Identifikazzjoni ta 'Lipocalin Assoċjat ma' Newtrophil Gelatinase Bħala Biomarkatur Bikri Urinarju ġdid għal Korriment Iskemiku Renali

Kuntatt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

JAYA MISHRA,* QING MA,* ANNE PRADA,* MARK MITSNEFES,* KAMYAR ZAHEDI,* JUN YANG,† JONATHAN BARASCH,†, u PRASAD DEVARAJAN*

*Nefroloġija u Pressjoni għolja, iċ-Ċentru Mediku ta 'l-Isptar tat-Tfal ta' Cincinnati, Cincinnati, Ohio; u † Nefroloġija, Kulleġġ tat-Tobba u Kirurgi, Columbia University, New York, New York

Astratt.

Akutarenaliinsuffiċjenza (ARF) sekondarja għal korriment iskemiku tibqa' problema komuni u potenzjalment devastanti. Intużat strateġija ta 'interrogazzjoni mat-traskriptome kollu biex tidentifika ġeni renali li huma indotti kmieni ħafna wara iskemija renali, li l-prodotti tal-proteini tagħhom jistgħu jservu bħala bijomarkaturi ġodda għall-ARF. Ġew identifikati seba' ġeni li huma regolati 'l fuq flimkien ma' - 10-darbiet, li wieħed minnhom (Cyr61) reċentement ġie rrappurtat li ġie indott wara iskemija renali. B'mod mhux mistenni, l-induzzjoni tas-sitt traskrizzjonijiet l-oħra kienet ġdida għall-qasam ARF. F'dan l-istudju, wieħed minn dawn il-ġeni mhux rikonoxxuti qabel kien ikkaratterizzat aktar, jiġifieri lipocalin assoċjat ma 'ġelatinasi tan-newtrofili (NGAL), minħabba li huwa polypeptide żgħir imnixxi li huwa reżistenti għall-protease u konsegwentement jista' jiġi skopert faċilment fl-awrina. L-upregulation mmarkata tal-livelli tal-mRNA u tal-proteini NGAL fil-ġurdien postiskemiku bikrikliewiġie kkonfermat. L-espressjoni tal-proteina NGAL ġiet skoperta b'mod predominanti f'ċelluli tat-tubuli prossimali pożittivi għall-antiġeni nukleari proliferanti, f'distribuzzjoni ċitoplasmika puntjata li ko-lokalizzata ma 'markaturi ta' endosomi tard. NGAL ġie skopert faċilment fl-awrina fl-ewwel produzzjoni tal-awrina wara iskemija kemm fil-mudelli tal-ġrieden kif ukoll tal-firien tal-ARF. Id-dehra ta' NGAL fl-awrina kienet relatata mad-doża u d-dewmien ta'renaliiskemija u qabel id-dehra ta' markaturi urinarji oħra bħal N-acetyl- -D-glucosaminidase u 2-mikroglobulina. L-oriġini ta 'NGAL miċ-ċelluli tat-tubuli ġiet ikkonfermata f'ċelluli tat-tubuli prossimali tal-bniedem ikkultivati ​​soġġetti għal ħsara iskemika in vitro, fejn NGAL mRNA ġie indott malajr fiċ-ċelloli u l-proteina NGAL kienet faċilment skoperta fil-medju tal-kultura fi żmien siegħa ta' tnaqqis ħafif ta 'ATP. NGAL kien ukoll skopert faċilment fl-awrina tal-ġrieden b'nefrotossiċità indotta minn cisplatin, għal darb'oħra qabel id-dehra ta' N-acetyl- -D-glucosaminidase u 2-mikroglobulina. Ir-riżultati jindikaw li NGAL jista' jirrappreżenta bijomarkatur urinarju bikri, sensittiv u mhux invażiv għal iskemiku u nefrotossiku.renalikorriment.

Cistanche herbajista' jikkura korriment renali

Ikseb aktar informazzjoni dwar prodotti relatati Cistanche

Akutarenalifalliment(ARF) sekondarja għal korriment iskemiku jew nefrotossiku tibqa' problema komuni u potenzjalment devastanti fin-nefroloġija klinika, b'rata persistentement għolja ta 'mortalità minkejja avvanzi sinifikanti fil-kura ta' appoġġ (1-4). Studji pijunieri fuq bosta deċennji dawwal ir-rwoli ta 'vasokostrizzjoni persistenti, ostruzzjoni tubulari, alterazzjonijiet strutturali u metaboliċi ċellulari, u r-rispons infjammatorju fil-patoġenesi ta' ARF (4-7). Għalkemm dawn l-istudji wittew it-triq għal approċċi terapewtiċi ta 'suċċess fil-mudelli tal-annimali, l-isforzi ta' riċerka translazzjonali fil-bnedmin taw riżultati diżappuntanti (2-4). Ir-raġunijiet għal dan jistgħu jinkludu r-rispons multidimensjonali tal-kliewi għall-iskemija u n-nefrotossini u skarsezza ta 'markaturi bikrija għall-ARF b'dewmien riżultanti fil-bidu tat-terapija (4-8).

Tentattivi biex tiżvela l-bażi molekulari ta 'dawn l-għadd kbir kmienirenalirisponsi ġew iffaċilitati minn avvanzi reċenti fil-ġenomika funzjonali li taw għodod ġodda għall-analiżi tal-ġenoma kollu ta 'proċessi bijoloġiċi kumplessi bħal ARF iskemiku (8-11). Il-metodi cDNA microarray jipprovdu profili ta 'espressjoni paralleli u kwantitattivi ta' eluf ta 'ġeni, li meta kkombinati ma' għodod bijoinformatiċi jistgħu jidentifikaw ġeni f'mogħdija bijoloġika, jikkaratterizzaw il-funzjoni ta 'ġeni ġodda, u jiskopru subklassijiet tal-mard (9). Bl-użu ta' din it-teknika ta' skrining, identifikajna sottosett ta' seba' ġeni li l-espressjoni tagħhom hija rregolata 0-darbiet fl-ewwel ftit sigħat wara l-iskemikurenalikorrimentf'mudell tal-ġurdien. Waħda minn dawn it-traskrizzjonijiet, proteina 61 b'ħafna cysteine ​​(Cyr61), reċentement ħafna ġiet ikkonfermata li hija indotta minn iskemija renali (8), iżda l-imġieba tas-sitt ġeni espressi b'mod differenzjali l-oħra hija ġdida għal-letteratura ARF. F'dan l-istudju, għażilna li nikkaratterizzaw aktar wieħed minn dawn il-ġeni li qabel ma kinux rikonoxxuti, jiġifieri lipocalin assoċjat ma 'ġelatinasi tan-newtrofili (NGAL), minħabba li huwa polypeptide żgħir imnixxi li jista' jiġi skopert fl-awrina, b'mod partikolari, minħabba li huwa reżistenti għall-protease. Ir-riżultati tagħna jindikaw li NGAL jista 'jirrappreżenta bijomarkatur ġdid tal-awrina bikri għal iskemiku u nefrotossikurenalikorriment.

Materjali u metodi

Mudelli tal-ġurdien ta' Korriment ta' Iskemija-Riperfużjoni Renali

Aħna użajna mudelli murini stabbiliti sew li fihom il-konsegwenzi strutturali u funzjonali ta’ perjodi qosra ta’renaliiskemija ġew dokumentati qabel (11-15). Fil-qosor, ġrieden maskili Swiss-Webster (Taconic Farms, Germantown, NY) li jiżnu 25 sa 35 g kienu miżmuma bi 12:12-h dawl: ċiklu skur u tħallew aċċess liberu għall-ikel u l-ilma. L-annimali ġew anestetizzati bis-sodium pentobarbital (50 mg/kg intraperitonealment) u mqiegħda fuq mejda tat-tisħin biex tinżamm temperatura tar-rektum ta' 37 grad. Intużaw tliet protokolli separati: (1) iskemija unilaterali mingħajr ARF, (2) iskemija bilaterali b'ARF, u (3) iskemija subklinika ħafifa bilaterali. Għall-esperimenti ta 'iskemija unilaterali, il-pedikulu tal-kliewi tax-xellug kien occluded b'morsa vaskulari mhux trawmatika għal 45 min, matul liema ħin il-kliewi nżammet sħun u niedja. Il-morsa mbagħad tneħħiet, il-kliewi ġiet osservata għar-ritorn tal-fluss tad-demm, u l-inċiżjoni ġiet suturata. Il-ġrieden tħallew jirkupraw f'gaġġa msaħħna, u nkisbu kollezzjonijiet ta' awrina f'waqthom. Wara 0, 3, 12, jew 24 siegħa ta’ riperfużjoni, l-annimali ġew anestetizzati mill-ġdid, il-kavità addominali nfetħet, u nkiseb demm permezz tat-titqib tal-vena cava inferjuri għall-kejl tal-krejatinina fis-serum permezz ta’ kit ta’ analiżi kolorimetriku kwantitattiv (Sigma, St. Louis, MO). Il-ġrieden inqatlu, il-kliewi kienu perfużjoni ffissati in situ b'4 fil-mija paraformaldehyde fil-PBS, u ż-żewġ kliewi ġew maħsuda (il-kliewi dritt serviet bħala kontroll għal kull annimal). Mill-inqas tliet annimali separati ġew eżaminati f'kull wieħed mill-perjodi ta' rifluss. Nofs ta 'kull kilwa ġie snap-iffriżat fin-nitroġenu likwidu u maħżun f'70 grad sa aktar ipproċessar; kampjun kien iffissat fil-formalin, paraffin-embedded, u sezzjoni (4 m). Sezzjonijiet tal-paraffin kienu mtebbgħin b'ematoxylin-eosin u eżaminati istoloġikament. Il-kliewi kklampjati wrew il-bidliet morfoloġiċi karatteristiċi li jirriżultaw minn korriment ta 'iskemija-riperfużjoni, kif ippubblikat qabel minn oħrajn (12-14) u minna (11). In-nofs l-ieħor ta 'kull kilwa kien inkorporat fil-kompost OCT (Tissue-Tek), u nkisbu sezzjonijiet iffriżati (4 m) għall-immunoistokimika. Għall-iskemija bilaterali b'esperimenti ARF, iż-żewġ kliewi ġew ikklampjati għal 30 min u eżaminati f'diversi perjodi ta 'reflow kif iddettaljat hawn fuq. Dan il-grupp ta 'tmien annimali kien iddisinjat biex jirrappreżenta ARF klinika u wera elevazzjoni sinifikanti fil-krejatinina fis-serum f'24 siegħa wara l-korriment. Għall-esperimenti bilaterali ta 'iskemija subklinika ħafifa, iż-żewġ kliewi ġew ikklampjati għal 5, 10, jew 20 min biss u eżaminati f'diversi perjodi ta' riperfużjoni kif hawn fuq. Dan il-grad ħafif ta 'korriment kien iddisinjat biex jissimula iskemija renali subklinika, u ġrieden f'dan il-grupp ma wrew l-ebda elevazzjoni fil-krejatinina fis-serum imkejla f'24 siegħa wara l-ħsara.

Mudell tal-Firien ta' Korriment ta' Iskemija-Riperfużjoni Renali

Aħna użajna mudelli ta 'annimali gerriema stabbiliti sewrenalikorriment iskemija-riperfużjoni (10). Fil-qosor, firien irġiel Sprague-Dawley li jiżnu 200 sa 250 g (Taconic Farms) ġew anestetizzati b'ketamine (150 g/g) u xylazine (3 g/g) u soġġetti għal okklużjoni bilaterali tal-arterja renali bi klampi mikrovaskulari għal 30 min kif iddettaljat f' il-protokoll tal-maws. Kollezzjonijiet tal-awrina f'waqthom inkisbu fi 3, 6, 9, 12, u 24 siegħa ta 'riperfużjoni, u nġabar demm għall-kejl tal-krejatinina fil-ħin tal-qtil (24 siegħa).

Mudell tal-ġurdien ta' Korriment Renali Indott minn Cisplatin

Aħna użajna mudelli murini stabbiliti sew li fihom il-konsegwenzi strutturali u funzjonali ta 'amministrazzjoni ta' cisplatin ġew dokumentati qabel (16-18). Fil-qosor, il-ġrieden ingħataw injezzjoni intraperitoneali waħda ta 'cisplatin (20 mg/kg body wt). Dan jirriżulta f'nekrożi taċ-ċelluli tat-tubuli u apoptożi u nitroġenu elevat tal-urea fid-demm fi żmien 3 d wara l-injezzjoni ta 'cisplatin (16-18). L-annimali kienu miżmuma f'gaġeġ metaboliċi, u ġabriet ta 'awrina nkisbu kuljum.

Iżolament tal-RNA

Tessuti sħaħ tal-kliewi tal-ġrieden (jew ċelluli tat-tubuli prossimali tal-bniedem ikkultivati; ara hawn taħt) ġew imfixkla b'Terroriżmu tat-Tessut (Prodotti Biospec, Racine, WI). L-RNA totali mill-kliewi ta 'kontroll u iskemiċi ġie iżolat bl-użu tal-RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) u kkwantifikat permezz ta' spettrofotometrija.

Proċeduri Microarray

Deskrizzjonijiet dettaljati tal-ħardwer u l-proċeduri tal-microarray ġew ippubblikati qabel (11). Fil-qosor, għal kull esperiment, 100 g ta’ RNA totali tal-kliewi tal-ġurdien purifikat ġie traskritt b’lura b’Superscript II reverse transcriptase (Life Technologies, Rockville, MD) fil-preżenza ta’ Cy3-dUTP (Amersham, Piscataway, NJ) għall-kontrolli u Cy5-dUTP għal kampjuni iskemiċi. Il-kampjuni tal-cDNA ġew ippurifikati bl-użu ta 'filtru Microcon YM-50 (Millipore, Madison, WI) u ibridizzati għal slides microarray li fihom 8979 sondi tal-ġurdien verifikati b'sekwenza unika (11). Tliet annimali separati ġew eżaminati għal kull wieħed mill-perjodi ta 'reflow, u mill-inqas żewġ esperimenti microarray indipendenti saru għal kull wieħed mill-annimali. Is-slajds tal-firxa ġew skannjati bl-użu ta 'skaner tal-mikroarray (GenePix 4000B; Axon Instruments, Foster City, CA) biex jinkisbu stampi TIFF separati għall-fluworexxenza Cy3 u Cy5. L-intensitajiet tas-sinjali għal Cy3 u Cy5 ġew determinati għal ġeni individwali bl-użu tas-softwer tal-estrazzjoni tad-dejta GenePix Pro 3.0 (Axon Instruments). Il-kontroll tal-kwalità u l-analiżi tad-dejta tlestew kif deskritt qabel (11).

pjanti cistanche għall-kliewi

Traskrizzjoni inversa semikwantitattiva–PCR

Ammont ugwali (1 plus - g) ta 'RNA totali mill-kliewi tal-ġrieden ta' kontroll u sperimentali ġie traskritt b'lura b'reverse transcriptase Superscript II (Life Technologies) fil-preżenza ta 'hexamers każwali skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-PCR twettaq bl-użu ta' kit (Roche, Indianapolis, IN) u l-primers li ġejjin: ġurdien NGAL sense 5'-CACCACGGACTACAACCAGT TCGC-3', ġurdien NGAL antisense 5'-TCAGTTGTCAATGCATTG GTCGGTG-3', NGAL uman sens 5'-TCAGCCGTCGATACACT GGTC-3', u Human NGAL antisense 5'-CCTCGTCCGAGTGG TGAGCAC-3'. Pari tal-primer għall-ġrieden u l-bniedem -actin u glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) inkisbu minn Clontech (La Jolla, CA). Reazzjonijiet finti nieqsa minn cDNA servew bħala kontrolli negattivi. Il-prodotti tal-PCR ġew analizzati b'elettroforesi tal-ġel tal-agarose segwita minn tbajja bil-bromur tal-etidju u ġew ikkwantifikati permezz ta' densitometrija. Bidliet darbiet fl-espressjoni tal-mRNA NGAL fil-kliewi iskemiċi versus kontroll ġew espressi wara normalizzazzjoni għal -actin jew amplifikazzjoni GAPDH.

Mikroskopija

Għall-iskoperta ta' NGAL, sezzjonijiet iffriżati ġew permeabilizzati bi {{0}}.2 fil-mija Triton X-100 f'PBS għal 10 minuti, imblukkati bis-serum tal-mogħoż għal siegħa, u inkubati b'antikorp primarju għal NGAL ( 1:500 dilwizzjoni) għal siegħa. Slajds imbagħad ġew esposti għal 30 min fid-dlam għal antikorpi sekondarji konjugati ma 'Cy5 (Amersham, Arlington Heights, IL) u viżwalizzati b'mikroskopju fluworexxenti (Zeiss Axiophot) mgħammar b'filtri rhodamine. Għal ko-lokalizzazzjoni ta' NGAL ma' Rab11, sezzjonijiet serjali ġew l-ewwel inkubati b'antikorp NGAL jew antikorp monoklonali għal Rab11 (dilwizzjoni 1:500; Laboratorji tat-Trasduction), imbagħad b'antikorpi sekondarji konjugati jew ma' Cy5 (għal NGAL) jew Cy3 (għal Rab11). ) u viżwalizzat b'filtri rhodamine jew fluorescein, rispettivament. Għal ko-lokalizzazzjoni ta’ NGAL b’antiġen nukleari taċ-ċelluli proliferanti (PCNA), sezzjonijiet ġew ko-inkubati b’antikorp NGAL u antikorp monoklonali għal PCNA (dilwizzjoni 1:500; Upstate), u s-sejbien seħħ permezz ta’ tbajja ta’ immunoperoxidase (Sistema ta’ Tbajja ImmunoCruz, Bijoteknoloġija ta’ Santa Cruz). Għall-assaġġ TUNEL, użajna l-ApoAlert DNA Fragmentation Assay Kit (Clontech). Sezzjonijiet tal-paraffin ġew deparaffinizzati permezz tal-xylene u gradi dixxendenti ta' etanol, iffissati b'4 fil-mija formaldehyde/PBS għal 30 min f'4 gradi, permeabilizzati bi proteinase K f'temperatura ambjentali għal 15-il minuta u 0.2 fil-mija Triton X-100/PBS għal 15 min f'4 gradi, u inkubat b'taħlita ta' nukleotidi u enzima TdT għal 60 min f'37 grad. Ir-reazzjoni ġiet mitmuma b'2 SSC, u s-sezzjonijiet ġew maħsula bil-PBS u mmuntati bi Crystal/ mount (Biomed, Foster City, CA). Nuklei apoptotiċi pożittivi għal TUNEL ġew skoperti permezz ta 'viżwalizzazzjoni b'mikroskopju fluworexxenti.

Ġbir ta' l-awrina

Ġrieden jew firien tqiegħdu f'gaġeġ metaboliċi (Nalgene, Rochester, NY), u l-awrina nġabret qabel u kull siegħa wara bilateralirenaliokklużjoni tal-arterja. Kampjuni ta 'l-awrina ġew ċentrifugati f'5000 g biex jitneħħew id-debris, u s-supernatant ġie analizzat permezz ta' Western blotting. Il-krejatinina urinarja ġiet imkejla permezz ta' kit ta' analiżi kolorimetriku kwantitattiv (Sigma) biex jiġu normalizzati kampjuni għad-determinazzjoni ta' NGAL fl-awrina. Kit ta' analiżi kolorimetriku għad-determinazzjoni ta' N-acetyl -D-glucosaminidase (NAG) fl-awrina nkiseb minn Roche.

Kultura taċ-Ċelloli

Umanrenaliċelluli epiteljali tubulari prossimali (RPTEC) inkisbu minn Clonetics (San Diego, CA). Iċ-ċelloli tkabbru fihomrenalimezz bażali taċ-ċelluli epiteljali supplimentat biRenaliKumpless tal-Medju tat-Tkabbir taċ-Ċelluli Epiteljali (REGM) ({{0}}.5 l/ml hydrocortisone, 10 pg/ml hEGF, 0.5 - g/ml epinephrine, 6.5 pg/ml trijodothyronine, 10 plus - g/ml transferrin, 5 - g/ml insulina, 1 -g/ml gentamicin sulfate, u 2 fil-mija FBS), kif rakkomandat mill-manifattur.

Tnaqqis ħafif ta 'ATP ta' Ċelloli Kkulturati

Immodifikajna protokolli deskritti qabel ta 'iskemija in vitro permezz ta' tnaqqis ta 'ATP b'inibituri ta' fosforilazzjoni ossidattiva (19,20). Fit-tieni jum wara l-konfluwenza, iċ-ċelloli RPTEC ġew inkubati b'1 m ta 'antimycin A (Sigma) għal perjodi ta' żmien li jvarjaw sa 6 sigħat. Preċedentement urejna li dan jirriżulta fi tnaqqis parzjali riversibbli ta 'ATP ħafif u l-ebda telf ta' vijabbiltà taċ-ċelluli f'tipi oħra ta 'ċelluli epiteljali renali kkultivati ​​bħal ċelluli MDCK (19) u 786-O (20). Il-livelli ta 'ATP ġew immonitorjati bl-użu ta' kit ta 'assaġġ ibbażat fuq luciferase (Sigma) u espressi bħala perċentwal tal-valuri ta' kontroll. Iċ-ċelloli ġew maħsuda f'diversi punti ta 'żmien ta' tnaqqis tal-ATP u analizzati għall-espressjoni tal-mRNA NGAL permezz ta 'traskrizzjoni inversa–PCR (RT-PCR) u espressjoni ta' proteina NGAL permezz ta 'analiżi tal-Punent. Is-sekrezzjoni ta' NGAL fil-medju tal-kultura kienet ukoll immonitorjata.

Materjali u Metodi Oħra

Il-kimiċi kollha nxtraw mingħand Sigma sakemm ma jkunx speċifikat mod ieħor. Għal Western blotting, il-konċentrazzjonijiet tal-proteini ġew determinati mill-assaġġ Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA), u ammonti ugwali ta 'proteina totali ġew mgħobbija f'kull korsija. Antikorp monoklonali għal - -tubulina (Sigma) intuża f'1:10,000 dilwizzjoni għall-konferma ta 'tagħbija ugwali ta' proteini, u antikorp poliklonali għal NGAL intuża f'1:500 (21). Antikorp monoklonali għal 2-mikroglobulina intuża f'1:500 (Sigma). L-immunodetezzjoni ta 'proteini trasferiti nkisbet bl-użu ta' kimiluminixxenza msaħħa (Amersham).

Riżultati

Karatterizzazzjoni tal-Mudelli ta 'Annimali ta' Korriment Bikrija ta 'Iskemija-Riperfużjoni Renali

Aħna użajna mudelli murini li fihom il-konsegwenzi strutturali u funzjonali ta 'perjodi qosra ta' iskemija renali ġew dokumentati (11-15). Il-karatteristiċi istopatoloġiċi karatteristiċi tal-ħsara iskemika kienu faċilment evidenti fil-kampjuni ta 'riperfużjoni ta' 24-h wara iskemija kemm unilaterali (45 min) kif ukoll bilaterali (30 min). Dawn kienu jinkludu telf ta 'membrani tal-bord tal-pinzell, dilatazzjoni tubulari, epitelju tubulari ċċattjat, debris luminali, u infiltrati interstizjali (Figura 1). Aħna ddokumentajna l-preżenza ta 'ċelluli apoptotiċi bl-użu tal-assaġġ TUNEL. L-apoptosi kienet lokalizzata b'mod predominanti għal ċelluli tubulari distali u parti axxendenti tal-linja ta' Henle, kemm f'ċelloli maqlugħin fil-lumen kif ukoll f'ċelloli mwaħħla. Ċelloli tubulari prossimali okkażjonali kienu wkoll apoptotiċi, iżda l-glomeruli kienu essenzjalment nieqsa mill-apoptożi. L-ebda ċellula pożittiva għal TUNEL ma nstabet fil-kliewi ta' kontroll jew fil-kampjuni iskemiċi fejn TdT tħalla barra (mhux murija). Il-bidliet istoloġiċi u apoptotiċi ta 'hawn fuq kienu nieqsa minn kliewi soġġetti għal gradi ħfief ta' iskemija (5, 10, jew 20 min ta 'iskemija bilaterali; mhux murija). Il-livelli tal-krejatinina fis-serum kienu jirriflettu l-bidliet istopatoloġiċi osservati. Għalhekk, ġrieden b'iskemija renali unilaterali jew gradi ħfief ta 'iskemija bilaterali subklinika urew livelli ta' kreatinina fis-serum li ma setgħux jintgħarfu minn annimali ta 'kontroll, filwaqt li ġrieden b'iskemija bilaterali għal 30 minuta wrew elevazzjoni sinifikanti tal-krejatinina fis-serum (Figura 1).

Figura 1. Karatterizzazzjoni tal-mudell tal-ġurdien ta 'iskemikurenalikorriment. Il-pannelli tax-xellug juru r-riżultati tat-tbajja tal-ematossilin u tal-eosina (fuq) u t-tbajja 'ta' TUNEL (ta' isfel) ta 'sezzjonijiet tal-kliewi minn ġrieden ta' kontroll jew wara 24 siegħa ta 'iskemija-riperfużjoni (IRI). (Lemin) Riżultati ta 'determinazzjonijiet tal-krejatinina fis-serum fil-ġrieden ta' kontroll (Con), wara iskemija unilaterali għal 45 min (U45), jew wara iskemija bilaterali għal perjodi varji kif muri. *P 0.05 kontra l-kontroll. Numri fil-vireg jindikaw numru ta 'annimali.

L-mRNA ta' NGAL Huwa Indott b'mod Sinjifikattiv fil-Kliewi Postiskemiku Bikrija

Permezz ta 'analiżi microarray ta' ġrieden b'unilateralirenaliiskemija, NGAL instab li kien indott b'mod konsistenti (3.2 flimkien ma' - 0.5-darbiet, 11.1 flimkien ma' - 1.2-darbiet, u 4.3 flimkien ma' {{1{{30} }}}.6-darbiet fi 3, 12, u 24 siegħa ta' riperfużjoni) fil-kliewi iskemiku tal-ġurdien meta mqabbla mal-kliewi ta' kontroll mill-istess annimal (medja plus - SD minn tliet annimali f'kull punt ta' ħin). Din is-sejba ġiet ikkonfermata minn RT-PCR semikwantitattiv, bl-użu ta 'protokoll ta' normalizzazzjoni kemm b'plus -actin kif ukoll GAPDH. L-ebda tibdil sinifikanti fl-espressjoni ta 'mRNA ta' jew plus -actin jew GAPDH ma ġew innutati fi kwalunkwe mill-perjodi ta 'riperfużjoni eżaminati, kif deskritt qabel (11). Madankollu, bl-użu ta' primers speċifiċi għall-ġrieden, skoprejna regolazzjoni sinifikanti 'l fuq tal-espressjoni tal-mRNA NGAL (4.1 flimkien ma' -0.5-darbiet, 9 flimkien -0.6-darbiet, u 4.2 flimkien 0.4-darbiet fi 3, 12, u 24 siegħa ta' riperfużjoni, rispettivament, fejn il-valuri jirrappreżentaw il-medja plus - SD minn tliet annimali separati). Dawn ir-riżultati huma illustrati fil-Figura 2 u huma bi qbil ġenerali mal-bidliet misjuba mill-analiżi tat-traskriptome.

Figura 2. Induzzjoni ta 'mRNA ta' lipocalin assoċjat mal-ġelatinase newtrofili tal-kliewi tal-ġrieden (NGAL) wara iskemija. (Fuq) Traskrizzjoni inversa rappreżentattiva-PCR (RT-PCR) bi primers għal actin tal-ġrieden u NGAL, bl-użu ta 'RNA estratt minn ġrieden kliewi ta' kontroll (C) jew wara diversi perjodi ta 'riperfużjoni kif muri (sigħat). Il-korsija M fiha sellum tad-DNA 100-bp. (T'isfel) Żieda darbiet fl-espressjoni tal-mRNA NGAL f'diversi punti ta 'żmien mill-kontroll (CON). Valuri miksuba minn microarray (linja solida) versus RT-PCR (linja bit-tikek) huma mezzi SD minn tliet esperimenti f'kull punt ta' ħin.

Il-proteina NGAL hija espressa żżejjed b'mod notevoli fit-tubuli prossimili tal-kliewi tal-ġrieden iskemiċi bikrija

Kien li jmiss ta 'interess li jiġi ddeterminat jekk l-espressjoni postiskemika tal-proteina NGAL fil-kliewi hix parallela ma' dik tal-mRNA. Permezz ta' analiżi tal-Punent, NGAL kien biss skopert bħala 25-kD peptide immunoreattiv fil-kliewi tal-ġrieden ta' kontroll. L-identità ta 'din il-faxxa bħala NGAL ġiet stabbilita f'sett separat ta' esperimenti, fejn preinkubazzjoni tal-antikorp primarju b'lipokalin rikombinanti tal-ġurdien imblukkat kompletament din l-immunoreattività (mhux murija). Fl-esperimenti ta 'iskemija unilaterali, l-espressjoni NGAL ġiet indotta minn tlieta sa erba' darbiet permezz ta' densitometrija fil-kliewi iskemiku minn ħames annimali separati fi żmien 3 sigħat ta 'ħsara, kif muri fil-Figura 3. Dan ir-rispons kien imtejjeb b'mod drammatiku fl-esperimenti ta' iskemija bilaterali minn tmien annimali separati . NGAL f'dawn il-ġrieden ġie indott tliet darbiet wara 3 sigħat ta' riperfużjoni, laħaq il-quċċata ta' 12-darbiet fil-kampjuni 24-h, u naqas għal livelli normali mill-perjodu ta' rkupru ta' 72-siegħa (Figura 3) .

Figura 3. Induzzjoni tal-proteina NGAL tal-kliewi tal-ġrieden wara iskemija unilaterali jew bilaterali. (Fuq) Western blots rappreżentattivi b'kampjuni sħaħ tal-kliewi miksuba minn ġrieden ta 'kontroll (Con) jew wara perjodi ta' riperfużjoni kif muri (sigħat), sondati b'antikorp poliklonali għal NGAL jew antikorp monoklonali għal tubulin (biex juri tagħbija ugwali ta 'proteini). Markers tal-piż molekulari huma fuq ix-xellug. (Il-qiegħ) Żieda ta' darbiet fl-espressjoni tal-proteina NGAL f'diversi punti ta' ħin mill-kontroll (CON). Il-valuri miksuba bid-densitometrija huma mezzi SD minn ħames annimali għal iskemija unilaterali u tmien annimali għal iskemija bilaterali

Bl-użu ta 'tekniki immunoistokimiċi, wara wrejna li l-proteina NGAL bilkemm kienet skoperta fil-kliewi tal-ġrieden tal-kontroll iżda hija regolata b'mod predominanti f'tubuli prossimali fi żmien 3 sigħat ta' iskemija kif muri fil-Figura 4. L-identifikazzjoni ta 'tubuli prossimali f'dawn is-sezzjonijiet kienet ibbażata fuq il-preżenza ta' pinzell membrana tal-fruntiera, il-proporzjon ta 'daqs nukleari għal ċellula, u morfoloġija ċellulari. L-NGAL indott deher f'distribuzzjoni ċitoplasmika punteġġjata fi ħdan iċ-ċelluli tat-tubuli prossimali, reminixxenti ta 'proteina mnixxija. Dan il-mudell ta 'espressjoni kien identiku kemm f'mudelli unilaterali kif ukoll bilaterali ta' korriment ta 'iskemija-riperfużjoni u kien evidenti b'mod konsistenti f'kull annimal studjat. Il-glomeruli kienu nieqsa mill-espressjoni NGAL, u l-ebda newtrofili li jesprimu NGAL ma kienu evidenti. Minħabba li NGAL intwera f'ċelluli kkultivati ​​tal-kliewi tat-tumur Wilms biex jikko-lokalizzaw mill-inqas parzjalment ma 'endosomes (21), aħna eżaminajna f'sezzjonijiet serjali d-distribuzzjoni ta 'NGAL u Rab11 (markatur ta' endosomi ta 'riċiklaġġ tard). Immaġini magħquda wrew ko-lokalizzazzjoni sinifikanti ta 'NGAL ma' Rab11 (Figura 4). Biex tesplora s-sinifikat funzjonali ta 'espressjoni mtejba ta' NGAL wara iskemija, eżaminajna sezzjonijiet serjali tal-kliewi għal espressjoni NGAL, nuklei pożittivi għal TUNEL, jew nuklei pożittivi għal PCNA. Filwaqt li ċ-ċelloli tat-tubuli li jesprimu żejjed NGAL ma kinux pożittivi għal TUNEL (mhux murija), ko-lokalizzazzjoni sinifikanti ta 'NGAL u PCNA kienet evidenti fiċ-ċelloli li qed jipproliferu u li jirriġeneraw fil-perjodu ta' reflow 48-h (Figura 4).

Figura 4. Induzzjoni tal-proteina NGAL tal-kliewi tal-ġrieden wara iskemija. (Fuq) Riżultati rappreżentattivi ta 'immunoistokimika fuq sezzjonijiet iffriżati ta' kliewi tal-ġrieden miksuba minn ġrieden ta 'kontroll jew wara perjodi varji ta' reflow kif muri (sigħat), sondati b'antikorp poliklonali għal NGAL. G, glomerulus. Il-pannell immarkat HP huwa ta 'qawwa għolja 100 plus -ingrandiment, u l-pannelli l-oħra huma f'20. (Il-qiegħ) Iż-żewġ pannelli tax-xellug juru tubuli wara 3 sigħat ta 'riperfużjoni, li jesprimu NGAL (aħmar) jew Rab11 (aħdar). It-tielet panel juri immaġni magħquda, li tindika l-ko-lokalizzazzjoni bl-isfar. Il-pannell fuq il-lemin estrem juri ko-lokalizzazzjoni ta 'NGAL b'antiġen nukleari taċ-ċelluli proliferanti fit-tubuli wara 48 siegħa ta' reflow.

Il-proteina NGAL Jinstab Faċilment fl-Awrina Immedjatament wara l-Induzzjoni tal-ARF fil-ġrieden

Li jmiss kien ta’ interess konsiderevoli li jiġi determinat jekk l-espressjoni postiskemika tal-proteina NGAL setgħetx tiġi skoperta fl-awrina, u b’hekk tissuġġerixxi l-utilità tagħha bħala bijomarkatur mhux invażiv bikri ta’ iskemiku.renalikorriment. Bl-użu ta 'konċentrazzjonijiet ta' krejatinina fl-awrina biex jiġu ugwalizzati għat-tagħbija tal-kampjun, NGAL kien assenti mill-awrina qabel l-iskemija. B'kuntrast impressjonanti, NGAL kien manifest bħala faxxa ta' 25-kD fi żmien sagħtejn mill-ħsara (fl-ewwel produzzjoni ta' awrina wara l-iskemija) fl-annimali kollha eżaminati (ħamsa b'iskemija unilaterali u tmienja b'iskemija bilaterali), kif muri f' Figura 5. L-identità ta 'din il-medda bħala NGAL ġiet stabbilita f'sett separat ta' esperimenti, li fihom il-preinkubazzjoni tal-antikorp primarju b'lipocalin rikombinanti tal-ġurdien imblukkat kompletament din l-immunoreattività (mhux murija). B'mod notevoli, NGAL kien faċilment skopert f'inqas 1 l ta 'awrina mhux ipproċessata mill-analiżi tal-Punent u ppersisti għat-tul kollu eżaminat (24 siegħa ta' riperfużjoni). Imbagħad qabbilna l-eskrezzjoni ta' NGAL fl-awrina ma' dik ta' markaturi ta' korriment stabbiliti qabel, bħal 2-mikroglobulina u NAG. Filwaqt li NGAL urinarju kien evidenti fi żmien 2 sigħat ta 'iskemija, 2-mikroglobulina kienet skoperta fl-istess kampjuni urinarji biss wara 12-il siegħa ta' iskemija unilaterali u 8 sigħat ta 'iskemija bilaterali (Figura 5). Bl-istess mod, l-eskrezzjoni ta 'NAG fl-awrina żdiedet b'mod sinifikanti biss wara 12-il siegħa ta' iskemija unilaterali u 8 sigħat ta 'iskemija bilaterali meta mqabbla ma' annimali ta 'kontroll mhux iskemiku (Figura 5).

Figura 5. Sejbien bikri tal-proteina NGAL fl-awrina fil-ġrieden b'iskemiku akutrenalifalliment (ARF). (Fuq) Blots rappreżentattivi tal-Punent ta' kampjuni ta' awrina mhux ipproċessati (1 sa 2 plus - l għal kull korsija, normalizzati għall-kontenut tal-krejatinina) inkisbu f'perjodi ta' riperfużjoni kif muri (sigħat), wara unilaterali jew bilateralirenaliikklampjar tal-arterji. Markers tal-piż molekulari huma murija fuq ix-xellug. Il-blots ġew ittestjati b'NGAL (fuq) jew {{0}}mikroglobulina (Beta2-M; nofs). (Il-qiegħ) Determinazzjonijiet ta' N-acetyl- - D-glucosaminidase (NAG) fl-awrina f'diversi perjodi ta' riperfużjoni kif indikat, minn ħames annimali għal iskemija unilaterali u tmien annimali għal iskemija bilaterali. Il-valuri huma SD medji. *P 0.05 kontra l-kontroll f'kull punt tal-ħin, ANOVA.

Il-proteina NGAL Jinstab Faċilment fl-Awrina Anke wara Iskemija Renali Ħafifa fil-Ġrieden

Biex tiddetermina s-sensittività tas-sejbien ta' NGAL urinarju fin-nuqqas ta' ARF ċara, użajna protokolli fejn settijiet separati ta' ġrieden kienu soġġetti biss għal 5, 10, jew 20 min ta' bilaterali.renaliokklużjoni tal-arterja. Dawn l-istudji tfasslu biex jevalwaw l-eskrezzjoni ta' NGAL fl-awrina wara iskemija renali subklinika ħafifa. Il-krejatinina fis-serum imkejla wara 24 siegħa ta' rifluss kienet fil-limiti normali f'dawn il-ġrieden kollha (Figura 1). Jolqot, NGAL ġie skopert faċilment f'inqas 1 l ta 'awrina mhux ipproċessata f'dawn l-annimali (Figura 6), għalkemm id-dehra tiegħu kienet kemmxejn ittardjata meta mqabbla ma' annimali b'ARF ċara. Għalhekk, filwaqt li 30 min ta 'iskemija bilaterali rriżultaw f'eliminazzjoni ta' NGAL fl-awrina fi żmien 2 sigħat (Figura 5), ​​ġrieden b'20 jew 10 min ta 'iskemija bilaterali manifestaw NGAL fl-awrina wara 4 sigħat u dawk b'5 min ta' iskemija eliminati NGAL biss wara 6 sigħat ( Figura 6). Għalhekk, id-dehra ta 'NGAL fl-awrina tikkorrelata mad-doża u t-tul ta' iskemija renali.

Il-proteina NGAL Jinstab Faċilment fl-Awrina Immedjatament wara l-Induzzjoni tal-ARF fil-Firien

Figura 6. Sejbien ta 'proteina NGAL fl-awrina fil-ġrieden b'iskemija renali subklinika. Western blot rappreżentattiv ta 'kampjuni ta' awrina mhux ipproċessati (1 sa 2 l għal kull korsija, normalizzati għall-kontenut tal-krejatinina) miksuba f'perjodi ta 'riperfużjoni kif muri (sigħat), wara 5, 10, jew 20 min ta' kklampjar bilaterali tal-arterja renali. Markers tal-piż molekulari huma murija fuq ix-xellug. Dawn l-annimali wrew krejatinina fis-serum normali f'24 siegħa ta' rifluss.

Minħabba li jeżisti dibattitu dwar id-differenzi ta 'speċi fir-risponsi għall-okklużjoni ta' l-arterja renali (22), aħna mbagħad eżaminajna l-imġieba ta 'NGAL f'mudell ta' annimal differenti, jiġifieri mudell ta 'far stabbilit sew ta' korriment ta 'iskemija-riperfużjoni renali. Bl-użu ta 'konċentrazzjonijiet ta' krejatinina fl-awrina biex jiġu ugwalizzati għat-tagħbija tal-kampjun, NGAL kien assenti mill-awrina qabel l-iskemija. B'kuntrast notevoli, NGAL kien manifest bħala 25-kD peptide immunoreattiv fi żmien 3 sigħat mill-ħsara (fl-ewwel produzzjoni ta 'awrina wara l-iskemija), kif muri fil-Figura 7. B'paragun, il-krejatinina fis-serum f'dan il-mudell ta' il-ħsara iskemika kienet elevata biss wara 24 siegħa ta' riperfużjoni (mhux murija). Għal darb'oħra, NGAL kien jinstab f'1 l ta 'awrina mhux ipproċessata u baqa' jippersisti għat-tul kollu eżaminat (24 siegħa ta 'riperfużjoni).

Figura 7. Sejbien bikri tal-proteina NGAL fl-awrina fil-firien b'ARF iskemiku. Western blot rappreżentattiv ta 'kampjuni ta' awrina mhux ipproċessati (1 sa 2 l għal kull korsija, normalizzati għall-kontenut tal-krejatinina) miksuba f'perjodi ta 'riperfużjoni kif muri (sigħat), wara 30 min ta' ikklampjar tal-arterja renali bilaterali fil-firien. Markers tal-piż molekulari huma murija fuq ix-xellug. Dawn l-annimali wrew żieda sinifikanti fil-krejatinina fis-serum f'24 siegħa ta' rifluss.

NGAL mRNA Huwa Indott f'Ċelloli Kultivati ​​tal-Bniedem Prossimili Tubuli wara Iskemija Ħafifa Bikrija

Biex tikkonferma l-oriġini ta 'NGAL minn ċelluli iskemiċi tat-tubuli prossimali, immodifikajna protokolli deskritti qabel ta' iskemija in vitro permezz ta 'tnaqqis ta' ATP f'ċelluli koltivati ​​ta 'tubuli prossimali tal-bniedem (RPTEC). L-inkubazzjoni hija 1-m ta' antimycin irriżulta fi tnaqqis parzjali ħafif ta' ATP għal madwar 83 flimkien ma' 3 fil-mija tal-kontroll fi żmien siegħa, bi tnaqqis aktar gradwali għal madwar 75 flimkien ma' - 3 fil-mija tal-kontroll b'6 sigħat ( medju-SD minn erba' esperimenti). L-ebda konsegwenzi morfoloġiċi ta' dan it-tnaqqis ħafif tal-ATP ma kienu dixxernibbli. NGAL mRNA kien biss skoperta fiċ-ċelloli ta 'mistrieħ. Madankollu, wara tnaqqis parzjali ta 'ATP, induzzjoni rapida u dipendenti fuq it-tul ta' mRNA ta 'NGAL kienet evidenti permezz ta' RT-PCR, kif muri fil-Figura 8.

Il-proteina NGAL Jinstab Faċilment fil-Medju wara Iskemija Bikrija In Vitro

Wara eżaminajna l-espressjoni tal-proteina NGAL fiċ-ċelloli RPTEC u l-mezz tal-kultura wara tnaqqis ħafif tal-ATP. Il-proteina NGAL kienet skoperta fiċ-ċelloli tal-kontroll RPTEC, u l-espressjoni tagħha żdiedet wara t-tnaqqis tal-ATP b'mod dipendenti fuq it-tul, kif muri fil-Figura 8. L-ebda proteina immunoreattiva NGAL ma nstabet fil-mezz tal-kultura miċ-ċelloli tal-kontroll, iżda NGAL kienet faċilment skoperta fi żmien 1. h ta 'tnaqqis ħafif ta' ATP (Figura 8). Żidiet ulterjuri fl-abbundanza tal-proteini NGAL ġew innutati relatati mat-tul tat-tnaqqis tal-ATP. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-proteina NGAL indotta hija mnixxija malajr fil-medju, analogu għad-dehra mgħaġġla ta 'NGAL fl-awrina wara iskemija renali in vivo.

Figura 8. Induzzjoni ta 'NGAL mRNA wara iskemija in vitro. (Fuq) Rappreżentant RT-PCR bi primers għal NGAL uman, bl-użu ta 'RNA estratt minn ċelloli epiteljali tubulari prossimali renali (RPTEC) ċelluli wara diversi perjodi ta' tnaqqis parzjali ta 'ATP kif muri (sigħat). Il-korsija M fiha sellum tad-DNA 100-bp. (Nofs) Żieda fl-espressjoni tal-mRNA NGAL f'diversi punti ta' ħin mill-kontroll (0), normalizzata għall-espressjoni ta' glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Il-valuri murija huma mezzi SD minn tliet esperimenti f'kull punt ta' ħin. (T'isfel) Western blot rappreżentattiv b'kampjuni RPTEC wara diversi perjodi ta 'tnaqqis parzjali ta' ATP kif muri (sigħat), miksuba minn ammonti ugwali ta 'pritkuni taċ-ċelluli (Pel) jew il-medju tal-kultura (Sup), sondati b'antikorp poliklonali għal NGAL. Markers tal-piż molekulari huma fuq ix-xellug. Il-figura hija rappreżentattiva ta 'tliet esperimenti separati.

Il-proteina NGAL Jinstab Faċilment fl-Awrina Kmieni wara l-Induzzjoni ta' Nefrotossiċità Indotta minn Cisplatin

Wara xtaqna niddeterminaw jekk NGAL jistax jiġi skopert fl-awrina wara forom oħra ta 'korriment taċ-ċelluli tat-tubuli. F'mudell stabbilit tal-ġrieden ta 'nefrotossiċità ta' cisplatin, NGAL ġie skopert faċilment fl-awrina fi żmien 1 d mill-għoti ta 'cisplatin (Figura 9). B'kuntrast, il-{2}}mikroglobulina urinarja bilkemm kienet skoperta wara 2 d u ma setgħetx tiġi skoperta b'mod affidabbli sal-jum 4 sa 5 wara cisplatin. Bl-istess mod, żieda fl-eskrezzjoni tal-NAG fl-awrina ma kinitx evidenti qabel il-ġranet 4 u 5 wara l-għoti ta' cisplatin (Figura 9).

Figura 9. Sejbien bikri tal-proteina NGAL fl-awrina fil-ġrieden b'korriment ikkawżat minn cisplatin. (A) Western blots rappreżentattivi fuq kampjuni ta 'awrina mhux ipproċessati (1 sa 2 l għal kull korsija, normalizzati għall-kontenut tal-krejatinina) miksuba fi ġranet kif muri wara l-amministrazzjoni ta' cisplatin, sondati b'antikorp għal 2-mikroglobulina jew NGAL. Markers tal-piż molekulari huma murija fuq ix-xellug. (B) Determinazzjonijiet ta 'NAG fl-awrina f'diversi jiem wara l-għoti ta' cisplatin (n 4). Il-valuri huma medji flimkien ma' -SD. *P 0.05 kontra jum 0.

Diskussjoni

Aħna użajna strateġija ta 'interrogazzjoni mat-traskriptome kollha biex nidentifikaw ġeni renali li huma indotti kmieni wara iskemija renali, li l-prodotti tal-proteini tagħhom jistgħu jservu bħala bijomarkaturi ġodda għall-ARF. Aħna identifikajna seba' ġeni li huma upregulated 10-darbiet, li wieħed minnhom (Cyr61) reċentement ġie rrappurtat li ġie indott wara iskemija renali (8). Mhux mistenni, l-induzzjoni tas-sitt traskrizzjonijiet l-oħra kienet ġdida għall-qasam ARF. F'dan l-istudju, għażilna li nikkaratterizzaw aktar wieħed minn dawn il-ġeni li qabel ma kinux rikonoxxuti, jiġifieri NGAL.

NGAL jappartjeni għas-superfamilja tal-lipocalin ta' - 20 proteini mnixxija relatati strutturalment li huma maħsuba li jittrasportaw varjetà ta' ligands fi ħdan kaliċi b'kanna (23). NGAL uman kien oriġinarjament identifikat bħala proteina 25-kD marbuta b'mod kovalenti mal-ġelatinasi minn newtrofili umani, fejn tirrappreżenta waħda mill-proteini tal-granuli sekondarji tan-newtrofili (24,25). Studji ta' klonazzjoni molekulari wrew li l-NGAL uman huwa simili għall-ġene tal-ġurdien 24p3 ​​identifikat għall-ewwel darba f'kulturi primarji ta' kliewi tal-ġrieden li ġew indotti biex jipproliferaw (26). NGAL huwa espress f'livelli baxxi ħafna f'tessuti umani oħra, inklużi l-kliewi, it-trakea, il-pulmuni, l-istonku u l-kolon (27). L-espressjoni NGAL hija indotta b'mod notevoli fl-epitelja stimulata. Per eżempju, huwa upregulated fiċ-ċelloli epiteljali tal-kolon f'żoni ta 'infjammazzjoni jew neoplażja iżda huwa nieqes minn żoni li jintervjenu mhux involuti jew f'leżjonijiet metastatiċi (28). Il-konċentrazzjonijiet ta 'NGAL huma elevati fis-serum ta' pazjenti b'infezzjonijiet batteriċi akuti (29), l-isputum ta 'suġġetti bl-ażma jew mard pulmonari ostruttiv kroniku (30), u l-fluwidu tal-bronki mill-pulmun emphysematous (31). F'dawn il-każijiet kollha, l-induzzjoni NGAL hija postulata li hija r-riżultat ta 'interazzjonijiet bejn ċelluli infjammatorji u l-kisja epiteljali, b'regolazzjoni 'l fuq tal-espressjoni NGAL tkun evidenti kemm fin-newtrofili kif ukoll fl-epitelju (28-32).

Ir-regolazzjoni 'l fuq ta' NGAL fil-kliewi maturi s'issa ma ġietx deskritta. Diversi linji ta 'evidenza miġbura mill-istudju tagħna jissuġġerixxu li l-induzzjoni NGAL skoperta tirrappreżenta rispons intrinsiku ġdid taċ-ċelluli tat-tubuli prossimali tal-kliewi għal ħsara iskemika u mhix derivata biss minn newtrofili attivati. L-ewwel, ir-rispons huwa estremament rapidu, b'NGAL jidher fl-awrina fi żmien sagħtejn mill-ħsara (fl-ewwel produzzjoni ta 'l-awrina wara l-okklużjoni ta' l-arterja renali), u l-akkumulazzjoni ta 'newtrofili renali f'dan il-mudell ta' ARF iskemiku normalment tiġi nnutata l-ewwel f'4 sigħat. wara injury (33–35). It-tieni, ix-xejriet temporali tal-induzzjoni NGAL u l-akkumulazzjoni tan-newtrofili huma diverġenti. L-espressjoni tal-mRNA u tal-proteini NGAL kienet innotata b'mod massimu fi 12-il siegħa ta 'rifluss, filwaqt li l-akkumulazzjoni tan-newtrofili tilħaq il-qċaċet f'24 siegħa (33-35), sa liema ħin l-espressjoni ta' NGAL naqset b'mod sinifikanti. It-tielet, l-ebda newtrofili li jesprimu NGAL ma kienu skoperti mill-immunofluworexxenza fil-kampjuni tal-kliewi eżaminati (Figura 4). Ir-raba 'u l-aktar konvinċenti, l-induzzjoni tal-mRNA u l-proteina ta' NGAL ġiet iddokumentata li sseħħ f'ċelluli tat-tubuli prossimali tal-bniedem ikkultivati ​​wara iskemija in vitro, b'NGAL tnixxi fil-medju tal-kultura fi żmien siegħa mit-tnaqqis tal-ATP, f'sistema li fiha n-newtrofili huma assolutament assenti. Madankollu, l-istudji in vivo tagħna ma jippermettux li neskludu kompletament xi kontribut mill-infiltrazzjoni ta 'newtrofili attivati ​​għar-regolazzjoni NGAL osservata. Tabilħaqq, huwa possibbli li regolazzjoni 'l fuq ta' NGAL fiċ-ċelluli tat-tubuli renali tista 'tiġi indotta mir-rilaxx lokali ta' ċitokini minn newtrofili maqbuda fil-mikroċirkolazzjoni kmieni wara ħsara iskemika.

X'inhu cistanche? Cistanchejistgħu jittrattawrenalikorriment

Spjegazzjoni adegwata għall-induzzjoni ta 'NGAL mill-epitelja stimulata kienet nieqsa, u jekk NGAL huwiex protettiv jew qrib il-korriment jew saħansitra persuna fil-qrib innoċenti għadu mhux ċar. Evidenza riċenti tissuġġerixxi li, għall-inqas f'sottosett ta 'tipi ta' ċelluli, NGAL jista 'jirrappreżenta molekula proapoptotic (36-38). Fil-linja taċ-ċelluli limfoċitiċi pro-B tal-ġurdien, l-irtirar taċ-ċitokini rriżulta f'induzzjoni notevoli ta 'NGAL kif ukoll il-bidu ta' apoptożi (36,37). NGAL ġie wkoll marbut ma 'apoptożi fit-tessuti riproduttivi. Iċ-ċelluli epiteljali tal-glandola mammarja involuta u l-utru jesprimu livelli għoljin ta 'NGAL, li jikkoinċidu temporalment ma' perjodu ta 'apoptożi massima (38). Huwa probabbli li NGAL jirregola subsett ta 'popolazzjonijiet ta' ċelluli billi jinduċi apoptożi. L-epitelja stimulata tista' tirregola 'l fuq għal NGAL biex tinduċi apoptożi ta' newtrofili li jinfiltraw, u b'hekk tippermetti liċ-ċelloli residenti jgħix mill-ħerba tar-rispons infjammatorju. Inkella, iċ-ċelloli epiteljali jistgħu jutilizzaw dan il-mekkaniżmu biex jirregolaw il-mewt tagħhom stess. Madankollu, huwa interessanti li wieħed jinnota fl-istudji tagħna li l-induzzjoni ta 'NGAL wara l-ħsara bikrija ta' iskemija-riperfużjoni tal-kliewi sseħħ b'mod predominanti fiċ-ċelloli tat-tubuli prossimali li ma wrewx nuklei pożittivi għal TUNEL.

Studji reċenti oħra wrew li NGAL isaħħaħ il-fenotip epiteljali. NGAL huwa espress mill-bud ureteriku penetranti u jqajjem in-nefroġenesi billi jistimula l-konverżjoni ta 'ċelluli mesenkimali f'epitelja tal-kliewi (21). Lipocalin ieħor, glycodelin, intwera li jinduċi fenotip epiteljali meta espress fiċ-ċelloli tal-karċinoma tas-sider tal-bniedem (40). Dawn is-sejbiet huma speċjalment pertinenti għall-kliewi maturi, fejn wieħed mir-risponsi dokumentati sew għal ħsara iskemika hija d-dehra notevoli ta 'ċelluli epiteljali dedifferenzjati li jgħattu t-tubuli prossimali (41). Aspett importanti tar-riġenerazzjoni u t-tiswija tal-kliewi wara korriment iskemiku jinvolvi l-akkwist mill-ġdid tal-fenotip epiteljali, proċess li jirrikapitola diversi aspetti tal-iżvilupp normali (42). Dan jissuġġerixxi li NGAL jista 'jiġi espress mit-tubuli bil-ħsara biex jinduċi epitelializzazzjoni mill-ġdid. L-appoġġ għal dan il-kunċett ġej mill-identifikazzjoni reċenti ta 'NGAL bħala proteina li tittrasporta l-ħadid li hija komplementari għat-transferrin matul in-nefroġenesi (21). Huwa magħruf sew li l-kunsinna tal-ħadid fiċ-ċelloli hija kruċjali għat-tkabbir u l-iżvilupp taċ-ċelluli, u dan huwa preżumibbilment kritiku għar-riġenerazzjoni renali postiskemika eżatt kif inhu waqt l-ontoġenija. Minħabba li NGAL jidher li jorbot u jittrasporta l-ħadid (21), huwa probabbli wkoll li NGAL jista 'jservi bħala sink għall-ħadid li jitfa' minn ċelluli epiteljali tat-tubuli prossimali bil-ħsara. Minħabba li NGAL jista 'jiġi endocytosed mit-tubuli prossimali (K. Mori u J. Barasch, osservazzjonijiet mhux ippubblikati), il-proteina tista' potenzjalment tirriċikla l-ħadid f'ċelloli vijabbli. Dan jista 'jistimula t-tkabbir u l-iżvilupp, kif ukoll ineħħi l-ħadid, molekula reattiva, mis-sit tal-ħsara fit-tessuti, u b'hekk jillimita ċ-ċitotossiċità medjata mill-ħadid. Ir-riżultati tagħna juru li l-ko-lokalizzazzjoni ta' NGAL f'ċelluli tat-tubuli li jirriġeneraw u li jipproliferu pożittivi għal PCNA tagħti aktar appoġġ għal din l-ipoteżi.

Implikazzjoni ewlenija tas-sejbiet tagħna hija l-possibbiltà li NGAL ikun bijomarkatur ġdid fl-awrina għal iskemiku.renalikorrimentli jitqabbel b'mod favorevoli ma' bijomarkaturi oħra li ġew deskritti. Forsi l-aħjar eżempju studjat huwa molekula ta' ħsara fil-kliewi-1 (KIM-1), molekula ta' adeżjoni putattiva involuta fir-riġenerazzjoni tal-kliewi (43,44). F'mudell tal-firien ta' korriment ta' iskemija-riperfużjoni, KIM-1 instab li kien regolat 'il fuq minn 24 sa 48 siegħa wara l-insult inizjali, li jagħmilha markatur affidabbli iżda kemmxejn tard ta' ħsara fiċ-ċelluli tubulari. Studji eleganti reċenti wrew li KIM-1 jista' jiġi skopert fil-bijopsija tal-kliewi u fl-awrina ta' pazjenti b'nekrożi tubulari akuta iskemika (45). Madankollu, din l-iskoperta kienet dokumentata f'pazjenti b'ħsara iskemika fil-kliewi stabbilita, u l-utilità tal-kejl tal-KIM-1 urinarju għall-iskoperta ta' ħsara subklinika bikrija s'issa għadha ma ġietx validata. F'eżempju reċenti ieħor, Cyr61 instab li huwa proteina moħbija f'ċisteine ​​li tista' tinkixef fl-awrina 3 sa 6 sigħat wara korriment iskemiku tal-kliewi (8). Madankollu, din l-iskoperta kienet teħtieġ pass ta 'purifikazzjoni ta' bijoafinità bi żibeġ ta 'eparina-Sepharose, u anke wara purifikazzjoni bħal din, diversi peptidi ta' reazzjoni inkroċjata kienu apparenti. B'kuntrast, l-istudju tagħna juri li NGAL ġie skopert faċilment u malajr bħala peptidi immunoreattivi relattivament nodfa f'Blots tal-Punent bl-inqas 1 l ta 'l-ewwel produzzjoni ta' awrina mhux ipproċessata wara iskemija renali kemm fil-ġrieden kif ukoll fil-firien. Barra minn hekk, NGAL urinarju kien evidenti anke wara iskemija renali "subklinika" ħafifa ħafna, minkejja livelli normali ta' kreatinina fis-serum. Barra minn hekk, l-iskoperta ta' NGAL fl-awrina kienet ferm qabel id-dehra ta' markaturi tradizzjonali fl-awrina, inklużi 2- mikroglobulina u NAG.

Fl-aħħar nett, ta’ min jinnota li NGAL kien ukoll skopert fl-awrina kmieni wara l-għoti ta’ cisplatin, fi żmien meta indikaturi morfoloġiċi u bijokimiċi oħra ta’renalikorrimentkienu assenti. Għalhekk, l-upregulation u l-eliminazzjoni urinarja ta 'NGAL jistgħu jirrappreżentaw rispons rapidu taċ-ċelluli tat-tubuli renali għal varjetà ta' insulti, u l-iskoperta ta 'NGAL fl-awrina tista' tirrappreżenta għodda klinika mhux invażiva applikabbli b'mod wiesa 'għal dijanjosi bikrija ta' korriment taċ-ċelluli tat-tubuli.

Fil-qosor, id-dejta tagħna tindika li NGAL jirrappreżenta bijomarkatur urinarju ġdid, sensittiv u mhux invażiv għall-iskemija renali. Ikun importanti fil-ħidma ta’ traduzzjoni futura li tiġi eżaminata l-espressjoni ta’ NGAL fl-awrina ta’ pazjenti b’forom ħfief u bikrija ta’ iskemiku.renalikorriment. Huwa ttamat li skoperta bikrija bħal din tista 'tħalli lill-kliniċi biex jistabbilixxu sforzi ta' intervent f'waqtu fl-ARF, kundizzjoni li għadha assoċjata ma 'pronjosi diżastruża li għaliha terapiji ġodda huma meħtieġa b'mod iddisprat. Barra minn hekk, huwa ttamat li skoperta daqshekk rapida u sempliċi ta’ NGAL urinarju f’pazjenti b’iskemiku subkliniku sottili.renalikorriment(eż., trapjanti tal-kliewi relatati mal-ħajja, kirurġija vaskulari, avvenimenti kardjovaskulari) jew ħsara nefrotossika subklinika (eż., l-użu ta 'aġenti ta' kuntrast u aminoglikosidi) se javża lill-kliniċista biex jistabbilixxi manuvri mmirati biex jipprevjenu progressjoni għal ARF ċara.

Rikonoxximenti

Dan ix-xogħol kien appoġġjat minn għotjiet mill-Istituti Nazzjonali tas-Saħħa/Istitut Nazzjonali tad-Dijabete u Mard Diġestiv u tal-Kliewi lil PD (DK53289, DK52612) u JB (DK55388 u DK58872).

Cistanche tubulosajistgħu jittrattawkorriment renali

Referenzi
1. Thadani R, Pascual M, Bonventre JV: Insuffiċjenza renali akuta. N Engl J Med 334: 1448–1460, 1996
2. Star RA: Trattament ta 'akutrenalifalliment. Kidney Int 54: 1817–1831, 1998
3. Liaño F, Pascual J: Fatturi ta' tbassir u skor. Fi: Insuffiċjenza Renal Akuta, editjat minn Molitoris BA, u Finn WF, Philadelphia, WB Saunders, 2001, pp 507–518
4. Molitoris BA: Transizzjoni għal terapija f'insuffiċjenza renali akuta iskemika. J Am Soc Nephrol 14: 265–267, 2003
5. Brady HR, Brenner BM, Clarkson MR, Lieberthal W: Insuffiċjenza renali akuta. Fi: The Kidney, 6th Ed., editjat minn Brenner BM, Philadelphia, WB Saunders, 2000, pp 1201–1262
6. Sutton TA, Molitoris BA: Mekkaniżmi ta 'korriment ċellulari f'insuffiċjenza renali akuta iskemika. Semin Nephrol 18: 490–497, 1998
7. Sheridan AM, Bonventre JV: Bijoloġija taċ-ċelluli u mekkaniżmi molekulari ta' korriment f'iskemiku akutrenalifalliment. Curr Opin Nephrol Hypertens 9: 327–334, 2000
8. Muramatsu Y, Tsujie M, Kohda Y, Pham B, Perantoni AO, Zhao H, Jo SK, Yuen PST, Craig L, Hu X, Star RA: Sejbien bikri ta 'proteina b'ħafna cysteine ​​61 (CYR61, CCN1) fl-awrina wara korriment ta’ iskemija-riperfużjoni tal-kliewi. Kidney Int 62: 1601–1610, 2002

9. Kurella M, Hsiao LL, Yishida T, Randall JD, Chow G, Sarang SS, Jensen RV, Gullans SR: Analiżi tal-mikroarray tad-DNA ta 'proċessi bijoloġiċi kumplessi. J Am Soc Nephrol 12: 1072–1078, 2001

10. Yoshida T, Kurelia M, Beato F, Min H, Ingelfinger JR, Stears RL, Swinford RD, Gullans SR, Tang SS: Tibdil ta 'monitoraġġ fl-espressjoni tal-ġeni fl-iskemija-riperfużjoni renali fil-far. Kidney Int 61: 1646–1654, 2002

11. Supavekin S, Zhanh W, Kucherlapati R, Kaskel FJ, Moore LC, Devarajan P: Espressjoni tal-ġeni differenzjali wara iskemija / riperfużjoni renali bikrija. Kidney Int 63: 1714–1724, 2003
12. Nogae S, Miyazaki M, Kobayashi N, Saito T, Abe K, Saito H, Nakane PK, Nakanishi Y, Koji T: Induzzjoni ta 'apoptosi f'mudell ta' iskemija-riperfużjoni tal-kliewi tal-ġurdien: Involviment possibbli ta 'Fas. J Am Soc Nephrol 9: 620–631, 1998
13. Daemen MARC, Van de Ven MWCM, Heineman E, Buurman WA: Involviment ta 'interleukin endoġenu-10 u fattur tan-nekrożi tat-tumur - f'korriment ta' iskemija-riperfużjoni renali. Trapjant 67: 792–800, 1999
14. Kelly KJ, Plotkin Z, Dagher PC: Is-supplimentazzjoni tal-guanosine tnaqqas l-apoptożi u tipproteġirenalifunzjoni fl-issettjar ta 'korriment iskemiku. J Clin Invest 108: 1291–1298, 2001
15. Burne NJ, Rabb H: Kontribuzzjonijiet patofiżjoloġiċi ta 'fucosyltransferases f'korriment ta' iskemija-riperfużjoni renali. J Immunol 169: 2648–2652, 2002
16. Megyesi J, Safirstein RL, Prezz PM: Induzzjoni ta 'p21WAF1 / CIP / SD1 fiċ-ċelloli tat-tubuli tal-kliewi taffettwa l-kors ta' akut indott minn cisplatinrenalifalliment. J Clin Invest 101: 777–782, 1998
17. Shiraishi F, Curtis LM, Truong L, Poss K, Visner GA, Madsen K, Nick HS, Agarwal A: L-ablazzjoni jew l-espressjoni tal-ġene Heme oxygenase -1 jimmodula l-apoptosi tubulari renali indotta minn cisplatin. Am J Physiol 278: F726–F736, 2000
18. Ramesh G, Reeves WB: TNF-medja l-espressjoni ta’ kimokini u ċitokini urenalikorrimentfin-nefrotossiċità ta' cisplatin. J Clin Invest 110: 835–842, 2002
19. Feldenberg LR, Thevananther S, del Rio M, De Leon M, Devarajan P: It-tnaqqis parzjali tal-ATP jinduċi apoptosi medjata minn Fas u caspase fiċ-ċelloli MDCK. Am J Physiol 276: F837–F846, 1999
20. Devarajan P, De Leon M, Talasazan F, Schoenfeld AR, Davidowitz EJ, Burk RD: Il-prodott tal-ġene von Hippel-Lindau jinibixxi l-apoptosi taċ-ċelluli renali permezz ta 'mogħdijiet dipendenti Bcl-2-. J Biol Chem 276: 40599–40605, 2001
21. Yang J, Goetz D, Li JY, Wand W, Mori K, Setlik D, Du T, ErdjumentBromage H, Tempst P, Strong R, Barasch J: Mogħdija ta 'kunsinna tal-ħadid medjata minn lipocalin. Mol Cell 10: 1045–1056, 2002
22. Molitoris BA, Weinberg JM, Venkatachalam MA, Zager RA, Nath KA, Goligorsky MS: Insuffiċjenza renali akuta II. Mudelli sperimentali ta 'insuffiċjenza renali akuta: Imperfetta iżda indispensabbli. Am J Physiol 278: F1–F12, 2000
23. Fjura DR, North AC, Sansom CE: Il-familja tal-proteini lipocalin: ħarsa ġenerali strutturali u tas-sekwenza. Biochim Biophys Acta 1482: 9–24, 2000
24. Kjeldsen L, Cowland JB, Borregaard N: Lipokalin assoċjat man-newtrofili tal-ġelatinasi tal-bniedem u proteini omoloġi fil-firien u l-ġurdien. Biochim Biophys Acta 1482: 272–283, 2000
25. Xu S, Venge P: Lipocalins bħala markaturi bijokimiċi tal-mard. Biochim Biophys Acta 1482: 298–307, 2000
26. Hraba-Renevey S, Turler H, Kress M, Salomon C, Weil R: SV 40-espressjoni indotta tal-ġene tal-ġrieden 24p3 ​​tinvolvi mekkaniżmu ta 'wara t-traskrizzjoni. Onkogene 4: 601–608, 1989
27. Cowland JB, Borregaard N: Karatterizzazzjoni molekulari u mudell ta 'espressjoni tat-tessut tal-ġene għal lipokalin assoċjat man-newtrophil gelatinase mill-bnedmin. Genomics 45: 17–23, 1997
28. Nielson BS, Borregaard N, Bundgaard JR, Timshel S, Sehested M, Kjeldsen L: Induzzjoni ta 'sintesi NGAL f'ċelloli epiteljali ta' neoplażja tal-kolorektum tal-bniedem u mard infjammatorju tal-musrana. Gut 38: 414–420, 1996
29. Xu SY, Pauksen K, Venge P: Il-kejl tas-serum tal-lipokalin tan-newtrofili umani (HNL) jiddiskrimina bejn infezzjonijiet batteriċi u virali akuti. Scand J Clin Lab Invest 55: 125–131, 1995
30. Keatings VM, Barnes PJ: Markers ta 'attivazzjoni tal-granuloċiti fl-isputum indott meta mqabbla bejn mard pulmonari ostruttiv kroniku, ażma, u suġġetti normali. Am J Respir Crit Care Med 155: 449–453, 1997
31. Betsuyaky T, Nishimura M, Takeyabu K, Tanino M, Venge P, Xu S, Kawakami Y: Proteini tal-granuli newtrofili fil-fluwidu tal-ħasil tal-bronkoalveolari minn suġġetti b'enfisema subklinika. Am J Respir Crit Care Med 159: 1985–1991, 1999
32. Carlson M, Raab Y, Severus L, Xu S, Hallgren R, Venge P: Lipokalin tan-newtrofili tal-bniedem huwa markatur uniku ta 'infjammazzjoni tan-newtrofili f'kolite ulċerattiva u proctitis. Gut 50: 501–506, 2002
33. Chiao H, Kohda Y, McLeroy P, Craig L, Housing I, Star RA: -L-ormon li jistimula l-melanoċiti jipproteġi kontrarenalikorrimentwara iskemija fil-ġrieden u l-firien. J Clin Invest 99: 1165–1172, 1997
34. Rabb H, Ramirez G, Saba SR, Reynolds D, Xu J, Flavell R, Antonia S: Ħsara iskemika-riperfużjoni renali fi ġrieden defiċjenti ta 'L-selectin. Am J Physiol 271: F408–F13, 1996
35. Rabb H, Star R: Rispons infjammatorju u l-konsegwenzi tiegħu fl-akutrenalifalliment. Fi: Insuffiċjenza Renal Akuta, editjat minn Molitoris BA, u Finn WF, Philadelphia, WB Saunders, 2001, pp 89 –100
36. Devireddy LR, Teodoro JG, Richard FA, Green MR: Induzzjoni ta' apoptożi minn lipokalin imnixxi li huwa regolat b'mod traskrizzjoni minn deprivazzjoni ta' IL-3. Xjenza 293: 829–834, 2001
37. Persengiev SP, Devireddy LR, Green MR: Inibizzjoni ta 'apoptożi minn ATFx: Rwol ġdid għal membru tal-familja ATF/CREB ta' fatturi ta 'traskrizzjoni bZIP tal-mammiferi. Ġeni Dev 16: 1806–1814, 2002
38. Ryon J, Bendickson L, Nilsen-Hamilton M: Espressjoni għolja f'tessuti riproduttivi involuti ta 'uterocalin/24p3, lipocalin u proteina ta' fażi akuta. Biochem J 367: 271–277, 2002
39. Imħassar fil-prova.
40. Kamarainen M, Seppala M, Virtanen I, Andersson LC: L-espressjoni ta 'glycodelin fiċ-ċelloli tal-kanċer tas-sider MCF-7 tinduċi divrenzjar fl-epitelju acinar organizzat. Lab Invest 77: 565–573, 1997
41. Witzgall R, Brown D, Schwarz C, Bonventre JV: Lokalizzazzjoni ta 'antiġen nukleari taċ-ċelluli proliferanti, vimentin, c-fos, u clusterin fil-kliewi postiskemiku: Evidenza għal rispons ġenetiku eteroġenju fost segmenti nephron, u ġabra kbira ta' mitotikament ċelluli attivi u dedifferenzjati. J Clin Invest 93: 2175–2188, 1994
42. Hammerman MR: Rikapitulazzjoni tal-filoġenija mill-ontoġenija fin-nefroloġija. Kidney Int 57: 742–755, 2000
43. Ichimura T, Bonventre JV, Bailly V, Wei H, Hession CA, Cate RL, Sanicola M: Kidney injury molecule-1 (KIM-1), molekula putattiva ta' adeżjoni taċ-ċelluli epiteljali li fiha immunoglobulina ġdida dominju, huwa regolat 'il fuq fiċ-ċelloli tal-kliewi wara korriment. J Biol Chem 271: 4135–4142, 1998
44. Bailly V, Zhang Z, Meier W, Cate R, Sanicola M, Bonventre JV: Shedding of kidney injury molecule -1, proteina ta 'adeżjoni putattiva involuta fir-riġenerazzjoni tal-kliewi. J Biol Chem 277: 39739– 39748, 2002
45. Han WK, Bailly V, Abichandani R, Thadani R, Bonventre JV: Kidney injury molecule -1 (KIM-1): A bijomarkatur ġdid għall-ħsara tat-tubuli tal-kliewi prossimali tal-bniedem. Kidney Int 62: 237–244, 2002