdied wara s-sawm għal 21 jum (Figura 3C). L-attività ta 'enzimi antiossidanti, inklużi SOD, GSH-Px, u CAT, żdiedet wara s-sawm. L-attivitajiet ta 'GSH-Px u CAT naqsu malajr u rkupraw fil-jum 3 ta' riforniment. Għalkemm l-attività ta 'SOD naqset bir-riforniment, xorta kienet ogħla minn dik tal-kontroll (Figura 4).

Figura 3. Stress ossidattiv fil-kliewi taż-zebrafish waqt is-sawm u l-għalf mill-ġdid. (A) Il-kontenut ta 'MDA fil-kliewi. (B) Il-bidla ta 'ROS fil-kliewi. (C) Il-kontenut ta 'NO fil-kliewi. F: tmigħ; S: ġuħ; R: riforniment. n=6–10. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0.01;="" ***:="" p=""><>

Figura 4. L-attività ta 'enżimi fis-sistemi antiossidanti fil-kliewitaż-zebrafish waqt is-sawm u l-ikel mill-ġdid. (A) L-attività tas-SOD fil-kliewi. (B) L-attività ta 'GSH-Px fil-kliewi. (C) L-attività tal-CAT fil-kliewi. F: tmigħ; S: ġuħ; R: riforniment. n=6–10. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0.01;="" ***:="" p=""><>

3.4. Is-Sistema Immuni Innata tal-Kliewi taż-Żebra Ġiet Affettwata mis-Sawm u t-Trigħ mill-ġdid

L-attività ta 'ALP żdiedet fil-kliewi wara s-sawm u naqset wara l-għalf mill-ġdid (Figura 5A). B'riforniment għal 7 ijiem, ma kien hemm l-ebda differenza sinifikanti bejn il-grupp ta 'riforniment u l-kontroll. L-attività tal-lysozyme fil-kliewi wriet xejra simili għal ALP, li żdiedet mas-sawm (Figura 5B). Naqas malajr wara l-għalf mill-ġdid. Ir-rispons tal-fqigħ respiratorju fil-kliewi ma wera l-ebda tibdil sinifikanti fi gruppi differenti, iżda r-rispons kien ogħla fil-grupp tas-sawm u l-għalf mill-ġdid (Figura 5C). L-espressjoni tal-mRNA taċ-ċitokine proinflammatorju il-1 wriet żieda notevoli fil-gruppi kollha tas-sawm iżda naqset fil-pront wara l-għalf mill-ġdid (Figura 6A). L-espressjoni tal-mRNA ta 'tgfb1a u tgfb1b wriet l-istess xejra bħal il-1 (Figura 6E, F). Madankollu, l-espressjoni tal-mRNA ta 'nfkb1 żdiedet b'mod notevoli biss wara l-ġuħ għal 24 jum u naqset wara l-għalf mill-ġdid għal 3 ijiem. L-espressjoni tal-mRNA ta 'nfkb2 wriet xejra simili għal dik ta' nfkb1 (Figura 6B, C). Il-ġene arg2 jikkodifika arginase II, li huwa relatat mar-rispons proinflammatorju. Barra minn hekk, l-espressjoni ta 'mRNA ta' arg2 żdiedet b'mod notevoli fil-gruppi kollha ta 'sawm u tnaqqset wara l-għalf mill-ġdid (Figura 6D). Wara li sfida liż-zebrafish li għaddew minn sawm u reeeding, ir-rispons kien aktar b'saħħtu fil-grupp tas-sawm. L-espressjoni tal-mRNA ta' il-1 u mmp9 fil-grupp ta' sawm ikkurat bl-LPS kienet ogħla b'mod sinifikanti minn dik fil-gruppi ta' kontroll jew ta' riforniment ikkurati bl-LPS (Figura 7).

Figura 5. Il-parametri tas-sistema immuni intrinsika fil-kliewitaż-zebrafish waqt is-sawm u l-ikel mill-ġdid. (A) Attività ALP fil-kliewi taż-zebrafish waqt is-sawm u l-għalf mill-ġdid. (B) Attività liżożima fil-kliewitaż-zebrafish waqt is-sawm u l-ikel mill-ġdid. (C) Ir-rispons tal-fqigħ respiratorju tal-kliewi fiż-zebrafish wara sajjem u refed. (C1) Il-valur tal-fluworexxenza/proteina tal-kliewi f'ħinijiet differenti. (C2) Fluworexxenza/valuri tal-proteini tal-kliewifi 150 min. (C3) Normalizzazzjoni tal-valur tal-fluworexxenza/proteina tal-kliewi fi 150 min. F: tmigħ; S: ġuħ; R: riforniment. n=12. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0.01;="" ***:="" p=""><>

