Konsum Għoli ta 'Melħ U L-Effetti Tiegħu Fuq Il-Mikrobijoma Naturali tal-Imsaren fil-ġrieden Wildling

1. Introduzzjoni

L-imsaren tal-mammiferi huwa kkolonizzat minn komunità batterjali kumplessa u diversa, li flimkien mal-ospitanti toħloq relazzjoni simbjotika delikata [1,2]. Din il-komunità batterjali teżerċita ħafna funzjonijiet utli għall-ospitanti, inklużi funzjonijiet metaboliċi, immunomodulanti u trofiċi [3-7] u l-kompożizzjoni tal-mikrobijota tal-musrana tista 'tinbidel matul il-ħajja, f'konformità mal-ħtiġijiet speċifiċi u l-fiżjoloġija tal-ospitant [1,8, 9]. Ħafna funzjonijiet ta 'benefiċċju ta' batterji li jippromwovu s-saħħa tal-imsaren huma medjati minn metaboliti derivati ​​mill-fermentazzjoni anerobika [10-13] u kundizzjonijiet diżbijotiċi jistgħu jaffettwaw b'mod sinifikanti s-saħħa tal-ospitanti [2,11,14,15]. It-tħassib dejjem jikber għall-impatt tal-istil tal-ħajja fuq is-saħħa wassal għal interess xjentifiku akbar fl-involviment tal-mikrobijota tal-musrana u l-implikazzjonijiet translazzjonali tiegħu [16,17]. Tabilħaqq, il-mikrobijota tal-musrana hija ffurmata minn fatturi kemm estrinsiċi (eż., stil ta 'ħajja, dieta, u trattamenti mediċi) kif ukoll intrinsiċi (eż., ġenetika ospitanti, regolamenti immuni u metaboliċi) [8,18-20]. Huwa ġeneralment rikonoxxut li elementi estrinsiċi jistgħu jġibu effetti ta 'impatt, bid-dieta bħala wieħed mill-fatturi ewlenin li jikkontribwixxu biex jaffettwaw il-kompożizzjoni u l-funzjoni tal-mikrobijota tal-musrana [1,2,21]. Komponenti tad-dieta tal-Punent, bħal konsum għoli ta 'melħ, huma magħrufa li jweġġgħu l-omeostażi tal-ospitanti billi jaffettwaw is-sistema immuni u jbiddlu l-mikrobijota u l-mard tal-musrana [18,22-37]. Fil-mikrobijota tal-imsaren tal-marieni, dieta b'ħafna melħ (HSD) hija assoċjata mat-tnaqqis ta' batterji li jippromwovu s-saħħa magħrufa notorjament bħala produtturi ta' aċidi grassi ta' katina qasira (SCFA) bħal Lactobacillus spp., Bifidobacterium, Blautia u Faecalibaculum [28, 29,38-41], flimkien ma 'żieda fl-abbundanza ta' Akkermansia, produttur SCFA opportunistiku ieħor li ntwera li jaffettwa l-immunità u l-mard tal-ospitanti f'sistemi ta 'mudell differenti [42,43]. Mudelli ta’ annimali murini huma spiss użati biex jistudjaw kif fatturi tad-dieta jistgħu jsawru l-mikrobijota tal-musrana, is-sistema immunitarja u l-mard [29,44-46]. Għalkemm l-użu ta 'ġrieden tal-laboratorju konvenzjonali (CLM) għadu għażla valida għal ħafna studji, xi drabi jonqos milli jittraduċi b'mod xieraq applikazzjonijiet iffukati fuq il-mikrobijota tal-musrana [47-49]. Pereżempju, ir-riċerka immunoloġika u metabolomika f'mudelli murini ta 'mard infjammatorju tal-musrana (IBD) u obeżità wriet li tbassar ħażin ir-riżultati tat-traduzzjoni ta' studji dwar il-mikrobijota tal-musrana [50]. Dan jista 'jkun minħabba ħafna differenzi inerenti f'dawn is-sistemi tal-mudell, bħall-anatomija, il-ġenetika u l-fiżjoloġija tal-imsaren differenti [16,50]. Madankollu, problema oħra tal-użu tas-CLM għall-istudju tal-interazzjonijiet mikrobijota-immuni hija l-domestikazzjoni tal-kompożizzjoni batterjali tal-imsaren f'CLM, li hija riflessa fit-tnaqqis tal-kumplessità u r-reżiljenza tal-mikrobijota tal-imsaren CLM meta mqabbla mal-ġrieden selvaġġi [51]. Il-ħtieġa għal ambjenti sanitizzati u kkontrollati tiffaċċja preżenza mnaqqsa ta 'patoġeni u parassiti potenzjali, li huwa maħsub li konsegwentement twassal għal sistema immuni inqas "edukata" f'CLM meta mqabbla ma' ġrieden selvaġġi [51–53]. Biex tiġi indirizzata din il-problema, il-mudell tal-murine selvaġġ ġie żviluppat minn C57BL/6 trasferiment tal-embrijuni derivati ​​mill-ġrieden fi ġrieden selvaġġi biex tinkiseb mikrobijota tal-imsaren derivata mill-imsaren, biex tingħeleb il-kwistjoni tat-traduzzjoni ta 'studji tal-mikrobijota immunoloġika-imsaren [54]. Studji reċenti li involvew dan il-mudell tal-ġrieden urew riżultati superjuri fit-tbassir tal-valur translazzjonali ta 'immunoterapiji sperimentali meta mqabbel ma' CLM [54,55]. Barra minn hekk, il-mikrobijota tal-musrana selvaġġa kienet aktar reżistenti u reżistenti għat-trattament tal-antibijotiċi u d-dieta b'ħafna xaħam meta mqabbla ma 'CLM, komparabbli mas-sitwazzjoni aktar kumplessa fil-bnedmin [54,55]. Madankollu, minkejja l-effetti stabbiliti tal-HSD fuq il-mikrobijota tal-musrana, is-sistema immunitarja, u diversi mudelli ta 'mard f'CLM, l-effetti ta' konsum għoli ta 'melħ fuq mikrobijota tal-musrana naturali derivata mill-ambjent naturali mhumiex magħrufa. F'dan l-istudju, aħna evalwajna l-effett ta 'HSD fuq kompożizzjonijiet differenti ta' ekosistema batterjali tal-imsaren u funzjonijiet ta 'tbassir ta' CLM meta mqabbla ma 'ġrieden selvaġġi.

