mtLingwa
Id-dar / Għarfien / Il-kontenut

Għarfien

Effetti ta 'Angiotensin II fuq il-Produzzjoni ta' Eritropojetin fil-Kliewi u l-Fwied

May 09, 2022

Għal aktar informazzjoni. kuntatttina.xiang@wecistanche.com
Astratt: Il-kliewihuwa s-sit ewlieni tal-produzzjoni tal-eritropojetina fil-ġisem. Aħna żviluppajna metodu ġdid għall-iskoperta ta 'proteina EPO permezz ta' deglycosylation-coupled Western blotting. Is-sejbien ta' Epo deglycosylated jippermetti l-eżami ta' bidliet żgħar fil-produzzjoni tal-Epo. Bl-użu ta 'dan il-metodu, investigajna l-effetti ta' angiotensin II(ATII) fuq il-produzzjoni ta 'Epo fil-kliewi. ATII stimula l-konċentrazzjoni Epo fil-plażma; Espressjoni ta' mRNA ta' Epo, HF2a, u PHD2 f'segmenti tan-nephron fil-kortiċi renali u l-medulla ta' barra; u l-espressjoni tal-proteina Epo fil-kortiċi renali. L-ibridizzazzjoni in situ u l-immunoistokimika wrew li l-ATII jistimula l-mRNA tal-Epo u l-espressjoni tal-proteini mhux biss fit-tubuli prossimali iżda wkoll fil-kanali tal-ġbir, speċjalment f'ċelloli interkalati. Din id-dejta tappoġġja r-regolamentazzjoni tal-produzzjoni tal-EPO fil-kliewi mis-sistema renin-angiotensin-aldosterone (RAS).

Kliem ewlieni: eritropojetin; anġjotensin I; sistema renin-angiotensin-aldosterone; deglycosylation; Western blotting; HIF2; tubuli prossimali; katusi tal-ġbir

life extension standardized cistanche: protection liver

Ikklikkja biex titgħallem għal xiex tintuża s-cistanche

1. Introduzzjoni

L-eritropojetin (EPO) jistimula l-produzzjoni tal-eritroċiti fil-mudullun[1]. L-ipoksja u l-anemija jistimulaw il-produzzjoni tal-Epo mill-kliewi [1-4]. Ipoksja severa u anemija severa jikkawżaw żieda ta' aktar minn 500-darbiet fil-konċentrazzjoni tal-Epo fis-serum [5]. Madankollu, kundizzjonijiet bħal dawn huma rari u ħafna nies ma jesperjenzawhomx matul ħajjithom. Il-konċentrazzjoni ta' EPO fis-serum f'nies normali hija baxxa, u l-espressjoni tal-proteina Epo fil-kliewi ta' kontroll kienet baxxa wisq biex tinstab [5-8]. Aħna żviluppajna metodu ġdid ta 'Western blotting u sibna li l-Epo deglycosylated huwa markatur preċiż tal-espressjoni tal-Epo [5,9]. Il-proteina EPO fil-kliewi tiġi skoperta f'34-43 kDa, u d-deglycosylation bl-użu ta' PNGase tbiddel il-faxxa għal 22 kDa. Il-medda wiesgħa ta' Eoo hija kkonċentrata għal medda dejqa ta' 22 kDa, li tirriżulta f'żieda fis-sensittività ta' skoperta b'10-100-darbiet [5,9]. Għalhekk, l-iskoperta ta 'bidliet żgħar fil-produzzjoni tal-Epo saret possibbli.

Is-sistema renin-angiotensin-aldosterone (RAS) tirregola l-ilma renali u l-eskrezzjoni tal-elettroliti biex iżżomm l-omeostasi tal-fluwidu tal-ġisem [10,11]. L-inibituri RAS jikkawżaw anemija billi jnaqqsu l-produzzjoni tal-Epo. Kim et al. irrapporta li l-angiotensin II (ATI) iżid il-produzzjoni tal-Epo permezz tar-rispons bikri tat-tkabbir medjat mir-riċettur tal-angiotensin 1(AT1R)-1(Egr{-1)attivazzjoni fiċ-ċelloli 786-O tal-kliewi umani [12,13 ] Kato et al. irrapporta li ġrieden transġeniċi li għandhom ġeni ta 'renin u angiotensinogen juru eritroċitożi u dawk il-ġrieden knockout li m'għandhomx renin u angiotensinogen juru anemija [14,15]. L-anemija tal-ġrieden knockout ta 'angiotensinogen ġiet salvata permezz ta' infużjoni ATII, li tissuġġerixxi li mogħdija ġenetika minn angiotensinogen għal AT għandha rwol ewlieni fil-produzzjoni ta 'Epo indotta minn ATII. Dawn ir-rapporti jissuġġerixxu li l-produzzjoni tal-Epo hija regolata mhux biss minn ipoksja jew anemija iżda wkoll minn RAS [4,12,14-18]. Fir-rapporti preċedenti tagħna, urejna li l-aldosterone jistimula l-produzzjoni tal-Epo miċ-ċelloli interkalati tal-kanali tal-ġbir[7]. F'dan ir-rapport, aħna eżaminajna l-effetti tal-ATII fuq il-produzzjoni tal-Epo mill-kliewiufwied.

Informazzjoni estiża:Cistanchehuwa ħelu, mielaħ, u sħun fin-natura. Jappartjeni għall-meridjani tal-kliewi u tal-musrana l-kbira. Cistanche jista 'jipproteġimijokardju iskemiku, ibaxxu l-lipidi tad-demm, jirreżistu l-aterosklerożi, u l-antitrombożi, inaqqsu r-reżistenza vaskulari periferali, ibaxxu l-pressjoni tad-demm, u jirreżistu l-fwied xaħmi u attivitajiet farmakoloġiċi oħra. Totalglukosidita 'Cistanche jista' jtejjeb b'mod sinifikanti s-sopravivenza ta 'epatoċiti kkultivati ​​primarji Fi kliem ieħor, glukosidi totali ta' Cistanche jistgħu jnaqqsu l-apoptożi billi jżidu l-espressjoni ta 'ġeni inibitorji u jnaqqsu l-espressjoni ta' ġeni pro-apoptotic permezz ta 'apoptożi. apoptożi u nekrożi, iżidu r-rata ta 'sopravivenza taċ-ċelluli u jiksbu effett protettiv fuq epatoċiti primarji. Fl-esperiment tal-ġurdien, decoction ta 'l-ilma ta' 15 fil-mija ta 'Cistanche jista' jsewwi l-istruttura tat-tessut taċ-ċelloli tal-fwied u jżid il-kontenut ta 'glycogen epatiku fil-ġrieden soġġetti għal eżerċizzju ta' stress, sabiex jinkiseb l-effett protettiv tiegħu fuq il-fwied.

cistanche herb benefits：improve kidney function

2. Riżultati

2.1.Konċentrazzjoni Epo tal-Plasma

L-amministrazzjoni ta' ATI żiedet il-konċentrazzjoni ta' Epo fil-plażma minn 1.4 ± 0.2 għal 2.9 ±0.3 mIU/mL (Figura la).

2.2.Epo mRNA Espressjoni fil-Kortiċi Renali u Microdissected Proximal Convoluted Tubuli (PCT) u Medullari Thick Ascending Limbs (MAL)

ATII stimula l-espressjoni ta' Epo u HIF2&mRNA fil-kortiċi renali bi 13.2±4.7 u 11.4±0.6 darbiet minn A1 u A10, rispettivament (n=3-4) u 9.6±3.7 u8 .6±2.6 darbiet minn A1 u A10, rispettivament (n{=3-4)(Figura lbc).F'PCT mikrodissected, ATI żied l-Epo mRNA bi 3.4±0.7 u 2.4±. 0.2 darbiet bi 10-9 M u 10-6M ATII, rispettivament (n=3)u HIF2& mRNA bi 2.0±{{5{{ 54}}}}.2 u 2.3± 0.8 darbiet minn 10-9M u 10-6 M ATII, rispettivament (n=3)(Figura 1ld,e). L-ATII żiedet ukoll l-espressjoni tal-mRNA tal-Epo f'MAL b'4.3±1.0 u 6.5±2.0 darbiet b'10-M u10-6MATRispettivament (n=3)(Figura1f

image

Figure 1.Epo mRNA expression.(a)Plasma Epo concentration in control and ATI-injected rats. ATll significantly increased the plasma Epo concentration from 1.4 ± 0,2 to 29±0.3 mIU/mL (*p<0.05).(b,c) ATll significantly increased Epo mRNAexpression in the renal cortex(13.2±4.7 and 11.4±0.6 times increase by A1 and A10, respectively) (b), and HIF2a mRNA expression was also stimulated by ATll(9.6± 3.7 and 8.6 ± 2.6 times increase by AI and A10, respectively)(c)(d-f) In microdissected nephron segments, ATII increased Epo mRNA expression in PCT(d) and MAL(f).HIFla mRNA was also increased by ATI in PCT(e). C,control;A1ATI 1mg/keg; A10. ATII 10 mg/kg; ATII9, AT2 10-9M; ATI6,ATII 10-6 M.*p<0.05,*p<001 by the t-test or a non-parametric analysis using the Kruskal-Wallis test and multiple comparisons by the Dunnettor Shirley-Williams'test.

2.3. In Situ Hybridization ta 'Epoand l-Effetti ta' ATII

L-espressjoni tal-mRNA tal-EPO kienet osservata f'nephrons kortikali taħt kundizzjonijiet bażali, kif irrappurtat qabel [19].ATII stimola l-espressjoni tal-mRNA tal-Epo f'PCT, MAL, u kanali tal-ġbir kortikali u medullari (CCD u OMCD) wara 2 h (Figura 2: 2a, 2d) ). L-espressjoni tal-mRNA HIF2a żdiedet fil-biċċa l-kbira tas-segmenti tan-nephron u ċ-ċelloli peritubulari kemm tal-kortiċi kif ukoll tal-medulla (Figura 2: 2-4b,2-4e). L-espressjoni tal-mRNA PHD2 żdiedet ukoll f'MAL, CCD, u OMCD (Figura 2:3-4c, 3-4f).ATII naqset milli tinduċi espressjoni tal-mRNA tal-Epo fiċ-ċelloli peritubulari tal-kortiċi renali.

ATII on Epo mRNA expression evaluated by ISH. In situ hybridization was used to analyze the effects of ATII on Epo, HIF2α, and PHD2 mRNA expression in mouse kidneys. Epo mRNA expression was observed in cortical nephrons under basal conditions (1-a,d). ATII stimulated Epo mRNA expression in PCT, MAL, CCD, and OMCD at 2–6 h (2⁓4-a,d) and HIF2α mRNA expression in most nephron segments and peritubular cells of both the cortex and the medulla at 2– 6 h (2⁓4-b,e). In contrast, ATII stimulated PHD2 mRNA expression in MAL, CCD, and OMCD at 4– 6 h (3⁓4-c,f). (a–c) Renal cortex and (d–f) renal outer medulla. The numbers 1, 2, 3, and 4 show 0, 2, 4, and 6 h after the injection of ATII, respectively. 2.4. Western Blotting Analysis of ATII-Induced Epo Production in the Kidney and Liver The effects of fludrocortisone, an aldosterone agonist, were examined using deglycosylation-coupled Western blotting. The band of deglycosylated Epo at 22 kDa was observed in control rats (C2, C4, and C6 in Figure 3a right side), showing that Epo is produced in control rats. Fludrocortisone significantly stimulated the expression of deglycosylated Epo at 2 and 4 h after injection. The expression became equal to that in control rats Figure 2. Effects of ATII on Epo mRNA expression evaluated by ISH. In situ hybridization was used to analyze the effects of ATII on Epo, HIF2α, and PHD2 mRNA expression in mouse kidneys. Epo mRNA expression was observed in cortical nephrons under basal conditions (1-a,d). ATII stimulated Epo mRNA expression in PCT, MAL, CCD, and OMCD at 2–6 h (2~4-a,d) and HIF2α mRNA expression in most nephron segments and peritubular cells of both the cortex and the medulla at 2–6 h (2~4-b,e). In contrast, ATII stimulated PHD2 mRNA expression in MAL, CCD, and OMCD at 4–6 h (3~4-c,f). (a–c) Renal cortex and (d–f) renal outer medulla. The numbers 1, 2, 3, and 4 show 0, 2, 4, and 6 h after the injection of ATII, respectively

2.4. Western Blotting Analiżi tal-Produzzjoni tal-Epo Indotta mill-ATI fil-Kliewi u l-Fwied

L-effetti ta 'fludrocortisone, agonist ta' aldosterone, ġew eżaminati bl-użu ta 'deglycosylation-coupled Western blotting. Il-medda ta 'Epo deglycosylated f'22 kDa ġiet osservata fil-firien ta' kontroll (C2, C4, u C6 fil-Figura 3a naħa tal-lemin), li turi li Epo huwa prodott fil-firien ta 'kontroll. Fludrocortisone stimula b'mod sinifikanti l-espressjoni ta 'Epo deglycosylated fi 2 u 4 sigħat wara l-injezzjoni. L-espressjoni saret ugwali għal dik fil-firien ta 'kontroll wara 6 sigħat. Sussegwentement, ġie eżaminat l-effett tal-espressjoni ATIIon Epo. L-effett ta 'ATI fuq il-produzzjoni ta' Epo kien akbar fil-kortiċi renali milli fil-medulla ta 'barra tal-kliewi (Figura 3b). L-effett ta' ATI fuq il-produzzjoni ta' Epo ma kienx osservat fil-medula interna tal-kliewi (dejta mhux murija). ATI żiedet l-espressjoni tal-proteina Epo skont id-doża (Figura 3c).AT żiedet il-produzzjoni ta' Epo deglycosylated fil-kortiċi renali b'1.6±0.2 u 3.4±0.3 darbiet b'1 u 10 mg/kg rispettivament (n=6-8). B'kuntrast, il-produzzjoni tal-EPO ma dehritx fil-fwied, anki wara l-għoti ta 'ATII (Figura 3d).

ffects of fludrocortisone and ATII on Epo protein expression in the kidney and liver. (a) Effects of fludrocortisone on Epo production in the kidney. Fludrocortisone increased deglycosylated Epo protein expression at 2 and 4 h after the injection. The levels returned to basal values after 6 h. (b) ATII dose-dependently increased deglycosylated Epo protein expression in the renal cortex and outer medulla. The effects were larger in the renal cortex than in the renal outer medulla. (c) ATII increased deglycosylated Epo production in the renal cortex by 1.6- and 3.4-fold by 1 and 10 mg/kg, respectively. (d) In contrast, deglycosylated Epo production was not observed in control and ATII-injected livers. Recombinant rat Epo is shown as the control in Figure 3c. Glycosylated Epo and deglycosylated rat Epo were used in lane 1. Glycosylated Epo and deglycosylated Epo were used in lanes 11 and 12, respectively. * p < 0.05, ** p < 0.01 by a non-parametric analysis using the Kruskal–Wallis test and multiple comparisons by the Shirley–Williams' test. Figure 3. Effects of fludrocortisone and ATII on Epo protein expression in the kidney and liver. (a) Effects of fludrocortisone on Epo production in the kidney. Fludrocortisone increased deglycosylated Epo protein expression at 2 and 4 h after the injection. The levels returned to basal values after 6 h. (b) ATII dose-dependently increased deglycosylated Epo protein expression in the renal cortex and outer medulla. The effects were larger in the renal cortex than in the renal outer medulla. (c) ATII increased deglycosylated Epo production in the renal cortex by 1.6- and 3.4-fold by 1 and 10 mg/kg, respectively. (d) In contrast, deglycosylated Epo production was not observed in control and ATII-injected livers. Recombinant rat Epo is shown as the control in Figure 3c. Glycosylated Epo and deglycosylated rat Epo were used in lane 1. Glycosylated Epo and deglycosylated Epo were used in lanes 11 and 12, respectively. * p < 0.05, ** p < 0.01 by a non-parametric analysis using the Kruskal–Wallis test and multiple comparisons by the Shirley–Williams' test.

2.5. Immunohistochemistrvy tal-Produzzjoni tal-Epo mill-Kliewi

Minn ġrieden IHCof, taħt kundizzjonijiet bażali, instabet tbajja Epo mit-tubuli prossimali sal-kanali tal-ġbir (tubuli prossimali

Figure 4. Immunohistochemical study of the effects of ATl on Epo production by the kidney.Under basal conditions, Epo staining was found from the proximal tubules to the collecting ducts (proximal tubules< thick ascending limbs<collecting ducts)(1-a-c).ATIl increased Epoproduction in MAL, CCD, and OMCD(3~4-a-c), particularly in the type A intercalated cells, after 4-6h (brown cells in 3~4-a-c). The renal outer medulla is shown at a different magnification. The numbers 1,2,3,and 4 show 0, 2,4, and 6 h after the injection of ATIl, respectively.

cistanche propiedades blood lipid lowering

3. Diskussjoni

L-iskoperta ta 'Epo permezz ta' Western blotting kienet diffiċli sakemm is-sejba tagħna ta 'assaġġ akkoppjat mad-deglycosylation [5,7,9,20-26]. F'ipoksja severa u anemija, il-produzzjoni ta' EPO hija stimulata għal livell għoli u l-iskoperta ta' Epo hija faċli [2-5]. Madankollu, kundizzjonijiet bħal dawn huma rari in vivo. Sibna li l-Epo huwa prodott mill-kliewi anke taħt kundizzjonijiet ta 'kontroll. Is-sejbien ta 'Epo fil-kliewi ta' kontroll huwa diffiċli, anke permezz tal-Western blotting tagħna. Id-deglycosylation ta 'Epo minn PNGase iżid l-intensità tal-faxxa ta' Epo f'22 kDa, li jagħmilha possibbli li jinstabu livelli aktar baxxi ta 'EPO. Bl-użu ta 'dan il-metodu, investigajna l-effetti tal-fludrocortisone u l-ATII fuq il-produzzjoni tal-Epo.

ATll żied l-espressjoni tal-mRNA tal-Epo fil-kortiċi renali. Sussegwentement, aħna eżaminajna l-effetti ta 'ATIIon Epo mRNA espressjoni fil microdissected PCT u MAL.ATll żiedu l-Epo mRNA espressjoni fil PCT u MAL, Aħna eżaminajna wkoll l-effetti ta' ATI mill-ibridizzazzjoni in situ (ISH). ISH żvelat li l-ATI iżid l-espressjoni tal-mRNA tal-Epo mhux biss fi

tubuli prossimali iżda wkoll fit-tubuli distali. Barra minn hekk, investigajna l-espressjoni tal-proteina Epo permezz ta 'Western blotting. F'dan l-istudju ntuża l-blotting tal-Punent akkoppjat mad-deglycosylation. Ir-riżultati juru li ATIl b'mod dipendenti fuq id-doża jżid l-espressjoni tal-proteina Epo fil-kliewi iżda mhux fil-fwied. Il-konċentrazzjoni ta' Epo fil-plażma żdiedet bi 2-3-darbiet, li hija kompatibbli mar-rapporti preċedenti 4,68,12. Dan il-livell ta' produzzjoni ta' EPO fid-demm ma jistax jitkejjel permezz ta' Western blotting. Madankollu, il-blotting tal-Punent akkoppjat mad-deglycosylation għamel is-sejbien possibbli, u ATII żied b'mod sinifikanti l-espressjoni tal-proteina Epo fil-kliewi. L-immunoistokimika wriet ukoll li ATlI żżid l-espressjoni tal-proteina Epo kemm fit-tubuli prossimali kif ukoll f'dawk distali. L-effett tal-ATII huwa identiku għal dak tal-fludrocortisone fiċ-ċelloli interkalati tal-kanali tal-ġbir [7]. L-istudju tagħna huwa l-ewwel wieħed li juri l-lokalizzazzjoni intrarenali tal-produzzjoni tal-Epo indotta mill-ATII minn ISH u IHC.

AT Il żiedet ukoll l-espressjoni tal-mRNA HIF2 fil-kortiċi renali u t-tubuli konvoluti prossimali, li turi li ż-żieda fil-produzzjoni tal-Epo minn ATII hija kkawżata mill-istimulazzjoni ta 'HIP2, l-istess bħal aldosterone [7l. L-istudju tagħna jindika li l-produzzjoni tal-EPO mill-kliewi hija regolata mis-sistema renin-angiotensin-aldosterone. Ir-rwol tal-ATIⅡ fuq il-produzzjoni tal-Epo fil-kliewi ġie ssuġġerit [4,12,16-18]. Jelkmann issuġġerixxa effetti indiretti ta' angiotensin Ⅱl bħala fattur ta' tkabbir għal pro-ġenituri eritroċitiċi majelojdi |4|. Kim et al. irrapporta b'mod ċar li angiotensin II tistimula l-produzzjoni ta' Epo permezz ta' attivazzjoni ta' Egr-1 medjata minn AT1R permezz ta' protein kinase attivat minn p21Ras-mitogen/kinase(ERK) kinaseERK/2 tal-kliewi tal-bniedem [12.13] ]. Ir-rwol ta 'passaġġ ġenetiku minn angiotensinogen għal ATII ġie eżaminat minn Kato et al. [14,15]. Huma wrew li ġrieden transġeniċi li għandhom ġeni ta 'renin u angiotensinogen juru eritroċitożi. Huma rrappurtaw ukoll li ġrieden knockout nieqsa minn renin u angiotensinogen juru anemija li ġiet salvata permezz ta 'infużjoni ATIl, li tissuġġerixxi li mogħdija ġenetika minn angiotensinogen għal ATll għandha rwol ewlieni fil-produzzjoni ta' Epo indotta minn ATI. Il-mekkaniżmi tal-produzzjoni tal-Epo taħt kundizzjonijiet iposiċi u bażali severi jistgħu jkunu differenti, iżda xi passi bħall-istimulazzjoni ta 'HIF2 jistgħu jkunu l-istess. L-abbiltà li tipproduċi Epo tkun differenti bejn iċ-ċelloli interstizjali renali u n-nephrons. L-iskoperta ta 'HIF2 permezz ta' Western blotting ma kinitx ta 'suċċess f'dan l-istudju; ma stajniex niskopru l-medda HIF2 f'madwar 115 kDa, anke bl-użu ta' sc-46691, sc-13596, Ab8365, u NB100-122.

4. Materjali u Metodi

4.1.Materjali u Annimali

Intużaw firien Sprague-Dawley maskili (Ġappun SLC, Hamamatsu, Ġappun) u ġrieden C57BL/6J (Charles River Japan, Yokohama, Japan). Il-firien ingħataw 1 jew 10 mg/kg ta' ATI(A1 u A10, rispettivament), u l-ġrieden ingħataw 5 mg/kg ta' ATII b'injezzjoni intraperitoneali. Il-grupp ta' kontroll ġie injettat b'salina. Wara 4 sigħat, il-firien ġew injettati b'anestetiku imħallat (0.3 mg/kg ta' medetomidine, 4.0 mg/kg ta' midazolam, u 5.0 mg/kg ta' butorphanol), u d-demm kien meħuda mill-aorta addominali. Il-kliewi u l-fwied ġew imqassma wara li ħarġu 20 mL ta 'PBS fl-aorta addominali. F'xi esperimenti, flieli tal-kliewi ġew inkubati f'kollaġenażi (tip 1, C-0130; Sigma-Aldrich, Burlington, NJ, USA) u kumplessi ta' ribonucleoside vanadyl (R-3380; Sigma-Aldrich) għal 20 min. , u PCT u MAL ġew mikrodissected, kif deskritt qabel [7]. PCT jew MAL mikrodissected ġew inkubati b'ATI jew il-vettura għal 2 sigħat f'37 grad. Ġrieden kienu anestetizzati b'1.5 fil-mija isoflurane fi 30 fil-mija O2 (taħlita ta '100 fil-mija O, u arja) wara 2.4, u 6h. Il-kliewi tneħħew malajr u qatgħu lonġitudinali. Il-biċċiet ewlenin tal-kliewi ġew iffissati permezz ta 'immersjoni f'4 fil-mija paraformaldehyde/0.1 M phosphate buffer matul il-lejl u pproċessati fil-paraffin għal analiżi istoloġika.

Il-protokolli tagħna ġew iċċekkjati u approvati mill-Kumitat tal-Etika Istituzzjonali taċ-Ċentru Mediku tal-Università ta 'Kitasato (2018032, 2019029) u l-Iskola tal-Mediċina tal-Università ta' Kitasato (2019-141).

4.2. PCR f'ħin reali

L-RNA ġie estratt mill-kliewi, il-fwied u l-PCT jew MAL mikrodissected bl-użu ta 'Qiacube u l-RNeasy Mini Kit (74106; Qiagen, Venlo, l-Olanda), kif deskritt qabel [5]. cDNA ġie sintetizzat bl-użu ta 'Takara PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit (6210; Takara, Otsu, Ġappun). Twettqet PCR f'ħin reali bl-użu ta' sondi minn Applied Biosystems(GAPDH Rn01775763 g1, Epo Rn00667869 m1.HIF2 Rn00576515 m1. HIFla Rn01472831 m1, PHD2 Rn00710295 m1, MALRQ; fil-kontroll u firien ATII tqabblu bl-użu ta 'AACT.

4.3. In Situ Hybridization

ISH sar, kif deskritt qabel [5,27]. Fil-qosor, l-RNA totali mill-kliewi tal-ġrieden (636612; BDBioscieces Clontech) ġie traskritt b'lura b'kitt RNA PCR (AMV), ver. 3.0 (RR{019; Takara), u s-sonda cRNA għall-Epo (nru ta' adeżjoni tal-GenBank NM 007942).HIF2 (adeżjoni ta' GenBank nru NM 010137), jew PHD2(nru ta' adeżjoni tal-GenBank NM_053207) ġie ġġenerat bi primers PCR ta' denbu tar-reġjun tal-promotur T7. Is-sezzjonijiet ibridizzati ġew ittrattati suċċessivament b'0.1 fil-mija avidin, 0.01 fil-mija soluzzjoni tal-bijotina, 0.5 fil-mija kaseina/TBS, antikorp tal-framment tan-nagħaġ konjugat anti-DIG F (ab') anti-DIG F (ab') tan-nagħaġ (11207733910; Roche Diagnostics, Basel, Svizzera) Soluzzjoni .biotinylated tyramide, u HRP-konjugat streptavidin (P0397; DakoCytomation, Glostrup, id-Danimarka). It-taqsimiet ġew imtebba bl-użu tas-sistema likwida DAB (BSB 0016: Bio SB.Santa Barbara.CA, USA) u l-ematossilin ta 'Mayer (30002; Muto Pure Chemicals, Tokyo, Ġappun).

4.4. Immunoistokimika

Is-sezzjonijiet tal-kliewi kienu immuno-mtebbgħin, kif deskritt qabel [7,28]. Fil-qosor, it-taqsimiet ġew imblukkati b'5 fil-mija serum normali tal-mogħoż u rreaġixxew b'antikorp Epo poliklonali kontra l-bniedem tal-fenek (sc-7956,1:50; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), segwit minn Histofine Tebgħa sempliċi MAX-PO(414341F; Nichirei Bioscience, Tokyo, Ġappun). Is-sezzjonijiet kienu mtebbgħin bl-użu tas-sistema likwida DAB u kontrotebba bl-ematoxylin ta 'Mayer.

Immaġini nkisbu permezz ta 'mikroskopju ottiku (Axioplan 2; Carl Zeiss, oberkochen, il-Ġermanja) b'kamera diġitali (AxioCam MRcb; Carl Zeiss). Immaġini maqbuda ġew analizzati bl-użu ta 'sistema ta' analiżi tal-immaġni (AxioVision Rel.4.6; Carl Zeiss).

4.5. Western Blotting Analiżi b'Deglycosylation

Twettqet analiżi Western blotting, kif deskritt qabel [4,6,7]. Il-proteina nġabret mill-kortiċi renali u l-fwied bl-użu ta' CelLytic MT(C-3228; Sigma-Aldrich) u ntużat għal Western blotting. Kampjuni tal-kliewi u tal-fwied ġew deglycosylated bl-użu ta ' N-glycosidase F (PNGase,4450); Takara, kif deskritt qabel. Fil-qosor, 1 μL ta '10 fil-mija SDS ġie miżjud ma' 10μL ta 'kampjuni tal-kliewi jew tal-fwied u mgħolli għal 3 min. Imbagħad, ġew miżjuda 11 uL ta '2× buffer stabilizzanti u l-kampjuni ġew vortexed. Wara ż-żieda ta' 1-2 μL ta' PBS jew PNGase, il-kampjuni ġew inkubati f'banju ta' l-ilma għal 20 siegħa f'37 grad. Wara l-inkubazzjoni, il-kampjuni ġew mibrumin 'l isfel u s-supernatant inġabar u użat għal SDS-PAGE (10-20 ġel gradjent fil-mija: Cosmo Bio Nru, 414893. Tokyo. Ġappun). Il-buffer stabilizzanti 2 × kien fih 125 mM Tris- HCl (pH8.6), 48mMEDTA, 4 fil-mija Nonidet P-40, u 8 fil-mija 2-mercaptoethanol. Epo uman rikombinanti (rhEpo, 587102; BioLegend, San Diego, CA, USA) intuża bħala kontroll pożittiv. Wara SDS-PAGE, il-proteini ġew trasferiti għal membrana PVDF (Immobilon-P; IPVH00010: Merck Millipore, Burlington.NI.USA) b'120 mA għal 60-90 min. Il-membrana ġiet imblukkata b'5 fil-mija ħalib xkumat (Morinaga, Ġappun) għal 60 min u inkubata bl-antikorp kontra Epo (sc-5290, 1:500; Santa Cruz Biotechnology) għal 60 min f'temperatura ambjentali. Wara l-ħasil, il-membrana ġiet inkubata b'antikorp sekondarju (mogħoż kontra l-ġurdien IgG(H plus L);115-035-166, 1:5000; Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, USA) għal 60 min. Il-meded ġew viżwalizzati mill-ECL Select Western Blotting Detection System (RPN2235; GE Healthcare Bio-Science AB, Chicago, IL, USA) u LAS4000 (Fujifilm, Tokyo, Ġappun).

4.6. Kejl tal-Konċentrazzjoni tal-Epo tal-Plażma

Il-plażma nġabret mill-firien tal-kontroll u ttrattati b'ATI f'4 sigħat wara injezzjoni peritoneali. Il-konċentrazzjonijiet ta 'EPO fil-plażma ġew imkejla minn CLEIA (SRL, Tokyo, Ġappun) bl-użu ta' Access Epo minn Beckman Coulter (Brea, CA, USA).

4.7. Plażma E

Id-dejta hija espressa bħala l-medja ± SEM. Is-sinifikat statistiku twettqet bl-użu tal-Istatistika Excel (BellCurve, Tokyo, il-Ġappun). Is-sinifikat statistiku ġie analizzat bl-użu ta 'f-test jew analiżi mhux parametrika bl-użu tat-test Kruskal-Wallis u paraguni multipli bit-test ta' Shirley-Williams. p-Valuri<0.05 were="" considered="" statistically="">

effects of cistanches：improve kidney function

5. Konklużjonijiet

Bħala konklużjoni, l-istudju tagħna juri li ATII iżid l-espressjoni tal-mRNA u tal-proteini tal-Epo fit-tubuli renali prossimali u distali. Flimkien mal-istudji preċedenti tagħna, il-produzzjoni tal-Epo mill-kliewi taħt kundizzjonijiet bażali hija regolata mis-sistema renin-angiotensin-aldosterone.




Tista 'Tħobb ukoll