Disinn In Silico Ta Vaċċin Promiskuu Chimeric Multi-Epitopi Kontra Mikobacterium Tuberculosis Parti 2

 2.15. Ħarsa ġenerali tad-disinn tal-vaċċin b'ħafna epitopi

Fig. 1 ġabret fil-qosor il-kunċett ġenerali ta 'dan id-disinn tal-vaċċin b'ħafna epitopi. Fil-qosor, aħna analizzajna l-antiġeniċità tal-proteini M. tuberculosis miksuba minn IEDB u għażilna tmien kandidati antiġeniċi għall-kostruzzjoni ta 'vaċċin multi-epitopi, meta wieħed iqis il-klassifikazzjoni funzjonali tagħhom u l-lokalizzazzjoni subċellulari. Imbagħad, aħna mbassra l-epitopi antiġeniċi ta 'dawn it-tmien proteini u għażilna 15-il epitopi CTL, 16-il epitopi HTL, u 10 epitopi taċ-ċelluli B, li kienu marbuta aktar ma' HBHA adjuvant u PADRE permezz ta 'linkers xierqa. Barra minn hekk, aħna mbassra l-antiġeniċità, l-allerġeniċità, il-proprjetajiet fiżikokimiċi, u l-profil immunoġeniku tal-vaċċin multi-epitopi ddisinjat. Sadanittant, aħna mbassra wkoll l-istrutturi sekondarji u terzjarji tal-vaċċin u analizzajna l-interazzjoni potenzjali tiegħu mar-riċettur immuni TLR4.

Mycobacterium tuberculosis huwa patoġenu komuni li jikkawża tuberkulosi. Il-proteina ta 'Mycobacterium tuberculosis hija waħda mill-komponenti ewlenin ta' Mycobacterium tuberculosis, li hija kritika ħafna għall-funzjoni tas-sistema immuni tal-bniedem.

Il-proteina ta 'Mycobacterium tuberculosis tista' tattiva s-sistema immuni tal-bniedem u ttejjeb l-immunità tal-ġisem. Meta l-ġisem ikun infettat minn Mycobacterium tuberculosis, is-sistema immuni tal-bniedem se tipproduċi serje ta 'risponsi immuni, inklużi l-attivazzjoni u l-proliferazzjoni ta' ċelluli T speċifiċi u ċelluli B. Dawn iċ-ċelloli jistgħu jirrilaxxaw varjetà ta 'fatturi immuni, bħal interferon, interleukin, eċċ., Kif ukoll antikorpi biex jgħinu lill-ġisem jirreżisti l-Mycobacterium tuberculosis li jinvadi.

Barra minn hekk, il-proteina Mycobacterium tuberculosis tista 'wkoll tirregola l-bilanċ tas-sistema immuni u tevita ħsara immuni kkawżata minn attivazzjoni eċċessiva tar-rispons immuni tal-ġisem. F'dawn l-aħħar snin, ir-riċerka u l-iżvilupp tal-vaċċini tat-tuberkulożi ffokaw ukoll prinċipalment fuq l-applikazzjoni tal-proteina Mycobacterium tuberculosis, li tista 'ttejjeb l-immunità tas-sistema immuni umana permezz tat-tilqim u tevita b'mod effettiv l-okkorrenza u t-tixrid tat-tuberkulożi.

Għalhekk, il-proteina Mycobacterium tuberculosis hija importanti ħafna għall-effett tal-immunità umana. Billi ssaħħaħ b'mod attiv is-sistema immuni, permezz ta 'eżerċizzju xieraq u nutrizzjoni raġonevoli, tista' tipprevjeni aħjar it-tuberkulożi u mard infettiv ieħor u żżomm saħħa tajba. Minn dan il-lat, jeħtieġ li ntejbu l-immunità tagħna. Cistanche jista 'jtejjeb l-immunità b'mod sinifikanti minħabba li l-polisakkaridi fil-laħam jistgħu jirregolaw ir-rispons immuni tas-sistema immuni tal-bniedem, itejbu l-abbiltà tal-istress taċ-ċelloli immuni, u jtejbu l-immunità taċ-ċelloli immuni. Effett batteriċida.

Ikklikkja suppliment cistanche deserticola

3. Riżultati

3.1. Irkupru ta 'proteini M. tuberculosis għall-kostruzzjoni ta' vaċċin multi-epitopi

Biex nibnu vaċċin b'ħafna epitopi kontra t-TB, l-ewwel analizzajna l-antiġeniċità tal-proteini f'M. tuberculosis H37Rv. Total ta '492 proteina bi proprjetajiet immunoloġiċi vvalidati nkisbu mid-database IEDB, li minnhom 402 proteina (81.70 fil-mija) kienu mbassra li kienu antiġeniċi. Għall-karatterizzazzjoni funzjonali ta 'dawn l-492 proteina, 353 ġew arrikkit fid-database DAVID, filwaqt li 139 ma kinux. L-analiżi tal-lokalizzazzjoni wriet li 97 mit-353 proteina arrikkita kienu lokalizzati fil-kompartiment extraċellulari, l-ispazju barra l-wiċċ taċ-ċellula. Proteini lokalizzati fil-kompartiment extraċellulari jinkludu proteini tal-membrana ta 'barra u proteini mnixxija.

Fost is-97 proteina, 49 huma proteini tas-sekrezzjoni. Aktar arrikkiment ta '49 proteina mnixxita żvela li ħames proteini ġew imnixxija fl-ispazju extraċellulari u ħamsa kienu meħtieġa għall-patoġenesi (validata b'mod sperimentali minn BioCyc) [48]. Barra minn hekk, meta dawn l-għaxar proteini kienu allinjati mal-proteini totali ta 'H. sapiens, żewġ proteini (Mpt83 u Mpt70) kienu simili ħafna għall-proteini H. sapiens. Għalhekk, it-tmien proteini li jifdal mhux simili għall-proteini H. sapiens (Tabella 1) tqiesu kandidati finali għall-kostruzzjoni ta 'vaċċin b'ħafna epitopi.