2. Materjali u Metodi

2.1. Annimali u Dieta

Ġrieden C57BL/6 tat-tip selvaġġ (nisa ta '7-8 ġimgħat, n=20) inxtraw minn Charles River u miżmuma fil-faċilità tal-annimali tal-Università ta' Hasselt taħt kundizzjonijiet standardizzati. Ġrieden selvaġġi (C57BL/6 sfond ġenetiku, irġiel n=12 u nisa n=11) [54] kienu miżmuma fil-faċilità tal-annimali ta 'UHasselt taħt kundizzjonijiet standardizzati. Studji fuq l-annimali ġew approvati mill-Kumitat Etiku dwar Esperimenti fuq l-Annimali (ECAE) fl-Università ta’ Hasselt (ID201618A4V1, ID202235). Il-ġrieden kienu miżmuma (4 ġrieden/gaġġa) f'kamra kkontrollata b'temperatura (21-23 ◦C) b'ċiklu ta 'dawl/dawl skur ta' 12:12 h. Id-dieti purifikati li ġejjin inxtraw minn Ssniff (Soest, il-Ġermanja): 0.5% NaCl/dieta ta 'kontroll (E15430-04), u 4% NaCl/HSD (E15431-34). Għall-HSD, l-annimali ġew mitmugħa b'1% NaCl fl-ilma tax-xorb minbarra E15431-34, kif deskritt f'[28]. Il-ġrieden CLM kienu mqassma b'mod ugwali bejn il-grupp ta' kontroll (n=10) u HSD (n=10). Għall-ġrieden selvaġġi, individwi rġiel u nisa kienu wkoll imqassma b'mod ugwali fil-gruppi tad-dieta ta 'kontroll u HSD (6 irġiel għall-kontroll, 6 irġiel għall-HSD, 5 nisa għall-kontroll, u 6 nisa għall-HSD).

sistema immunitarja li żżid il-pjanti cistanche

2.2. Estrazzjoni tad-DNA

L-estrazzjoni tad-DNA mikrobjali saret kif deskritt f'[28], bl-użu ta 'protokoll modifikat tal-QIAmp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, il-Ġermanja). Fil-qosor, gerbub tal-ħmieġ ġew miżjuda ma '2-mL Eppendorf li kien fih 0.5 mm żibeġ tal-ħġieġ u 1.5 mL ta' lysis buffer (ASL) (Qiagen, Hilden, il-Ġermanja). It-taħbit taż-żibeġ intuża biex iwettaq omoġenizzazzjoni mekkanika tal-gerbub. L-estrazzjoni sħiħa twettqet skont il-protokoll tal-manifattur b'modifiki minuri (titwil tal-ħin ta 'inkubazzjoni tal-proteinażi K għal 2 h f'70 ◦C). Il-konċentrazzjonijiet tad-DNA ġew evalwati bl-użu ta 'spettrofotometru NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) u maħżuna f'-20 ◦C qabel l-amplifikazzjoni tal-ġene 16S rRNA.

2.3. Amplifikazzjoni u Sekwenzar tal-Ġene rRNA 16S

Is-sekwenza tal-ġeni 16S rRNA ġiet amplifikata bl-użu ta 'primer speċifiku għar-reġjun V4 (F515/R806), kif deskritt qabel [56]. Fil-qosor, intuża 25 ng ta' DNA għal kull reazzjoni PCR (30 µL) (KAPA HiFi HotStart ReadyMix, Roche, Basel, CH, USA) ta' denaturazzjoni inizjali għal 30 s f'98 ◦C, segwiti minn 25 ċiklu (10 s f'98 ◦ C, 20 s f'55 ◦C, u 20 s f'72 ◦C). Ir-reazzjonijiet saru fi tliet kopji, miġbura flimkien għal kull kampjun, u ppurifikati b'sistema ta 'tindif ibbażata fuq żibeġ manjetiċi (Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Il-preparazzjoni tal-librerija saret permezz ta 'PCR ta' ċiklu limitat biex tinkiseb il-librerija indiċjata bl-użu tat-teknoloġija Nextera (Nextera XT Index Kit, Illumina, San Diego, CA, USA), segwit mit-tieni pass ta 'tindif ta' żibeġ manjetiċi AMPure XP. Kampjuni indiċjati mbagħad ġew normalizzati għall-istess konċentrazzjoni ta '4nM, miġbura, u sekwenzati fuq pjattaforma Illumina MiSeq PE300 bi protokoll ta' 2 × 300 bp paired-end skond il-protokoll tal-kumpanija (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA).