Figura 6. L-espressjoni relattiva tal-mRNA ta 'ġeni relatati mal-immunità fil-kliewi taż-zebrafish waqt is-sawm u l-għalf mill-ġdid. (A–F):il-1 , nfkb1, nfkb2, arg2, tgfb1a u tgfb1b. F: tmigħ; S: ġuħ; R: riforniment. n=8–1{{10}}. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0.01;="" ***:="" p=""><>

Figura 7. L-espressjoni relattiva tal-mRNA tal-ġeni relatati mal-immunità fil-kliewita’ zebrafish ikkontestat b’5 uL ta’ 20 ug/mL LPS wara s-sawm u l-ikel mill-ġdid. (A–C) il-1 , mmp9 u nfkb1. F: tmigħ; S: ġuħ; R: riforniment. n=8–12. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0.01;="" ***:="" p=""><>

4. Diskussjoni

Fl-istudju preżenti, sibna li CG sħiħ jista 'jiġi realizzat fiż-zebrafish wara tul ta' żmien differenti ta 'ġuħ. Anke wara 3 ġimgħat ta 'sawm, il-piż tal-ġisem taż-zebrafish laħaq dak tal-grupp ta' kontroll wara ġimgħatejn. Dan ir-riżultat kien konsistenti max-xogħol preċedenti [28]. Studji wrew li l-ġuħ u l-għalf mill-ġdid jinfluwenzaw l-istat metaboliku taż-zebrafish [27,28]. Fi speċi mrobbija, is-sinifikat tas-CG huwa li jtejjeb l-effiċjenza tal-produzzjoni. Huwa importanti għall-ispeċi mrobbija li jżommu proprjetajiet antibatteriċi waqt is-sawm u l-għalf mill-ġdid. Matul dan il-proċess, iż-zebrafish għandu l-potenzjal li jbati minn patoġeni. Ġie rrappurtat li l-ġuħ ma influwenzax ir-rispons immuni f'Piaractus mesopotamicus infettat [18]. Sfortunatament, is-sawm ippromwova s-suxxettibilità taż-żebra għal S. agalactiae. Fl-istess ħin, il-parametri bijokimiċi u l-espressjoni tal-mRNA tas-sistema immuni intrinsika kienu influwenzati mill-ġuħ.

Fiż-zebrafish, il-lymph nodes huma assenti, u l-kliewi hija l-organu limfojde primarju, ekwivalenti għall-mudullun tal-mammiferi [24]. F'zebrafish adulti, il-kliewi hija s-sit ewlieni tal-ematopoeżi [35]. Il-popolazzjonijiet fil-mudullun tal-kliewi fihom ħafna tipi ta 'ċelluli ematopojetiċi, inklużi makrofaġi, newtrofili u limfoċiti [36,37]. Il-funzjoni xierqa tal-kliewi hija importanti għas-sistema immuni innata fiż-zebrafish. Fl-istudju preżenti, osservajna xi bidliet morfoloġiċi fil-kliewi taż-zebrafish soġġetti għall-ġuħ. Id-depożizzjoni ta' MMCs fil-kliewi żdiedet b'mod sinifikanti wara l-ġuħ. Preċedentement instab li l-ġuħ jista 'jikkawża d-depożizzjoni ta' melano-macrophages (MMs) fil-kliewi u l-milsa fil-ħut [38]. L-MMCs jidhru prinċipalment fil-kliewi, fil-fwied u fil-milsa u huma mxerrda u inqas strutturati fil-kliewi [39]. L-MMCs huma kkunsidrati li jaħdmu kemm fid-difiżi immuni kif ukoll fi proċessi fiżjoloġiċi normali, mhux immunoloġiċi. Il-funzjoni primarja ta 'MMCs hija fagoċitosi. Huwa maħsub li l-MMCs jistgħu jieħdu sehem kemm fir-risponsi immuni intrinsiċi kif ukoll f'dawk adattivi. Iż-żieda ta 'MMCs wara l-ġuħ tista' tkun dovuta għall-emofagoċitosi u t-tneħħija ta 'debris taċ-ċelluli. Barra minn hekk, fil-jiem bikrija tar-riforniment, ġiet osservata l-istruttura tal-qtar hyalin. Il-preżenza ta 'qtar hyalin hija maħsuba li hija indikattiva prinċipalment ta' alpha2u-globulina fiċ-ċelloli epiteljali tubulari [40]. Barra minn hekk, f'mudell ta 'sarkoma histiocytic, istiocytes neoplastiċi pproduċew liżożima, u liżożima akkumulat f'ċelloli epiteljali tubulari [41]. Fil-qosor, il-formazzjoni ta 'qtar hyaline sseħħ minħabba li l-kliewi ma jistgħux jiddiġerixxu l-proteina li jakkumula fiċ-ċelloli epiteljali tubulari. Il-livell ta' KIM-1 (kodifikat minn havcr1) jista' jindika l-ħsara strutturali tat-tubuli [42]. Wara l-ġuħ, l-espressjoni tal-mRNA ta 'havcr1 notevolment żdiedet u naqset bir-riforniment. Nistgħu nbassru li l-funzjoni tal-kliewi hija mxekkla bis-sawm, u b'reeeding, il-funzjoni tal-kliewi tirkupra. Madankollu, ir-rekwiżiti huma ta 'piż fil-bidu tar-riforniment.

