Identifikazzjoni Ta' Sitogluside Bħala Aġent Potenzjal li Tnaqqas il-Pigmentazzjoni tal-Ġilda Permezz tal-Farmakoloġija tan-Netwerk

Kuntatt: ali.ma@wecistanche.com

Haoran Guo,1 Hongliang Zeng,2 Chuhan Fu,1 Jinhua Huang,1 Jianyun Lu,1 Yibo Hu,1Ying Zhou,1 Liping Luo,1 Yushan Zhang,1 Lan Zhang,1 Jing Chen,1 u Qinghai Zeng 1

Ħafna mediċini tradizzjonali Ċiniżi (TCMs) majbajdu l-ġildaproprjetajiet ġew irreġistrati fil-Ben-Cao-Gang-Mu u preskrizzjonijiet folk, u xi letteratura tikkonferma li l-estratti tagħhom għandhom il-potenzjal li jinibixxupigmentazzjoni. Madankollu, l-ebda studji sistematiċi ma identifikaw il-mekkaniżmi regolatorji speċifiċi tal-ingredjenti attivi potenzjali. L-għan ta 'dan l-istudju kien li jeżamina l-ingredjenti fit-TCMs li jinibixxu l-ġildapigmentazzjonipermezz ta' sistema ta' farmakoloġija ta' netwerk u biex jiġu esplorati mekkaniżmi sottostanti. Aħna identifikajna 148 ingredjent attiv potenzjali minn 14-il TCMs, u bbażati fuq il-"grad" medju tal-parametri topoloġiċi, l-aqwa ħames TCMs (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, u Paeoniae Radix Alba) li kienu l-aktar probabbli li jikkawżawjbajdu l-ġildapermezz ta 'proċessi anti-infjammatorji ġew magħżula. Sitogluside, l-aktar ingredjent komuni fl-aqwa ħames TCMs, jinibixxi l-melanogenesisin taċ-ċelluli tal-melanoma umana (MNT1) u ċ-ċelluli tal-melanoma murina (B16F0) u jnaqqas il-ġildapigmentazzjonifiż-zebrafish.Barra minn hekk, riċerka mekkanistika wriet li s-sitogluside huwa kapaċi jirregolatyrosinase(TYR) espressjoni billi jinibixxi l-mogħdijiet ERK u p38 u jinibixxi l-attività TYR. Dawn ir-riżultati juru li l-farmakoloġija tan-netwerk hija għodda effettiva għall-iskoperta ta 'komposti naturali bi proprjetajiet li jbajdu l-ġilda u d-determinazzjoni tal-mekkaniżmi possibbli tagħhom. Sitogluside huwa ingredjent attiv ġdid li jbajdu l-ġilda b'effetti regolatorji doppji li jinibixxuTYRespressjoni u attività.

Ikklikkja biexEstratt ta' Cistanche DHT għat-tibjid tal-ġilda

Introduzzjoni

Il-melanin mhux biss jiddetermina l-kulur tal-ġilda, l-għajnejn u x-xagħar tal-bniedem iżda għandu wkoll rwol ewlieni fil-kamuflaġġ, l-imitar, il-komunikazzjoni soċjali u l-protezzjoni mir-raġġi ultravjola. Madankollu, meta l-melanin jiġi prodott iżżejjed u mqassam b'mod anormali fl-epidermide, jikkawża varjetà ta' kundizzjonijiet, bħal freckles u melasma, li jistgħu jaffettwaw b'mod negattiv is-sbuħija perċepita u l-kunfidenza soċjali [1]. Melanin huwa l-prodott finali ta 'L-tyrosine wara passi multipli ta' reazzjonijiet enżimatiċi u huwa sintetizzat f'melanocyte melanosomes [2]. Fil-ġilda, il-melanoċiti jinsabu fil-basallayer tal-epidermide u jistgħu jipproduċu u jittrasferixxu maturemelanosomes għal keratinocytes, u b'hekk jikkawżaw il-ġildapigmentazzjoni [3]. TYRhija l-enzima ewlenija li tillimita r-rata fil-produzzjoni tal-melanin [4], u l-fattur ta’ traskrizzjoni assoċjat mal-mikroftalmja (MITF) huwa l-fattur ta’ traskrizzjoni prinċipali li jirregola l-espressjoni traskrizzjoni ta’ TYR [5].

Riċentement, studji sabu li r-risponsi infjammatorji għandhom rwoli importanti fir-regolamentazzjoni tal-melanoġenesi [6].Pereżempju, IL-18, prodott minn ċelluli Langerhans, ċelluli dendritiċi, u keratinoċiti fl-epidermide, jistgħu jirregolaw l-espressjonijiet ta 'TRP{{2 }} (proteina relatata mat-tyrosinase 1) u TRP-2 (proteina relatata mat-tyrosinase 2) billi tattiva l-mogħdijiet ta’ thep38/MAPK (protein kinase attivat minn mitoġenu) u PKA (protein kinase A), u b’hekk tippromwovi l-melanoġenesi[7, 8 ]. TNF-jirregola l-produzzjoni tal-melanin B16 prinċipalment billi jattiva NF-κB [9]. PGe2 (prostaglandin e2), li jinħareġ minn fibroblasti u keratinoċiti, intwera li jistimula d-divrenzjar taċ-ċelluli dendritiċi u jibda l-attività TYR fil-melanoċiti permezz tal-mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni cAMP (cyclic adenosine monophosphate) u Plc (phospholipase c) [10]. PIH (iperpigmentazzjoni postinfjammatorja) hija tip ta 'melanizzazzjoni reattiva tal-ġilda [11]. Diversi mard tal-ġilda, trawma, jew kirurġija kosmetika ħafna drabi jwasslu għalpigmentazzjonitaż-żona affettwata, speċjalment f'nies ta 'kulur [12]. Pazjenti b'PIH normalment iġarrbu stress psikoloġiku immens, li każijiet inseveri, jaffettwaw b'mod negattiv il-kwalità tal-ħajja tagħhom. Għalhekk, ċerti mediċini li jirregolaw l-infjammazzjoni jintużaw biex jikkuraw il-PIH u mard ieħor li jikkawża iperpigmentazzjoni. ta' phosphoinositide 3-kinase/Akt [14].

Tibjidaġenti, bħal hydroquinone (HQ) u vitamina Ċ, huma tradizzjonalment użati biex jittrattaw il-pigmentazzjoni [15]. HQ huwa hydroxyphenol b'effett inibitorju qawwi fuq il-melanogenesis. Madankollu, minħabba diversi effetti sekondarji bħal dermatite tal-kuntatt irritanti jew allerġika, kulur tad-dwiefer, u fejqan tal-feriti indebolita, l-użu ta 'HQ huwa ristrett[16, 17]. Il-Vitamina Ċ tinibixxiTYRbilli jinteraġixxi ma 'copperions f'siti attivi TYR, u b'hekk inaqqas il-melanoġenesi. Madankollu, il-vitamina Ċ hija instabbli fil-prodotti lesti. Barra minn hekk, jekk il-konċentrazzjoni ta 'vitamina Ċ hija ogħla minn 20 fil-mija, tista' tikkawża irritazzjoni tal-ġilda [18]. Għalhekk, ingredjenti naturali minn firxa wiesgħa ta 'sorsi li huma sikuri, effettivi, stabbli ħafna, u faċli biex jinħażnu huma fid-domanda kbira.