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Ikklikkja hawn biex tara l-prodotti Cistanche Enhance Immunity

【Staqsi għal aktar】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.4. Ipproċessar u Analiżi Statistika ta '16S rRNA Gene Sequencing Data

Is-sekwenzi mhux ipproċessati ġew ipproċessati bl-użu ta' pipeline QIIME 2 [57]. Wara l-iffiltrar tat-tul u l-kwalità (parametri awtomatiċi), il-qari ġew iffiltrati u assenjati lil unitajiet tassonomiċi operattivi (OTUs) bl-użu ta 'DADA2 [58]. L-assenjazzjoni tassonomika twettqet mill-algoritmu VSEARCH (https://github.com/torognes/vsearch; aċċessata fid-9 ta' Novembru 2022) u d-database Silva v128 (https://www.arb-silva.de /; aċċessata fid-9 ta' Novembru 2{{40}}22). It-tabella ASV imbagħad ġiet normalizzata b'rarefazzjoni f'6.147 fond sabiex kull kampjun laħaq il-plateau fl-aħħar tal-kurva tar-rarefazzjoni. Alpha-diversità ġiet evalwata bl-użu ta 'żewġ metriċi differenti: rikkezza OTUs (Osservat), Chao1, Shannon, Simpson, Inverse Simpson (InvSimpson) indiċi ekoloġiċi. Għad-diversità beta, id-dissimilarità ta 'Bray-Curtis, ix-xebh ta' Jaccard, u l-metriċi UniFrac Weighted and Unweighted [59] ġew ikkalkulati u plottjati mill-Analiżi tal-Koordinati Prinċipali (PCoA) biex Ħares id-distanza reali bejn il-kampjuni. Biex tiġi normalizzata t-tabella tal-għadd tal-OTU, ir-rarefazzjoni saret f'fond ta' 6305 sekwenza għal kull kampjun 100 darbiet. L-output miksub mill-assenjazzjoni tat-tassonomija OTU, bħala tabella tassonomija, intuża biex tikkollassa t-tabella OTU normalizzata f'tabelli għal-livelli tassonomija L2 (Phylum), L5 (Familja) u L6 (Ġenus). L-analiżi statistiċi saru bl-użu ta' R (https://www.R-project.org/; aċċessata fil-25 ta' Novembru 2022; Verżjoni 4.2.0). Il-pakkett R "vegan" (Verżjoni 2.6-4) [60] intuża biex jiġġenera metriċi ta' diversità beta biex iqabblu d-differenzi fil-kompożizzjoni tal-gruppi permezz tal-PCoA jew permezz tal-analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA). Il-pakketti u s-separazzjoni tad-dejta ġew ittestjati permezz ta 'test ta' permutazzjoni b'proporzjonijiet psewdo-F (funzjoni "Adonis" fi "vegan"). Is-separazzjoni f'termini ta' diversità beta bejn il-gruppi ġiet ittestjata permezz ta' Analiżi Multivarjata Permutazzjonali ta' Varjazzjoni bl-Użu ta' Matriċi tad-Distanza (PERMANOVA, funzjoni "Adonis" f'"vegan"), filwaqt li d-differenzi għal dispersjoni intra-gruppi ġew ittestjati permezz tat-test ta' dispersjonijiet ta' omoġeneità Multivarjata ta' gruppi (PERMDISP). , funzjoni "betadisper" fi "vegan"). Taxa li ma kinux preżenti f'mill-inqas 4 kampjuni ġew esklużi mill-analiżi. Id-differenzi f'termini ta' abbundenzi relattivi ta' taxa ġew l-ewwel evalwati bit-test preliminari Kruskal-Wallis bejn 4 gruppi u mbagħad evalwati aktar bit-test Wilcoxon bejn il-pari ta' tqabbil li ġejjin: CLM Control vs CLM HSD, wildling Control vs wildling HSD, CLM Control vs. Wildling Control, CLM HSD vs wildling HSD. Għall-evalwazzjoni tad-differenzi tassonomiċi bejn wildling u CLM, id-Daqs tal-Effett tal-Analiżi Diskriminanti Lineari (LEfSe: https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/; aċċessat fil-25 ta’ Novembru 2022) intuża biex jiddistingwi l-karatteristiċi ewlenin fil-livell tal-ġeneru [ 61]. Ir-riżultati LEfSe imbagħad intwerew bħala bar graph, b'limitu ta 'punteġġ ta' Analiżi Diskriminanti Lineari (LDA) ogħla minn 1.0. Kull meta kien meħtieġ, il-valuri p ta 'paraguni multipli ġew aġġustati bil-metodu Benjamini-Hochberg. Rata ta' skoperta falza (FDR) Inqas minn jew ugwali għal 0.05 kienet ikkunsidrata bħala statistikament sinifikanti: * p Inqas minn jew ugwali għal 0.05; ** p Inqas minn jew ugwali għal 0.01; *** p Inqas minn jew ugwali għal 0.001. Id-differenzi funzjonali bejn mikrobijomi ta 'kontenut differenti ta' NaCl fl-ikel (0.5% u 4% kontenut ta 'ikel NaCl) ġew analizzati minn PICRUSt2, pakkett ta' softwer bijoinformatiku biex ibassar kontenut funzjonali ta 'metagenome minn data ta' sekwenzar tal-ġeni rDNA 16s (https://huttenhower.sph. harvard.edu/picrust/; aċċessata fid-29 ta' Novembru 2022; PICRUSt2 2.4.1) [62]. Il-pipeline PICRUSt2 ġie applikat għal sekwenzi rappreżentattivi u t-tabella tal-abbundanza tagħhom minn DADA2 bl-użu ta 'parametri standard (https://github.com/picrust/picrust2/wiki/Full-pipeline-script; aċċessata fid-29 ta' Novembru 2022). Mill-output sħiħ tal-pipeline, tbassir metaġenomika għall-passaġġi KEGG Orthology u MetaCyc inbnew bħala tabelli, b'funzjonijiet ta 'tbassir bħala ringieli u kampjuni bħala kolonni, u użati biex iqabblu l-funzjonijiet tal-mikrobijota tal-musrana f'wildling u CLM fuq reġim HSD. Funzjonijiet ta 'tbassir tal-komunità mikrobjali li kkontribwew l-aktar għall-varjazzjoni bejn wildling u CLM mill-ewwel (PC1), it-tieni (PC2) u t-tielet komponent prinċipali (PC3) ġew magħżula għal aktar analiżi fuq il-konsum HSD fiż-żewġ mudelli. Il-matriċi bl-abbundenzi tal-funzjoni ta 'tbassir ġiet imbagħad normalizzata, trasformata f'valuri ta' Proporzjon ta 'Logg Iċċentrat (CLR), u l-proporzjon log2mean ikkalkulat (HSD/Kontroll) kemm għal wildling kif ukoll CLM. Fl-aħħarnett, il-proporzjonijiet log2mean tqabblu bejn il-gruppi permezz tat-test Wilcoxon u plottjati bħala plott cuneiform. Id-differenzi bejn il-gruppi tqabblu statistikament f'softwer R bl-użu tal-funzjonijiet tat-test Wilcoxon-test u Kruskal-Wallis u valuri p aġġustati bil-metodu Holm jew Benjamini-Hochberg.