3.2. Tbassir ta 'epitopi taċ-ċelluli T u taċ-ċelluli B ta' proteini kandidati

Qabel it-tbassir tal-epitopi, il-peptidi tas-sinjali ġew identifikati u mħassra minn proteini kandidati. Total ta' 623 epitopi CTL minn tmien proteini kandidati b'135 ligaturi b'saħħithom (16 ta' A1, 40 ta' A2, 22 ta' A3, 19 ta' A24, u 38 ta' supertipi B7 ta' MHC klassi I) kienu mbassra mill-NetMHCpan{{12} }.1 server (Fig. 2A, B). Fost il-135 ligaturi b'saħħithom, 36 kienu kemm antiġeniċi kif ukoll immunoġeniċi. Fl-aħħarnett, għażilna 15 minn 36 epitopi CTL skont il-kriterji li ġejjin: tliet epitopi għal kull supertip u mill-inqas wieħed għal kull proteina kandidata (Nota: EsxA ma kellu l-ebda binder qawwi li kien kemm antiġeniku kif ukoll immunoġeniku) (Tabella 2).

Barra minn hekk, aħna mbassra l-epitopi HTL tagħhom (epitopi MHC klassi II). {{0}}mer epitopi minn erba' alleli (HLA_DRB, HLA_DP, HLA_DQ, u H-2-I) b' klassifikazzjoni perċentwali Inqas minn jew ugwali għal 2.0 tqiesu li jgħaqqdu b'saħħithom u kklassifikati mill-inqas sal-ogħla punteġġ. L-alleli HLA-DR kellhom l-ogħla numru ta 'legaturi MHC II (2990), filwaqt li l-HLA-DP kellhom l-inqas (601) (Fig. 2C, D). Għandu jiġi nnutat li r-rispons immuni f'disturbi granulomatożi bħal tuberkulożi, lebbra, u sarkoidosi huwa ddominat minn ċelluli T-helper-1 (Th1) li jipproduċu IFN [97]. Barra minn hekk, rapporti preċedenti wrew li l-espressjoni ta 'ċitokini Th1 (IFN- u IL2) naqset f'pazjenti b'tuberkulożi [98]. Għalhekk, biex nistimulaw iċ-ċelloli Th1, aħna mbassra 15-mer IFN- -peptidi li jinduċu dawn il-proteini. Total ta' 534 epitopi b'attività li tinduċi IFN kienu mbassra bl-użu ta' NetMHCIIpan 4.0, li minnhom 315-il epitopi huma antiġeniċi. Minn dawn it-315-il epitopi, 103 wrew attività ta' rabta qawwija ma' mill-inqas allele HLA wieħed.

Ukoll, il-polimorfiżmu fl-alleli HLA jirriżulta f'varjazzjoni allelika, li twassal għal speċifiċitajiet ta' rbit ta 'peptidi distinti ħafna [55]. Bħala riżultat, aħna għażilna epitope wieħed bl-attività li torbot l-aktar b'saħħitha (l-aktar epitope promisku) minn kull waħda mit-tmien proteini kandidati. Barra minn hekk, il-95 epitopi li jifdal ġew ikklassifikati abbażi tas-saħħa tal-irbit, u mbagħad intgħażlu tmien epitopi addizzjonali, b'massimu ta 'żewġ epitopi għal kull proteina kandidata. Fl-aħħarnett, għażilna 16 minn 103 epitopi HTL skont il-kriterji li ġejjin: mill-inqas epitopi wieħed u massimu ta 'tliet epitopi għal kull proteina kandidata, l-aktar attività ta' rabta b'saħħitha għal kull proteina kandidata, u l-aktar antiġeniċi u li jinduċu IFN. Imbagħad użajnahom biex nibnu dan il-vaċċin b'ħafna epitopi (Tabella 2).

Fir-rigward tat-tbassir lineari tal-epitopi taċ-ċelluli B, intużaw żewġ servers (BepiPred2.0 u ABCpred) u nkisbu 166 epitopi. Aħna mbassra l-antiġeniċità tal-aqwa ħames epitopi għal kull proteina u mbagħad għażilna għaxar epitopi antiġeniċi (16-mer, mill-inqas wieħed minn kull proteina kandidata) (Tabella 2).

3.3. Kostruzzjoni ta' vaċċin b'ħafna epitopi

Għall-kostruzzjoni ta' vaċċin b'ħafna epitopi, HBHA, PADRE, 16 HTL (15-mer), 15 CTL, u 10 epitopi lineari taċ-ċelluli B (16-mer) ġew imqabbda permezz ta' linkers xierqa u denbu minn His × 6 tag (Fig. 3). L-adjuvants huma komponenti importanti tal-vaċċini li jistgħu jqawwu r-risponsi immuni intrinsiċi u adattivi [99]. Ħafna proteini minn M. tuberculosis għandhom proprjetajiet awżiljarji u ntużaw biex jiddisinjaw vaċċini [17,27,87,100-105]. Wieħed mill-aktar użati huwa HBHA [100-105], li huwa immunostimulant qawwi li jinduċi l-maturazzjoni taċ-ċelluli dendritiċi (DCs) permezz tal-ipproċessar TLR4 [105,106]. DCs ittrattati b'HBHA instabu li jattivaw ċelluli T naive, polarizzaw ċelluli T CD4 plus u CD8 plus biex inixxu IFN- u jinduċu ċitotossiċità medjata minn ċelluli T [47].

F'dan l-istudju, poġġejna HBHA bħala aġġuvant tal-proteina fit-tmiem N minħabba li huwa adattat biex tinbeda s-sintesi tal-kostruzzjoni tal-vaċċin minn HBHA, proteina li sseħħ b'mod naturali. HBHA qabel tqiegħed fit-tarf N ta 'xi vaċċini multiepitopi bħala adjuvant [105,107]. Minbarra l-adjuvants, PADRE, li huwa sigur għall-bnedmin, jista 'jtejjeb b'mod sinifikanti l-immunoġeniċità tal-vaċċin minħabba li jingħaqad b'affinità għolja ma' alleli multipli MHC-II tal-ġurdien u umani b'affinità għolja biex jinduċi risponsi medjati miċ-ċelluli Th [47,62]. HBHA u PADRE kienu konnessi minn linker PEAK helical, li jipprovdi riġidità filwaqt li jissepara ż-żewġ komponenti tal-proteini biex itejjeb l-effiċjenza u jnaqqas l-interferenza. Barra minn hekk, pont tal-melħ Glu-Lys iffurmat fi ħdan is-segmenti stabbilizza l-linker.