Il-fagoċitosi hija proċess importanti ta' difiża fis-sistema immuni innata fil-ħut. L-istress ossidattiv se jillimita r-rispons immuni [20]. Id-difiża antiossidanti tiddependi prinċipalment fuq l-enzimi. SOD, GPx, u catalase huma komponenti importanti tas-sistemi antiossidanti [43]. SOD jimmedja l-konverżjoni ta 'anjoni superossidu u H2O2. Catalase jieħu sehem fid-diżintossikazzjoni ta' H2O2 fl-ilma. GPx jikkatalizza l-idroperossidi (eż., H2O2 u idroperossidi tal-lipidi) għal H2O billi jossidizza l-glutathione (GSH) f'glutathione disulfid (GSSH) [43-45]. L-MDA huwa wieħed mill-prodotti ewlenin tal-ossidazzjoni tal-lipidi u huwa prodott minn aċidi grassi polyunsaturated (PUFAs) minn reazzjonijiet kimiċi u reazzjonijiet katalizzati minn enżimi. ROS jista 'jipperossida l-PUFAs biex jiġġenera MDA. Il-kontenut tal-MDA huwa bijomarkatur użat komunement biex jevalwa l-istress ossidattiv [46]. Fix-xogħol preżenti, anki jekk il-kontenut ta 'ROS naqas, il-kontenut ta' MDA fil-kliewi żdied b'mod notevoli, u l-attività tal-enzimi kollha li jappartjenu għas-sistema antiossidanti kienet elevata wkoll. L-iskoperta ta 'ROS hija rispons temporanju. Il-bidla fl-attività ta 'l-enzima antiossidant kienet ir-riżultat ta' sawm fit-tul. Ix-xejriet kuntrarji bejn ROS u enzimi antiossidanti jistgħu jkunu dovuti għall-fatt li proċessi ta 'attività ċellulari normali jipproduċu ROS, filwaqt li l-ġuħ fit-tul iwassal għal attività ċellulari mnaqqsa. Dan ir-riżultat wera li l-ġuħ ikkawża stress ossidattiv fil-kliewi b'mod kroniku. Stress ossidattiv persistenti jista 'jikkawża ħsara lis-sustanzi fiċ-ċelloli bħal lipidi u proteini u fl-aħħar iwassal għal apoptożi u l-akkumulazzjoni ta' aggregati molekulari ossidizzati [20]. Fit-teleosti, ġie rrappurtat li l-ġuħ indott il-kontenut ta 'MDA fil-fwied u l-imsaren u żied l-attività ta' enzimi antiossidanti [47-49]. Dawn ir-riżultati implikaw li għalkemm is-sistema antiossidanti kienet attivata, ma kinitx biżżejjed biex tneħħi l-ħsara kkawżata mill-ġuħ. Sadanittant, l-istress ossidattiv jista' jattiva firxa kbira ta' fatturi ta' traskrizzjoni, bħal NF-kB, Nrf2, u HIF-1a. Sussegwentement, dawn il-fatturi ta 'traskrizzjoni jinduċu l-espressjoni ta' ħafna ċitokini u kimokini. Għalhekk, stress ossidattiv jista' jwassal għal infjammazzjoni kronika [44].