3. Riżultati

3.1. L-HSD Jaffettwa d-Diversità u l-Kompożizzjoni ta' CLM u Wildling Gut Microbiota

Biex ninvestigaw l-impatt tal-HSD fuq ekosistema mikrobjali tal-imsaren derivati ​​mill-imsaren fil-ġrieden, tajna HSD jew dieti ta 'kontroll lil ġrieden selvaġġi u CLM. Il-ġrieden inżammu fuq reġimi ta 'dieta għal ġimgħatejn u l-kompożizzjoni tal-mikrobijota tal-musrana tal-ippurgar ġiet sussegwentement investigata permezz ta' sekwenzar tal-ġeni 16S RNA minn gerbub tal-ħmieġ miġbura f'jum 14 (Figura 1A). F'konformità ma 'rapport preċedenti, ma nstabu l-ebda differenzi qawwija f'termini ta' piżijiet tal-ġisem bejn il-gruppi ta 'kontroll u HSD ta' CLM u ġrieden selvaġġi [29]. Biex nevalwaw il-mikrobijota differenti tal-musrana bejn iż-żewġ mudelli CLM u ġrieden selvaġġi fil-linja bażi, aħna stmat id-diversità alfa (Osservat jew Richness, Chao1, Shannon, Simpson, u Inverse Simpson indiċi), id-diversità beta (id-differenza Bray-Curtis), u d-diversità prinċipali. differenzi tassonomiċi. F'konformità ma' studji preċedenti [54], il-mikrobijota tal-musrana selvaġġa kienet ikkaratterizzata minn rikkezza mikrobjali akbar (Figura 1B, l-indiċi tad-diversità alfa kollha), kif ukoll kompożizzjoni mikrobjali distinta u aktar eteroġenja minn CLM (Figura 1C, PERMANOVA p {{9} }.001 & PERMDISP p=0.0009, wildling vs CLM u Figura S1). F'termini ta 'firem mikrobjali, CLM u mikrobijota tal-imsaren tal-ġrieden selvaġġi kienu kkaratterizzati minn taxa batterjali differenti (Figura S1). F'konformità ma' Rosshart et al. [54], taxa batterjali minn ġrieden selvaġġi jappartjenu għal Intestinomonas, Desulfovibrio, Tuzzerella, Oscillobacter, Orodibacter, u l-ġeneru patoġeniku Helicobacter, li kkaratterizza l-profil mhux domestikat derivat mill-ambjent naturali ta 'dan il-mudell (Figura S1).