Riċentement, aktar ingredjenti TCM instabu li huma effettivi fl-inibizzjoni tal-ġildapigmentazzjoni, bħal apigeninand paeoniflorin [19-21]. It-TCMs b'attività ta 'tibjid deskritta fil-Ben-Cao-Gang-Mu jintużaw ħafna bħala riċetti sigrieti fiċ-Ċina, u llum il-ġurnata, huma kkonfermati li għandhom l-effett li jinibixxu l-pigmentazzjoni. Pereżempju, l-estratt ta 'Hedysarum multijugum Maxim (ir-riżoma ta' Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge) jikkawża tbajjad tal-ġilda billi jinibixxi l-mogħdija ERK [22]. L-estratt niexef ta' Typhonii Rhizoma (ir-riżoma ta' Sauromatum gigan-teum (Engl.) Cusimano u Hett.) jista' effettivament jinibixxi l-tyrosinaseattività in vitro [23]. U l-mediċina bbażata fuq l-evidenza kkonfermat ukoll li l-estratt ta’ SapindiMukorossi Semen (il-frott ta’ Sapindus mukorossi Gaertn.), li jinibixxi l-attività tat-tyrosinase, għandu l-potenzjal li jintuża bħala addittiv tad-droga u kożmetiku [24]. Xi preskrizzjonijiet folk tradizzjonali, għalkemm mhux miġbura f'kompendju, huma wkoll użati ħafna. San-Bai-Tang (SBT) huwa eżempju tipiku. Ye et al. wera li SBT jista 'jnaqqas il-produzzjoni tal-melanin billi jinibixxi l-passaġġ ta' sinjalazzjoni p38/MAPK u l-attività TYR [25]. TCMs oħra deskritti f'xi preskrizzjonijiet intwera li għandhom ukolljbajdu l-ġildaeffetti. L-estratt ta' Coicis Semen (iż-żerriegħa ta' Coix AquaticaRoxb.) jinibixxi l-produzzjoni tal-melanin billi jirregola 'l isfel MITF, TYR, TRP-1, u TRP-2 [26]. Barra minn hekk, cellassay taTYRwera li Ampelopsis japonica (ir-rhizomeof Ampelopsis japonica (Thunb.) Makino) inibixxi l-attività tal-faqqiegħ TYR b'aktar minn 50 fil-mija [27]. It-TCMs li jbajdu rreġistrati f'dawn ir-riċetti antiki ġew ippruvati li huma effettivi minn tekniki sperimentali moderni, iżda ħafna minnhom huma vverifikati fil-forma ta 'estratti, u l-ingredjenti attivi li jaħdmu mhumiex ċari.Dan qajjem l-interess tagħna fl-ingredjenti attivi tat-TCMs b'effetti ta' jbajdu rreġistrati. fi preskrizzjonijiet antiki.

Barra minn hekk, it-TCMs jew il-preskrizzjonijiet għandhom ingredjenti kumplessi, modi differenti ta 'azzjoni, u ingredjenti attivi mhux magħrufa. Barra minn hekk, l-inkonsistenza ta 'fatturi bħall-kwalità tal-materja prima, metodi ta' pproċessar, tekniki ta 'preparazzjoni, kompatibilità ta' ingredjenti użati fil-kompożizzjoni, u forom tad-dożaġġ għandha impatt akbar fuq l-effikaċja tat-TCMs [19, 28]. Għalhekk, l-użu ta 'ċerti TCMs majbajdu l-ġildaeffetti hija ristretta. Għalhekk huwa urġenti li jiġu identifikati ingredjenti attivi b'effetti potenzjali li jbajdu fuq il-ġilda, permezz ta 'screening sistematiku biex tiġi żgurata s-sigurtà, l-effikaċja u l-istabbiltà ta' dawn l-ingredjenti.

F'dawn l-aħħar snin, l-applikazzjoni tal-bijoloġija tas-sistema fil-qasam tat-TCM għamlet progress kbir. Il-farmakoloġija tan-netwerk tat-TCM hija trans-dixxiplina ġdida li tgħaqqad il-farmakoloġija tat-TCMs max-xjenza tan-netwerk, il-bijoloġija tas-sistema, ix-xjenza tal-komputazzjoni u l-bijoinformatika [29]. Jifhem bis-sħiħ il-kumplessità bejn id-drogi, il-mard, u s-sistemi bijoloġiċi mill-perspettiva tan-netwerk "kumpless-proteina/ġene-mard" [30]. Il-farmakoloġija tan-netwerk hija għodda effettiva u sistematika biex tistudja l-azzjoni farmakoloġika, il-mekkaniżmu, is-sigurtà u aspetti oħra tal-mediċina tal-ħxejjex, speċjalment it-TCMs, u tipprovdi għarfien siewi għall-iskoperta kurrenti tad-droga [31, 32].

ingredjenti li jbajdu l-ġilda

2. Materjali u Metodi

2.1. Proċess Farmakoloġiku tan-Netwerk

2.1.1. Bini ta' Database għal Ingredjenti Kimiċi

Tabella tal-fluss tal-programm sperimentali studjat hija murija fil-Figura 1. It-TCMs b'effetti kontra l-pigmentazzjoni, deskritti fil-Ben-Cao-Gang-Mu u fil-preskrizzjonijiet folkloristiċi, kienu użati għall-analiżi farmakoloġika tan-netwerk. Typhonii Rhizoma, Ricini Semen, Hedysarum multijugum Maxim., Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, u Sapindi MukorossiSemen, deskritti fil-Ben-Cao-Gang-Mu, għandhomjbajduu proprjetajiet li jbaxxu isfar u jistgħu jneħħu spotsand moles tal-wiċċ. Poria cocos (Schw.) Wolf (l-sclerotium ta 'Smilax china L.), Paeoniae Radix Alba, u Atractylodes macrocephala Koidz (ir-riżoma ta' Atractylodes macrocephalaKoidz.) Li huma kostitwenti tal-SBT huma magħrufa biex itejbu n-nisġa tal-ġilda u jnaqqsu l-kloasma upigmentazzjoni. Ħwawar oħrajn irreġistrati tradizzjonalment, bħal Bletilla striata (Thunb. Murray) Rchb.F. (ir-riżoma ta 'Bletilla striata(Thunb.) Rchb.F.), Ampelopsis japonica, A. dahurica (Fisch.)Benth. Et Hook (ir-riżoma ta' Angelica dahurica (Hoffm.)Benth. u Hook.f. ex Franch. u Sav.), Atractylodes lancea(Thunb.) Dc. (ir-riżoma ta 'Atractylodes lancea (Thunb.)DC.), Fructus Ligustri Lucidi, u Coicis Semen, ġew inklużi wkoll f'dan l-istudju. Minħabba n-numru kbir ta 'TCMs inklużi f'dan l-istudju, screenings multipli tad-databases tal-mediċina Ċiniża se jikkawżaw konfużjoni fl-ipproċessar tad-dejta. Aħna nużaw biss id-database tas-Sistemi tal-Mediċina Tradizzjonali Ċiniża Farmakoloġija (TCMSP), database użata aktar komunement, għall-iskrinjar ta 'segwitu. L-ingredjenti kimiċi ta' dawn it-TCMs ġew imfittxija fit-TCMSP (aġġornat fl-24 ta' April,2020) [33]. Id-droga li jixbhu (DL) u l-bijodisponibilità orali (OB) huma parametri ta' screening użati b'mod komuni. Mediċini topiċi jew sistemiċi huma trattamenti komuni għal mard tal-pigmentazzjoni tal-ġilda; għalhekk, użajna biss DL bħala l-kriterju tal-iskrinjar. Il-kumplessi eċċellenti b'DL > 0:18 ġew magħżula biex iżidu r-rata ta 'hit tal-kandidati tad-droga.