Peress li PADRE jista 'jtejjeb l-attività tal-epitopi HTL tal-vaċċin [54], poġġiejna s-16-il epitopi HTL wara PADRE. Il-linker GPGPG intuża biex jgħaqqad epitopi HTL ma 'xulxin u ma' PADRE peress li jiffaċilita l-progressjoni taċ-ċelluli immuni u l-preżentazzjoni tal-epitopi [108,109]. Barra minn hekk, GPGPG jinduċi rispons immuni HTL, li jista 'jfixkel l-immunoġeniċità tal-junctional u jirrestawra l-immunoġeniċità ta' epitopi individwali wara l-ipproċessar [108].

Għall-15-il epitopi CTL, l-epitopi individwali ngħaqad b'linker AAY, li jgħin lill-epitopi jipproduċi siti xierqa biex jorbot mat-trasportatur TAP u jtejjeb il-preżentazzjoni tal-epitopi [47]. Barra minn hekk, is-subunità kollha tal-epitopi CTL kienet marbuta mal-epitopi HTL upstream permezz tal-linker HEYGAEALERAG li jippossjedi ħames siti ta' qsim xierqa (A7-L8, A5-E6, Y3-G4, R 10-A11, u L{8-E9) essenzjali għal sistemi ta' degradazzjoni proteasomali u lisosomali ewkarjotiċi. Fl-ewkarjoti, il-proteasomes u l-lysosomes huma l-iktar makkinarju proteolitiku importanti, li juża s-sistema ubiquitin-proteasome (UPS) u l-mogħdija awtofaġika, rispettivament [110].

Il-linker HEYGAEALERAG intuża wkoll biex jgħaqqad is-subunità tal-epitopi CTL mal-10 epitopi taċ-ċelluli B lineari downstream marbuta flimkien minn linkers KK. Skont studji preċedenti, il-linker KK jipprevjeni l-induzzjoni ta 'antikorpi fis-sekwenza ta' aċidi amminiċi li tirriżulta mill-kombinazzjoni taż-żewġ peptidi, u b'hekk tiffaċilita l-wiri speċifiku ta 'kull peptide għall-antikorp [111]. Fl-aħħarnett, tikketta His× 6 kienet imwaħħla mal-C-terminal tal-aħħar epitope lineari taċ-ċelluli B għall-purifikazzjoni u l-karatterizzazzjoni sussegwenti tal-vaċċin (Fig. 3).

Il-proteina kimerika finali tikkonsisti f'933 residwi ta 'aċidu amminiku, li jibdew b'adjuvant HBHA, segwiti minn 41 epitopi, u jispiċċaw b'tikketta His× 6 (Fig. 3). Peress li din il-proteina kimerika hija komposta minn antiġeni multi-epitopi minn tmien proteini, semmieha MTBV8, il-Vilċin tat-TB Multi-epitopi derivat minn 8 proteini kandidati.

3.4. Analiżi tal-antiġeniċità, allerġeniċità, u parametri fiżjokimiċi ta 'MTBV8

Studji preċedenti wrew li l-antiġeniċità hija meħtieġa għal vaċċini umani biex iġibu risponsi immuni umorali, li jwasslu għall-ġenerazzjoni ta 'ċelloli tal-memorja diretti kontra epitopi ta' aġenti infettivi [112]. Għalhekk, aħna mbassra l-antiġeniċità tal-vaċċin multi-epitopi MTBV8 bl-użu tas-server VaxiJen 2.0 u ksibna antiġeniċità ta' 0.97, li hija ogħla b'mod sinifikanti mill-valur tal-limitu ({{7} }.4) [45,46] biex proteina batterika titqies antiġenika. Notevolment, MTBV8 kien aktar antiġeniku mill-proteini komponenti kollha (Fig. 4), li jissuġġerixxi li jista 'jistimula b'mod effettiv ir-risponsi immuni tal-host.

Barra minn hekk, ħafna makromolekuli mikrobiċi ġew irrappurtati li għandhom il-potenzjal li jinduċu reazzjonijiet ta' sensittività eċċessiva fil-bnedmin [113]. Biex tanalizza l-kwistjoni ta 'sensittività eċċessiva ta' MTBV8 u t-tmien proteini kostitwenti, aħna mbassra l-allerġeniċità tagħhom bl-użu tas-server AllerTOP 2.0. Tnejn mit-tmien proteini komponenti (LprA u EspC) kienu mbassra li kienu allerġeni (Tabella 1). Għandu jiġi nnutat li għalkemm il-vaċċin multi-epitopi ddisinjat (MTBV8) kien fih għaxar epitopi miksuba minn dawn iż-żewġ proteini, kien imbassar li ma kienx allerġiku, li jindika li dan il-vaċċin huwa sigur.

Biex nikkaratterizzaw aktar l-MTBV8, analizzajna l-proprjetajiet fiżikokimiċi tiegħu permezz tas-server ExPASy ProtParam. Il-proteina rikombinanti għandha piż molekulari ta '94.84 kDa u punt iżoelettriku ta' 8.91. Barra minn hekk, il-proteina kienet ikkunsidrata stabbli b'indiċi ta' instabbiltà kkalkulat (II) ta' 26.44 (proteini b'indiċi ta' instabbiltà > 40 kienu kkunsidrati bħala mhux stabbli) [64]. Il-half-life in vitro stmata hija ta' 30 sigħat fir-retikoċiti tal-mammiferi, itwal minn 20 in vivo fil-ħmira, u in vivo 10 sigħat f'E. coli. Barra minn hekk, l-indiċi alifatiku ta 'MTBV8 kien 71.91, u l-valur medju ġenerali ta' idrofiliċità (GRAVY) kien - 0.32, li jindika li l-proteina rikombinanti kienet idrofilika. Fl-aħħarnett, il-valur tas-solubilità proporzjonali għal MTBV8 (0.54) kien akbar mill-medja għas-sett tad-dejta tal-popolazzjoni (0.45), li jindika li l-kandidat għall-vaċċin kien aktar solubbli minn nofs il-proteini E. coli [114]. Ir-riżultati ta 'hawn fuq indikaw li MTBV8 għandu proprjetajiet fiżiċi u kimiċi tajbin u huwa adattat għall-użu bħala vaċċin.