Sfidat bi Streptococcus agalactiae, iż-zebrafish fil-grupp tas-sawm sofra mortalità ogħla minn dawk fil-grupp ta 'kontroll. Sadanittant, l-attività ta 'ALP u lysozyme tjiebet bil-ġuħ. Lysozyme huwa komponent importanti fis-sistema immuni intrinsika tal-ħut u jieħu sehem fil-proċess tal-fagoċitosi [50]. Skont ir-riżultati, il-ġuħ ikkawża l-espressjoni tal-mRNA ta' il-1 , nfkb1, tgfb1a, tgfb1b, u arg2. Dawn il-bidliet jistgħu jkunu kkawżati minn stress ossidattiv. TGFB1 huwa ċitokin li għandu effetti kemm favur l-infjammazzjoni kif ukoll kontra l-infjammazzjoni [51]. TGFB1 rikombinanti wera attività immunosoppressiva u rregola l-espressjoni ta' ċitokini pro-infjammatorji fil-lewkoċiti ta' teleosti. Fiż-zebrafish, l-espressjoni ta’ tgfb1a ikkawżat infjammazzjoni fil-fwied [52]. Induzzjoni kronika tgfb1a attivat infjammazzjoni, u l-espressjoni tagħha indotta fibrożi tal-fwied fil-karċinoma epatoċellulari bikrija f'zebrafish. Arginase hija enzima primordjali u hija responsabbli biex tikkonverti L-arginine f'L-ornithine u urea. Arginase għandu żewġ isoenzimi (arginase I u arginase II) [53,54]. Arginase II huwa ġene relatat mal-immunità u nstab li huwa relatat ma' risponsi proinflammatorji fil-makrofaġi permezz ta' ROS mitokondrijali. Din id-dejta wriet li l-ġuħ jista’ jinduċi rispons immuni fil-kliewi. Fil-ġrieden, il-ġuħ naqqas is-sensittività għal LPS u ma influwenzax l-espressjoni ta' il-1 [55]. Madankollu, zebrafish stimulat bl-LPS wera rispons approssimattiv għal LPS, u l-espressjoni ta 'il-1 u mmp9 kienet sinifikament ogħla milli fil-gruppi l-oħra. B'kuntrast mal-ġrieden, il-ħut taż-żebra sar aktar sensittiv għal LPS wara l-ġuħ, għalhekk il-ġuħ jista 'jfixkel il-kapaċità tagħhom li jneħħu l-patoġeni.

5. Konklużjonijiet

Fl-istudju preżenti, esplorajna b'mod preliminari l-influwenza tas-sawm u l-ikel mill-ġdid fuq is-sistema immuni innata taż-żebrafish. Tkabbir kumpensatorju ġie realizzat fiż-żebrafish, akkumpanjat minn żieda fis-suxxettibilità għall-patoġeni wara l-ġuħ. Stress ossidattiv — ikkawżat mill-ġuħ u l-mudelli molekulari assoċjati mal-periklu prodotti minn tubuli renali feruti — setgħu kkontribwew għall-infjammazzjoni. Huwa meħtieġ aktar studju biex jiġi esplorat kif il-ġuħ iżid is-suxxettibilità u kif l-istat metaboliku jinfluwenza tipi differenti ta 'ċelluli immuni.

Materjali Supplimentari: Dawn li ġejjin huma disponibbli onlajn fuq https://www.mdpi.com/article/10 .3390/biom11060825/s1, Tabella S1: Lista ta 'primers użati f'dan l-istudju; Tabella S2: Ir-riżultat statistiku tal-esperiment.

Kontribuzzjonijiet tal-Awtur: Kunċettwalizzazzjoni, ZL, u WL; Kurazzjoni tad-dejta, JJ; Analiżi formali, ZL, u DL; Akkwist ta' finanzjament, WL; Investigazzjoni, ZL, DL, RC, u YY; Metodoloġija, ZL; Superviżjoni, WL; Kitba—abbozz oriġinali, ZL; Kitba—reviżjoni u editjar, WL L-awturi kollha qraw u qablu mal-verżjoni ppubblikata tal-manuskritt.

Finanzjament: Dan ix-xogħol kien iffinanzjat mill-Programm Nazzjonali ta' R&D Ewlenin taċ-Ċina (2018YFD0900101), is-Sistema ta' Riċerka Agrikola taċ-Ċina ta' MOF u MARA (CARS-46), u l-Programm għal Talenti Pendenti Ċiniżi fir-Riċerka Xjentifika Agrikola ({{3} }}) lil Wensheng Li.

Dikjarazzjoni tal-Bord ta 'Reviżjoni Istituzzjonali: L-istudju sar skont il-linji gwida tad-Dikjarazzjoni ta' Ħelsinki, u approvat mill-Kumitat għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Università Sun Yat-Sen.

Dikjarazzjoni ta' Kunsens Informat: Mhux applikabbli.

Dikjarazzjoni tad-Disponibbiltà tad-Data: Mhux applikabbli.

Kunflitti ta' Interess: L-awturi jiddikjaraw li m'għandhom l-ebda kunflitt ta' interess.