2.1.2. Intersezzjoni bejn Target Genes of TCMs andPigmentation-Associated Genes.

Is-sett tal-ġeni assoċjati mapigmentazzjoniintgħażlet abbażi tad-database GeneCards (aġġornata fl-24 ta' April, 2020), li minnha ntgħażlu miri b'punteġġ tal-marda tal-età > 1. Eventwalment, ġew identifikati 6180miri relatati mal-pigmentazzjoni. L-intersezzjoni bejn il-ġeni fil-mira ta 'TCMs u l-ġeni assoċjati mal-pigmentazzjoni ġiet illustrata bl-użu ta' dijagramma Venn [34].

2.1.3. Kostruzzjoni ta 'Compound-Target-PathwayNetwork Attiv.

Ingredjenti attivi u ġeni mmirati regolati ġew skrinjati skont ir-riżultati tad-dijagramma Venn. In-netwerk inbena bl-użu tas-softwer Cytoscape [35] u ntuża biex jindika r-relazzjoni bejn il-komposti attivi tat-TCMs u l-ġeni fil-mira ta'pigmentazzjoni.Kull ġene fil-mira regolat minn ingredjent attiv fl-aTCM kien meqjus bħala "grad." Il-parametri topoloġiċi medji ta '"grad" ta' kull TCM intużaw biex jevalwaw l-importanza tat-TCMs magħżula. Il-komposti ġew ikklassifikati, u l-aqwa ħames TCMs ġew magħżula għal analiżi ewlenin. Barra minn hekk, ġiet analizzata informazzjoni dettaljata dwar l-ingredjenti potenzjali attivi rrappurtati biex jirregolaw il-pigmentazzjoni.

2.1.4. Enċiklopedija ta 'Kjoto tal-Ġeni u l-Ġenoma (KEGG) Analiżi ta' Arrikkiment ta 'Ġeni fil-mira Irregolati minn TCMs Potenzjalment Effettivi.

Ġeni fil-mira regolati mill-aqwa ħames TCMs intgħażlu biex jiddeterminaw il-mogħdijiet fil-mira tal-KEGG u jesploraw il-mekkaniżmi possibbli ta’ ingredjenti potenzjalment effettivi f’dawn it-TCMs kontrapigmentazzjoniIr-riżorsi bijoinformatiċi DAVID 6.8 intużaw biex janalizzaw l-arrikkiment tal-mogħdijiet fil-mira tal-KEGG. Is-simboli tal-ġeni tal-miri potenzjali tal-ingredjenti attivi effettivi ttellgħu. L-identifikaturi tal-ġeni miksuba mbagħad ġew imniżżla u daħlu KOBAS3. Intgħażel il-ġene li aġġusta p valuri inqas minn 0.05.

2.1.5. Simulazzjoni ta' Docking Molekulari.

L-istrutturi 2D ta 'sitogluside, arbutin, nicotinamide, HQ, kojic acid, u aċidu askorbiku nkisbu mid-database PubChem. L-istrutturi mekkaniċi tal-molekuli żgħar ġew ottimizzati bl-użu ta' ChemBio3D Ultra 14.0. L-istruttura tal-kristall 3D tal-faqqiegħTYR(PDB ID: 2Y9X, koordinati ta' docking: X =-8:87, Y=-30:74, u Z=-41:52) inkisbet mill-Bank tad-Data tal-Protein ( PDB) database [36]. Il-kristallstrutturi 3D ta 'sitt riċetturi tal-membrana (riċettur opioid u, ID PDB: 4DKI; riċettur melanocortin 1, ID PDB: 2L1J; riċettur endothelin B, ID PDB: 5GLI; riċettur adrenerġiku, ID PDB: 4GBR; riċettur prostaglandin, ID PDB: 6D26 ; riċettur tal-fattur taċ-ċelluli staminali, ID PDB: 2EC8) inkisbu mid-database tal-PDB. L-istrutturi tal-proteini ġew ippreparati bl-użu ta 'AutoDock Tools billi tneħħew molekuli tal-ilma, żiedu l-idroġeni, u ħolqu bonds ta' ordni żero għal metalli u bonds disulfide. Fl-aħħar nett, simulazzjonijiet ta' docking molekulari saru bl-użu ta' AutoDock Vina 1.1.2 [37], u r-riżultati ġew analizzati bl-użu ta' PyMoL 1.7.2.1.

2.2. Validazzjoni Sperimentali

2.2.1. Kimiċi u Antikorpi.

Sitogluside (purità akbar minn jew ugwali għal 98 fil-mija) inxtara mingħand ChemFaces (#CFN98, 713, Chem Faces). Dimethylsulfoxide (DMSO) inxtara minn Sigma-Aldrich. Paraformaldehyde newtrali (4 fil-mija) inxtara minn Biosharp (Hefei, iċ-Ċina). Aċidu Kojic, theFontana-Masson Stain Kit, deoxycholate tas-sodju, u L DOPA nxtraw minn Solarbio (Beijing, iċ-Ċina). Dulbecco's modifikat Eagle's medium (DMEM) kien mixtri minn Gibco (#C11995500BT, Gibco). Serum bovin tal-fetu (FBS) u Kit ta' Għadd taċ-Ċelloli-8 (CCK8) inxtraw minn BI (Kibbutz Beit-Haemek, Iżrael). PMA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, l-attivatur ERK/MAPK) inxtara minn APExBIO (#N2060, APExBIO). Anisomycin (l-attivatur p38/MAPK) inxtara minn MedChem Express (HY-18982, MedChemExpress). Antikorpi primarji kontra l-proteina Rab-27A (RAB27A) (#69295,CST), kinażi regolata minn sinjal extraċellulari (ERK) (#4695,CST), p-ERK (#4370, CST), c- Jun N-terminal kinase JNK(#9252, CST), p-JNK (#4668, CST), p38 (#8690, CST), p38 (#4511, CST), proteinCREB li torbot l-element tar-rispons cAMP ( #9107, CST), u p-CREB (#9198, CST) inxtraw minn Cell Signaling Technology. Antikorpi primarji kontra TRP1 (ab235447, Abcam), TRP2 (NBP1-56058,Novusbio), MITF (STJ94134, Laboratorju ta' San Ġwann),TYR(BS1484, Bioworld), u GAPDH (#AP0066, Bioworld) inxtraw minn Abcam, Novusbio, St. John's Laboratory, u Bioworld, rispettivament.

