Kif Tħares Ċelloli Tubulari Renali Affettwati B'Apoptożi Indotta minn Gentamicin?

Effetti protettivi ta 'Zhibai Dihuang Wan fuq ċelluli tubulari tal-kliewi affettwati b'apoptożi indotta minn gentamicin

Għal aktar informazzjoni:ali.ma@wecistanche.com

Kliem ewlieni: Akuta kliewimard, Apoptożi, Gentamicin,Ċellula tubulari tal-kliewi, kliewi.

Astratt

Rilevanza etnofarmakoloġika: Zhibai Dihuang Wan (ZDW) hija mediċina tradizzjonali Ċiniża antika magħmula minn tmien ingredjenti veġetali u ġiet użata biex tikkura kronika.kliewiinfjammazzjoni u dijabete għal eluf ta 'snin. Madankollu, l-influwenza ta 'ZDW fuq akutakliewikorriment għadu mhux magħruf. Kellna l-intenzjoni li nidentifikaw l-influwenza ta 'ZDW fuq it-tkabbir taċ-ċelluli ugentamicin-indotta apoptotic korriment fiċelluli tubulari tal-kliewi.

Materjali u metodi: Aħna estratti ZDW b'fluwidu intestinali artifiċjali u far ittrattatċelluli tubulari tal-kliewi(NRK-52E) b'diversi konċentrazzjonijiet tal-estrazzjoni ZDW. Proliferazzjoni taċ-ċelluli ugentamicin-indottaapoptożitaċ-ċelloli NRK-52E ġew evalwati bl-użu ta' monitoraġġ tal-proliferazzjoni f'ħin reali u t-tbajja' tal-annessin V, rispettivament. Western blotting intuża biex jevalwa l-livelli ta' espressjoni Bcl-2 u caspase-3. L-effett ta 'ZDW fuqgentamicin-indottakliewiil-korriment kien ukoll immonitorjat fil-ġrieden bl-użu tat-terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated biotiylated UTP nick end labeling assay (TUNEL), u l-kejl tal-krejatinina fis-serum u n-nitroġenu tal-urea fid-demm.

Riżultati: Sibna li 30 μ g / ml ta 'ZDW ippromwoviet il-proliferazzjoni taċ-ċelluli tal-farċelluli tubulari tal-kliewi. ZDW esprima wkoll effett protettiv li jiddependi mid-doża kontragentamicin-indottaapoptożifiċ-ċelloli. Trattament minn qabel bi 3 μ g/ml jew 30 μ g/ml ta' ZDW żied b'mod massimu Bcl-2 u naqas il-caspase cleaved-3 fil-gentamicinċelluli NRK-52E ittrattati. Fost l-ingredjenti tal-ħxejjex ta 'ZDW, Phellodendron amurense Rupr., Qoxra (Cortex Phellodendri), u Anemarrhena asphodeloides Bunge biss, ir-riżoma inibit kemm il-gentamicin-indotta Bcl-2 tnaqqis u qasma caspase-3 żieda. Phellodendron amurense Rupr., Qoxra u Anemarrhena asphodeloides Bunge, riżoma wkoll inibitgentamicin-indottaapoptożif'konċentrazzjonijiet partikolari; madankollu, dawn iż-żewġ ingredjenti kienu inqas effettivi minn ZDW. Fil-mudell tal-maws tagentamicin-nefropatija indotta, it-trattament ZDW naqqas b'mod sinifikanti ċ-ċelloli apoptotiċi fil-kortiċi renali u tejbet il-funzjoni renali.

Konklużjonijiet: Ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu li ZDW f'dożi adegwati attenwagentamicin-indotta apoptotic korriment fiċelluli tubulari tal-kliewiu tipproteġi wkollkliewiminngentamicin-korriment ikkaġunat fil-ġrieden.

1. Introduzzjoni

Mediċini erbali ilhom jintużaw biex jikkuraw diversi mard għal ħafna sekli, speċjalment fis-soċjetà Ċiniża. Riċentement, l-effetti sekondarji potenzjali tal-ħxejjex aromatiċi fuq il-kliewiġew irrappurtati (Isnard Bagnis et al., 2004). Fl-1991, in-nefrologi fil-Belġju rrappurtaw dwar ħafna nisa żgħażagħ li kienu belgħu estratti ta 'ħxejjex Ċiniżi li fihom Aristolochia fang chi f'reġimi ta' dieta li ppreżentaw gradi differenti ta 'insuffiċjenza renali (Vanherweghem et al., 1993). L-espożizzjoni għall-pjanta Aristolochia miżjuda involontarjament li fiha l-aċidu aristolokiku (AA) ġiet ippruvata li hija l-kawża ewlenija tal-ħsara renali, atipija taċ-ċelluli uroteljali u karċinoma (De Broe, 2012). Peress li l-mediċina tradizzjonali Ċiniża hija pprattikata ġeneralment fit-Tajwan u ċ-Ċina kontinentali, in-nefropatija AA hija prevalenti f'dawn l-oqsma u hija problema potenzjali tas-saħħa pubblika (Grollman, 2013). Il-biċċa l-kbira tan-nefrologi fit-Tajwan jirrakkomandaw li l-pazjenti jevitaw il-mediċina tradizzjonali tal-ħxejjex. Madankollu, xi mediċini erbali tradizzjonali wrew wegħda fit-trattament takliewimard fi studji prekliniċi jew provi kliniċi (Wojcikowski et al., 2006; Wang et al., 2012; Zhang et al., 2012). Filwaqt li jiġi evitat l-użu ta’ pjanti Aristolochia f’mediċini erbali huwa essenzjali, il-mediċini erbali għadhom kandidati potenzjali għat-trattament ta’ ċertikliewimard.

