Spettrometrija tal-Massa Tandem b'Riżoluzzjoni Għolja Tidentifika Disinn Partikolari ta' Ganglioside f'Mard Bikrija tal-Kliewi Dijabetiċi Ta' Pazjenti b'Dijabete Mellitus tat-Tip 2

Astratt:

Meta wieħed iqis l-informazzjoni siewja pprovduta mill-glycosphingolipidi bħalamarkaturi molekulariu d-dejta limitata disponibbli għall-iskoperta u l-karatterizzazzjoni tagħhom f'pazjenti li jbatu minnMard dijabetiku tal-kliewi tat-Tip 2(DKD), żviluppajna u implimentajna metodu superjuri bbażat fuq spettrometrija tal-massa b'riżoluzzjoni għolja (HR) u tandem MS (MS/MS) għad-determinazzjoni ta' gangliosides fl-awrina ta'Pazjenti DKD. Dan l-istudju kien iffukat fuq: (i) l-ittestjar tal-fattibilità u l-prestazzjonijiet tal-HR MS u MS/MS fl-immappjar usekwenzar ta 'gangliosides renali f'Tip 2 DMpazjenti; (ii) determinazzjoni tal-bidliet fil-ganglioside ta' l-awrina ta' DKDpazjenti fistadji differenti tal-marda-normo-, mikro-, u makroalbuminurja-f'assaġġ komparattiv b'kontrolli b'saħħithom. Minħabba r-riżoluzzjoni għolja u l-eżattezza tal-massa, l-iskrining komparattiv tal-MS wera li l-istatus ta 'sialylation tal-komponenti tal-ganglioside; il-modifika tagħhom b'O-acetyl, CH3COO−, O-fucosyl, u O-GalNAc; kif ukoll il-kompożizzjoni taċ-ċeramide jirrappreżentaw markaturi possibbli għal skoperta bikrija ta 'DKD, il-valutazzjoni tal-progressjoni tal-marda, u trattament ta' segwitu. Barra minn hekk, investigazzjoni strutturali minn MS/MS wriet li GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) u GT1b(d18:1/18:{{ 23}}) l-isomeri huma assoċjati mal-makroalbuminurja, li jistħoqqilhom aktar investigazzjoni fir-rigward tar-rwol tagħhom fid-DKD.

Kliem ewlieni: nanoelettrospray; spettrometrija tal-massa tandem b'riżoluzzjoni għolja; screening; analiżi tal-frammentazzjoni; mard tal-kliewi dijabetiku; bijomarkaturi tal-ganglioside

1. Introduzzjoni

Id-dijabete mellitus tat-Tip 2 (DM) tibqa’ sfida terapewtika bi prevalenza globali dejjem tiżdied, minkejja l-avvanzi xjentifiċi fil-qasam. Assoċjat ma 'ħsara makrovaskulari u mikrovaskulari devastanti fit-tul, it-Tip 2 DM iwassal għal żieda fil-mortalità. Mard dijabetiku tal-kliewi (DKD) huwa l-aktar kawża komuni ta 'mard tal-kliewi fl-aħħar stadju (ESRD) fil-pajjiżi żviluppati u li qed jiżviluppaw [1,2]. Għalhekk, l-iskoperta bikrija ta 'DKD u l-immaniġġjar ottimali ta' Tip 2 DM huma kruċjali sabiex jitnaqqsu l-kumplikazzjonijiet, il-morbidità u l-mortalità. Bħalissa, id-dijanjosi u l-progressjoni tad-DKD jiddependu fuq il-kejl tal-albuminurja u t-tnaqqis kostanti fir-rata ta 'filtrazzjoni glomerulari (eGFR), iż-żewġ parametri li juru tbassir modest ta' status renali futur. L-istorja naturali ta 'DKD tinkludi diversi stadji kliniċi, inklużi dawn li ġejjin: iperfiltrazzjoni glomerulari bikrija, l-okkorrenza ta' mikroalbuminurja jew makroalbuminurja, tnaqqis fir-rata ta 'filtrazzjoni glomerulari, u ESRD. Madankollu, riċerka reċenti tqis l-albuminurja bħala markatur ta 'kundizzjoni li qed tiddeterjora [3].