2.2.2. Kultura taċ-Ċelloli u Trattament.

MNT1 u B16F0, li huma sinjuri fil-melanożomi, jintużaw ħafna biex jistudjaw il-melanoġenesi [38]. Konsegwentement, dawn iż-żewġ linji taċ-ċelluli ġew magħżula għal esperimenti sussegwenti. Iċ-ċelloli MNT1 u B16F0 kienu kkultivati ​​f'20 fil-mija jew 10 fil-mija serum bovin tal-fetu (BiologicalIndustries, Iżrael) u 1 fil-mija penicillin-streptomycin (Gibco) f'DMEM. Iċ-ċelloli kollha ġew ikkultivati ​​f'inkubatur imxarrab f'37 grad u 5 fil-mija CO2. Sitogluside ġie maħlul f'DMSO, u l-konċentrazzjoni finali ta 'DMSO kienet<0.1%. pma="" and="" anisomycin="" were="" separately="" dissolved="" in="" dmso,="" and="" the="" final="" concentration="" of="" dmso="" was=""><>

2.2.3. Żebrafish Kultura u Trattament.

L-embrijuni taż-żebrafish u l-medju tal-kultura nxtraw minn EzeRinka Biotech (Nanjing, iċ-Ċina). Il-protokoll sperimentali ġie approvat mill-Kumitat tal-Etika tat-Tielet Isptar Xiangya tal-Università Ċentrali tan-Nofsinhar (Nru 2021-S137). Fl-ewwel jum ta' wara t-tfaqqis, iż-żebrafish tkabbru fi 12-platt tajjeb (10 perwell), protett mid-dawl, u kkultivat f'37 grad. Iż-zebrafish ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' sitogluside, u ttieħdu ritratti bl-użu ta' mikroskopju maqlub f'intervalli ta' 24 siegħa biex jirreġistraw il-bidliet fil-melanin fid-denb taż-zebrafish. Wara li ttieħdu l-istampi, inqraw u rrekordjati kontinwament soluzzjonijiet ta' sitogluside ta' konċentrazzjonijiet differenti għal ġimgħa.

2.2.4. Vijabilità taċ-Ċelloli.

Il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet ivvalutata bl-użu ta' ċelluli CCK8.MNT1 u B16F0 ġew ibbanjati fi 96-pjanċi ta' bir f'adensità ta' 2000 ċellula/bir jew 500 ċellula/bir. Iċ-ċelloli ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' sitogluside (25, 50,100, 200, 400, 600, u 800 μM). Wara 24 siegħa jew 48 siegħa, 10 μLof CCK8 reaġent ġie miżjud ma 'kull bir, u ċ-ċelloli ġew inkubati f'37 grad għal siegħa. Meta l-kulur tal-medju daru oranġjo, il-kultura ġiet mitmuma, u microplatereader (PerkinElmer EnVision Xcite, UK) intuża biex titkejjel l-assorbiment f'490 nm.

2.2.5. Fontana-Masson Melanin Tbajja.

Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​fi pjanċa ta' 6-tajjeb u ttrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta'sitogluside għal jumejn, u l-aċidu kojic bħala kontroll pożittiv ġie miżjud f'200 μM. Iċ-ċelloli mbagħad tqiegħdu f'4 fil-mija paraformaldehyde għal 15-il minuta. Wara t-tlaħliħ bl-ilma, iċ-ċelluli ġew inkubati b'soluzzjoni ta 'ammonja-fidda Fontana għal 24 siegħa f'kamra mudlama, laħlaħ bl-ilma, u mbagħad imqiegħda f'iposulfit għal 5 min addizzjonali. Intuża mikroskopju maqlub biex josserva l-melanin.

2.2.6. Esperiment ta 'Rkupru tal-Funzjoni.

PMA, bħala attivatur rikonoxxut ta' ERK/MAPK [39, 40], ġie ttestjat għaċ-ċitotossiċità permezz ta' esperiment CCK8 f'konċentrazzjonijiet differenti (6.25,12.5, 25, 50, 100, 200, 400, u 800 ng/mL) għal 24 siegħa. U wara li ċ-ċelloli MNT1 u B16F0 ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti (25, 50, u 100 ng/mL) ta 'PMA għal sagħtejn, il-livell ta' fosforilazzjoni ta 'ERK ġie skopert b'esperiment ta' westernblotting. Fil-konċentrazzjoni magħżula, iċ-ċelluli ġew ittrattati b'0, 1, 2, 4, 6, u 8 sigħat biex jiskopru l-ħin effettiv ta 'attivazzjoni. Wara li ċ-ċelloli ġew ittrattati b'sitogluside (200 μM) u PMA (25 ng/mL) għal 48 siegħa (irtrattati kull 8 sigħat), il-livelli tal-proteini ta'TYRandp-ERK ġew skoperti. It-tbajja’ tal-melanin Fontana-Masson skopra l-kontenut tal-melanin. Anisomycin [41] huwa l-attivatur ta 'p38/MAPK, li l-konċentrazzjoni ta' esplorazzjoni tiegħu hija4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, u 512 nM, u l-metodi sperimentali l-oħra huma l-istess bħal PMA.

2.2.7. Kejl tal-Attività TYR.

Iċ-ċelloli ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' sitogluside għal jumejn. Wara d-diġestjoni u ċ-ċentrifugazzjoni, iċ-ċelluli ġew magħduda u sospiżi mill-ġdid darbtejn f'melħ imbuffer bil-fosfat (PBS). Sussegwentement, ġew miżjuda 500 μL ta' soluzzjoni ta' deoxycholate tas-sodju ta' 0.5 fil-mija ma' kull kampjun. Il-kampjuni ġew inkubati f'4 gradi għal 10 min u mbagħad f'37 grad għal 15 min. Ġie miżjud 1 mL ta 'soluzzjoni ta' 1 fil-mija L-DOPA, u wara dan 200 μL ġew immedjatament pipettati fi 96-pjanċa tal-bir. Sussegwentement, intuża platereader multimode biex ikejjel il-valuri ta 'assorbiment (A0) f'475 nm, u l-kejl ġie ripetut wara 30 min (A30).TYRl-attività ġiet ikkalkulata bħala (A{{0}}A0)/numru taċ-ċellula.

2.2.8. TYR Activity Probe.

A fluorexxenceprobe qrib infra-aħmar għalTYRattività bbażata fuq resorufin intużat biex tiġi viżwalizzata l-attività fiċ-ċelloli ħajjin, kif deskritt qabel [42]. Fil-qosor, ċelloli MNT1 u B16F0 ġew ikkultivati ​​fi 6-wellplate u ttrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' sitogluside għal jumejn. . Ġiet miżjuda sonda ta 'fluworexxenza ta' 10 μM, u wara 4 h, iċ-ċelloli ġew sostitwiti b'PBS. Wara li d-dawl aħmar kien eċċitanti, intuża immedjatament mikroskopju fluworexxenti invertit biex jieħu ritratti.

2.2.9. Estrazzjoni tal-proteini u Western Blotting.

Wara li ċ-ċelluli ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta 'sitogluside għal jumejn, il-proteina ċellulari totali ġiet estratta bl-użu tal-RIPA Lysis Buffer (Thermo Fisher) u l-cocktails Protease Inhibitor u Phosphatase Inhibitor (Roche). Il-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet iddeterminata bl-użu ta' assaykit tal-proteini BCA (KeyGEN Biotec). Wara l-imblukkar b'1 fil-mija BSA, l-antikorpi primarji kontraTYR, MITF, TRP1, TRP2, RAB27A, CREB, p-CREB, ERK, p-ERK, JUK, p-JUK, p38, u p-p38 ġew inkubati bil-membrani matul il-lejl f'4 gradi f'1: 1000 u GAPDH f'1: 3000 Il-membrani ġew maħsula b'TBS-T u inkubati b'antikorp sekondarju tal-mogħoż kontra l-fenek f'1: 3000 għal siegħa. L-antibody tal-irbit ġie skopert mill-elettrokemiluminixxenza (ECL).

2.2.10. Analiżi Statistika.

SPSS22.0 intuża softwer għall-analiżi statistika, u t-test ta' Student jew analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda (ANOVA) intuża għal paraguni ta' gruppi multipli. It-test Mann-Whitney U intuża għal data mhux parametrika. p < 0:05="" fil-każijiet="" kollha="" tqieset="" statistikament="" sinifikanti.="" ∗∗∗p="">< 0:001,="" ∗∗p="">< 0:01,="" u="" ∗p=""><>

3. Riżultati

3.1. Ingredjenti komposti ta 'TCMs.

Ġew studjati erbatax-il TCM, irreġistrati fil-Ben-Cao-Gang-Mu u f'riċetti folkloristiċi, b'effetti kontra l-pigmentazzjoni. Total ta' 372 ingredjent tal-mediċina Ċiniża mill-14-il TCMs ġew irkuprati mid-database TCMSP (Tabella supplimentari S1).

3.2. Ġeni Target Irregolati minn TCMs u Ġeni tal-Pigmentazzjoni Relatati.

Skont is-sistema ta 'tbassir fil-mira fid-database TCMSP, inkisbu total ta' 834 ġene fil-mira mill-14-il TCMs. Total ta '9431 ġenesrelatati ma'pigmentazzjoniġew irkuprati mid-database GeneCards, li minnhom, 6180 intgħażlu u kellhom punteġġ ta' rilevanza > 1.

3.3. Klassifikazzjoni ta' 14-il TCMs u n-Netwerk tal-Mira tal-Kompost tal-Mard.

Bl-użu ta 'softwer Cytoscape, ħadna l-intersezzjoni tal-ġeni regolatorji ta' kull TCM u ġeni relatati mal-pigmentazzjoni u ksibna l-ingredjenti attivi potenzjali u l-ġeni fil-mira komuni. Sussegwentement, in-netwerk tal-mira tal-kompost tal-marda bejn TCM upigmentazzjoniinbniet. Ibbażat fuq dan, ksibna l-medja "grad" ta 'kull ingredjent attiv u kklassifikati l-TCMs skond il-punteġġi tagħhom. Skont il-punteġġi tal-klassifika, l-aqwa 5 ħwawar kienu Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, u Paeoniae Radix Alba (Figura 2(a)). Permezz ta 'analiżi KEGG ta' 220 ġeni fil-mira tal-aqwa 5 TCMs, 19.3 fil-mija tal-ġeni kienu sinjuri fil-mogħdija tas-sinjalar PI3K-Akt, 13.6 fil-mija tal-ġeni kienu relatati mal-mogħdija tas-sinjalar tat-TNF, u madwar 12.3 fil-mija tal-ġeni kienu relatati mal-IL{{ 12}}. Barra minn hekk, 37 ġene kienu involuti fil-mogħdija MAPK u 28 ġene kienu involuti fil-mogħdija HIF-1. Dawn il-mogħdijiet huma relatati mill-qrib mar-regolazzjoni tal-metaboliżmu tal-melanin u t-tixjiħ tal-ġilda. Fost l-aqwa 20 mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni arrikkit, mogħdijiet relatati mal-infjammazzjoni ammontaw għal kwart minn dawn (Figura 2 (c)). Il-Figuri 2(d)–2(h) juru n-netwerk tal-kompost-mira tal-marda bejn Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, Paeoniae Radix Alba, andpigmentation, rispettivament. Skont id-dijagramma Venn tal-ingredjenti fl-aqwa ħames TCMs, sibna li erba 'TCMs kien fihom sitogluside u beta-sitosterol (Figura 2(b), Tabella supplimentari S2).

3.4. Ingredjenti Attivi potenzjali fl-Inibixxi l-pigmentazzjoni.

Skont in-netwerk tal-marda-kompost-mira, 148ingredjenti relatati mal-pigmentazzjoninkisbu minn 14TCMs. Permezz ta 'tfittxija ta' letteratura, 25 mill-148 ingredjent ġew irrappurtati li jinibixxu l-melanoġenesi. Erba 'ingredjenti attivi ġew irrappurtati bħala estratti tal-pjanti li jinibixxu l-melanoġenesi. Ġew studjati erbatax-il ingredjent attiv, u d-derivattivi tagħhom ġew irrappurtati li jirregolaw il-pigmentazzjoni. Interessanti, erba 'ingredjenti intwerew li jippromwovu l-melanogenesis, filwaqt li l-mekkaniżmu ta' sitt ingredjenti fir-regolatingmelanogenesis għadu mhux ċar. Il-bqija 95 ingredjent mediċinali potenzjali Ċiniż għadhom ma ġewx esplorati għar-regolamentazzjoni tal-pigmentazzjoni. Informazzjoni dettaljata dwar dawn l-ingredjenti hija pprovduta fit-Tabella supplimentari S3.

3.5. Effetti In Vitro u In Vivo ta' Sitogluside fuq il-Melanogenesis.

Wara l-proċess ta 'screening ta' hawn fuq, sibna li erba 'TCMs fl-TCMs ta' fuq kien fihom sitogluside u -sitosterol. -Sitosterol ġie rrappurtat li jinibixxi l-ormon li jistimula l-melanoċiti (-MSH), li jistimula l-melanoġenesi permezz tal-mogħdija ta’ sinjalazzjoni p38 fiċ-ċelloli tal-melanoma B16F10 [43]. Madankollu, l-effetti kontra l-pigmentazzjoni tas-sitogluside u l-mekkaniżmu speċifiku tiegħu ma ġewx irrappurtati. Għalhekk, għażilna sitogluside bħala kandidat tad-droga għal dawn l-istudji. L-assaġġ CCK8 sar biex jiġu esplorati l-konċentrazzjonijiet tossiċi potenzjali ta' sitogluside fiċ-ċelloli MNT1 u B16F0. Ir-riżultati wrew li s-sitogluside ma kellu l-ebda effett ovvju fuq il-proliferazzjoni taċ-ċelloli(Figuri 3(a) u 3(b)) f'konċentrazzjonijiet taħt 400 μM. Tbajja ta' melanin imwettqa bl-użu ta' 25, 50, 100, u 200 μMsitogluside wera li s-sitogluside jista' jnaqqas kontenut ta 'melanin fiċ-ċelloli MNT1 u B16F0 b'mod dipendenti mid-doża (Figura 3(c)). Barra minn hekk, it-trattament b'sitogluside inibixxi l-ġilda b'mod sinifikantipigmentazzjonifiż-zebrafish b'mod dipendenti fuq iż-żmien u d-doża (Figura 3(d)). Dawn ir-riżultati ssuġġerew li s-sitogluside inibixxi l-melanoġenesi in vitro u in vivo.

3.6. Effetti ta' Sitogluside fuq l-Espressjoni TYR.

Mir-riżultati preċedenti, sitogluside jista 'effettivament inaqqas il-kontenut ta' melanin, iżda kif jirregola dan il-proċess għadu mhux magħruf u għalhekk ta 'interess. Western blotting sar biex tiġi identifikata l-espressjoni ta 'ġeni relatati mal-melanoġenesi (TYR, MITF, TRP1, TRP2, u RAB27A) fil-livell tal-proteini. (Figura 4(a)). Peress li MAPK u PKA huma l-mogħdijiet tas-sinjalar ewlenin li jirregolaw TYR, esplorajna ulterjorment il-bidliet fil-proteini ewlenin f'dawn iż-żewġ mogħdijiet. , Billi ma kien hemm l-ebda tibdil sinifikanti fil-livelli totali ta 'proteini CREB, ERK, JNK, andp38 jew il-livelli ta' fosforilazzjoni ta 'JNK u CREB (Figura 4 (b), Figura S1A). Skont ir-riżultati tal-esperiment CCK8, sibna li PMA taħt 100 ng/mL mhix tossika għaż-żewġ ċelloli (Figura S1B), u 25 ng/mL PMA ovvjament iżidu l-livell ta 'fosforilazzjoni ta' ERK. Il-livell ta 'fosforilazzjoni ta' ERK naqas gradwalment wara 4 sigħat (Figura S1C-D). Permezz tal-melaninstaining Fontana-Masson, sibna li PMA jista 'jżid b'mod sinifikanti l-kontenut ta' themelanin taċ-ċelloli MNT1 u B16F0. Ir-riżultati tal-westernblotting jissuġġerixxu wkoll li PMA jista 'jirregola l-livell ta' fosforilazzjoni ta 'ERK, u sitogluside jista' jnaqqas il-livell ta 'fosforilazzjoni ta' ERK regolat 'il fuq minn PMA. Billi jinibixxi l-livell ta 'fosforilazzjoni ta' ERK u jnaqqas il-livell ta 'proteina ta'TYR, sitogluside inaqqas il-kontenut tal-melanin miżjud b'PMA (Figuri 4(c) u 4(e),Figura S2A). Fl-istess ħin, sibna li anisomycinhas riżultati simili. Anisomycin taħt 8 nM mhuwiex tossiku għaż-żewġ ċelloli, u 2 nM anisomycin jistgħu jżidu b'mod sinifikanti l-livell ta 'fosforilazzjoni ta' p38. Fi 8 sigħat, il-livell ta 'fosforilazzjoni ta' p38 għadu għoli (Figura S1B, Figura S1E-F). Ir-riżultati ta 'fontana-Masson melaninstaining u western blotting jissuġġerixxu wkoll li sitoglusidecan jinibixxi l-livell ta' fosforilazzjoni ta 'p38 upregulated by anisomycin, inaqqas il-kontenut ta' proteina TYR, u jinibixxipigmentazzjoni(Figuri 4(d) u ​​4(f), Figura S2B).Għalhekk, sitogluside jista 'jnaqqas l-espressjoni TYR billi jinibixxi l-mogħdijiet ERK/MAPK u p38/MAPK. Madankollu, il-mekkaniżmu li bih sitogluside jinibixxi dawn il-mogħdijiet ta' sinjalazzjoni għadu mhux ċar. Aħna ntraċċajna r-riċetturi tal-membrana upstream ta 'dawn il-mogħdijiet tas-sinjalar u użajna docking molekulari biex nesploraw il-mekkaniżmu ta' regolazzjoni ta 'mogħdijiet downstream. L-enerġiji li jorbtu bejn sitogluside u s-sitt riċetturi tal-membrana, jiġifieri l-opjojdi u, melanocortin 1, fattur taċ-ċelluli staminali, endothelinB, adrenerġiċi u riċetturi tal-prostaglandin kienu -7.8,-5.8, {{9 }}.5, -5.4, -3.4, u 0 kal/mol, rispettivament. Permezz ta 'docking molekulari, sibna li fost ir-riċetturi sixmembrane, sitogluside kellu affinitajiet għoljin ħafna mal-u opjojdi, melanocortin 1, u riċetturi tal-fattur tat-tkabbir taċ-ċelluli staminali (Figura 4(g)). Aħna nispekulaw li s-sitogluside jista 'jinibixxi l-mogħdijiet ERK/MAPK u p38/MAPK billi jorbtu mar-riċetturi tal-membrana imsemmija qabel, u b'hekk jirregolaw l-espressjoni TYR.

3.7. Effett ta' Sitogluside fuq l-Attività TYR.

Peress liTYRhija l-enzima ewlenija fis-sintesi tal-melanin, hija l-aktar mira prominenti għall-inibizzjoni tal-melanoġenesi. Il-biċċa l-kbira tal-kożmetiċi disponibbli fil-kummerċ jew l-aġenti li jħaffu l-ġilda, bħal HQ, arbutin, u kojic acid, huma inibituri TYR. Aħna użajna sitogluside u xi wħud klinikament użatijbajdu l-ġildaaġenti (arbutin, nicotinamide, kojic acid, HQ, u aċidu askorbiku) biex iwettqu docking molekulari ma 'TYR. L-interazzjonijiet dettaljati bejn sitogluside u l-aġenti msemmija hawn fuqTYRhuma murija fil-Figura 5(a). L-enerġiji li jorbtu ta' dawn is-sitt komposti kienu -6.2, -6.4, -5.6, -5.7, -5.4, u{{ 11}}.4 kcal/mol, rispettivament. Ġeneralment huwa maħsub li meta l-enerġija ta' affinità hija -4, tindika forza li torbot, u meta tkun Akbar minn jew ugwali għal -7.0, tindika forza li torbot b'saħħitha. In-naħa ta 'Sitoglu kklassifikati fit-tieni post fl-affinità, kemmxejn aktar dgħajfa mill-arbutin, urew kapaċità ta' kombinazzjoni relattivament pendenti.

Fl-istess ħin, esperiment ta 'konverżjoni L-DOPA intuża biex jikxef l-attività ta' TYR, bl-użu ta 'aċidu kojic bħala kontroll pożittiv. Ir-riżultati wrew li sitogluside inibixxa l-attività TYR fiċ-ċelloli MNT1 u B16F0 b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni, u l-grupp ta 'konċentrazzjoni għolja (2{00 μM) wera effett inibitorju ekwivalenti għal dak muri minn 200 μM kojic aċidu (Figuri 5(b) u 5(c)). Barra minn hekk, ir-riżultati tal-esperiment tas-sonda TYR wrew li hekk kif żdiedet il-konċentrazzjoni ta 'sitogluside, l-intensità tal-fluworexxenza naqset gradwalment fiċ-ċelloli, u l-intensità tal-fluworexxenza tal-grupp ta' konċentrazzjoni għolja kienet qrib dik ta '200 μM kojic acid fiċ-ċelloli MNT1 u B16F0 (Figura 5(d), Figura S2C). Dawn ir-riżultati jindikaw li s-sitogluside jista 'jinibixxi b'mod effettivTYRattività fiċ-ċelloli MNT1u B16F0. Barra minn hekk, nispekulaw li s-sitogluside, bħala kompost ta 'sterol naturali, jista' jippenetra direttament il-membrana taċ-ċellula u jorbot ma 'TYR u jinibixxi l-attività tiegħu, u b'hekk jinibixxi l-melanoġenesi.

4. Diskussjoni

F'dan l-istudju, użajna l-farmakoloġija tan-netwerk biex nesploraw mekkaniżmi ta 'potenzjaljbajdu l-ġildaingredjenti li jinsabu f'14-il TCMs, iddokumentati fil-Ben-Cao-Gang-Mu u preskrizzjonijiet folk, fl-inibizzjonipigmentazzjoni. L-istudju ppropona wkoll metodu innovattiv li juża l-parametru topoloġiku medju ta '"grad" ta' kull ingredjent attiv biex jevalwa l-effettività potenzjali tal-ħxejjex aromatiċi. Skont il-"grad" medju, ġew magħżula Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarummultijugum Maxim., Ampelopsis japonica, PseudobulbusCremastrae Seu Pleiones, u Paeoniae Radix Alba, u permezz tal-analiżi tal-arrikkiment KEGG tal-ġeni regolati minn dawn il-ħames TCMs, ma kienx mistenni mill-25 fil-mija. mogħdijiet ta' sinjalazzjoni kienu relatati mal-infjammazzjoni, inklużi mogħdijiet ta' sinjalazzjoni IL-17, TNF, HIF-1, PI3K-Akt, u MAPK.

Riċentement, varjetà ta 'medjaturi infjammatorji ġew murija li jattivaw jew jinibixxu mogħdijiet ta' sinjalazzjoni relatati mal-melanoġenesi li jippromwovu jew jinibixxu l-ġildapigmentazzjoni[6]. Ċelluli tal-melanoma B16F10 inkulturati, TNF-naqqas l-espressjoni ta 'TYRu attività TRP1 u TYR b'mod dipendenti fuq id-doża [44]. IL-17 u TNF- jistgħu jnaqqsu l-espressjoni ta 'ġeni relatati mal-melanoġenesi fil-melanoċiti, u IL-17 jistgħu jtejbu b'mod sinifikanti l-effett inibitorju ta' TNF- fuq il-melanoġenesi. Wara t-trattament b'etanercept (anti-TNF), il-ġeni relatati mal-melanoġenesi kienu regolati b'mod sinifikanti fil-leżjonijiet tal-ġilda ta 'pazjenti bi psorjasi[45]. HIF-1, fattur qawwi ta' traskrizzjoni li jirregola r-rispons infjammatorju, ġie rrappurtat li huwa involut fir-regolamentazzjoni ta' fatturi bħal IL-17 u TNF- [46-48]. Għalhekk, HIF-1 x'aktarx li jipparteċipa fir-regolazzjoni tal-melanoġenesi billi jinfluwenza l-infjammazzjoni. Ċitokini oħra bħal IL-18, IL-33, GM-CSF, u IL-1 jistgħu jippromwovu l-melanoġenesi billi jattivaw il-PKA, MAPK, jew mogħdijiet oħra ta’ sinjalazzjoni, filwaqt li IFN- , IL-1 , IL{-4, u IL{-6 inaqqsu l-melanoġenesi billi jinibixxu STAT1, NF-κB, u mogħdijiet ta' sinjalazzjoni JAK2-STAT6 [6]. Is-sejbiet tagħna jissuġġerixxu li l-aqwa ħames TCMs (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, u Paeoniae Radix Alba) jistgħu jeżerċitaw effett kontra l-pigmentazzjoni prinċipalment permezz ta 'mogħdijiet anti-infjammatorji. Il-letteratura preċedenti semmiet ukoll li dawn l-aqwa ħames TCMs għandhom effetti anti-infjammatorji u anti-aging qawwija [49, 50]. Dan jappoġġa wkoll il-konġettura tagħna li TCMs jista 'jkollhom rwol mhux negliġibbli fil-pigmentazzjoni postinfjammatorja.

Waqt li qegħda ħarsa lejn il-letteratura ta '148 ingredjent misjuba f'14-il TCMs, sibna wkoll li fost 35 mill-ingredjenti rrappurtati, kważi 70 fil-mija minnhom ġew ikkonfermati li jew inaqqsu l-kontenut ta' melanin jew jinibixxu l-attività TYR. Dan mhux biss jikkonferma li r-rekords ta' preskrizzjonijiet li jbajdu l-ġilda f'kotba antiki huma fil-biċċa l-kbira affidabbli iżda juri wkoll li r-referenza għal-letteratura antika hija metodu affidabbli biex tinkiseb għarfien dwar it-TCMs. Għad hemm 95 kompost li għadhom mhux esplorati, li għandhom il-potenzjal li jirreżistupigmentazzjoni. Permezz tal-analiżi tad-dijagrammi Venn tal-aqwa ħames TCMs, inkisbu 13-il ingredjent komuni. Fosthom, esperimenti in vitro kkonfermaw li daidzein, rutin, u ( plus )-catechin jistgħu jnaqqsu l-kontenut tal-melanin [51-53]. Is-sukrożju jfixkel il-maturazzjoni xierqa tal-melanosome billi jinduċi stress osmotiku u jinibixxi l-passaġġ PI3 kinase, u b'hekk jinterferixxi mal-melanoġenesi [54]. Quercetin inaqqas il-melanoġenesi indotta mill-istress ossidattiv [55]. Barra minn hekk, metodi kimiċi u fiżiċi bħal analiżi spettroskopiċi u tal-attività tal-istruttura kkonfermaw li lupeoland kaempferol jista’ jinibixxiTYRu tnaqqas il-melanoġenesi[56, 57]. Dan jindika li l-farmakoloġija tan-netwerk forsi hija metodu fattibbli biex tħafferjbajduingredjenti. Erba 'TCMs fl-aqwa ħames TCMs kien fihom sitogluside, u m'hemm l-ebda rapporti dwar jekk is-sitogluside jirregolax il-pigmentazzjoni jew il-mekkaniżmu relatat tiegħu. Għalhekk, għażilna sitogluside għal dawn l-istudji.

Sitogluside, sterol glycoside li huwa preżenti ħafna fil-pjanti, ġie rrappurtat li jeżerċita effetti antitumorali, antiossidanti u newroprotettivi [58-60]. F'dan l-istudju, skoprejna li s-sitogluside naqqas b'mod effettiv il-kontenut tal-melanin in vitro u in vivo. Esperimenti sussegwenti wrew li setgħet tnaqqas b'mod sinifikanti l-espressjoni ta 'TYR. L-aċidu kojiku kien użat bħala kontroll pożittiv, u jista 'wkoll jinibixxi l-livelli ta' proteina ta 'ġeni relatati mal-melanoġenesi bħal TYR,MITF, u TYRP1 taħt stimulazzjoni -MSH, li wasreported minn Jeon et al. [61]. Minħabba n-nuqqas ta 'stimulazzjoni eżoġena, 200 μM aċidu kojic kellu biss effetti inibitorji moderati fuq l-espressjoni tal-ġeni fl-istudju tagħna, iżda minħabba li kojicacid għandu attività inibitorja ta' tyrosinase kbira, għadna nużaw itas kontroll pożittiv f'dan l-istudju. L-espressjoni TYR kienet irrapportata li hija regolata direttament jew indirettament mill-mogħdijiet MAPKor PKA, rispettivament. Numru dejjem jikber ta’ ingredjenti ġew ikkonfermati li għandhom effett ta’ jbajdu fuq il-ġilda billi jinibixxu l-mogħdija tas-sinjalar MAPK. Pereżempju, fargesin inaqqas l-espressjoni ta’TYRbilli jinibixxi l-mogħdija P38/MAPK [62]. Il-polisakkaridi tal-Ganoderma lucidum jistgħu jirreżistu l-melanoġenesi indotta mill-UVB billi jirregolaw il-mogħdija MAPK [63]. L-istudju tagħna sab li sitogluside, f'konċentrazzjoni ta '200 μM, kellu l-potenzjal li jnaqqas l-espressjoni TYR billi jinibixxi l-mogħdijiet ta' sinjalazzjoni ERK/-MAPK u P38/MAPK. Dan ġie rrappurtat permezz tad-docking molekulari bejn ir-riċetturi tal-membrana upstream tal-mogħdijiet MAPK [64] u s-sitogluside. Sibna li s-sitogluside jingħaqad b'mod qawwi mar-riċetturi tal-opioid u, melanocortin 1, u staminali tat-tkabbir taċ-ċelluli. Għalhekk, aħna nispekulaw li sitogluside jista 'jinteraġixxi ma' dawn ir-riċetturi tal-membrana, jinibixxi l-mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni ERK/MAPK u P38/MAPK, u jnaqqas l-espressjoni ta' TYR.

Peress li TYR hija l-enzima ewlenija fis-sintesi ta’ partiċelli melanin fil-melanoċiti, l-inibizzjoni tal-attività tas-sit katalitiku ta’ TYR hija essenzjali biex titnaqqas il-ġilda.pigmentazzjoni[65]. Ħafna aġenti li jdaffu l-ġilda fis-suq huma inibituri ta 'TYRactivity, bħal HQ, arbutin, u kojic acid. F'dan l-istudju, użajna docking molekulari biex nesploraw l-effetti vinkolanti ta 'sitogluside u ħamsa komunijbajdu l-ġildaingredjenti attivi (arbutin, nicotinamide, kojic acid, HQ, andascorbic acid) [66] b'TYR. Ir-riżultati wrew li sitogluside kellu affinità li torbot b'saħħitha ma 'TYR, thanarbutin aktar dgħajfa, iżda aktar b'saħħitha minn aċidu kojic, nicotinamide, HQ, andascorbic acid. Arbutin huwa prodrug ta 'HQ u prodott naturali li jista' jnaqqas jew jinibixxi s-sintesi ta 'melanin billi jinibixxi TYR. Madankollu, il-forma naturali ta 'arbutin hija kimikament instabbli u tista' tikkonverti għal HQ, li hija katalizzata u metabolizzata f'metaboliti tal-benżin b'tossiċità potenzjali għall-mudullun [67]. L-użu tal-inkożmetiċi tal-aċidu kojic huwa ristrett minħabba l-karċinoġeniċità u l-instabilità tiegħu waqt il-ħażna [68]. Għalhekk, is-sitogluside, kompost ta 'sterol naturali derivat minn varjetà ta' pjanti, huwa mistenni li jaġixxi bħala aġent qawwi li jħaffef il-ġilda. Madankollu, is-solubilità tas-sitogluside fid-DMSO hija baxxa, li hija wkoll nuqqas ta 'dan l-ingredjent naturali. Verifika sperimentali sussegwenti wriet li sitogluside huwa sigur fil-linji taċ-ċelluli MNT1 u B16F0, u l-grupp ta 'konċentrazzjoni baxxa kellu effett inibitorju agood fuq l-attività TYR, filwaqt li l-grupp ta' konċentrazzjoni għolja kellu l-istess effett bħall-istess konċentrazzjoni ta 'aċidu kojic. Għalhekk, sitogluside jista 'jintuża terapewtikament bħala regolatur li jbajdu l-ġilda, li mhux biss inaqqas l-espressjoni ta' TYR iżda wkoll jinibixxi l-attività tiegħu (Figura 6).

5. Konklużjonijiet

Il-farmakoloġija tan-netwerk hija forsi għodda effettiva għall-iskoperta ta 'ingredjenti attivi naturali li jnaqqsu l-pigmentazzjoni tal-ġilda u l-mekkaniżmi possibbli tagħhom. Fructus LigustriLucidi, Hedysarum multijugum maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, u PaeoniaeRadix Alba għandhom potenzjaljbajdu l-ġildaproprjetajiet u jistgħu jinibixxupigmentazzjonibilli tirregola l-infjammazzjoni. Sitogluside huwa rumanzjbajdu l-ġildaingredjent attiv b'effetti dualregulatory, jiġifieri. jinibixxiTYRespressjoni u attività.

pilloli cistanche