Ikklikkja għall-effetti Cistanche għall-adrenali

Zhi bai Dihuang Wan (ZDW), formula polyherbal, intużat għall-kura kronikakliewiinfjammazzjoni u dijabete għal eluf ta 'snin. ZDW huwa magħmul minn Cornus officinalis Siebold & Zucc (13.8 fil-mija), Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., għerq, moħmi (Radix Rehmanniae preparata, 27.6 fil-mija), Dioscorea oppositifolia L. (13.8 fil-mija), Phellodendron amurense Rupr., qoxra (Cortex Phellodendri, 6.9 fil-mija), Anemarrhena asphodeloides Bunge, riżoma (6.9 fil-mija), Paeonia suffruticose Andrews, qoxra ta 'l-għeruq (Moutan Cortex, 10.3 fil-mija), Alisma Plantago-Aquatica L., riżoma (Rhizoma Alismatis, co )10. (Schw.) Wolf (10.3 fil-mija ), u ma fihx Aristolochia. Fost dawn l-ingredjenti, hemm Cornusofficinalis Siebold & Zucc, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., għerq, moħmi, Phellodendron amurense Rupr., qoxra, u Poria cocos huma rrappurtati li huma ta 'benefiċċju għan-nefropatija dijabetika jew korriment kronika tal-kliewi f'mudelli ta' annimali (Yokozawa et al., 2004; Kim et al., 2008; Jiang et al., 2012; Zhao et al., 2013). ZDW mingħajr Anemarrhena asphodeloides Bunge u Phellodendron amurense Rupr., Qoxra kellha wkoll effett protettiv parzjali fuq nefropatija dijabetika bikrija fil-firien (He et al., 2007). Dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li ZDW għandu effetti potenzjalment protettivi kontra l-ħsara renali. Madankollu, l-influwenza ta 'ZDW fuq it-tkabbir taċ-ċelluli uapoptożitaċelluli tubulari tal-kliewigħadu mhux ċar.

Gentamicinhuwa antibijotiku aminoglycoside użat ħafna biex jikkura infezzjonijiet batteriċi gram-negattivi, iżda jinduċi akutikliewikorriment f'madwar 30 fil-mija tal-pazjenti (Singh et al., 2012). Fiċ-ċelloli tubulari prossimali tal-kliewi, jinduċuapoptożihuwa mekkaniżmu ċitotossiku ewlieni ta 'gentamicin(Servais et al., 2006).Gentamicinjinduċiapoptożipermezz ta 'passaġġ ta' sinjalazzjoni medjat mill-mitokondriju, inkluż tnaqqis ta 'Bcl-xL u żieda fil-caspase cleaved-3 u -9 (Ali, 2003; Juan et al., 2007). Sal-lum, m'hemm l-ebda rimedju kliniku ideali biex jipprevjenigentamicin-indotta akutakliewikorriment. F'dan l-istudju, investigajna l-influwenza ta 'ZDW fuqgentamicin-indottaapoptożifiċelluli tubulari tal-kliewiin vitro u in vivo. Id-dejta tagħna żvelat l-effett protettiv ta 'ZDW fuqgentamicin-trattatċelluli tubulari tal-kliewiu aktar wera kontribuzzjonijiet tal-ingredjenti tagħha għall-effett protettiv ta 'ZDW.

2. Materjali u metodi

2.1. Reaġenti u preparazzjoni ta 'ZDW

Dulbecco's modifikat Eagle's medium (DMEM), serum tal-għoġol tal-fetu, u reaġenti tal-kultura tat-tessuti nkisbu minn Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD, USA). Il-kimiċi l-oħra kollha ta 'grad reaġent inkisbu minn Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA). It-trabijiet ta' ZDW (lott Nru. 051941) u l-ingredjenti tiegħu (Cornus officinalis Siebold & Zucc, lott Nru. C810Y; Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., għerq, moħmi, lott Nru C730N; Dioscorea oppositifolia L., lott Nru C624N; Phellodendron amurense Rupr., qoxra, lott Nru C722Y; Anemarrhena asphodeloides Bunge, riżoma, lott Nru C805N; Paeonia sufruticosa, root bar, Andrews lott Nru C813Y; Alisma Plantago-Aquatica L., riżoma, lott Nru C819N; Poria cocos (Schw.) Wolf, lott Nru C827N) inxtraw minn SunTen Pharmaceutical Co. (Taipei, Tajwan). Skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur, 29 g tat-taħlita tal-8-ħxejjex aromatiċi (4 g Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 g Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., għerq, moħmi, 4 g Dioscorea oppositifolia L., 2 g Phellodendron amurense Rupr., Qoxra, 2 g Anemarrhena asphodeloides Bunge, riżoma, 3 g Paeonia suffruticose Andrews, qoxra ta 'l-għeruq, 3 g Alisma Plantago-Aquatica L., riżoma u 3 g Poria cocos (Schw.) Wolf) kien mgħolli fi 2290 ml ta 'ilma distillat għal 4 sigħat f'{23}}C, iffiltrat, lajofilizzat biex jagħti 7.5 g estratti niexfa, u mbagħad imħallat ma' 2.2 g lamtu tal-qamħirrum u 5.3 g ċelluloża trab biex tiġġenera 15 g ZDW. Il-ħwawar kollha ġew ivverifikati minn professur tal-herboloġija minn Brion Research Institute tat-Tajwan, ROC Il-kampjuni tal-vawċers ġew depożitati f'Herbarium tal-Istitut Nazzjonali tar-Riċerka tal-Mediċina Ċiniża, Tajwan, ROC (numri tal-vawċers: Cornus officinalis Siebold & Zucc - NHP{{32} }, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., għerq, moħmi -NHP-00411, Dioscorea oppositifolia L. - NHP-00600, Phellodendron amurense Rupr., qoxra - NHP{-00369, Anemarrhena asphodeloides Bunge, riżoma - NHP-00196, Paeonia suffruticose Andrews, qoxra tal-għeruq- NHP-00169, Alisma Plantago-Aquatica L., riżoma - NHP{-00424, Poria cocos (Schw.) Wolf - NHP -00309). Il-mediċini erbali (0.1 g) ġew diġeriti b'1 ml ta' fluwidu intestinali artifiċjali (1 fil-mija pankreatin, 50 mM fosfat diidroġenu tal-potassju, pH 7.5) f'37 1C għal 2 sigħat, iffiltrat minn 0.22- μ m filtri, u mbagħad applikati fl-esperimenti taċ-ċelluli. Barra minn hekk, fluwidu intestinali artifiċjali waħdu ġie wkoll inkubat f'37 1C għal 2 sigħat, iffiltrat permezz ta 'filtri ta' 0.22- μ m, u mbagħad applikat fi gruppi ta 'kontroll.