Figura 1. Impatt tal-HSD fuq il-kompożizzjoni batterjali ta' CLM (n=10/grupp) u ġrieden selvaġġi (n=11 għal Ctrl selvaġġ u n=12 għal HSD selvaġġ). (A) Disinn sperimentali. C57BL/6 CLM jew ġrieden selvaġġi ġew mitmugħa b'0.5% NaCl (kontroll, Ctrl) jew melħ għoli 4% NaCl (HSD) u musrana tal-komunità batterjali tal-musrana kkaratterizzata minn sekwenzar tal-amplicon tal-ġene rRNA 16S. (B) Indiċijiet għad-diversità alfa tal-mikrobijota tal-musrana tal-ippurgar ta 'CLM u wildling; mix-xellug għal-lemin, jintwerew l-indiċi li ġejjin: Osservat (għana OUT), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson (Inverse Simpson). Id-differenzi bejn il-gruppi huma evalwati statistikament bit-test Wilcoxon. (C) Plott tal-analiżi tal-koordinati prinċipali tal-ordinazzjoni tad-diversità beta mill-metrika tad-differenza Bray-Curtis bejn CLM vs wildling (fuq), kontroll CLM vs CLM HSD (qiegħ xellug), u kontroll wildling vs wildling HSD (lemin ta 'isfel); separazzjoni u omoġeneità bejn il-gruppi ġew ikkalkolati bit-testijiet PERMANOVA u PERMDISP rispettivament. * p Inqas minn jew ugwali għal 0.05; ** p Inqas minn jew ugwali għal 0.01; **** p Inqas minn jew ugwali għal 0.0001. Figura 1. Impatt tal-HSD fuq il-kompożizzjoni batterjali ta' CLM (n=10/grupp) u ġrieden selvaġġi (n=11 għal Ctrl selvaġġ u n=12 għal HSD selvaġġ). (A) Disinn sperimentali. C57BL/6 CLM jew ġrieden wildling ġew mitmugħa b'0.5% NaCl (kontroll, Ctrl) jew melħ għoli 4% NaCl (HSD) u musrana tal-komunità batterjali tal-musrana kkaratterizzata minn sekwenzar tal-amplicon tal-ġene 16S rRNA. (B) Indiċijiet għad-diversità alfa tal-mikrobijota tal-musrana tal-ippurgar ta 'CLM u wildling; mix-xellug għal-lemin, jintwerew l-indiċi li ġejjin: Osservat (għana OUT), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson (Inverse Simpson). Id-differenzi bejn il-gruppi huma evalwati statistikament bit-test Wilcoxon. (C) Plott tal-analiżi tal-koordinati prinċipali tal-ordinazzjoni tad-diversità beta mill-metrika tad-differenza Bray-Curtis bejn CLM vs wildling (fuq), kontroll CLM vs CLM HSD (qiegħ xellug), u kontroll wildling vs wildling HSD (lemin ta 'isfel); separazzjoni u omoġeneità bejn il-gruppi ġew ikkalkolati bit-testijiet PERMANOVA u PERMDISP rispettivament. * p Inqas minn jew ugwali għal 0.05; ** p Inqas minn jew ugwali għal 0.01; **** p Inqas minn jew ugwali għal 0.0001.

L-HSD wassal għal tnaqqis sinifikanti fid-diversità batterjali (Figura 1B, l-indiċi tad-diversità alfa kollha) kif ukoll bidla mikrobjali sinifikanti fil-kompożizzjoni tas-CLM (Figura 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0 .1, CLM Ctrl vs CLM HSD). B'kuntrast, il-mikrobijota tal-imsaren tal-ġrieden selvaġġi kienet ikkaratterizzata minn diversità ogħla fuq HSD (Figura 1B, Indiċi Osservati u Chao1), b'mod diverġenti minn CLM, u kienu wkoll ikkaratterizzati minn bidla fil-kompożizzjoni mikrobjali inqas evidenti fuq HSD meta mqabbla ma 'CLM (Figura 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0.5, wildling Ctrl vs wildling HSD).

3.2. Il-Kompożizzjoni Mikrobika tal-Imsaren tal-Ġrieden Wildling Hija Aktar Reżistenti għall-HSD milli CLM

Id-differenzi fil-kompożizzjoni batterjali bejn wildling u CLM ġew ikkaratterizzati aktar tassonomikament. Fil-livell tal-phylum, l-aktar phyla abbundanti f'termini ta 'abbundanza relattiva kienu: Firmicutes (CLM: 52 ± 12%, wildling: 32 ± 34%), Bacteroidota (CLM: 24 ± 23%, wildling: 57 ± 19%), Actinobacteriota (CLM: 1{{10}} ± 7%, wildling: 0.7 ± 1.3%) u Verrucomicrobiota (CLM: 24 ± 23%, wildling: 0%/mhux misjuba) (Figura 2). Il-profil mikrobjali tal-imsaren wera abbundenzi differenti ulterjuri għall-phyla kollha misjuba f'kampjuni tal-ħmieġ bejn ġrieden selvaġġi u CLM (Figura 2). B'mod partikolari, il-phyla tal-mikrobijota tal-qalba Firmicutes, Bacteroidota u Verrucomicrobiota kienu differenti b'mod sinifikanti bejn iż-żewġ mudelli (Figura 2). B'mod aktar speċifiku, fil-livell tal-familja, ġie osservat kontribut differenti fil-mikrobijota tal-musrana selvaġġa vs CLM għal ħafna mill-batterji rrappurtati qabel bħala sensittivi għall-HSD [28], inklużi Lactobacillaceae, Clostridiaceae, Peptostreptococcaceae, u Akkermansiaceae (Figura 3). F'konformità ma' dan, xejriet simili ġew ikkonfermati fil-livell tal-ġeneru bejn kampjuni selvaġġi u CLM għall-membri ewlenin tal-familji msemmija qabel; fost dawn, l-aktar rappreżentattivi kienu Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, Faecalibaculum u Akkermansia (Figuri S1 u 4). Biex nikkaratterizzaw aktar l-impatt ta 'HSD fuq CLM u kompożizzjonijiet tal-mikrobijota tal-musrana selvaġġa, analizzajna wkoll l-impatt tar-reġim tad-dieta f'livelli ta' klassifikazzjoni differenti. Fil-livell tal-phylum, il-mikrobijota tal-imsaren CLM ittrattata b'HSD kienet ikkaratterizzata minn tnaqqis sinifikanti ta 'Firmicutes u arrikkiment ta' Verrucomicrobiota (Figura 2), iżda l-ebda wieħed mill-phyla maġġuri ma kien affettwat minn HSD f'kampjuni wildling (Figura 2). Fil-livell tal-familja, il-mikrobijota tal-musrana CLM kienet ikkaratterizzata minn tnaqqis sinifikanti ta 'batterji li jipproduċu l-aċidu lattiku bħal Lactobacillaceae, kif ukoll produtturi SCFA bħal Peptostreptococcaceae u Clostridiaceae (Figura 3). Barra minn hekk, f'CLM mitmugħa bl-HSD, osservajna żidiet f'Akkermansiaceae, Sutterellaceae, Defluvitaleaceae u Eggerthellaceae (Figura 3). B'kuntrast, HSD affettwa familji batterjali differenti fil-mikrobijota tal-musrana selvaġġa, fosthom iż-żewġ Muribaculaceae u Prevotellaceae abbundanti ħafna, li t-tnejn żdiedu mal-HSD (Figura 3). Il-modulazzjoni batterika li l-aktar ikkontribwiet għall-effett HSD f'CLM inkludiet iż-żieda tal-ġeneri Akkermansia, Parasutterella, u Enterorhabdus, kif ukoll it-tnaqqis ta 'Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, (Eubacterium) oxidoreducens group, Muribaculum u Anaerovorax (Figura 4). Ħlief għal Roseburia, l-ebda wieħed mill-ġeneri msemmija qabel ma kien affettwat minn HSD fil-mikrobijota tal-musrana selvaġġa, filwaqt li l-ġeneru Anaerovorax wera tendenza opposta minn dik ta 'CLM (Figura 4).