3.5. Profil immunoġeniku ta 'MTBV8

Biex nevalwaw il-profil ta 'immunoġeniċità ta' MTBV8, aħna analizzajna r-risponsi immuni in silico permezz tas-server immuni C-IMMSIM. Kif muri f'Fig. 5A, it-titri IgM u IgG1 żdiedu sostanzjalment wara stimulazzjoni immuni sekondarja minn MTBV8. Barra minn hekk, il-livell ta 'ċelluli B attivi żdied u baqa' f'livell għoli wara kull immunizzazzjoni (Fig. 5B). Anke għaċ-ċelloli B fil-plażma, l-isotipi B IgM u IgG1 baqgħu għoljin wara l-immunizzazzjoni (Fig. Supplimentari 1A, B). Fir-rigward tal-effett fuq iċ-ċelluli T, il-livelli ta 'ċelluli tal-memorja Th (y2) (Fig. 1C Supplimentari) u ċelluli Th attivi (Fig. 5C) żdiedu malajr wara immunizzazzjoni primarja u ġew imsaħħa b'mod sinifikanti wara immunizzazzjoni sekondarja. Iċ-ċelluli T regolatorji (primarjament ċelluli attivi) ġew stimulati mal-immunizzazzjoni inizjali u mbagħad naqsu malajr (Fig. 1D Supplimentari). Interessanti, il-livell ta 'ċelluli attivi ċitotossiċi T (Tc) żdied malajr wara l-immunizzazzjoni primarja, baqa' għoli fit-tieni immunizzazzjoni, u mbagħad naqas b'mod stabbli, filwaqt li ċ-ċelloli Tc ta 'mistrieħ wrew it-tendenza inversa għal ċelluli Tc attivi (Fig. 5D). B'kuntrast, il-livelli ta 'ċelluli Tc anerġiċi (y2) (Fig. 5D) u ċelluli Tc tal-memorja (Fig. Supplimentari 1E) baqgħu ma nbidlux mal-immunizzazzjoni. Barra minn hekk, għandu jiġi nnutat li l-livelli tal-fatturi immuni IFN- u IL-2 imnixxija miċ-ċelluli T li huma kritiċi għar-rispons immuni kontra M. tuberculosis [115] żdiedu wkoll b'mod sinifikanti wara l-immunizzazzjoni MTBV8 (Fig. 5E).

Barra minn hekk, aħna mbassra l-effett tat-tilqim MTBV8 fuq popolazzjonijiet ta 'ċelluli immuni intrinsika (Fig. 5F u Supplimentari Fig. 1FH). Ċelloli li jippreżentaw -2 f'DCs u makrofaġi żdiedu malajr mal-ewwel tilqim, filwaqt li kienet osservata żieda żgħira biss wara t-tieni tilqim (Fig. 5F u Supplimentari Fig. 1G). Barra minn hekk, fil-makrofagi, l-ewwel immunizzazzjoni rriżultat f'żieda jew tnaqqis simultanju fil-makrofaġi attivi u ta 'mistrieħ. Ftit ġimgħat wara t-tieni tilqim, il-makrofagi attivi naqsu malajr filwaqt li l-makrofaġi ta’ mistrieħ żdiedu malajr. (Figura Supplimentari 1G). Notevolment, ċelluli naturali qattiel u popolazzjonijiet ta 'ċelluli epiteljali attivi urew mudell pjuttost kostanti mal-immunizzazzjoni. (Figura Supplimentari 1F, H). Meħuda flimkien, dawn it-tbassir issuġġerew li MTBV8 jista 'jistimula b'mod qawwi kemm ir-risponsi immuni intrinsiċi kif ukoll dawk adattivi, li jagħmilha kandidat potenzjalment effettiv għall-vaċċin.

3.6. Strutturi mbassra sekondarji u terzjarji tal-MTBV8

Biex nikkaratterizzaw aħjar l-MTBV8, ipprevedejna l-istrutturi sekondarji u terzjarji tiegħu, segwiti mill-irfinar tal-istruttura terzjarja tiegħu. L-istruttura sekondarja ta 'MTBV8 kienet tikkonsisti minn 42.12 fil-mija helices, 11.79 fil-mija strands, u 46.09 fil-mija coils (Figura 2 Supplimentari). Skont il-previżjonijiet DISOPRED3, 27.11 fil-mija tar-residwi tal-aċidu amminiku kienu diżordinati.

L-istruttura terzjarja ta 'MTBV8 kienet mbassra mis-server I-TASSER, u nkisbu 5 mudelli b'punteġġi C tajbin. Il-punteġġ C huwa bejn -5.0 u 2.0 u huwa proporzjonali għall-affidabbiltà tal-previżjoni. Dawn il-mudelli ġew soġġetti għal analiżi ProSA-web u l-mudell 4 intgħażel minħabba l-karatteristiċi li ġejjin; Punteġġ C=-3.8, punteġġ Z=-4.4. L-analiżi tal-plott Ramachandran ta 'din l-istruttura terzjarja wriet li inqas minn 70.0 fil-mija tar-residwi kienu f'reġjuni preferuti, għalhekk, aktar raffinar tal-istruttura terzjarja huwa meħtieġ.