2.2. Analiżi tal-marki tas-swaba' permezz ta' kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja (HPLC)

Il-kwalità ta 'ZDW kienet imkejla mill-HPLC. Fil-qosor, {{0}}.1 g trab ZDW ġie maħlul f'ilma demoniku f'temperatura tal-kamra għal sagħtejn, iffiltrat minn {{10}}.22- μ m filtri , u mbagħad applikata fl-analiżi HPLC. Mitt μ l tas-soluzzjoni ġiet applikata għal 250 4.6 mm C18-kolonna (Grace. Columbia, USA) bl-użu ta' sistema Waters HPLC mgħammra b'60{{18 }} kontrollur u 996 photodiode array detector (Waters, St. Massachusetts, USA). Il-kampjun imbagħad ġie eluwit b'gradjent ta 'metanol lineari ta' 0-95 fil-mija f'ilma demoniku, pH 7.0, fuq 60 min b'rata ta 'fluss ta' 0.8 ml/min. L-eluwenti ġew skoperti u kkwantifikati f'254 nm minn 0 min sa 60 min f'temperatura tal-kamra. L-analiżi twettqet 10 darbiet u r-riżultati huma konsistenti.

2.3. Kultura taċ-ċelluli

Xtrajna ċelluli tubulari prossimali renali tal-firien (NRK-52E) miċ-Ċentru ta' Ġbir u Riċerka tal-Bijoriżorsi (Hsinchu, Tajwan). Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​f'DMEM supplimentat b'soluzzjoni antibijotika/antifungali u 10 fil-mija serum tal-fetu bovin. Huma tkabbru sakemm il-monosaff sar konfluwenti. Iċ-ċelloli kkultivati ​​mbagħad ġew ikkultivati ​​fil-medium mingħajr serum matul il-lejl qabel l-esperiment. Estratti ZDW minn fluwidu intestinali artifiċjali ġew miżjuda ma 'ċelluli starved f'konċentrazzjoni indikata u fluwidu intestinali artifiċjali inkubat ġie applikat bħala trattament ta' kontroll. Wara 24 siegħa ta 'inkubazzjoni, kampjuni taċ-ċelluli ġew maħsuda u applikati fihomapoptożianaliżi u Western blotting analiżi.

2.4. Monitoraġġ f'ħin reali tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli

Biex tissorvelja l-proliferazzjoni taċ-ċelluli, użajna s-sistema "xCELLigence" minn Roche Applied Sciences (Indianapolis, IN, USA). Iċ-ċelloli NRK-52E ġew miżrugħa f'żewġ kopji fi E-plates f'densità ta' 10000 ċellula/bir. E-plates imbagħad ġew trasferiti għall-istrument xCELLi-glance RTCA DP għal monitoraġġ awtomatizzat f'ħin reali f'inkubatur umidifikat li fih 5 fil-mija CO 2 f'{8}}C. Wara 24 siegħa, iċ-ċelloli fil-pjanċi E ġew ġuħ matul il-lejl. Għall-assaġġ tal-proliferazzjoni, estratti ZDW ġew miżjuda maċ-ċelloli għal 30 min, u mbagħad 3 mmol/l ta 'gentamicinġie miżjud maċ-ċelloli. L-indiċi taċ-ċellula, unità arbitrarja li tirrifletti l-impedenza tas-sensor taċ-ċellula, tkejjel kull 15-il minuta. Il-kalkolu tal-inklinazzjoni sar bil-verżjoni tas-softwer RTCA 1.2 (Roche Applied Sciences). Twettqu tliet esperimenti indipendenti.

2.5. Sejbien ta' apoptożi

Fluorescein isothiocyanate (FITC)-annexin V/propidium iodide (PI) intużat tbajja doppja biex jinstabapoptożiindotta minngentamicintrattament. Iċ-ċelloli NRK-52E ttrattati ġew maħsuda u maħsula darbtejn b'salina phosphate-buffered (PBS) kiesħa fis-silġ. It-twaħħil speċifiku ta 'FITC-annexin V u mtebba' b'PI saru bl-użu ta' anapoptożikit ta 'skoperta (BD Biosciences-Pharmingen, San Diego, CA, USA), skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Iċ-ċelloli mbagħad ġew analizzati bl-użu taċ-ċitometrija tal-fluss.

2.6. Analiżi Western blot

Ġew applikati għoxrin mikrogramma ta' lisat tal-proteina NRK-52E għal kull korsija tal-istrixxa tal-blotting u analizzati permezz ta' Western blotting. Antikorpi għal Bcl-2 u caspase-3 inxtraw minn Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA), u dilwiti 1:1000 għall-assaġġ. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) ġie skopert bħala kontroll tat-tagħbija. Livelli relattivi tal-meded tal-proteini ġew ikkwantifikati bl-użu ta 'softwer Quantiscan (Biosoft, Cambridge, ir-Renju Unit).

2.7. Annimali u trattamenti

Ġrieden maskili BALB/c ta 'età ta' 8 ġimgħat u li jiżnu 20-25 g inkisbu minn BioLasco Taiwan (Taipei, Tajwan). L-esperimenti kollha tal-annimali ġew approvati mill-Kumitat tal-Università Medika ta 'Taipei għall-Kura u l-Użu Sperimentali tal-Annimali. L-annimali kienu miżmuma f'faċilità ċentrali, soġġetti għal ċiklu ta' 12-h dawl-dlam, u pprovduti b'chow regolari tal-firien u ilma tal-vit. Il-grupp sperimentali tal-ġrieden (n¼6) għalgentamicintrattament kienu soġġetti għal injezzjoni intraperitoneali (IP) bigentamicin(20 mg/kg/jum) għal 10 ijiem. It-trab ZDW (1 jew 2 g/kg) ġie maħlul fis-salina u ingħata mill-ħalq qabelgentamicininjezzjoni kull darba. Il-ġrieden fil-grupp ta 'kontroll (n¼6) ingħataw salina mill-ħalq u ġol-peritonew. Il-ġrieden kollha ġew anestetizzati bl-użu ta 'pentobarbital 30-50 mg/kg piż tal-ġisem intraperitonealment (Sigma, St. Louis, MO) jum wara l-aħħar injezzjoni tagħhom. L-annimali mbagħad ġew sagrifikati waqt li kienu għadhom taħt l-effett tal-anestesija, u nġabru kampjuni tad-demm mill-qalb għall-kejl tal-krejatinina fis-serum u n-nitroġenu tal-urea tad-demm. Il-kliewiinħasdu permezz ta' laparotomija, u t-tessut tal-kortiċi renali ġie ffriżat snap fin-nitroġenu likwidu u maħżun f'-80C.

2.8. Assaġġ in situ terminali deoxynucleotidyl transferase-mediated biotiniled UTP nick end labeling (TUNEL)

Sezzjonijiet tat-tessut iffriżat (4 μ m) tal-kliewiġew ipproċessati bl-ApopTag Fluorescein in situapoptożikit ta 'skoperta (CHEMICON International, Inc., CA, USA) skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Fil-qosor,kliewislides tat-tessuti ġew ittrattati minn qabel bil-proteinażi K u H₂O₂u inkubat bit-taħlita ta 'reazzjoni li jkun fiha terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) u dUTP konjugat ma' digoxigenin għal siegħa f'{2}}C, immuntat b'soluzzjoni ta 'immuntar li fiha PI, u finalment osservata b'mikroskopija fluworexxenti.

2.9. Analiżi statistiċi

Id-dejta hija ppreżentata bħala mezzi7devjazzjonijiet standard (SDs). Analiżi statistiċi saru bl-użu tat-test t ta' Student, fejn P 0.05 tqieset bħala statistikament sinifikanti.

3. Riżultati

3.1. Influwenza ta 'ZDW fuq il-proliferazzjoni taċ-ċelluli

Għall-kontroll tal-kwalità ta 'ZDW, użajna HPLC biex nistabbilixxu l-kromatogramma tal-marki tas-swaba' kif muri fil-Fig. 1. L-ewwel investigajna l-influwenza ta 'estratti ZDW fuq il-proliferazzjoni taċ-ċelluli NRK-52E. Biex timita l-ambjent gastrointestinali, ZDW ġie diġerit u estratt bl-użu ta 'fluwidu intestinali artifiċjali, u mbagħad applikat f'esperimenti taċ-ċelluli.

Fil-monitoraġġ f'ħin reali tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli, kemm il-kurvi tal-proliferazzjoni kif ukoll l-inklinazzjonijiet wrew li ċ-ċelloli ttrattati bi 30 μ g / ml ta 'ZDW kellhom rati ogħla ta' proliferazzjoni meta mqabbla maċ-ċelloli ta 'kontroll artifiċjali ttrattati bil-fluwidu intestinali (Fig. 2A u B). B'kuntrast, 300 μ g / ml ta 'ZDW naqqsu b'mod sinifikanti r-rati ta' proliferazzjoni. Id-dożaġġ ta' 30 μ g/ml ZDW fih 4 μ g/ml Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 μ g/ml Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., għerq, moħmi, 4 μ g/ml Dioscorea oppositifolia L., 2 μ g/ml Phellodendron amurense Rupr., qoxra, 2 μ g/ml Anemarrhena asphodeloides Bunge, riżoma, 3 μ g/ml Paeonia suffruticose Andrews, qoxra tal-għeruq, 3 μ g/ml Alisma Plantago-Aquatica L., riżoma u 4 μ g/ml Poria cocos (Schw.) Wolf. Madankollu, dawn id-dożaġġi tal-ingredjenti naqqsu l-proliferazzjoni taċ-ċelluli NRK-52E minflok (Fig. 2C).Gentamicininibixxi b'mod sinifikanti t-tkabbir taċ-ċelluli u saħansitra naqqas l-indiċi tan-numru taċ-ċelluli, li rkupra parzjalment bit-trattament bi 3 jew 30 μ g / ml ta 'ZDW kif muri f'Fig. 2A. Dożi għoljin ta 'ZDW (300 μ g/ml) żiedu aktar l-effett inibitorju ta'gentamicindwar il-kapaċità proliferattiva taċ-ċelluli. Ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu li ZDW b'doża baxxa (3–30 g/ml) tippromwovi l-proliferazzjoni taċ-ċelluli NRK-52E, anke fil-preżenza ta'gentamicintrattament.

3.2. Influwenza ta 'ZDW fuq l-apoptożi

Wara evalwajna l-influwenza tal-estratti ZDW fuq il-gentamicin-indottaapoptożif'ċelluli NRK{{0}}E permezz ta' tbajja' ta' annexin V/PI u ċitometrija tal-fluss. Kif muri fil-Fig. 3, estratti ZDW minn 0.3 sa 300 μ g / ml ma indoxxewx sinifikantiapoptożifiċ-ċelloli NRK-52E. Espożizzjoni għal 3 mmol/l ta'gentamicinċelluli apoptotiċi miżjuda b'mod notevoli. It-trattament minn qabel taċ-ċelloli b'ZDW mnaqqas b'mod sinifikantigentamicin-indottaapoptożib'mod dipendenti fuq id-doża, u l-effett inibitorju laħaq il-quċċata ta '30 μ g / ml u naqas fi 300 μ g / ml ta' ZDW (Fig. 3).

L-estratt ZDW ipproteġi ċelluli NRK-52E minngentamicin-indottaapoptożi. Biex nikkonferma dan ir-riżultat, aħna mmonitorjajna wkoll l-influwenza ta 'ZDW fuq il-mogħdija ta' sinjalazzjoni apoptotika indotta minngentamicin. F'ċelloli E normali NRK{{{0}}, konċentrazzjonijiet ZDW minn 0.3 sa 300 μ g/ml ma influwenzawx b'mod sinifikanti l-espressjoni ta' Bcl{-2 u l-qsim ta' caspase-3 (Fig. . 4).Gentamicinit-trattament naqqas b'mod sinifikanti l-espressjoni ta' Bcl-2 u kkawża qsim ta' caspase-3 fiċ-ċelluli NRK-52E. It-trattament minn qabel taċ-ċelloli b'ZDW tejjeb l-espressjoni ta' Bcl-2 ingentamicin-ċelluli trattati, u mnaqqsa b'mod sinifikantigentamicin-indotta caspase-3 qsim (Fig. 4).

3.3. Influwenza tal-ingredjenti ZDW fuq l-apoptożi

Ir-riżultati wrew li l-aktar konċentrazzjoni effettiva ta 'ZDW kienet qrib 30 μ g/ml. Fit-teorija, 30 μ g/ml ZDW fih 4 μ g/ml Cornus officinalis Siebold & Zucc, 8 μ g/ml Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., għerq, moħmi, 4 μ g/ml Dioscorea oppositifolia L., 2 μ g/ml Phellodendron amurense Rupr., qoxra, 2 μ g/ml Anemarrhena asphodeloides Bunge, riżoma, 3 μ g/ml Paeonia suffruticose Andrews, qoxra tal-għeruq, 3 μ g/ml Alisma Plantago-Aquatica L., riżoma u 3 μ g/ml Poria cocos. Madankollu, l-estratti ta' dawn l-ingredjenti fil-konċentrazzjonijiet indikati ma influwenzawx il-proliferazzjoni taċ-ċelloli NRK-52E kif żvelat minn monitoraġġ f'ħin reali tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli (dejta mhux murija). Aħna mmonitorjajna aktar l-ingredjenti ta 'ZDW separatament għall-effetti tagħhom fuq l-espressjoni tal-qsim ta' Bcl-2 u caspase-3gentamicinċelluli NRK-52E ittrattati. Fig. 5 turi li Cornus officinalis Sieb. et Zucc, Rehmannia glutinosa (Gaertn.) DC., għerq, moħmi, Dioscorea oppost, Paeonia suffrutticose Andrews, qoxra tal-għeruq, Alisma Plantago-Aquatica L., riżoma, u Poria cocos ma influwenzawx l-espressjoni ta' Bcl-2 u caspase-3 qsim figentamicin-ċelluli trattati. 0.2 μ g/ml Phellodendron amurense Rupr., qoxra u Anemarrhena asphodeloides Bunge biss, riżoma f'4 u 60 μ g/ml inibixxu t-tnejngentamicin-indotta Bcl-2 tnaqqis u kaspase-3 tiżdied fl-istess ħin (Fig. 5).

Simili għar-riżultati Western blotting, annexin V/PI tbajja wriet li Phellodendron amurense Rupr., Qoxra fi 0.2 μ g/ml u Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma f'4 u 60 μ g/ml inibit b'mod sinifikantigentamicin-indottaapoptożi(Fig. 6). L-ingredjenti veġetali l-oħra ma esprimewx effett antiapoptotiku fuqgentamicin-ċelluli NRK-52E ttrattati kif żvelat minn ċitometrija tal-fluss (dejta mhux murija). ZDW fih 6.9 fil-mija Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma. Id-dożaġġ ta '60 μ g/ml ta' Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma kien ferm fuq il-kwantità li tinsab fi 300 μ g/ml ta 'ZDW, li kienet l-ogħla dożaġġ użat f'dan l-istudju. Id-dożaġġ tal-qoxra Phellodendron amurense Rupr., ta '0.2 μ g/ml kien simili għall-kwantità ta' Phellodendron amurense Rupr., qoxra li tinsab fi 3 μ g/ml ta 'ZDW. Anemarrhena asphodeloides Bunge, dożaġġ ta 'rhizoma ta' 4 μ g / ml kien qrib il-kwantità ta 'Anemarrhena asphodeloides Bunge, riżoma li tinsab fi 30 μ g / ml ta' ZDW. Il-konċentrazzjonijiet ZDW ta 'kemm 3 u 30 μ g / ml kellhom effetti anti-apoptotic sinifikanti (Fig. 2), li jistgħu jirriżultaw parzjalment minn Phellodendron amurense Rupr., Qoxra, u Anemarrhena asphodeloides Bunge, rhizoma.

3.4. Effett protettiv ta 'ZDW fuq il-kliewi

L-effett protettiv ta 'ZDW fuqgentamicin-indottaapoptożiġie ppruvat aktar f'mudell ta' annimali tal-ġrieden. Ġrieden ġew ittrattati bigentamicin(20 mg/kg/jum) jew salina bħala kontrolli; il-gruppi sperimentali ġew ittrattati b'ZDW (1 jew 2 g/kg/jum) barra minn hekk. Fl-aħħar tal-perjodu ta 'trattament (9 ijiem), il-kliewiġew maħsuda permezz ta 'laparotomy u sezzjoni għal analiżi TUNEL in situ. Kif muri fil-Fig. 7, in-nuklei filkliewisezzjonijiet ġew żvelati bħala tikek qawwi mtebbgħin bil-PI. In-nuklei mferrxa u jleqqu mtebbgħin minn TUNEL jistgħu jiġu skoperti fuq il-kortiċi renali kollha ġewwagentamicinannimali ttrattati, iżda rari ġew skoperti fil-kampjuni ta 'kontroll. Trattament ZDW imnaqqasgentamicin-indotta nuklei apoptotiċi b'mod dipendenti fuq id-doża. Ħafna min-nuklei ttikkettjati b'TUNEL dehru fl-epitelju tat-tubuli prossimali. ZDW inibixxi l-in vivogentamicin-ċellula indottaapoptożifil-farċelluli tubulari tal-kliewi. Il-funzjoni renali tal-ġrieden sperimentali ġiet immonitorjata wkoll billi tkejjel il-konċentrazzjoni tan-nitroġenu tal-urea fid-demm u l-krejatinina fis-serum.

Fig. 8 turi li l-konċentrazzjonijiet ta 'nitroġenu urea fid-demm u kreatinina fis-serum kienu elevati fil-gentamicin-gruppi ttrattati, u t-trattament ZDW inibixxihom b'mod sinifikantigentamicin-żidiet indotti. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li ZDW jesprimi effett protettiv renali in vivo.

4. Diskussjoni

F'dan l-istudju, aħna ffukaw fuq l-effett ta 'ZDW fuqgentamicin-indottaapoptożifil-firien prossimaliċelluli tubulari tal-kliewi. Is-sejbiet prinċipali wrew li ZDW (3 u 30 μ g/ml) attenwatgentamicin-ħsara apoptotika indotta fiċ-ċelloli NRK -52E (Fig. 3). It-trattament minn qabel ta 'ZDW inibit ukollgentamicin-indotta sinjali apoptotiċi, inkluż tnaqqis ta 'Bcl-2 u żieda fil-qsim ta' caspase-3 (Fig. 4). F'mudell tal-ġurdien ta'gentamicintossiċità, it-trattament ZDW naqqas b'mod sinifikanti ċ-ċelloli apoptotiċi fil-kortiċi renali u tejbet il-funzjoni renali (Figuri 7 u 8). Ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu li ZDW tipproteġiċelluli tubulari tal-kliewiminngentamicin-indottaapoptożi. Barra minn hekk, sibna wkoll li 30 μ g/ml ZDW ippromwoviet il-proliferazzjoni taċ-ċelluli NRK - 52E (Fig. 2), li jistgħu jikkontribwixxu għall-irkupru tat-tubuli renali minnakutakliewimard. Madankollu, id-doża għolja ZDW (300 μ g / ml) naqqas il-proliferazzjoni taċ-ċelluli u l-effett antiapoptotiku tagħha naqas ukoll (Figuri 2 u 3). Dawn ir-riżultati juru li ZDW f'dożi għoljin huwa ċitotossiku għalċelluli tubulari tal-kliewi. Għalhekk, nissuġġerixxu li l-amministrazzjoni ta 'ZDW f'dożi adegwati tkun ta' benefiċċju għal pazjenti bigentamicin-indottakliewikorriment.

Il-mediċini erbali użati fl-esperimenti taċ-ċelluli ġew diġeriti u estratti bl-użu ta 'fluwidu intestinali artifiċjali li kien fih il-pankreatin. Il-pankreatin huwa magħmul minn amylase, lipase, u protease. Fil-prinċipju, il-molekuli bijoaċċessibbli fil-mediċini erbali jistgħu jinkisbu permezz ta 'estrazzjoni bbażata fil-laboratorju li timita l-ambjent gastrointestinali f'dettalji bħal kimiċi u enzimi preżenti, temperatura, ħinijiet ta' espożizzjoni, u pH. Fis-sistema tagħna,ċelluli tubulari tal-kliewikellhom iċ-ċans li jinteraġixxu mal-molekuli bijoaċċessibbli fil-mediċini erbali, iżda mhux il-materja prima. Il-molekuli bijoaċċessibbli effettivi ta 'ZDW fis-sistema tagħna għadhom mhux magħrufa. Tiskopri assorbiment ta 'ZDW fiċelluli tubulari tal-kliewihuwa diffiċli s'issa minħabba li m'hemm l-ebda mira xierqa biex timmonitorja. Madankollu, l-estratti intestinali artifiċjali ta 'ZDW eżerċitaw effett dipendenti fuq id-doża f'esperimenti ċellulari. Dawn l-esperimenti jissuġġerixxu li l-estratti intestinali artifiċjali ta 'ZDW fihom molekuli bijoaċċessibbli effettivi li jaġixxu fuq ċelloli tubulari tal-kliewi. Min-naħa l-oħra, ZDW orali esprima wkoll effett protettiv tal-kliewi skont id-doża filgentamicinġrieden ittrattati (Figuri 7 u 8). Din id-dejta timplika li l-molekuli effettivi tal-estratti intestinali artifiċjali ta 'ZDW jistgħu jeżistu wkoll fil-kliewital-ġrieden ittrattati bi ZDW. Ir-riżultati tagħna juru konsistenza farmakoloġika bejn l-istudji ċellulari b'estratti intestinali artifiċjali ta 'mediċini erbali u l-istudji fuq l-annimali b'mediċini erbali orali. L-applikazzjoni ta 'fluwidi intestinali artifiċjali fi studji ċellulari hija disponibbli reċentement. Fiċ-ċelloli Caco-2, intużaw fluwidi intestinali artifiċjali biex jinvestigaw il-karatteristiċi ta 'assorbiment ċellulari ta' L -valyl-ara-C (Cheon et al., 2006). Il-bijodisponibilità orali tal-kontaminanti tal-ħamrija ġiet imkejla in vitro bl-użu ta 'fluwidi intestinali artifiċjali (Ellickson et al., 2001). Il-bijoaċċessibbiltà tal-arseniku f'diversi tipi ta 'ross ġiet studjata wkoll bl-użu ta' sistema ta 'fluwidu gastrointestinali in vitro (He et al., 2012). L-estrazzjoni gastrointestinali artifiċjali tat riżultati fi qbil raġonevoli mal-kejl kliniku tal-bijodisponibilità tal-arseniku mkejjel b'analiżi tal-awrina f'bnedmin adulti wara l-inġestjoni ta' mediċina tradizzjonali Ċiniża li fiha l-arseniku (Koch et al., 2007). Barra minn hekk, il-pankreatin fil-fluwidu intestinali artifiċjali se jiġi awtodiġerit u jitlef l-attività enżimatika tiegħu waqt l-inkubazzjoni 37 1C. Il-konċentrazzjoni tal-frixa fl-esperimenti taċ-ċelluli kienet ukoll baxxa ħafna (0.3 30 ppm). L-influwenza tal-frixa fuq il-proliferazzjoni taċ-ċelluli uapoptożihija limitata ħafna. Nissuġġerixxu li l-estrazzjoni artifiċjali tal-fluwidu intestinali hija waħda mill-metodi ta 'estrazzjoni ideali għal mediċini erbali tradizzjonali f'esperimenti ta' kultura taċ-ċelluli.

Fost l-ingredjenti tal-ħxejjex ta 'ZDW, Phellodendron amurense Rupr biss., Qoxra u Anemarrhena asphodeloides Bunge, riżoma inibitgentamicin-indottaapoptożif'konċentrazzjonijiet partikolari (Figuri 5 u 6). Phellodendron amurense Rupr., Qoxra u Anemarrhena asphodeloides Bunge, ir-riżoma għandu jkollu rwol fl-effett protettiv ta 'ZDW fiċ-ċelloli NRK-52E. Phellodendron amurense Rupr., Qoxra fiha numru ta 'alkalojdi bħal berberine, palmatine, u jatrorrhizine. Phellodendron amurense Rupr., il-qoxra hija aġent anti-infjammatorju magħruf (Mori et al., 1995; Uchiyama et al., 1989) u tnaqqas l-istress ossidattiv fil-kliewital-firien dijabetiċi (Kim et al., 2008). Anemarrhena asphodeloides Bunge tintuża ħafna fil-mediċini tradizzjonali Ċiniżi. Ir-riżomi ta 'Anemarrhena asphodeloides Bunge għandhom attivitajiet antidijabetiċi, aggregazzjoni kontra l-plejtlits, u dijuretiċi (Takahashi et al., 1985). Timosaponins iżolati mir-riżomi ta 'Anemarrhena asphodeloides Bunge irażżan l-aggregazzjoni tal-plejtlits u l-ġenerazzjoni ta' superossidu indotta minn AA fin-newtrofili umani (Zhang et al., 1999a, 1999b). Anemarrhena asphodeloides Bunge għandu wkoll rwol protettiv kruċjali f'korriment fil-moħħ ikkaġunat mill-iskemija (Oh et al., 2007). B'kuntrast ma 'ZDW, Phellodendron amurense Rupr., Qoxra, u Anemarrhena asphodeloides Bunge, riżoma esprimew effetti anti-apoptotiċi fuq firxa ta' konċentrazzjoni limitata (Figuri 3 u 6). Barra minn hekk, 30 μ g / ml ZDW promossi l-proliferazzjoni taċ-ċelluli, iżda l-ingredjenti kollha f'30 μ g / ml ZDW naqqsu l-proliferazzjoni taċ-ċelluli minflok (Fig. 2C). Dan ir-riżultat jissuġġerixxi li l-effett li jippromwovi l-proliferazzjoni ta 'ZDW jista' ma jirriżultax mill-ingredjenti tiegħu individwalment. L-effett protettiv ta 'ZDW jista' jirriżulta, għall-inqas parzjalment, minn effetti sinerġistiċi kkawżati mill-ingredjenti jew mill-ġenerazzjoni ta 'molekuli modifikati ffurmati fil-proċessi ta' komposti farmaċewtiċi ta 'ZDW. Tradizzjonalment ħafna prattikanti tal-mediċina Ċiniża jemmnu li formula polyherbal hija ġeneralment aktar effettiva minn mediċina erbali waħda, li hija appoġġjata mir-riżultati tagħna.

F'dan l-istudju, il-gentamicinkonċentrazzjoni applikata fl-esperimenti tal-kultura taċ-ċelluli kienet simili għal studji ppubblikati qabel (Juan et al., 2007).Gentamicinkonċentrazzjonijiet ta' 1–3 mmol/l effettivament indottiapoptożifiċelluli tubulari tal-kliewi, u din il-firxa ta 'konċentrazzjoni hija qrib l-in vivokliewilivelli misjuba matulgentamicintrattamenti antimikrobiċi fil-ġrieden u l-firien (El Mouedden et al., 2000a, 2000b; Sandoval u Molitoris, 2004; Servais et al., 2005). Fi kliem ieħor, il-gentamicinil-konċentrazzjonijiet użati f'dan l-istudju in vitro kienu simili għall-konċentrazzjonijiet misjuba fil-ġriedenkliewiin vivo matulgentamicintrattament. Fl-esperiment tal-ġurdien tagħna,gentamiciningħata f'20 mg/kg intraperitoneally darba kuljum, ugentamicin-indottaapoptożikien osservat fil-ġurdienkliewi(Fig. 7). Dan id-dożaġġ huwa ssuġġerit bħala dożi ta' manteniment ugwali għal pazjent adult bi tneħħija tal-krejatinina stmata ta' 90 ml/min (El Mouedden et al., 2000a). Barra minn hekk, id-dożaġġ protettiv ta 'ZDW kien 1 sa 2 g/kg/jum f'dan l-istudju. Ġurdien huwa 7 sa 8 darbiet inqas effiċjenti metabolikament minn bniedem. Meta wieħed iqis id-differenza bejn ir-rati metaboliċi tal-ġrieden u l-bnedmin, id-dożaġġ ZDW fi studji fuq l-annimali huwa qrib l-applikazzjoni tradizzjonali ta 'ZDW fil-bnedmin. Dawn is-sejbiet jipprovdu l-bażi għal investigazzjonijiet futuri fil-bnedmin.

Is-sinjalar apoptotiku dipendenti fuq Caspase għandu rwol ewlienigentamicin-indottaapoptożi. Fil-mogħdija mitokondrijali, caspase-3 hija caspase executioner li tista' tinqasam għal attiva minn caspase-9 li hija attivata minn procaspase-9 minn ċitokromu ċitosolika ċ (Padanilam, 2003; Jiang u Wang , 2004). Ir-rilaxx mitokondrijali taċ-ċitokromu ċ huwa rregolat mill-proteini tal-familja Bcl-2 li jingħaqdu mal-membrana ta 'barra mitokondrijali u jimblukkaw l-effluss taċ-ċitokromu ċ (Yang et al., 1997). Fl-istudju tagħna,

gentamicinżiedet il-qsim ta' caspase-3 u naqqset l-espressjoni Bcl-2 fiċ-ċelloli NRK-52E. Dawn il-fenomeni apoptotiċi medjati mill-mitokondrija ġew maqluba permezz ta 'trattament ZDW. Ibbażat fuq is-sejbiet ta 'dan l-istudju, aħna ssuġġeriejna li ZDW jipproteġiċelluli tubulari tal-kliewiminngentamicin-indotta korriment apoptotic permezz ta 'inibizzjoni tal-mogħdija mitokondrijali.

5. Konklużjonijiet

Fil-qosor, ZDW f'dożi adegwati ppromwova l-proliferazzjoni taċ-ċelluli u inibitgentamicin-indottaapoptożifil-farċelluli tubulari tal-kliewi. ZDW inaqqas ukollgentamicin-tossiċità renali indotta in vivo. ZDW jista' jkollu potenzjal terapewtiku għal pazjenti b'gentamicin-indottakliewikorriment.

Rikonoxximenti

Dan l-istudju kien sponsorjat mill-Uffiċċju tal-Promozzjoni tas-Saħħa, Dipartiment tas-Saħħa, ROC (DOH98-HP-1106).