Figura 2. Effett tal-HSD fuq phyla batterjali mill-mikrobijota tal-musrana ta' CLM (n=10/grupp) u ġrieden selvaġġi (n=11 għal Ctrl selvaġġ u n=12 għal HSD selvaġġ). Il-kompożizzjoni totali f'termini ta' abbundanza relattiva ta' phyla tintwera permezz ta' bar plot għal kull individwu (fuq) u boxplot għal phyla speċifiċi (qiegħ); twettqu paraguni statistiċi bejn il-gruppi permezz tat-test Wilcoxon. * p Inqas minn jew ugwali għal 0.05; ** p Inqas minn jew ugwali għal {{10}}.01; *** p Inqas minn jew ugwali għal 0.001; **** p Inqas minn jew ugwali għal 0.0001.

Figura 3. Impatt tal-konsum tal-ikel b'ħafna melħ fuq familji batterjali ta' CLM (n=10/grupp) u ġrieden selvaġġi (n=11 għal Ctrl selvaġġ u n=12 għal HSD selvaġġ). Il-kompożizzjoni totali fil-livell tal-familja hija rappreżentata minn bar plot għal kull individwu (fuq) u boxplot għal familji speċifiċi (qiegħ); twettqu paraguni statistiċi bejn il-gruppi permezz tat-test Wilcoxon. * p Inqas minn jew ugwali għal 0.05; ** p Inqas minn jew ugwali għal {{10}}.01; *** p Inqas minn jew ugwali għal 0.001; **** p Inqas minn jew ugwali għal 0.0001.

Figura 4. Bidliet fil-ġeneri batterjali f'CLM (n=10/grupp) u ġrieden selvaġġi (n=11 għal Ctrl selvaġġ u n=12 għal HSD selvaġġ). Il-kontribuzzjoni ġenerali tal-abbundanza relattiva fil-livell tal-ġeneru hija plottjata bħala plott ċirkolari tal-bar għal kull individwu (fuq) u boxplot għal ġeneri speċifiċi (qiegħ); twettqu paraguni statistiċi bejn il-gruppi permezz tat-test Wilcoxon. * p Inqas minn jew ugwali għal 0.05; ** p Inqas minn jew ugwali għal 0.01; *** p Inqas minn jew ugwali għal 0.001; **** p Inqas minn jew ugwali għal 0.0001.

3.3. L-HSD Jaffettwa Funzjonijiet Mikrobiċi Predittivi f'CLM iżda Mhux fil-Ġrieden Wildling

L-output ta’ PICRUSt 2 ma skopra l-ebda differenza sinifikanti bejn il-funzjonijiet tal-komunità mikrobjali ta’ HSD selvaġġ vs ġrieden selvaġġi mhux ittrattati kemm għall-annotazzjonijiet tal-passaġġi KEGG Orthology kif ukoll MetaCyc, bl-unika eċċezzjoni ta’ funzjoni miżjuda indotta minn HSD fuq il-ġene recG għal helicase dipendenti fuq ATP minn l-Ortoloġija KEGG (Figura 5A). L-impatt tal-HSD fuq CLM kien ikkaratterizzat minn tnaqqis sinifikanti tal-funzjonijiet ta’ tbassir għall-KEGG Orthology, fosthom il-ġene spp (sucrose-6-phosphatase) u pfkA (phosphofructokinase 1), it-tnejn involuti fil-metaboliżmu tal-lamtu u tas-sukrożju, li huwa konformi. b'sejbiet preċedenti [28] (Figura 5A). Barra minn hekk, il-mikrobijota tal-musrana ta 'CLM mitmugħa bl-HSD kienet ikkaratterizzata minn tnaqqis fil-funzjonijiet ta' tbassir tal-ġeni involuti fit-trasport tal-membrana (feoB għat-trasport tal-ħadid, proteina AB 2P AB 2 permease, proteina li torbot AB 2A AB 2 ATP), bijosintesi tal-glutamina (glnA) , Regolatur tat-traskrizzjoni tal-familja LacI (lacI, galR) u transketolase (tktA, tktB) (Figura 5A). Għall-mogħdijiet MetaCyc, HSD arrikkit b'mod sinifikanti l-mikrobijota tal-musrana CLM ta 'funzjonijiet ta' tbassir assoċjati ma 'tnaqqis tan-nitrat (mogħdija ta' denitrifikazzjoni), degradazzjoni tal-galactose (degradazzjoni D-galactarate, super mogħdija ta 'degradazzjoni D-glucarate u D-galactarate), degradazzjoni tal-fenil-propanoat, xaħmija salvataġġ tal-aċidu, degradazzjoni tas-succinat għal aċidu butanoic u degradazzjoni tal-aċidu amminiku (degradazzjoni tal-amini aromatiċi, degradazzjoni tal-L-leucine) (Figura 5B). Barra minn hekk, f'konformità ma 'sejbiet preċedenti [28], il-mikrobijota tal-musrana HSD f'CLM tilfet il-funzjonijiet ta' tbassir għall-bijosintesi tal-aċidu ammino (mogħdija super tal-bijosintesi tal-L-alanine, bijosintesi tal-L-lysine), fermentazzjoni tal-aċidu mħallat, b'firma ġdida addizzjonali mitlufa bħal N- acetylglucosamine/N-acetyl-mannosamine/N-acetylneuraminate degradazzjoni u deoxyribonucleosides degradazzjoni (pyrimidine u purine degradazzjoni, inosine5phosphate biosintesi III) (Figura 5B).