L-istruttura terzjarja miksuba minn I-TASSER ġiet irfinuta mis-server ModRefiner, segwit mis-server GalaxyRefine biex jiġġenera ħames mudelli. Fost il-ħames mudelli raffinati, il-mudell 2 kellu l-aħjar struttura meta kkunsidra l-parametri li ġejjin: Test tad-distanza globali preċiżjoni għolja (0.89), RMSD (0}.58), MolProbity (2.31), kunflitt punteġġ (14.8), punteġġ ta 'rotamer fqir ({{10}}.80) u punteġġ tal-plott Ramachandran (86.5 fil-mija) (Fig. 6A). L-analiżi tal-plott Ramachandran ta 'din l-istruttura bl-użu ta' PROCHECK żvelat li mill-753 residwi mhux glycine, mhux proline u mhux terminali, 78.9 fil-mija minnhom kienu fl-aktar reġjun favorevoli [A, B, L], 17.3 fil-mija kienu fil- addizzjonalment permess reġjun [a, b, l, p], u 1.5 fil-mija fir-reġjun ġeneralment permess [∼a, ∼b, ∼l, ∼p], b'2.4 fil-mija biss fir-reġjun mhux permess (Fig. 6B). Meta analizzajna l-plott Ramachandran tal-istruttura raffinata bl-użu ta 'Molprobity, sibna li 86.5 fil-mija tar-residwi tal-aċidu amminiku kienu jinsabu fir-reġjun favorevoli, li kien l-istess bħal dak miksub mis-server GalaxyRefine (Fig. 6C) . Barra minn hekk, 98.0 fil-mija tar-residwi kienu fir-reġjun permissibbli, filwaqt li 19-il residwi kienu outliers (phi, psi) (Fig. 6C). Għalkemm il-mudell raffinat għandu aktar residwi fir-reġjun iffavorit meta mqabbel mal-mudell iġġenerat minn I-TASSER, jeħtieġ validazzjoni ulterjuri.

Il-validazzjoni tal-mudelli hija pass ewlieni fil-proċess tal-bini tal-mudelli peress li tista' tidentifika żbalji potenzjali fil-mudelli 3D imbassra [116]. Biex jiġi vvalidat il-mudell raffinat ta 'MTBV8, ProSA-web, u analiżijiet ERRAT saru. Analiżi ProSA-web wriet punteġġ Z ta '- 5.76 għal MTBV8 (Fig. 6D), li kien kemmxejn barra mill-firxa ta' punteġġi determinata b'mod sperimentali għal proteini ta 'daqs simili. Madankollu, l-analiżi ERRAT wriet fattur ta 'kwalità ġenerali ta' 70.94 għal MTBV8 raffinat. Peress li punteġġ ERRAT akbar minn 50 jirrappreżenta mudell ta 'kwalità tajba [117], punteġġ ta' 70.94 indika li għandna fiduċja għolja fl-istruttura mmudellata għal analiżi sussegwenti.

3.7. Docking molekulari ta 'MTBV8 b'riċetturi taċ-ċelluli immuni

L-affinità qawwija tal-vaċċini għar-riċetturi taċ-ċelluli immuni tipproduċi rispons immuni stabbli [118]. Biex tikseb għarfien dwar l-interazzjonijiet potenzjali bejn MTBV8 u riċetturi taċ-ċelluli immuni, wettaqna docking molekulari bejn MTBV8 u r-riċettur immuni TLR4 (Fig. 7A u B). Studji preċedenti wrew li ligands TLR4 jistgħu jattivaw DCs, li min-naħa tagħhom jattivaw ċelluli T naive, effettivament polarizzaw ċelluli T (ċelluli CD4 plus u CD8 plus) biex inixxu IFN- u jinduċu ċitotossiċità medjata miċ-ċelluli T [106]. Dawn il-proċessi jwasslu għal żieda fil-ġabra ta 'ċelluli tal-memorja effetur [119]. Peress li l-interazzjoni ta 'TLR4 ma' peptidi antiġeniċi twassal għal reazzjonijiet kontra l-infezzjoni tat-TB, aħna ffukajna fuq l-interazzjonijiet bejn MTBV8 u TLR4 (Fig. 7A). Ir-riżultati ta' docking molekulari minn Firedock wrew li l-mudell raffinat l-aktar favorit kellu enerġija globali ta' - 40.28, enerġija van der Waals attraenti (aVdW) ta' - 19.86, enerġija repulsiva (aħmar) ta' 2.19, enerġija ta' kuntatt atomiku ta '4.70 u kontribuzzjoni ta' bond idroġenu (HB) ta '- 1.03 (Fig. 7B). Barra minn hekk, Prodigy bassar enerġija li torbot bejn TLR4 u MTBV8 ta '-8.6 kcal/mol. Ir-riżultati ta 'hawn fuq indikaw li MTBV8 għandu affinità qawwija għal TLR4, li jippermettilu jiġġenera rispons immuni stabbli.

3.8. Simulazzjoni tad-dinamika molekulari

Is-simulazzjoni dinamika molekulari ntużat biex tanalizza l-moviment tal-atomi fil-vaċċin [120]. Id-deformabbiltà tal-katina ewlenija tiżvela sa liema punt molekula tista' tiddeforma f'kull residwu kostitwenti. Reġjuni ta 'deformazzjoni għolja indikaw il-pożizzjoni tal-katina "ċappetta" (Fig. 7C), u l-fattur B sperimentali nkiseb mill-bank tad-dejta tal-PDB korrispondenti filwaqt li l-kalkolu sar billi timmultiplika l-mobilità NMA b'8pi ^ 2 (Fig. 7D ). L-eigenvalue assenjat għal kull modalità normali huwa miżura ta 'ebusija tal-moviment, li hija direttament relatata mal-enerġija ta' deformazzjoni tal-istruttura kollha. L-eigenvalue huwa direttament proporzjonali għall-faċilità ta 'deformazzjoni (Fig. 7E). Il-varjanza ta' kull modalità normali hija inversament proporzjonali għall-valur proprju. Varjenzi individwali huma kkuluriti bil-kannella filwaqt li varjanzi kumulattivi huma kkuluriti bl-aħdar) (Fig. 7F). Fil-matriċi ta 'kovarjanza, hemm akkoppjar bejn pari ta' residwi, u mozzjonijiet korrelatati (aħmar), mhux korrelatati (abjad), u anti-korrelatati (blu) ġew murija (Fig. 7G). In-netwerk ta 'elastiċità rrappreżenta pari ta' atomi konnessi minn molol, u kull tikka rrappreżenta rebbiegħa bejn pari ta 'atomi korrispondenti. Il-kulur tat-tikek kien ifisser l-ebusija tagħhom; tikek griżi aktar skuri juru molol iebsa u viċi versa (Fig. 7H). Simulazzjonijiet ta 'dinamika molekulari bl-użu tas-server iMODS issuġġerew li l-kumpless ta' docking bejn MTBV8 u TLR4 kien stabbli.