Fl-aħħar għaxar snin, intwera interess partikolari fil-kunċett subtelocentric, li skontu t-tubuli prossimali u l-kompartiment tubulointerstizjali jista 'jkollhom rwol essenzjali fil-bidu u l-progressjoni tad-DKD [4-6]. F'dan il-kuntest, l-iżvilupp ta 'bijomarkaturi glikomiċi pronjostiċi u ta' tbassir qed jikseb attenzjoni dejjem akbar u sar il-fokus ta 'ħafna gruppi ta' riċerka matul is-snin [7-11].

Gangliosides jirrappreżentaw klassi partikolari ta 'glycosphingolipidi bi struttura kumplessa identifikata fit-tessuti u l-fluwidi tal-ġisem kollha u partikolarment abbundanti fis-sistema nervuża ċentrali (CNS) [12]. Bħala kostitwenti essenzjali tal-membrani bi saffi taċ-ċelluli newronali, il-gangliosides għandhom rwol vitali fl-iżvilupp, il-maturazzjoni u t-tixjiħ tal-moħħ, li jimmedjaw l-adeżjoni taċ-ċelluli, attivazzjoni, proliferazzjoni, motilità u tkabbir. Gangliosides jikkonsistu f'ċeramide ta 'kompożizzjoni differenti fir-rigward tal-bażi sphingoid, residwi ta' aċidu xaħmi msejsa fis-saff ta 'barra tal-membrana u katina ta' oligosakkaridi sijalilati li tkopri l-membrana u li jipparteċipaw f'interazzjonijiet speċifiċi u essenzjali ma 'molekuli oħra fl-ambjent tal-madwar. Permezz ta 'fatturat normali tal-wiċċ taċ-ċellula, magħruf bħala "twaqqigħ tal-wiċċ taċ-ċelluli", il-gangliosides huma rilaxxati, sa ċertu punt, fl-ispazju interċellulari.

Minħabba li l-espressjoni, id-distribuzzjoni u l-istruttura tal-gangliosidi huma magħrufa li huma speċifiċi għat-tip taċ-ċelluli u tat-tessuti u li jvarjaw matul l-iżvilupp tat-tessuti, il-maturazzjoni, it-tixjiħ, u fuq kollox, fi stati patoloġiċi [12], il-gangliosidi huma kkunsidrati fost l-aktar siewja. Markers dijanjostiċi u aġenti terapewtiċi prospettivi.

Diversi metodi li jużaw frammenti ta’ bijopsija tas-serum jew tal-kliewi ġew applikati għall-identifikazzjoni tal-ganglioside renali f’pazjenti b’DM tat-Tip 2, bħal immunostaining ta’ saff irqiq [7,8], kromatografija ta’ saff irqiq ta’ prestazzjoni għolja (HPTLC) [9], spettrofotometrija [10 ], u spettrometrija tal-massa (MS) [11].

Fid-dawl tal-informazzjoni siewja li tista 'tiġi pprovduta mill-gangliosides bħala markaturi molekulari tat-tessut newronali [12] u d-dejta limitata disponibbli s'issa fl-iskoperta u l-karatterizzazzjoni tal-glikosfingolipidi fl-awrina ta' pazjenti DKD, żviluppajna u implimentajna metodu superjuri bbażat fuq nanoelectrospray (nanoESI) MS b'riżoluzzjoni għolja (HR) għad-determinazzjoni ta 'gangliosides fl-awrina ta' pazjenti DM. Din l-għażla għall-HR MS kienet iggwidata mill-vantaġġi offruti minn dan il-metodu fl-analiżi tat-taħlitiet kumplessi ta 'gangliosides estratti mill-awrina umana. Il-qawwa ta 'riżoluzzjoni elevata ta' l-istrument: (i) tippermetti l-iskoperta ta 'jonji ta' valuri m/z mill-qrib, li inkella ma setgħux jiġu diskriminati f'kampjun eteroġenju b'ħafna komponenti li jkun fih speċi ta 'tulijiet u arkitetturi varji tal-katina glycan u kompożizzjonijiet differenti tal- ċeramide; (ii) bażikament telimina l-ħtieġa għas-separazzjoni tat-taħlita jew permezz ta' metodi kromatografiċi likwidi jew elettroforetiċi qabel l-analiżi MS; (iii) jipprovdi preċiżjoni għolja tal-massa, li żżid ħafna l-affidabbiltà tal-identifikazzjoni strutturali; u (iv) joffri mhux biss ħarsa aħjar dwar il-kumplessità tal-gangliosidome assoċjat mad-DM iżda wkoll dejta dwar l-ispeċi b'rwol potenzjali ta 'bijomarkatur ibbażat fuq il-kunfidenza għolja fid-determinazzjoni tal-massa kemm għall-joni molekulari kif ukoll għal framment.

Dan l-istudju pilota, bil-għan li jikkaratterizza l-gangliosides tal-awrina bi rwoli ta’ bijomarkatur fil-dijanjosi bikrija ta' DKD, kien iffukat fuq: (a) l-ittestjar tal-fattibilità u l-prestazzjoni ta 'HR MS u tandem MS (MS/MS) permezz ta' dissoċjazzjoni indotta minn ħabta ta 'enerġija għolja (HCD) fl-immappjar ta' gangliosides renali f'pazjenti DM tat-Tip 2; (b) determinazzjoni tal-bidliet fl-espressjoni ta 'taħlitiet ta' ganglioside indiġeni mill-kampjuni tal-awrina ta 'pazjenti DM tat-Tip 2 f'assaġġ komparattiv b'kontrolli b'saħħithom u karatterizzazzjoni tal-bijomarkaturi skoperti. Għal dan il-għan, aħna ottimizzajna pjattaforma bijoanalitika moderna bbażata fuq nanoESI HR MS fuq strument Orbitrap sintonizzat għal tħaddim f'modalità ta 'jone negattiv kemm fl-iskrinjar MS kif ukoll fil-frammentazzjoni MS / MS għal analiżi strutturali dettaljata.

2. Riżultati u Diskussjonijiet

2.1. Skrinjar Komparattiv tal-Kampjuni minn nanoESI HR MS

Il-kampjuni tal-ganglioside A1, A2, A3, u C ġew infużi minn nanoESI wieħed wara l-ieħor f'Orbitrap MS u skrinjati f'modalità ta 'jone negattiv taħt kundizzjonijiet strumentali identiċi. F'kull każ, is-sinjal tal-kurrent tal-joni totali (TIC) ġie akkwistat għal 2 min, u jiġġenera spettri mill-akkumulazzjoni ta '100 skans. Minħabba s-sensittività għolja tal-metodu, anke taħt il-kundizzjonijiet impjegati li jirrestrinġu l-ħin, l-ispettri tal-massa akkwiżiti kellhom proporzjon għoli ta 'sinjal għall-istorbju u mudell rikka ta' joni molekulari.

Il-valutazzjoni tad-dejta tal-immappjar ġġenerata taħt l-istess kundizzjonijiet żvelat differenzi sinifikanti fin-numru u t-tip ta’ komponenti tal-ganglioside espressi fil-kampjuni A1, A3, u C, filwaqt li ma ġew osservati l-ebda differenzi bejn il-kampjuni A1 u A2. Dawn ir-riżultati huma miġbura fil-qosor fit-Tabella 1, li komparattivament telenka l-istrutturi identifikati fit-taħlitiet indiġeni A1, A3, u C, flimkien mal-valuri sperimentali m/zexp tas-sinjali misjuba u l-valuri m/ztheor teoretiċi li jikkorrispondu għall-istrutturi proposti.

Ir-riżoluzzjoni għolja u l-eżattezza tal-massa tal-pjattaforma MS impjegata tejbu d-diskriminazzjoni u l-identifikazzjoni bbażati fuq kejl tal-massa preċiż ta 'mhux inqas minn 37 komponenti distinti ta' ganglioside u fucoganglioside tal-awrina fit-tliet kampjuni. L-ispeċi skoperti jappartjenu għal 15-il klassi differenti, inklużi l-modifiki tal-katina ewlenija tal-glycan (Tabella 2), u ġew assenjati l-eżattezza tal-massa medja eċċellenti ta '4 ppm.

Evalwazzjoni dettaljata tal-istrutturi fit-Tabella 1 wriet li mill-kampjuni kollha, it-taħlita A3, li tikkorrispondi għall-makroalbuminurja (għalhekk, għal stadju avvanzat ta’ DKD), fiha l-ogħla numru ta’ komposti distinti ta’ ganglioside, jiġifieri, 19, segwit minn kampjun C, bi 12-il speċi distinta, u kampjun A1, bi 10.

Meta mqabbel mal-kampjuni A1 u C, A3 ukoll: (i) jinkludi l-ogħla numru ta 'speċi bl-itwal katina O-glycan li tappartjeni għall-klassi G1 u l-aktar diversità prominenti ta' kompożizzjonijiet taċ-ċeramidi; (ii) jippreżenta l-ogħla numru ta' klassijiet ta' ganglioside espressi-12 klassijiet kontra 6 biss fil-kampjun A1 u 6 fil-kampjun C, rispettivament; (iii) fih l-ogħla numru ta' gangliosides, li juru qalba ta' saccharide mibdula minn O-acetyl mhux karboidrat, kif ukoll modifiki bijoloġikament rilevanti O-fucosyl u O-GalNAc tal-karboidrati; (iv) huwa l-uniku estratt urinarju li fih strutturi tal-ganglioside modifikati bit-twaħħil O-GalNAc, jiġifieri GalNAc-GS1(t18:1/18:0), misjub bħala molekula quadruply deprotonated u sodiated f'm/z 1176.8266 , u GalNAc-GQ1(d18:1/18:0), bħala molekula doppjament deprotonata f'm/z 1310.1271. Kif jidher fil-Figura 1a–c, li juri l-proporzjon tal-klassijiet tal-ganglioside espressi fit-tliet kampjuni, u fl-istogramma komparattiva murija fil-Figura 2, l-estratt A3 juri status ta 'sialylation partikolari, li huwa ddominat minn polysialocompounds. Ħlief għall-gangliotetraose monosialylated GM1(d18:1/16:1) misjub bħala [M-2H+ ] 2− f'm/z 756.9{078 u l-GM3 monosialylated (d18:0/24: 0) misjuba bħala molekula deprotonata doppjament f'm/z 645.3956, is-17-il speċi l-oħra kollha fihom aktar minn residwu wieħed ta' Neu5Ac fil-moety glycan tagħhom. Barra minn hekk, minħabba li mhux inqas minn seba 'trisialo GT1, erba' pentasialo GQ1, u anke GS1 heptasialylated ġew skoperti, ovvjament, ħdejn in-numru miżjud u d-diversità ta 'strutturi, it-tul tal-qlub glycan, u l-modifiki periferali tagħhom, is-sialylation ġenerali għolja kontenut jirrappreżenta karatteristika oħra speċifika għall-makroalbuminurja.

Tabella 1. Speċijiet ta 'ganglioside ġew identifikati f'kampjuni A1, A3, u C permezz ta' screening ta '(-) nanoESI Orbitrap MS. d: bażi sphingoid dihydroxylated; t: bażi sphingoid trihydroxylated.

Osservazzjoni klinikament rilevanti toħroġ ukoll mill-assaġġ komparattiv A1 vs C. Billi fil-kampjun tal-kontroll, C, l-ogħla grad ta 'sialylation tal-gangliosides misjuba huwa erbgħa, identifikati permezz ta' żewġ gangliotetraose tetrasialylated GQ1 li jvarjaw fil-kompożizzjoni tal-aglycone lipidiku tagħhom, fil-kampjun A1, l-ogħla grad ta 'sialylation huwa erbgħa. Ħdejn il-gangliosidi di-, tri-, u tetrasialylated, it-taħlita A1 fiha gangliotetraose pentasialo GP1(d18:1/18:0), misjub bħala [M{-4H+ ] 4− jone f' m/z 676.5569, li ġiet assenjata l-eżattezza tal-massa eċċellenti ta '2.95 ppm. Tali data relatata mal-istatus tas-sjalilazzjoni tal-kampjuni investigati turi li l-grad tas-sjalilazzjoni tal-gangliosidi renali jsegwi l-karatteristika C < A1 < A2=A3, osservazzjoni li tenfasizza l-prekoċità ta’ dawn il-modifiki, anke fl-istadju ta’ normoalbuminurja ta’ Pazjenti DM tat-Tip 2. Il-grad ta 'sialylation jiżdied mal-progressjoni tal-marda, li jagħmilha parametru molekulari li għandu jitqies mhux biss għall-iskoperta bikrija ta' DKD iżda wkoll għall-valutazzjoni ta 'progressjoni DKDueffettività tat-trattament.

Tabella 2. Dehra f'tabella tal-klassijiet identifikati tal-ganglioside tal-awrina flimkien mal-espressjoni differenzjali tagħhom f'kampjuni A1, A3, u C. Simboli: x=il-klassi ġiet skoperta; -=il-klassi ma nstabitx.

Spezzjoni dettaljata tal-kostituzzjoni tal-aglycone turi li, ħlief għad-differenzi notevoli fil-kompożizzjoni tal-katina tal-glycan, il-gangliosides espressi fit-tliet kampjuni juru wkoll differenzi fl-istruttura taċ-ċeramidi tagħhom. L-alterazzjonijiet l-aktar evidenti tal-parti tal-lipidi huma relatati mal-proċess inqas komuni ta 'trihydroxylation tal-bażi sphingoid, li jseħħ fit-taħlitiet tal-ganglioside A1 u A3, u t-tul mhux tas-soltu tal-ktajjen tal-aċidu xaħmi, preżenti biss f'A3. Kull wieħed mill-kampjuni A1 u A3 instab li fih żewġ speċi b'bażijiet sphingoid trihydroxylated taċ-ċeramide. Għalhekk, GT1(t18:0/18:0) u GT1(t18:0/20:0) ġew skoperti fil-kampjun A1, filwaqt li l-aktar strutturi kumplessi trihydroxylated GT1(t18:1/24:3) u Fuc-GT3(t18:1/18:3) instabu fil-kampjun A3.

B'mod notevoli, il-kampjun A3 juri wkoll evidenza ta 'speċi li fihom aċidi grassi ta' katina twila ħafna (VLCFA). VLCFA huwa meqjus bħala struttura lipidi li sseħħ rari li tinkludi 23 sa 27 atomu tal-karbonju fil-katina tal-aċidu xaħmi. Erba' speċijiet VLCFA mhux tas-soltu bħal dawn li jġorru 24 atomu tal-karbonju fil-katina tal-aċidu xaħmi ġew skoperti fil-kampjun A3: GM3(d18:0/24:{{10}}), GT1(t18:1 /24:3), O-Ac GT1(d18:0/24:0), u Fuc-GT1(d18:0/24:0), li minnhom struttura waħda karatteristiċi wkoll it-trihydroxylation bażi sphingoid mhux komuni u tliet rabtiet doppji fil-katina ta 'aċidu xaħmi, filwaqt li żewġ strutturi jippreżentaw annessi mal-qalba glycan ta' O-Ac u grupp fucosyl, rispettivament.

Dawn il-karatteristiċi tal-porzjonijiet taċ-ċeramide fil-kampjuni A1 u A3, li ma nstabux fil-kampjun ta' kontroll; ix-xebh bejn l-A1 u l-A2; u d-differenzi mmarkati misjuba fl-A3 jissuġġerixxu li, ħdejn il-kompożizzjoni tal-karboidrati u l-istatus ta 'sialylation, l-istruttura tal-parti tal-lipidi fil-gangliosides renali hija markatur ieħor possibbli ta' DKD bikrija. Barra minn hekk, il-modifiki fil-kompożizzjoni taċ-ċeramide jidhru li jiddependu fuq l-istadji tal-albuminurja; ċeramidi kumplessi, li juru trihydroxylation tal-bażi sphingoid u VLCFA jidhru li huma marbuta mal-istadji avvanzati tal-albuminurja. Meta wieħed iqis li n-numru mhux komuni ta' tliet rabtiet doppji fil-katina ta' l-aċidu xaħmi instab biss fil-kampjun A3 permezz ta' żewġ speċi differenti, Fuc-GT3(t18:1/18:3) u GT1(t18:1/24:3), apparentement, il-mekkaniżmu tal-formazzjoni ta 'bonds doppji huwa wkoll relatat mal-progressjoni ta' DKD.

L-effetti negattivi eżerċitati mill-akkumulazzjoni tal-lipidi fil-kliewi, kemm fil-livelli glomerulari kif ukoll tubulari, huma speċifiċi għaċ-ċelluli. Barra minn hekk, il-lipotossiċità hija assoċjata ma 'diversi tipi ta' lipidi, fosthom il-gangliosides juru rwol fl-istadju ċentrali [13].

Il-kontenut tal-kliewi tal-gangliosides, fost klassijiet oħra tal-lipidi, żdied fi ħdan il-podoċiti, kif ukoll iċ-ċelloli tat-tubuli prossimali, f'mudell tal-ġurdien DN [14]. Tubuli prossimili jistgħu jkunu esposti għal livelli għoljin ta 'lipidi urinarji, inklużi gangliosides, minħabba żieda fil-kontenut ta' aċidu xaħmi għal kull molekula ta 'albumina kmieni f'DKD [15]. Il-konsegwenzi diretti tal-akkumulazzjoni tal-lipidi fi ħdan is-segmenti tan-nephron huma relatati ma 'modifiki strutturali u funzjonali, li jwasslu għal indeboliment tal-ipproċessar tal-albumina kmieni fil-kors tat-Tip 2 DM.

Il-maġġoranza l-kbira tal-istudji li jiffokaw fuq il-karatterizzazzjoni tal-ganglioside renali jiddependu fuq mudelli sperimentali ta 'nefropatija dijabetika. Sa fejn nafu tagħna, dan huwa l-ewwel studju translazzjonali tal-bniedem minn riċerka bażika għal applikabilità klinika biex jirrapporta fuq mudell partikolari ta 'ganglioside urinarju f'pazjenti b'DM tat-Tip 2. Is-sinifikat prattiku ta 'l-istudju tagħna huwa fid-dimostrazzjoni ta' assoċjazzjoni tal-grad ta 'sialylation ta' gangliosides urinarji u l-istruttura taċ-ċeramidi tagħhom ma 'DKD bikrija, imfassla minn livell ta' albuminurja.

Servizz ta 'Appoġġ Ta' Wecistanche-L-akbar esportatur ta' cistanche fiċ-Ċina:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Shop Għal Aktar Speċifikazzjonijiet Dettalji:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

IKOLLOK ESTRAT TA' CISTANCHE ORGANIKU NATURALI B'25% ECHINACOSIDE U 9% ACTEOSIDE GĦALL-INFEZZJONI TAL-KLIEI