Figura 5. Kont.

Figura 5. Effett tal-HSD fuq il-funzjonijiet metaġenomika ta' tbassir tal-musrana f'mikrobijota tal-musrana CLM (n=10/grupp) u wildling (n=11 għal wildling Ctrl u n=12 għal wildling HSD). Output PICRUSt2 imfassal bħala plott cuneiform għall-annotazzjoni KEGG Orthology (A) u mogħdijiet MetaCyc (B) espress bħala log2 proporzjon medju tal-għadd tal-funzjonijiet ta 'tbassir bejn kampjuni HSD vs Ctrl. Il-paraguni statistiċi kollha saru bejn il-gruppi Ctrl vs HSD permezz tat-test Wilcoxon.

4. Diskussjoni

Il-mikrobijota tal-musrana selvaġġa kumplessa u diversa hija magħrufa li hija aktar reżistenti għal ċerti mudelli ta 'mard [51] u reġimi tad-dieta, bħal konsum għoli ta' xaħam [54,55]. Madankollu, l-ebda studju preċedenti ma evalwa l-effetti ta 'konsum għoli ta' sodju fuq mikrobijota tal-musrana mnissla mill-annimali selvaġġi. Hawnhekk, investigajna għall-ewwel darba kif l-HSD taffettwa l-mikrobijota tal-musrana selvaġġa meta mqabbla ma 'CLM. Interessanti, ir-riżultati tagħna wrew li meta mqabbel ma 'CLM, il-mikrobijoma selvaġġ huwa aktar reżistenti għad-disturb tal-HSD kemm f'livelli funzjonali ta' kompożizzjoni kif ukoll ta 'tbassir. Huwa stabbilit sew li konsum għoli ta 'melħ jista' jaggrava r-riskju ta 'diversi mard, bħal mard kardjovaskulari jew awtoimmuni, billi jbiddel il-kompożizzjoni tal-mikrobijoma tal-musrana u l-omeostasi immuni [25,29,31,34,63-65]. F'konformità mar-rapporti preċedenti, bidliet indotti mill-HSD fil-mikrobijota tal-musrana f'CLM kienu kkaratterizzati minn alterazzjonijiet sinifikanti fid-diversità tal-mikrobi, il-kompożizzjoni u l-funzjonijiet ta 'tbassir [28]. Il-batterji li jippromwovu s-saħħa bħall-familja Peptostreptococcaceae u l-ġeneri Lactobacillus, Roseburia u Tuzzerella naqsu f'termini ta 'abbundanza relattiva f'CLM, filwaqt li Akkermansia żdiedet b'mod sinifikanti fil-gruppi HSDfed. Aħna skoprejna wkoll abbundenzi relattivi ogħla ta 'HSD f'Defluvitaleaceae, Enterorhabdus, u Parasutterella. Interessanti, il-ġeneru Parasutterella huwa komponent ewlieni tal-mikrobijota tal-musrana kemm ta 'CLM kif ukoll tal-bnedmin, fejn iġib ruħu bħala asaccharolytic u produttur ta' succinate [66]. Kemm Enterorhabdus mill-familja Eggerthellaceae kif ukoll Parasutterella mill-familja Sutterellaceae huma magħrufa li huma arrikkit f'pazjenti b'IBD [67,68], u jindikaw aktar kif HSD jista 'jaffettwa l-iżvilupp tal-marda. Madankollu, interessanti, ġrieden selvaġġi ma wrewx entità simili ta 'ċaqliq mikrobjali indotti mill-HSD, bħal CLM. Minkejja dan, id-diversità selvaġġa żdiedet b'mod sinifikanti fuq HSD għal metriċi OTUs u Chao1 osservati, u ftit taxa biss kienu involuti fid-disturb HSD tal-mikrobijota tal-musrana selvaġġa, fosthom żieda ta 'Anaerovorax, flimkien ma' tnaqqis ta 'Erysipelatoclostridium, Roseburia u Lachnospiraceae. ġeneru UCG-004. Roseburia kienet l-unika firma batterika komunement kondiviża bejn il-gruppi HSD meta mqabbla mal-kontrolli korrispondenti, minkejja li CLM mitmugħa b'HSD għadu kkaratterizzat minn abbundanza ogħla ta 'din il-batterja meta mqabbel ma' ġrieden selvaġġi mitmugħa bl-HSD. Ta 'min jinnota, batterji li jipproduċu butirrat bħal Roseburia intwerew li għandhom abbundanza relattiva aktar baxxa f'pazjenti b'kolite ulċerattiva [69] u dan it-tnaqqis kien osservat ukoll li kien korrelatat mar-riskju ġenetiku IBD ta' suġġetti umani [70]. Dan huwa konformi ma’ sejbiet preċedenti, fejn bidliet fil-ġeneri batterjali bħal Roseburia jew Lactobacillus instabu li huma assoċjati ma’ riskju ta’ pressjoni għolja, possibbilment promossa minn dieta tal-Punent [71]. Il-kompożizzjoni batterjali tal-imsaren hija assoċjata wkoll mal-motilità u l-fiżjoloġija tal-imsaren [72].