3.9. Ottimizzazzjoni in silico u klonazzjoni ta 'MTBV8

Is-sintesi tal-proteini hija prerekwiżit għall-attività tagħha [121]. F'konformità ma' dan, aktar effiċjenzi tat-traskrizzjoni u tat-traduzzjoni tal-vaċċin huma meħtieġa għall-espressjoni żejda tiegħu fiċ-ċelloli E. coli permezz ta' plasmid li jirreplika lilhom infushom pET28a( plus ) [103]. L-ottimizzazzjoni tagħha nkisbet permezz tal-Indiċi tal-Adattament tal-Codon (CAI) ta '0.99, u kontenut ta' GC (54.81 fil-mija) bejn 30 fil-mija u 70 fil-mija, li ġeneralment jitqiesu bħala favorevoli għall-espressjoni tal-proteini fl-ospitant. Il-framment tad-DNA ta' mtbv8 jista' jiġi kklonat f'vettur pET-28a( plus ) bejn is-siti ta' restrizzjoni NcoI u XhoI bl-użu ta' SnapGene biex jiġġenera plasmid rikombinanti pET{-28a (plus )-mtbv8 (Fig Supplimentari .3).

4. Diskussjoni

4.1. L-emerġenza ta 'vaċċini multi-epitopi kontra t-tuberkulożi

It-tilqim huwa l-aktar mod affidabbli biex tiġġieled l-infezzjoni tat-tuberkulożi. Għal ħafna snin, ix-xjentisti identifikaw bosta kandidati promettenti għat-tilqim li jistgħu jissostitwixxu l-BCG, l-uniku vaċċin tat-TB approvat [8100,122–125]. Riċentement, il-vaċċini tat-TB rikombinanti rċevew attenzjoni dejjem akbar. Diversi vaċċini rikombinanti wrew effikaċja fi provi prekliniċi u kliniċi, inkluż l-ID93/GLA-SE li jikkonsisti f’erba’ vaċċini kandidati Rv2608 (familja PE/PPE), Rv1813 (espressi taħt stress/ipoksja), ESXV, u ESXW, li huma promettenti f’ ġrieden prova pre-klinika [122]. Għal provi kliniċi, GamTBvac, miksub billi tgħaqqad Ag85a u ESAT6-CFP10, kien ta' suċċess fi provi ta' fażi I [125], filwaqt li M72, li jikkonsisti f'żewġ kandidati [Mtb39A (PPE18) u Mtb32A], ta qawwa sinifikanti fil-fażi. II provi [123].

Provi b'suċċess ta 'dawn il-vaċċini rikombinanti jindikaw il-qawwa akbar ta' vaċċini bbażati fuq epitopi li sempliċement jinkorpora l-proprjetajiet immunoloġiċi ta 'proteini kandidati differenti fi proteina sintetika [124]. Notevolment, diversi vaċċini tas-subunità tat-TB ġew derivati ​​minn numru kbir ta 'kandidati għat-tilqim, u ħarġu bħala kandidati potenzjalment attraenti fi studji ta' mudelli fuq l-annimali [100]. Pereżempju, MP3RT, kandidat għall-vaċċin tat-TB multiepitope peptide li jikkonsisti f'sitt peptidi HTL immunoġeniċi, indotta livelli ogħla b'mod sinifikanti ta' limfoċiti IFN- u CD3 flimkien ma' IFN- plus T u unitajiet li jiffurmaw kolonji aktar baxxi (CFUs) fil-pulmun u l-milsa ta' ġrieden umanizzati milli ġrieden tat-tip selvaġġ [8]. Miexi 'l quddiem, ir-riċerka għal qawwa akbar f'dawn il-vaċċini wasslet għal arrikkiment ta' kandidati potenzjali ta 'proteini.

Barra minn hekk, proteini mnixxija minn M. tuberkulosi ġew ukoll ikkunsidrati fid-disinn ta 'MTBV8 (Tabella 1), minħabba li huma importanti għall-patoġenesi u l-virulenza tat-TB [126]. Barra minn hekk, xi proteini mnixxija tas-saffi ta 'barra taċ-ċelloli M. tuberculosis jistgħu jservu bħala antiġeni utli. Pereżempju, EsxA u EsxB ġew ippurifikati mill-kapsula ta 'M. tuberculosis [127] u ż-żamma ta' EsxA fil-kapsula ġiet implikata fiċ-ċitotossiċità [128]. Barra minn hekk, EsxA hija meħtieġa għall-integrità tal-ħajt taċ-ċellula batterjali [129]. B'mod ġenerali, il-proteini mnixxija għandhom uċuħ esposti biżżejjed b'tali mod li huma miri tar-risponsi immuni tal-ospitanti [130,131].

4.2. Stimulazzjoni potenzjali tas-sistema immuni intrinsika minn MTBV8

L-iskrinjar għal epitope fil-proteini kandidati jinvolvi l-attivazzjoni tas-sistema immuni intrinsika segwita mir-rikonoxximent tal-antiġen minn limfoċiti minħabba li ż-żewġ fatturi huma meħtieġa għall-attivazzjoni sussegwenti tas-sistema immuni adattiva [50]. Għar-rispons intrinsiku, il-formazzjoni ta 'kumpless stabbli bejn MTBV8 (megħjun mill-istimulatur TLR4 HBHA bħala aġġuvant) u TLR4 ta' DCs (Fig. 5F) hija importanti minħabba li ligandi TLR4 jistgħu jattivaw DCs u DCs attivati ​​jistgħu, min-naħa tagħhom, jattivaw. ċelluli T naive, effettivament polarizzaw CD4 plus u CD8 plus ċelluli T biex inixxu IFN- , u jinduċu ċitotossiċità medjata miċ-ċelluli T [106] u sussegwentement żiedu grupp ta 'ċelluli tal-memorja effetor [119].

Dan il-kumpless x'aktarx ikkontribwixxa għaż-żieda fil-popolazzjoni taċ-ċelluli tal-memorja (y2) f'limfoċiti B (Figura Supplimentari 1A) u limfoċiti Th (Fig. 1C Supplimentari) meta mqabbla ma 'ċelluli mhux tal-memorja. L-istimulazzjoni immuni b'MTBV8 hija komparabbli ma' dik miksuba b'vaċċini oħra multiepitopi kontra t-TB [33,37,39] u mard ieħor [27,62,107,124,132]. Dan ta x’jifhem dwar il-konsistenza tal-mekkaniżmu tal-vaċċin b’ħafna epitopi.

4.3. Istimulazzjoni potenzjali tas-sistema immuni adattiva minn MTBV8

Il-limfoċiti B u T huma ċ-ċelluli effetturi primarji li jikkoordinaw risponsi immuni adattivi permezz ta 'immunità umorali jew medjata minn ċelluli billi jagħrfu partijiet ta' patoġeni li jinvaduhom, imsejħa antiġeni [50]. Biex ninduċi rispons immuni adattiv umorali, aħna inkorporaw epitopi taċ-ċelluli B ta 'punteġġ għoli (Tabella 2) għar-rikonoxximent u l-qerda minn antikorpi espressi u mnixxija minn limfoċiti B [50,133]. L-istimulazzjoni tal-vaċċin ta 'limfoċiti B attivi (Fig. 5B), l-aktar ċelluli B li jxerrdu IgM- u IgG1- (Fig. Supplimentari 1A), tista' tirriżulta f'sekrezzjoni eċċessiva ta 'IgM u IgG1 (Fig. 5A).

L-antiġeniċità għolja tal-vaċċin (Fig. 4) jista 'jkollha implikazzjonijiet importanti għat-titjib tar-risponsi tal-antikorpi (Fig. 5A). Tabilħaqq, ir-risponsi immuni medjati miċ-ċelluli huma dipendenti ħafna fuq il-kapaċità taċ-ċelluli T li jirrikonoxxu l-antiġeni [134]. Biex niksbu dan, għażilna epitopi CTL u HTL antiġeniċi u qawwija li jorbtu mal-MHC (Tabella 2), li tejbu l-peptide: l-istabbiltà tal-kumpless MHC (pMHC), li hija l-fattur ewlieni li jikkontrolla l-immunoġeniċità tal-peptidi tal-MHC [135] u għandu rwol fil- il-priming ta 'ċelluli CD8 plus u CD4 plus T minn DCs, li jwassal għal risponsi ta' limfoċiti T (Fig. 5C, Fig. Supplimentari 1C) [136].

L-inkorporazzjoni ta 'linkers xierqa u oligopeptides sintetiċi (PADRE u HEYGAEALERAG) u l-ippożizzjonar preċiż ta' kull komponent jistgħu jiffaċilitaw il-purċissjoni u l-preżentazzjoni tal-epitopi (Fig. 3). Minħabba l-varjazzjoni tal-alleli fost il-bnedmin, għażilna epitopi CTL ibbażati fuq ir-rikonoxximent tal-alleli MHC-I ta 'razez umani ewlenin Tabella Supplimentari 1 (Tabella 2), u epitopi HTL promiskui ġew magħżula wara skrining għal proprjetajiet li jinduċu IFN u antiġeniċità.

4.4. Il-prospetti ta 'żvilupp ta' MTBV8

Dan id-disinn tal-vaċċin in silico huwa indikatur rilevanti fil-fażijiet tal-iskrinjar f'termini tas-sintesi u l-effikaċja tal-vaċċini kandidati. Għas-sintesi, it-tbassir tagħna wrew li jista 'jiġi sintetizzat fis-sistema E. coli, madankollu, sistemi oħra bħal ċelluli ta' insetti u mammiferi jistgħu wkoll jiġu kkunsidrati jekk is-sistemi bbażati fuq E. coli jippreżentaw diffikultajiet. Il-validazzjoni tal-laboratorju mxarrba hija l-istadju li jmiss fil-konferma tal-kandidati għat-tilqim wara studji in silico. Dan il-metodu fil-fatt intuża b'mod effettiv f'xi kandidati għat-tilqim, li kienu wkoll iddisinjati l-ewwel in silico u wara wrew effettivi fil-fażi sperimentali [137].

5. Konklużjoni

Appoġġ ewlieni tal-Għan ta' Żvilupp Sostenibbli tad-WHO għall-qerda sħiħa tat-TB huwa l-aċċess għal vaċċin qawwi biex jipprevjeni l-infezzjoni M. tuberculosis. Studji preċedenti wrew li vaċċini chimeriċi multi-epitopi jistgħu jisfruttaw il-proprjetajiet immuni/antiġeniċi ta 'ċerti proteini biex itejbu l-effikaċja immuni. F'dan l-istudju, użajna approċċ in silico biex niddisinjaw vaċċin kimeriku (MTBV8) billi nintegraw 41 epitopi promisku derivati ​​minn tmien proteini antiġeniċi mnixxija minn M. tuberculosis H37Rv. MTBV8 kien imbassar li jkun stabbli, solubbli, sigur, antiġeniku ħafna u immunoġeniku.

Analiżi immuno-informatika wriet li MTBV8 wera affinità tajba għar-riċettur ewlieni taċ-ċelluli immuni TLR4. Importanti, l-istimulazzjoni tat-tilqim ta 'MTBV8 tista' żżid b'mod sinifikanti l-livelli ta 'ċelluli B, ċelluli T, u popolazzjonijiet ta' ċelluli immuni intrinsika u stimulat il-produzzjoni ta 'immunoglobulini (IgG1, IgM, eċċ.) Kif ukoll fatturi immuni (IFN-, IL{6 }}, eċċ). Meħuda flimkien, il-vaċċin multi-epitopi MTBV8 huwa indikatur rilevanti fil-fażi tad-disinn tal-vaċċini kontra t-TB u jista' jsir pedament potenzjali fit-twettiq tal-'Istrateġija End TB'.

Dikjarazzjoni tal-kontribuzzjoni tal-awtur tal-kreditu

Binda T. Andongma: Kunċettwalizzazzjoni, Metodoloġija, Software, Kitba – abbozz oriġinali. Yazheng Huang: Kurazzjoni tad-dejta, Software. Fang Chen: Software, Viżwalizzazzjoni. Qing Tang: Kurazzjoni tad-dejta, Analiżi formali. Min Yang: Software, Viżwalizzazzjoni. Shan-Ho Chou: Kitba – reviżjoni u editjar. Xinfeng Li: Kunċettwalizzazzjoni, Metodoloġija, Software, Akkwist ta 'Finanzjament. Jin He: Superviżjoni, Kitba – reviżjoni u editjar, Akkwist ta 'finanzjament.

Dikjarazzjoni ta' Interess Kompetitur

L-awturi jiddikjaraw li m'għandhom l-ebda interessi finanzjarji konkorrenti magħrufa jew relazzjonijiet personali li setgħu jidhru li jinfluwenzaw ix-xogħol irrappurtat f'dan id-dokument.

Rikonoxximenti

Dan ix-xogħol kien appoġġjat mill-Fondazzjoni Nazzjonali tax-Xjenza Naturali taċ-Ċina (32200026, 31900057), il-fondi miftuħa tal-Laboratorju Ewlenin tal-Istat tal-Mikrobijoloġija Agrikola (AMLKF202108), u l-Fondazzjoni tax-Xjenza Postdottorat taċ-Ċina (2019M662654).

Appendiċi A. Informazzjoni ta' appoġġ

Dejta supplimentari assoċjata ma' dan l-artikolu tista' tinstab fil-verżjoni onlajn fuq doi:10.1016/j.csbj.2023.01.019.

Referenzi

[1] Boineau R, Domanski M, Troutman C, Anderson J, Johnson G, Mcnulty SE, Clappchanning N, Davidson-ray LD, Fraulo ES, Fishbein DP, et al. Amiodarone jew kardjoverter-defibrillator impjantabbli għal insuffiċjenza tal-qalb konġestiva. New Engl J Med 2005;352(3):225–37.

[2] Khoshnood S, Heidary M, Haeili M, Drancourt M, Darban-sarokhalil D, Nasiri MJ, Lohrasbi V. Kandidati ġodda għal vaċċin kontra Mycobacterium tuberculosis. Int J Biol Macromol 2018;120(Pt A):180–8.

[3] Kyu HH, Maddison ER, Henry NJ, Ledesma JR, Wiens KE, Reiner R, et al. Piż globali, reġjonali u nazzjonali tat-tuberkulożi, 1990-2016: jirriżulta mill-istudju tal-2016 tal-piż globali tal-mard, il-korrimenti u l-fatturi ta' riskju. Lancet Infect Dis 2018;18(12):1329–49.

[4] Organizzazzjoni Dinjija tas-Saħħa (2022). Rapport Globali dwar it-Tuberkolożi. 〈https://www. min. int/publications/i/item/9789240061729〉.

[5] Mirzayev F, Viney K, Linh NN, Gonzalez-Angulo L, Gegia M, Jaramillo E, Zignol M, Kasaeva T. Rakkomandazzjonijiet tal-Organizzazzjoni Dinjija tas-Saħħa dwar it-trattament tat-tuberkulożi reżistenti għad-droga, aġġornament tal-2020. Eur Respir J 2021;57(6):2003300.

[6] Ahmad Khan F, Fox G, Menzies D. Tuberkulożi reżistenti għad-droga. New York: Manwal tar-Reżistenza Antimikrobika Springer; 2017. p. 263–86.

[7] Mitchison D, Davies G. Il-kimoterapija tat-tuberkulożi: passat, preżenti u futur. Int J Tube Lung Dis 2012;16(6):724–32.

[8] Gong W, Liang Y, Mi J, Jia Z, Xue Y, Wang J, Wang L, Zhou Y, Sun S, Wu X. Vaċċin ibbażat fuq peptidi MP3RT indotta immunità protettiva kontra l-infezzjoni ta’ Mycobacterium tuberculosis f’mudell umanizzat tal-ġurdien . Front Immunol 2021;12:1–19.

[9] Lange C, Aaby P, Behr MA, Donald PR, Kaufmann SHE, Netea MG, Mandalakas AM. 100 sena ta 'Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guérin. Lancet Infect Dis 2022;22(1):e2–12.

[10] Glaziou P, Floyd K, Raviglione MC. Epidemjoloġija globali tat-tuberkulożi. Semin Respir Crit Care Med 2018;39(3):271–85.

[11] Ernst JD. Mekkaniżmi tal-evażjoni immuni M. tuberculosis bħala sfidi għad-disinn tal-vaċċin tat-TB. Cell Host Microbe 2018;24(1):34–42.

[12] Li X, Chen F, Liu X, Xiao J, Andongma BT, Tang Q, Cao X, Chou SH, Galperin MY, He J. Clp protease u antisense RNA jirregolaw b'mod konġunt ir-regolatur globali CarD biex jimmedja r-rispons tal-ġuħ mikobatterjali. eLife 2022;11:1–22.

[13] Liu CH, Liu H, Ge B. Immunità innata fit-tuberkulożi: difiża tal-host vs evażjoni tal-patoġenu. Cell Mol Immunol 2017;14(12):963–75.

[14] Elvang T, Christensen JP, Billeskov R, Hoang TTKT, Holst P, Thomsen AR, Andersen P, Dietrich J. CD4, u risponsi taċ-ċelluli T CD8 għall-M. tuberculosis Ag85B-TB10.4 promossi minn subunità adjuvanted, adenovector jew tilqim prime-boost eterologu. PLoS ONE 2009;4(4):e5139.

[15] Rossjohn J, Gras S, Miles JJ, Turner SJ, Godfrey DI, McCluskey J. T rikonoxximent tar-riċettur tal-antiġen taċ-ċelluli ta 'molekuli li jippreżentaw l-antiġen. Annu Rev Immunol 2015;33:169–200.

For more information:1950477648nn@gmail.com