Id-dieta b'ħafna fosfru Induċi regolazzjoni 'l fuq tal-espressjoni tal-MRNA Bmp2 u Spp1 fil-kliewi tal-firien

Hiroshi Matsuzaki, Kikue Mori, Shinichi Katsumata 

Biex niċċaraw il-mekkaniżmu tal-iżvilupp tan-nefrokalċinożi indotta minn dieta b'ħafna fosfru (P), aħna ffukajna fuq proteini relatati mal-għadam bħall-proteina morfoġenetika tal-għadam 2 u l-osteopontin. Dan l-istudju investiga l-effetti ta’ dieta b’ħafna P fuq l-espressjoni tal-mRNA ta’ Bmp2 u Spp1 fil-farkliewi. Il-firien Wistar kienu maqsuma f'żewġ gruppi u mitmugħa dieta ta 'kontroll (grupp ta' kontroll) jew dieta ta 'P għoli (grupp ta' P għoli).Kilwail-konċentrazzjonijiet ta 'kalċju u P żdiedu b'mod sinifikanti fil-grupp ta' P għoli meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll. L-espressjoni ta 'mRNA kemm ta' Bmp2 kif ukoll ta 'Spp1 żdiedet b'mod sinifikanti fil-grupp ta' P għoli meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll. Dawn ir-riżultati jindikaw li dieta b'ħafna P tinduċi regolazzjoni 'l fuq tal-mRNA ta' Bmp2 u Spp1 fil-kliewi.

Kliem ewlieni: dieta b'ħafna fosfru, nefrokalċinożi, Bmp2, Spp1,kliewi, far

Għal aktar informazzjoni jekk jogħġbok ikkuntattja:emily.li@wecistanche.com

cistanche biex jikkura mard tal-kliewi

Introduzzjoni

Nefrokalċinożi hija disturb ikkaratterizzat minn depożiti ta 'kalċju (Ca) fil-parenkima renali. Il-fosfru tad-dieta (P), b'mod partikolari, huwa fattur ċentrali fl-iżvilupp ta 'dan id-disturb. Amministrazzjoni ta 'dieta għolja P intwera li tirriżulta f'żieda fil-konċentrazzjoni ta' Ca fil-kliewiu depożiti ta' Ca fil-parenkima renali1-6）. Għalkemm l-effett ta 'dieta għolja P fuq l-iżvilupp ta' nefrokalċinożi kien il-fokus ta 'studju kontinwu, ftit huwa magħruf dwar il-mekkaniżmu responsabbli għall-iżvilupp ta' dan id-disturb. Għalhekk, tinħtieġ riżoluzzjoni f'waqtha ta' din il-kwistjoni.

Aħna rrappurtajna li wara eżami istoloġiku bl-użu ta 'mikroskopija elettronika ta' trażmissjoni, ġew osservati kristalli f'forma ta 'labra bħal hydroxyapatite fit-tubuli renali tal-firien mitmugħa b'dieta ta' P għoli6, 7）. Mikroanaliżi tar-raġġi-X indikat li d-depożiti ta 'Ca indotti minn dieta b'ħafna P huma magħmulin prinċipalment minn Ca u P7）. Dawn ir-riżultati wrew li d-depożiti ta 'Ca indotti minn dieta b'ħafna P huma forma ta' hydroxyapatite. Ibbażat fuq din is-sejba, aħna nippopolaw li l-iżvilupp tan-nefrokalċinożi huwa kkontrollat ​​minn mekkaniżmu simili għal dak fil-formazzjoni tal-għadam. Għalhekk, l-istudju preżenti ffoka fuq proteini assoċjati mal-għadam bħall-proteina morfoġenetika tal-għadam 2 (BMP2). BMP2 huwa fattur osteoġeniku li juri attività li tinduċi l-osteoġenesi8, 9）. Ta 'min jinnota li BMP2 ġie identifikat bħala fattur li jinduċi ectopicgħadamformazzjoni10, 11）. Għalhekk, aħna ipoteżijna li jekk BMP2 għandu rwol importanti fl-iżvilupp ta 'nefrokalċinożi, l-espressjoni ta' din il-proteina fil-kliewitkun regolata 'l fuq b'dieta għolja P. L-istudju preżenti kellu l-għan li jiddetermina jekk dieta ta 'P għolja taffettwax l-espressjoni tal-mRNA ta' Bmp2 fil-kliewi.

Sadanittant, l-istudju preċedenti tagħna rrapporta li dieta ta 'P għoli tgħolli l-espressjoni ta' osteopontin (OPN) fit-tubuli renali bl-użu ta 'analiżi immunoistokimika, li tissuġġerixxi li OPN jista' jkun implikat fl-iżvilupp ta 'depożiti ta' Ca indotti minn dieta ta 'P għoli12). Għalhekk, investigajna l-bidliet fl-espressjoni tal-mRNA Spp1 fil-kliewikif ukoll.

Ir-riżultati tal-istudju preżenti jistgħu jipprovdu għarfien siewi dwar il-mekkaniżmu responsabbli għall-iżvilupp ta 'nefrokalċinożi indotta minn dieta ta' P għoli.

materjali u metodi

Annimali u dieti.

L-istudju preżenti ġie approvat mill-Kumitat għall-Użu tal-Annimali tal-Università tal-Agrikoltura ta 'Tokjo, u l-annimali kollha nżammu skont il-linji gwida tal-università għall-kura u l-użu tal-annimali tal-laboratorju (Approvazzjoni Nru 300049).

Huwa importanti li wieħed jinnota li l-firien nisa jiżviluppaw nefrokalċinożi aktar faċilment minn firien irġiel13, 14）. Barra minn hekk, aħna rrappurtajna li dieta ta 'P għoli żżid l-espressjoni ta' OPN fit-tubuli renali ta 'firien nisa12）. L-istudju preżenti mbagħad uża firien nisa bħala annimali sperimentali. Firien Wistar nisa ta’ erba’ ġimgħat (Clea Japan, Tokyo, Japan) kienu miżmuma f’gaġeġ individwali ta’ xibka tal-wajer tal-istainless steel. Matul il-perjodu sperimentali, il-gaġeġ kienu jinsabu f'kamra b'dawl ikkontrollat ​​taħt dawl 12-h: ċiklu skur (dawl, 0800-2000 h), it-temperatura ta '22 ± 1 grad , u umdità relattiva ta' 60 fil-mija għal 65 fil-mija.

Il-kompożizzjoni tad-dieti sperimentali tidher fiTable 1. Id-dieti sperimentali tħejjew b'referenza għad-dieta AIN{{0}}G15). Id-dieti sperimentali kien fihom żewġ konċentrazzjonijiet differenti ta 'P (dieta ta' kontroll, 0.3 fil-mija; dieta ta 'P għoli, 1.5 fil-mija). Il-konċentrazzjoni P fid-dieta ta 'P għoli kienet issettjata għal 1.5 fil-mija peress li l-istudji preċedenti tagħna osservaw li konċentrazzjoni P fid-dieta ta' 1.5 fil-mija tinduċi

nefrokalċinożi severa6, 7, 12, 14）u espressjoni OPN għolja12）. Id-dieti sperimentali kollha kellhom l-istess konċentrazzjoni ta 'Ca (0.5 fil-mija). Konċentrazzjonijiet P u Ca, kif determinati mill-analiżi tad-dieti sperimentali, huma murija fiTable 1. Qabel il-bidu tal-istudju, il-firien kollha ġew akklimatizzati għal 7 ijiem, li matulhom ingħataw aċċess liberu għad-dieta ta 'kontroll u ilma dejonizzat. Wara l-perjodu ta 'akklimatizzazzjoni, il-firien ġew maqsuma b'mod każwali f'żewġ gruppi b'piżijiet medji tal-ġisem simili u mitmugħa jew id-dieta ta' kontroll (grupp ta 'kontroll) jew id-dieta ta' P għoli (grupp ta 'P għoli) għal 14-il jum. Il-firien ingħataw aċċess liberu għad-dieti sperimentali assenjati u l-ilma dejonizzat matul il-perjodu sperimentali. Fl-aħħar tal-perjodu sperimentali, il-firien ġew ewtanizzati b'injezzjoni intraperitoneali tat-taħlita anestetika (medetomidine, midazolam, u butorphanol), u demm ukliewiinġabru kampjuni għall-analiżi. Kampjuni tad-demm ġew ċentrifugati u s-supernatanti ġew użati bħala kampjuni tas-serum. Il-kliewi tneħħew u l-kapsula renali twarrbet. Is-serum ukliewikampjuni kienu maħżuna f'-80 grad sakemm meħtieġa għall-analiżi. Il-kilwa tal-lemin intużat għall-analiżi kwantitattiva tal-mRNA Bmp2 u Spp1, u x-xellugkliewiintuża għall-analiżi tal-konċentrazzjonijiet ta' Ca u P.

Analiżi minerali.

Kampjuni tad-dieti sperimentali ukliewiġew irmied f'550 grad għal 48 siegħa f'forn muffle, u minerali ġew estratti f'1 mol / L ta 'HCl għall-analiżi. Konċentrazzjonijiet ta' Ca fid-dieti sperimentali ukliewiġew determinati permezz ta' spettrofotometrija ta' assorbiment atomiku16）. konċentrazzjonijiet P fid-dieti sperimentali ukliewiġew analizzati bl-użu tal-metodu ta’ Gomori17）.

Analiżi kwantitattiva ta 'Bmp2 u Spp1 mRNA.

L-RNA totali ġie iżolat mill-kilwa omoġenizzata bl-użu ta 'reaġent TRIzol (Life Technologies, CA, USA) skont l-ispeċifikazzjonijiet tal-manifattur. L-ammont u l-purità tal-RNA ġew ivvalutati bl-użu ta' NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). cDNA ġie sintetizzat bl-użu tas-SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix għal qRT-PCR (Life Technologies) u mbagħad suġġett għal RT-PCR kwantitattiv f'ħin reali bl-użu ta 'SYBR Select Master Mix (Teknoloġiji tal-Ħajja). Primers speċifiċi18-20）intużaw għall-analiżi ta' Bmp2 (quddiem, 5'-ACCGTGCTCAGCTTCCATCAC-3'; reverse, 5'-TTCCTGCATTTGTTCCCGAAA-3'), Spp1 (quddiem, 5'- TGAGACTGGCAGTGGTTTGC-3'; bil-maqlub, 5'-CCACTTTCACCGGGAGACA-3'), u Gapdh (quddiem, 5'-TGGGAAGCTGGTCATCAAC-3'; lura, 5'-GCAT-CACCCCATTTGATGTT{{26} }'). Ir-reazzjoni tal-PCR f'ħin reali twettqet bl-użu ta 'Sistema StepOne Real-Time PCR (Applied Biosystems, CA, USA), u l-livelli tal-espressjoni tal-mRNA ġew normalizzati għal-livelli tal-mRNA ta' Gapdh. Il-valur tal-grupp ta 'kontroll kien ikkunsidrat bħala 1.00.

Analiżi statistika.

Ir-riżultati huma ppreżentati bħala l-mezzi ± SEM għal kull grupp ta' 6 firien. Wara li wettaq test F biex tiddetermina l-omoġeneità tal-varjanzi, intuża t-test ta' Student biex jiddetermina differenzi sinifikanti bejn iż-żewġ gruppi. Jekk l-omoġeneità tal-varjanzi ma kinitx ugwali, intuża t-test ta' Welch minflok it-test t ta' Student. Id-differenzi kienu kkunsidrati sinifikanti f'p ＜ 0.05

Riżultati

Piż tal-ġisem, teħid ta 'ikel, u analiżi tas-serum.

Il-piż tal-ġisem finali u t-teħid tal-ikel naqsu b'mod sinifikanti fil-grupp ta 'P għoli meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll (Tabella 2). Kilwapiż u konċentrazzjonijiet minerali.Kilwapiżijiet imxarrbin u niexfa żdiedu b'mod sinifikanti fil-grupp ta 'P għoli meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll (Tabella 3). KilwaIl-konċentrazzjonijiet ta 'Ca u P żdiedu wkoll b'mod sinifikanti fil-grupp ta' P għoli meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll.

Espressjoni tal-mRNA renali Bmp2 u Spp1.

Il-livelli ta' mRNA Bmp2 fil-grupp ta' P għoli żdiedu b'mod sinifikanti meta mqabbla mal-grupp ta' kontroll (Fig.1A). L-espressjoni tal-mRNA ta 'Spp1 żdiedet ukoll b'mod sinifikanti fil-grupp ta' P għoli meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll (Fig. 1B).

Diskussjoni

Wieħed mill-effetti fiżjoloġiċi magħrufa ta 'dieta għolja P huwa l-iżvilupp ta' nefrokalċinożi. Fl-istudju preżenti, il-konċentrazzjonijiet ta 'Ca u P fil-kliewi żdiedu fil-grupp ta' P għoli meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll, li huwa konsistenti mar-riżultati tal-istudji preċedenti 1-6）. Studji preċedenti rrappurtaw li punteġġi istoloġiċi ta 'nefrokalċinożi kienu korrelatati b'mod pożittiv mal-konċentrazzjonijiet ta' Ca u P tal-kliewi4, 21）. Għalhekk, għalkemm ma saret l-ebda osservazzjoni istoloġika tal-kliewi fl-istudju preżenti, żieda fil-konċentrazzjonijiet ta 'Ca u P fil-kliewi jindikaw li n-nefrokalċinożi kienet indotta mid-dieta ta' P għoli.

Minħabba li d-depożiti ta 'Ca indotti minn dieta ta' P għoli huma ġeneralment meqjusa li huma forma ta 'hydroxyapatite6, 7）, aħna ipoteżijna li l-iżvilupp tan-nefrokalċinożi huwa kkontrollat ​​minn mekkaniżmu simili għal dak tal-osteogenesis. Għalhekk, aħna eżaminajna l-effetti ta 'dieta ta' P għoli fuq l-espressjoni tal-mRNA Bmp2 fil-kliewi. Ir-rizultati

wera li l-espressjoni tal-mRNA ta 'Bmp2 renali żdiedet fil-grupp ta' P għoli u li dieta ta 'P għolja tinduċi regolazzjoni 'l fuq tal-espressjoni tal-mRNA ta' Bmp2 fil-kliewi. Din is-sejba tista 'tgħin biex tagħti kont għall-mekkaniżmu ta' żvilupp ta 'nefrokalċinożi indott minn dieta b'ħafna P. Għalkemm evidenza definittiva li tappoġġja l-ipoteżi tagħna hija nieqsa, possibbiltà waħda hija li l-espressjoni ta 'fatturi ta' traskrizzjoni osteoġeniċi hija elevata f'reġjuni kalċifikati fil-kliewi. BMP2 jinduċi differenzjazzjoni tal-osteoblast u formazzjoni tal-għadam billi jirregola fatturi ta 'traskrizzjoni osteoġeniċi bħal Osterix, Runx2, u Msx28, 9）; għalhekk, BMP2 jista 'jippromwovi n-nefrokalċinożi permezz tar-regolazzjoni ta' tali fatturi ta 'traskrizzjoni osteoġeniċi. Fil-preżent, ir-rwol dettaljat ta 'BMP2 fl-iżvilupp ta' nefrokalċinożi għadu mhux ċar. Barra minn hekk, peress li l-espressjoni tal-mRNA Bmp2 biss ġiet imkejla f'dan l-istudju, mhux magħruf jekk hemmx differenza fl-espressjoni tal-proteina BMP2. Madankollu, ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu mekkaniżmu possibbli li permezz tiegħu alterazzjonijiet fl-espressjoni BMP2 għandhom rwol qawwi fil-patoġenesi ta 'nefrokalċinożi indotta mid-dieta ta' P għoli.

L-istudju preżenti ffoka fuq l-espressjoni tal-mRNA Spp1 flimkien mal-espressjoni tal-mRNA Bmp2. L-istudju preċedenti tagħna bl-użu ta 'analiżi immunoistokimika indika livelli għoljin ta' espressjoni OPN fit-tubuli renali tal-firien mitmugħa b'dieta ta 'P għoli12). L-istudju preżenti sab li l-espressjoni tal-mRNA ta 'Spp1 żdiedet b'madwar 10-darbiet fil-grupp ta' P għoli. Riżultati ta 'l-istudji preżenti u preċedenti juru li dieta ta' P għoli tinduċi espressjoni OPN fil-kliewi. Min-naħa l-oħra, riċerkaturi oħra wrew li OPN bħala matriċi tal-ġebel huwa fattur importanti fil-formazzjoni ta 'ġebel urinarju22, 23）; għalhekk, ir-rapport preċedenti tagħna ssuġġerixxa li l-OPN jista 'jkollu rwol bħala komponent matriċi fil-formazzjoni ta' depożiti ta 'Ca indotti minn dieta ta' P għoli12）. Madankollu, Paloian et al. reċentement irrapporta li l-OPN għandu rwol fil-prevenzjoni ta 'nefrokalċinożi indotta mid-dieta ta' P għoli fil-ġrieden OPN KO24）. Jiġifieri, ir-rwol fiżjoloġiku ta 'OPN fuq nefrokalċinożi indotta mid-dieta ta' P għoli jidher li huwa soppressjoni aktar milli promozzjoni ta 'kalċifikazzjoni fil-kliewi. Barra minn hekk, rapporti preċedenti huma deskritti li l-livelli OPN jiżdiedu biex jikkumpensaw aktar kalċifikazzjoni ektopika patoloġika fikliewiu l-vaskulatura peress li l-OPN hija regolata 'l fuq fis-sit tal-kalċifikazzjoni patoloġika.

Kif imsemmi hawn fuq, l-istudju preżenti ssuġġerixxa l-importanza ta 'BMP2 u OPN fin-nefrokalċinożi indotta mid-dieta ta' P għoli. Ta 'min jinnota li l-effetti ta' BMP2 u OPN fuq l-iżvilupp ta 'nefrokalċinożi huma maħsuba li huma regolati minn mekkaniżmi differenti. Dawn id-differenzi mekkanistiċi jistgħu jindikaw li l-mekkaniżmu sottostanti tan-nefrokalċinożi huwa kkumplikat. Il-punt li jmiss li għandek tikkonsidra huwa li l-inibizzjoni tat-tkabbir setgħet affettwat l-espressjoni tal-mRNA ta 'Bmp2 u Spp1 fil-kliewiminħabba li l-istudju preżenti osserva tnaqqis fil-piż tal-ġisem finali fi grupp ta 'P għoli. Osservazzjonijiet fl-istudji preċedenti tagħna12） u preżenti jistgħu jgħinu biex jagħtu rendikont għal dan il-punt. Preċedentement irrappurtajna żieda fl-espressjoni tal-proteina OPN fit-tubuli renali tal-firien li t-tkabbir tagħhom

ma kienx inibit minn dieta b'livell għoli ta' P12）. Barra minn hekk, l-istudju preżenti wera inibizzjoni tat-tkabbir fil-grupp ta 'P għoli, iżda livelli għoljin ta' espressjoni ta 'Spp1 mRNA fil-kliewi. Ibbażat fuq dawn l-osservazzjonijiet, l-istudju preżenti jidher li għandu ftit effett ta 'inibizzjoni tat-tkabbir tal-espressjoni tal-mRNA Bmp2 u Spp1. Madankollu, id-dettalji tar-relazzjoni bejn l-inibizzjoni tat-tkabbir u l-espressjoni tal-ġeni Bmp2 u Spp1 għadhom mhux ċari. Għalhekk, aktar investigazzjonijiet huma meħtieġa biex jiċċaraw dan il-punt.

Bħala konklużjoni, biex jiġi ċċarat il-mekkaniżmu ta 'l-iżvilupp ta' nefrokalċinożi indott minn dieta ta 'P għoli, l-istudju preżenti ddetermina l-effetti ta' dieta ta 'P għoli fuq l-espressjoni ta' mRNA Bmp2 u Spp1 fil-kliewi. Il-konċentrazzjonijiet ta 'Ca u P fil-kliewi żdiedu b'mod sinifikanti fil-grupp ta' P għoli meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll. Barra minn hekk, l-espressjoni tal-mRNA ta 'Bmp2 u Spp1 żdiedet b'mod sinifikanti fil-grupp ta' P għoli meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll. Dawn ir-riżultati jindikaw li dieta b'ħafna P tippromwovi regolazzjoni 'l fuq tal-espressjoni tal-mRNA Bmp2 u Spp1 fil-kliewi.

Referenzi

1） Hitchman AJ, Has any SA, Hitchman A, Harrison JE, Tam C: Kalċifikazzjoni renali indotta mill-fosfat fil-far. Can J Physiol Pharmacol 57: 92-97, 1979

2） Parker HE: Interrelazzjonijiet tal-manjeżju u tal-fosfru f'livelli adegwati ta' fosfru fid-dieta eċċessivi. Nutr Rep Int 32: 1311-1318, 1985

3） Ritskes-Hoitinga J, Lemmens AG, Danse LHJC, Beynen AC: Nefrokalċinożi indotta mill-fosfru u funzjoni tal-kliewi fil-firien nisa. J Nutr 119: 1423-1431, 1989

4） Cockell KA, L'Abbe MR, Belonje B: Il-konċentrazzjonijiet u l-proporzjon ta 'kalċju u fosfru tad-dieta jinfluwenzaw l-iżvilupp ta' nefrokalċinożi fil-firien nisa. J Nutr 132: 252-256, 2002

5） Katsumata S, Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K: Effetti ta 'supplimentazzjoni tal-kalċju tad-dieta fuq il-metaboliżmu tal-għadam, konċentrazzjonijiet minerali tal-kliewi, u funzjoni tal-kliewi fil-firien mitmugħa dieta b'ħafna fosfru. J Nutr Sci Vitaminol 61: 195-200, 2015

6） Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K, Liu QL, Sato S, Kanke Y, Goto S: Dieta għolja ta 'fosfru malajr tinduċi nefrokalċinożi u korriment tubulari prossimali fil-firien. J Nutr Sci Vitaminol 43: 627-641, 1997

7) Liu QL, Sato S, Kishikawa T, Matsuzaki H, Yamanaka N: Effettività tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża, Wulingsan, fit-trażżin tal-iżvilupp ta 'nefrokalċinożi indotta minn dieta ta' fosfru għoli fil-firien żgħar. Med Electron Microsc 34: 103-114, 2001

8） Sirard C, Kim S, Mirtsos C, Tadich P, Hoodless PA, Its A, Maxson R, Wrana JL, Mak TW: Tfixkil immirat f'ċelloli murini jiżvela rekwiżit varjabbli għal Smad4 fit-trasformazzjoni tas-sinjalar relatat mal-fattur tat-tkabbir. J Biol Chem 275: 2063-2070, 2000

9） Matsubara T, Kida K, Yamaguchi A, Hata K, Ichida F, Meguro H, Aburatani H, Nishimura R, Yoneda T: BMP2 jirregola Osterix permezz ta 'Msx2 u Runx2 waqt id-divrenzjar tal-osteoblast. J Biol Chem 283: 29119-29125, 2008

10） Urist MR : Għadam: Formazzjoni b'awtoinduzzjoni. Xjenza 150: 893-899, 1965

11） Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, Mitsock LM, Whitters MJ, Kriz RW, Hewick RM, Wang EA: Regolaturi ġodda tal-formazzjoni tal-għadam: Kloni u attivitajiet molekulari. Xjenza 242: 1528-1534, 1988

12） Matsuzaki H, Katsumata S, Uehara M, Suzuki S, Miwa M: dieta ta 'fosfru għoli tinduċi espressjoni ta' osteopontin ta 'tubuli renali fil-firien. J Clin Biochem Nutr 41: 179-183, 2007

13） Cousins ​​FB, Geary CPM: Kalċifikazzjoni renali determinata mis-sess fil-firien. Natura 211 : 980-981, 1966

14） Matsuzaki H, Katsumata S, Masuyama R, Uehara M, Nakamura K, Suzuki K: Differenzi tas-sess fil-konċentrazzjonijiet minerali tal-kliewi u eskrezzjoni tal-albumina fl-awrina fil-firien mogħtija għalf b'fosfru għoli. Biosci Biotechnol Biochem 66: 1737-1739, 2002

15） Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC Jr: AIN-93 dieti purifikati għal annimali gerriema tal-laboratorju: Rapport finali tal-kumitat tal-kitba ad hoc tal-Istitut Amerikan tan-Nutrizzjoni dwar ir-riformulazzjoni tal-AIN-76Dieta tal-annimali gerriema . J Nutr 123: 1939-1951, 1993

16）Gimblet EG, Marney AF, Bonsnes RW: Determinazzjoni tal-kalċju u tal-manjeżju fis-serum, l-awrina, id-dieta u l-ippurgar permezz ta 'spettrofotometrija ta' assorbiment atomiku. Clin Chem 13 : 204-214, 1967

17）Gomori G: Modifikazzjoni tad-determinazzjoni kolorimetrika tal-fosfru għall-użu mal-kolorimetru fotoelettriku. J Lab Clin Med 27: 955-960, 1942

18) Ming LG, Lv X, Ma XN, Ge BF, Zhen P, Song P, Zhou J, Ma HP, Xian CJ, Chen KM: Il-grupp prenyl jikkontribwixxi għal attivitajiet ta 'phytoestrogen 8-prenynaringenin fit-titjib tal-formazzjoni tal-għadam u jinibixxi r-riassorbiment tal-għadam in vitro. Endokrinoloġija 154: 1202-1214, 2013

19）Kreke MR, Huckle WR, Goldstein AS: Il-fluss tal-fluwidu jistimula l-espressjoni tal-osteopontin u s-sialoprotein tal-għadam minn ċelluli stromali tal-mudullun b'mod temporalment dipendenti. Għadam 36: 1047-1055, 2005

20）Drechsler J, Grotzinger J, Hermanns HM: Karatterizzazzjoni tal-kumpless tar-riċettur ta 'l-oncostatin M tal-firien li jixbaħ lill-bniedem iżda huwa differenti mir-riċettur taċ-ċitokini murini. PLoS One 7 : e43155, 2012

21）Hoek AC, Lemmens AG, Mullink JWMA, Beynen AC: Influwenza tal-kalċju tad-dieta: proporzjon tal-fosfru fuq l-eskrezzjoni minerali u nefrokalċinożi fil-firien nisa. J Nutr 118: 1210-1216, 1988 

22) Kohri K, Suzuki Y, Yoshida K, Yamamoto K, Amasaki N, Yamate T, Umekawa T, Iguchi M, Shinohara H, Kurita T: Klonazzjoni molekulari u sekwenzar ta 'cDNA li jikkodifika proteina tal-ġebel urinarju, li hija identika għall-osteopontin. Biochem Biophys Res Commun 184: 859-864, 1992

23）Kohri K, Nomura S, Kitamura Y, Nagata T, Yoshioka K, Iguchi M, Yamate T, Umekawa T, Suzuki Y, Shinohara H, Kurita T: Struttura u espressjoni tal-mRNA li tikkodifika proteina tal-ġebel urinarju (Osteopontin). J Biol Chem 268: 15180-15184, 1993

24）Paloian NJ, Leaf EM, Giachelli CM: Osteopontin jipprotesta kontra nefrokalċinożi għolja kkaġunata minn fosfat u kalċifikazzjoni vaskulari. Kidney Int 89: 1027-1036, 2016

25）Giachelli CM, Bae N, Almeida M, Denhardt DT, Alpers CE, Schwartz SM: Osteopontin huwa elevat waqt il-formazzjoni ta 'neointima fl-arterji tal-firien u huwa komponent ġdid ta' plakek aterosklerotiċi umani. J Clin Invest 92: 1686-1696, 1993