benefiċċji cistanche għall-irġiel isaħħu s-sistema immuni

Il-ġeneru Anaerovorax kien osservat qabel fi ġrieden b'fiżjoloġija tal-imsaren anormali u motilità mnaqqsa [73]; madankollu, l-arrikkiment ta 'Anaerovorax fl-HSD għall-ġrieden selvaġġi jista' jwassal għal rwol differenti ta 'din it-taxa fil-kuntest tal-omeostażi tal-musrana u l-funzjoni xierqa. F'konformità mas-sejbiet preċedenti, osservajna żieda fil-ġeneru Akkermansia fil-grupp HSD ta 'CLM [28], filwaqt li l-mikrobijota tal-musrana tal-ġrieden selvaġġi kienet eżawrita minn dan il-ġeneru, li hija wkoll konsistenti ma' studji preċedenti fuq dan il-mudell [51, 53–55]. Għalkemm il-ġeneru Akkermansia huwa probijotiku potenzjali minħabba l-effett pożittiv tiegħu fuq it-titjib tal-profili immunoloġiċi u metaboliċi tal-ospitanti (eż. fl-obeżità u d-dijabete tat-tip 2) [42,74-77], ir-rwol ta 'dan il-ġeneru għadu mhux ċar minħabba n-negattiv tiegħu. korrelazzjoni mar-riżultati kliniċi fil-kanċer tal-kolorektum [78], il-marda ta 'Parkinson [79,80] u pazjenti bi sklerożi multipla [81]. B'mod konsistenti mar-riżultati preċedenti tagħna miksuba bil-mogħdijiet MetaCyc [28], CLM fuq HSD wera tnaqqis fil-funzjonijiet mikrobjali ta 'tbassir assoċjati mal-metaboliżmu tal-lamtu u tas-sukrożju għall-ortoloġija KEGG. Madankollu, il-bidliet minuri fil-kompożizzjoni batterjali tal-imsaren tal-ġrieden selvaġġi mitmugħa bl-HSD naqsu milli jinduċu xi varjazzjonijiet sinifikanti fil-funzjonijiet batterjali ta’ tbassir, li jindika li mikrobijota tal-imsaren derivata mill-imsaren u netwerks metaboliċi/ekoloġiċi huma ħafna aktar stabbli u jistgħu jadattaw ħafna aktar faċilment għal Varjazzjonijiet fid-dieta indotti mill-HSD meta mqabbla mal-ekosistemi tal-imsaren CLM, li jiġġustifika aktar investigazzjoni. Ta 'min isemmi wkoll hija l-influwenza possibbli tal-komunità fungali tal-musrana fuq in-netwerk tal-batterji tal-imsaren fuq reġimi ta' dieta differenzjali. Studji preċedenti diġà ssuġġerew kif l-interazzjonijiet potenzjali bejn il-batterji u l-fungi huma implikati fl-omeostasi tas-sistema immuni ospitanti u l-iżvilupp tal-mard [82-85]. F'dan il-kuntest, CLM huwa limitat aktar mill-kumplessità batterjali aktar baxxa tagħhom meta mqabbla ma 'ġrieden selvaġġi, li jistgħu jfixklu l-istabbiliment ta' mikobijota tal-musrana diversa [54]. Studji futuri se jkunu jistgħu jiddeterminaw il-kontribut tal-komunitajiet fungali tal-musrana f'ambjenti ta 'mikrobijota tal-musrana u l-immunità tal-ospiti bl-użu tal-mudell wildling. Fil-qosor, l-istudju tagħna jipprovdi dejta dwar kif konsum għoli ta 'sodju jaffettwa ekosistema mikrobjali tal-musrana naturali derivata mill-imsaren meta mqabbla ma' komunità batterjali tal-musrana domestikata ta 'CLM. L-istudju tagħna wera li l-HSD ma taffettwax it-taxa batterjali u l-mikrobijota tal-musrana fil-ġrieden selvaġġi bl-istess mod kif tagħmel għal mikrobijota tal-musrana domestikata minn CLM. Din id-diverġenza, kif iddikjarat qabel għal reġimi jew kundizzjonijiet tad-dieta oħra bħal dieti b'ħafna xaħam [54,55], tindika li r-riċerka futura hija meħtieġa f'sistemi ta 'mudelli murini naturali biex tirrikapitola u jiġi stmat l-impatt ta' interventi tad-dieta fuq ekosistemi tal-imsaren aktar kumplessi, bħal fil-bnedmin.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni