Wara li Stabbilixxi l-Fatt Li L-Effett Senolitiku Ta' Ouabain Huwa Dipendenti mit-Tip taċ-Ċellula

Jekk jogħġbok ikkuntattjaoscar.xiao@wecistanche.comgħal aktar informazzjoni

Disturb fl-omeostażi K*/Nat ikkawżat minn ouabain iwassal għal reazzjonijiet fiżjoloġiċi differenti fil-kontroll u A549 senescent u END-MSCs

Wara li stabbilixxa l-fatt li l-effett senolitiku ta 'ouabain huwa dipendenti mit-tip taċ-ċellula, aktar ippruvajna niċċaraw x'jista' jissejjes fuq id-differenzi żvelati fir-risponsi ta 'hMSCs u A549. Għal dan il-għan, analizzajna senescence indotta mill-istress ossidattiv ta' END-MSCs u etoposide. -senescence indotta ta 'A549 b'mod aktar preċiż.benefiċċji cynomoriumIl-mekkaniżmu molekulari ewlieni ta 'azzjoni ta' diversi glikosidi kardijaċi huwa l-inibizzjoni ta 'Nat/K plus -ATPase [44].Nat/K plus -ATPase hija enzima tal-membrana tal-plażma li tippompja s-sodju miċ-ċellula waqt li tippompja l-potassju fiċ-ċellula kontra gradijenti ta' konċentrazzjoni. u b'hekk tipparteċipa fil-manutenzjoni ta 'K plus u Na plus omeostażi. Għalhekk, staqsejna jekk jistax ikun hemm xi differenzi fl-omeostażi tal-jone bażali u indotta minn ouabain bejn ċelluli ta 'kontroll u senescent ta' żewġ tipi.

Jekk jogħġbok ikklikkja hawn biex tkun taf aktar

Id-disturb fl-omeostażi K plus u Na plus ikkawżat minn ouabain għandu finalment iwassal għad-dissipazzjoni tal-potenzjal tal-membrana tal-plażma. Għalhekk, aktar, użajna sonda fluworexxenti speċifika DiBAC4(3) biex tkejjel il-potenzjal transmembrane ta 'ċelloli mhux eċċitanti. Fluworexxenza miżjuda ta 'dan iż-żebgħa tirrifletti d-depolarizzazzjoni tal-membrana.ġjaċint tad-deżertF'kull tip ta 'ċellula ttestjat ouabain indotta depolarizzazzjoni tal-membrana prevedibbli, li tikkonferma żbilanċ joniku (Fig. 10a). Notevolment, osservajna livelli komparabbli ta 'depolarizzazzjoni tal-membrana fil-kontroll u END-MSCs senescent, filwaqt li A549 senescent kien ikkaratterizzat minn membrana depolarizzata b'mod sinifikanti aktar meta mqabbla ma' ċelloli A549 ta 'kontroll.

Konsegwenzi importanti oħra tad-deregolazzjoni jonika huma bidliet fil-potenzjal tal-membrana mitokondrijali (MP).

Għalhekk, bl-użu tas-sonda fluworexxenti JC-1 aħna evalwajna l-MMP f'ċelloli ta 'kontroll u senescent fuq trattament ta' ouabain. Għandu jiġi enfasizzat b'mod speċifiku li ċ-ċelluli senescent huma komunement ikkaratterizzati minn tnaqqis ta' MMP li jirrifletti funzjonament ħażin tal-mitokondrija, alterazzjonijiet fil-metaboliżmu tal-enerġija, u livelli miżjuda ta' speċi ta' ossiġnu reattiv intraċellulari[45]. Kif mistenni, l-MMP fiċ-ċelloli senescent END-MSCs u A549 kien aktar baxx milli f'dawk ta 'kontroll,

għalkemm dan it-tnaqqis ma affettwax il-vijabbiltà taċ-ċelluli senescent (Figuri Id, 6a, 10b).metodu ta 'estrazzjoni flavonoid pdfSimili għar-riżultati ta 'hawn fuq, ouabain indotta depolarizzazzjoni MMP qawwija f'senes-cent A549 meta mqabbla mal-kontropartijiet proliferanti tagħhom, filwaqt li l-effett fuq MMP ta' kontroll u senescent END-MSCs kien minimu (Fig.10b). Fil-qosor ir-riżultati deskritti f'din il-parti, nistgħu nikkonkludu li l-imblukkar ta 'Na plus /K plus -ATPase minn ouabain iwassal għal depolarizzazzjoni drammatika tal-membrana tal-plażma u tnaqqis ta' MMP f'każ ta 'senescent A549, kuntrarjament għal senescent END-MSCS.

Alterazzjonijiet fil-mekkaniżmi ta 'K plus importazzjoni jimmedjaw ir-reżistenza għall-ouabain ta' END-MSCs senescent

Biex jiġu ċċarati mekkaniżmi li jimmedjaw bidliet indotti mill-ouabain fil-polarizzazzjoni tal-membrana u MMP bejn A549 senescent u END-MSCs, barra minn hekk, użajna approċċ bijo-informatiku avvanzat. L-għan tal-analiżi kien li tiżvela karatteristiċi traskrittomiċi possibbli li jimmedjaw ir-reżistenza għall-ouabain jew is-sensittività ta' ċelluli senescent dipendenti fuq it-tip ta' ċelluli. Fi kliem ieħor, staqsejna l-mistoqsija: kif is-senescence ta 'END-MSCs (ċelluli reżistenti għall-ouabain) hija differenti mis-senescence ta' A549 (ċelluli sensittivi għall-ouabain)? Biex inwieġbu din il-mistoqsija, użajna tliet settijiet ta' data ta' sekwenzar RNA indipendenti (RNA-Seq). L-ewwel waħda kienet l-analiżi RNA-Seq

Fig.6 Validazzjoni tal-mudell ta 'senescence A549 indott minn etoposide. Iċ-ċelluli senescent A549 juru telf ta 'proliferazzjoni, b jakkwistaw daqs taċ-ċellula elevat, livell ta' awtofluworexxenza c, u attività d SA-b-Gal meta mqabbla ma 'dawk ta' kontroll. e Livelli ta 'fosforilazzjoni ta' p53 u Rb u livelli ta 'espressjoni ta' proteini p21 u HMGBI fil-kontroll u A549 senescent. Il-valuri ppreżentati huma medji±SD. Għal gruppi multipli ġew applikati paraguni f'ANOVA one-way, n=3, ns mhux sinifikanti,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c,="" and="" d="" welch's="" test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001.>flavonojdiIl-vireg tal-iskala għall-immaġini huma 500 μm. GAPDH intuża bħala kontroll tat-tagħbija tal-kontroll u END-MSCs senescent imwettqa minna. It-tieni wieħed kien id-dataset għall-kontroll u l-senescent A549 imniżżel minn GEO [43]. Ta 'min jinnota, il-kundizzjonijiet li jinduċu s-senescence ikkoinċidew ma' dawk applikati fl-istudju preżenti u fl-istudji pilota ta 'seno-lysis indotta mill-glikosidi kardijaċi. U t-tielet dataset kien għall-kontroll u l-IMR senescent -90 miksub direttament mill-istudju dwar il-glikosidi kardijaċi bħala komposti senolitiċi [25]. Importanti, l-IMR-90 ġie ppruvat li huwa suxxettibbli għal analiżi indotta mill-ouabain. Għandu jiġi nnutat li t-tqabbil ta’ żewġ settijiet ta’ dejta biss rilevanti għal END-MSCs u A549 fl-aħħar mill-aħħar iwassal għal riżultati mhux xierqa, peress li f’tali analiżi d-differenza mfittxija bejn il-proċess ta’ senescence f’END-MSCs u A549 ma tkunx tista’ tiġi distinta mill-varjazzjonijiet medjati minn diversi effetti tekniċi tal-lott (ie tip ta 'magna ta' sekwenzar, il-kundizzjonijiet tal-kampjun dam). Biex innaqqsu kwalunkwe effett tal-lott, qabbilna sett ta' dejta wieħed għal ċelloli reżistenti għall-ouabain (END-MSCs) u tnejn għal ċelloli sensittivi għall-ouabain (A549, IMR-90). Biex nivvalidaw ir-rilevanza tal-analiżi komparattiva ulterjuri, għamilna Analiżi tal-Komponent Prinċipali għas-sottosett ta 'ġeni relatati mat-terminu GO "senescence ċellulari" (GO 0090398) ibbażat fuq is-sett tad-dejta fil-qosor li fih kampjuni mit-tliet esperimenti deskritti. Tabilħaqq, għal kull tip ta 'ċellula kampjuni miġbura f'żewġ gruppi separati - il-kontroll u dawk senescent (Fig.10d).

cistanche jista 'anti-aging

Biex twettaq analiżi ta 'ġeni espressi b'mod differenzjali (DEGs) matul is-senescence ta' ċelluli reżistenti għall-ouabain u sensittivi, aħna ġġeneraw il-mudell statistiku li ġabar f'sinteżi żewġ tbassir u l-interazzjoni tagħhom. Il-preżentazzjoni skematika ta 'l-analiżi hija murija fil-Fig. 10c.Fil-qosor, l-ewwel tbassir fil-mudell qasmet il-kampjuni kollha permezz ta' sottogruppi ta 'kontroll u senescence, it-tieni—b'reżistenza għall-ouabain jew sensittività għall-ouabain, u l-aħħar komponent fil-mudell irrifletta l- interazzjoni taż-żewġ tbassir. Ir-riżultat tal-ittestjar tal-espressjoni differenzjali għall-aħħar varjabbli huwa ppreżentat fit-Tabella Supplimentari 1.

Imbagħad wettaqna analiżi tal-arrikkiment tas-sett tal-ġeni (GSEA) f'termini tal-Ontoloġija tal-Ġene (GO) għal Proċessi Bijoloġiċi (BP) (Tabella Supplimentari 2). Notevolment, fost il-proċessi arrikkit b'mod sinifikanti, sibna "Importazzjoni tal-jone tal-potassju" u "Regolamentazzjoni pożittiva tat-trasport transmembrana tal-katjoni li għandha tiġi regolata 'l fuq matul is-senescence ta' END-MSCs reżistenti għall-ouabain meta mqabbla mas-senescence ta 'ċelluli sensittivi għall-ouabain (Fig. 10e). ). Il-listi tal-ġeni tal-arrikkiment tal-qalba relatati ma 'dawn il-proċessi kienu jinkludu KCNJ2, KCNJ14, KCNJ8, SLC12A7, SLC12A8, WNK4 li kienu regolati b'mod sinifikanti f'END-MSCs senescent (Fig. 10f). Il-proteini kodifikati mill-ġeni KCNJ huma kanali tal-potassju tat-tip rettifikatur 'l ġewwa, li għandhom tendenza akbar li jippermettu li l-potassju jgħaddi ġo ċellola aktar milli barra minn ċellola.użi hesperidinSLC12 familja ta 'trasportaturi tal-klorur cation-you-pled. Il-ġene WNK4 jikkodifika għal serine/threonine kinase li jaġixxi bħala attivatur tal-kotrasportaturi tal-klorur akkoppjat mas-sodju u inibitur tal-kotrasportaturi tal-klorur akkoppjat mal-potassju. Flimkien, dawn is-sejbiet ippermettew li jissuġġerixxu li END-MSCs senes-cent jistgħu jirrestawraw K intraċellulari eżawriti flimkien ma 'livelli aktar effettivi minn ċelluli A549 senescent u għalhekk jistgħu jimmaniġġjaw bi żbilanċ joniku indott minn ouabain.

Wirja END-MSCs senescent elevata

reżistenza għall-apoptożi meta mqabbla ma 'dawk ta' kontroll, filwaqt li A549 senescent le

Ir-rwol tal-K plus in intraċellulari fir-regolamentazzjoni tal-mewt taċ-ċelluli huwa stabbilit sew [46]. Differenzi żvelati bejn senes-cent END-MSCs u ċelluli A549 fil-kapaċità li jżommu K intraċellulari flimkien ma 'omeostażi wassluna biex inqabblu r-reżistenza ġenerali għall-istress miksuba matul is-senescence taż-żewġ tipi ta' ċelluli. Huwa magħruf li l-istress eżoġenu huwa akkumpanjat minn disturb fl-omeostażi jonika, li jwassal għal skambju rapidu ta 'diversi joni, inkluż K plus bejn iċ-ċellula u l-ambjent tagħha [46]. Ir-riżultati ta 'influwenzi stressanti huma fil-biċċa l-kbira dipendenti fuq il-kapaċità taċ-ċelloli li jirrestawraw il-bilanċ joniku intraċellulari xieraq. Kif muri f'Fig.10e, f, senescence ta 'END-MSCs kienet akkumpanjata mill-upregulation ta' K flimkien ma 'importazzjoni li tissuġġerixxi li matul

Fig.10 END-MSCs senescent reżistenti għal Ouabain huma kapaċi jirrestawraw id-disturb ta 'l-omeostażi K plus /Nat ikkawżat minn ouabain permezz ta' importazzjoni effettiva ta 'K plus, filwaqt li ċ-ċelluli senescent sensittivi għal ouabain m'għandhomx din il-kapaċità. a Determinazzjoni potenzjali tal-membrana ta' kontroll u END-MSCs senescent u ċelluli A549 qabel u 24 siegħa wara t-trattament ta' ouabain, bl-użu ta' sonda fluworexxenti DiBAC4(3). b Evalwazzjoni tal-potenzjal tal-membrana mitokondrijali ta 'kontroll u END-MSCs senescent u ċelluli A549 qabel u 24 siegħa wara t-trattament ta' ouabain, bl-użu ta 'sonda fluworexxenti JC-1. c Disinn tal-analiżi bijoinformatika komparattiva ta’ tliet settijiet ta’ dejta RNA-Seq indipendenti.d Analiżi tal-Komponent Prinċipali għas-subsett ta’ ġeni relatati mat-terminu GO “senescence ċellulari”(GO 0090398) ibbażata fuq id-dejta magħquda minn tliet settijiet ta’ dejta RNA-Seq indipendenti . Ir-riżultati tal-GSEA għall-ġeni espressi b'mod differenzjali bejn iċ-ċelloli reżistenti għall-analiżi medjata mill-ouabain (END-MSCs) u dawk sensittivi għall-analiżi medjata mill-ouabain (A549 u IMR-90) għal 'Regolamentazzjoni pożittiva tat-trasport transmembrana tal-katjoni' u 'Proċessi bijoloġiċi ta' importazzjoni tal-jone tal-potassju. f Mappa tas-sħana li tirrifletti l-ġeni tal-arrikkiment tal-qalba għall-proċessi bijoloġiċi 'Regolamentazzjoni pożittiva tat-trasport transmembrana tal-katjoni' u 'Importazzjoni tal-jone tal-potassju'. Il-valuri huma medji±SD. Is-sinifikat statistiku ġie vvalutat bit-test t tal-Istudent: ns mhux sinifikanti,*p<><><>

l-iżvilupp tas-senescence END-MSCs itejbu l-kapaċità tagħhom li jirrestawraw il-livelli K plus. Interessanti, ma stajniex niżvelaw tendenza simili għas-senescence A549, għalhekk, A549 deher li ma jakkwista l-ebda karatteristika speċifika relatata mal-importazzjoni K * matul il-progressjoni tas-senescence. Skont id-dejta letterarja, it-tnaqqis indott mill-istress fil-K* intraċellulari u l-inkapaċità li jerġa 'jġib il-livell tiegħu jiffavorixxi l-attivazzjoni ta' caspases u nucleases u għalhekk huma proposti li jkunu fattur pro-apoptotiku [46].

F'konformità ma 'dan is-suġġeriment, bl-użu ta' analiżi bijoinformatika tas-settijiet ta 'dejta RNA-seq ta' hawn fuq aħna żvelajna tnaqqis sinifikanti ta 'regolazzjoni tal-proċessi relatati mal-apoptożi matul is-senescence ta' END-MSCs meta mqabbla ma 'A549 u IMR -90 (Fig. lla) . Barra minn hekk, is-senescence ta 'A549 u IMR-90 hija kkaratterizzata minn regolazzjoni sinifikanti 'l fuq ta' ġeni pro-apoptotic, inklużi BAD, BAX, BOK, BAK-1, u NOXA (Fig.11b). Din id-dejta tindika li END-MSCs jiksbu fenotip reżistenti għall-apoptożi matul is-senescence, filwaqt li l-IMR-90 senescent u A549 saru suxxettibbli għall-apoptożi (Fig.11b). Biex tissaħħaħ din l-osservazzjoni, aħna analizzajna wkoll sett ta 'dejta tal-microarray għal AD-MSCs senescent ta' kontroll u replikattivi li ppreservaw ukoll ir-reżistenza għall-ouabain matul is-senescence kif indikat hawn fuq (Fig.4g). Meta analizzajna l-livelli ta 'espressjoni tal-ġeni relatati mal-apoptożi, osservajna fenotip distint reżistenti għall-apoptożi ta' AD-MSCs senescent simili għal dak ta 'END-MSCs senescent (Supplemental Fig.S8a, b).

Biex tivverifika r-riżultati ta 'analiżi traskriptomika, aħna stmat livelli ta' espressjoni ta 'ġeni relatati ma' apoptożi u K flimkien ma 'importazzjoni fiż-żewġ tipi ta' ċelluli senescent-END-MSCs u A549 minn RT-PCR (Supplimentari Fig. S9). Barra minn hekk, analizzajna l-espressjoni tal-istess lista tal-ġeni bl-użu ta 'mudelli ċellulari oħra reżistenti għall-ouabain u sensittivi għall-ouabain, DP-MSCs senescent ittrattati b'doxorubicin, u SK-Help senescent ittrattati b'etoposide, rispettivament (Fig. S9 Supplimentari). Kif muri fil-Fig. S9 Supplimentari, iż-żewġ tipi ta 'END-MSCs u DP-MSCs senexxenti ta' ċelluli reżistenti għall-ouabain urew mudelli simili ta 'espressjoni tal-ġeni, speċifikament KCNJ2, SLC12A u WNK4 li qed jipparteċipaw fir-restawr K plus kienu regolati 'l fuq, BAX proapoptotic kien regolat 'l isfel, filwaqt li antiapoptotic MCL-I kien upregulated. Barra minn hekk, il-mudell tal-espressjoni tal-istess ġeni kien differenti minn dawk osservati għal A549 u SK-Hep1 sensittivi għall-ouabain. Dawn ir-riżultati jikkonfermaw id-dejta traskrittomika tagħna u jsaħħu l-konklużjoni dwar profili varjati ta 'apoptożi miksuba matul is-senescence ta' tipi differenti ta 'ċelluli.

Imbagħad ittestjajna jekk id-distinzjonijiet osservati fl-isfond tal-apoptożi matul is-senescence ta 'END-MSCs u A549 jistgħux ikollhom impatt fuq ir-reżistenza ġenerali għall-istress taċ-ċelloli senescent. Biex nagħmlu dan, ivvalutajna l-vijabbiltà taċ-ċelluli fuq stress ossidattiv u staurosporine, tipikament applikati biex jinduċu apoptożi. Tabilħaqq, END-MSCs senescent irriżultaw li kienu ferm aktar reżistenti għaż-żewġ tensjonijiet meta mqabbla mal-kontropartijiet ta 'kontroll tagħhom (Fig. 1lc). Kuntrarjament, iċ-ċelloli A549 wrew sitwazzjoni viċi versa, peress li ċ-ċelloli senescent wrew tendenza li jkunu aktar sensittivi lejn mewt taċ-ċelluli kkaġunata mill-istress (Fig. 11d). Din l-osservazzjoni tbiddel il-paradigma eżistenti li r-reżistenza tal-mewt imsaħħa hija karatteristika komuni ta 'kull tip ta' ċelluli senescent, li turi l-ispeċifiċità taċ-ċelluli ovvja tagħha.

Fuq il-bażi tad-dejta ta 'hawn fuq, asssumina li t-tnaqqis tad-"difiża" tal-apoptosi ta' END-MSCs senescent għandu joħloq kundizzjonijiet favorevoli għal aktar analiżi. F'dan ir-rigward, iffukajna fuq membru antiapoptotiku magħruf tal-proteini tal-familja BCL-2—MCL-1, peress li l-espressjoni tagħha kienet regolata 'l fuq f'END-MSCs senescent reżistenti għall-apoptożi (Fig. 1lb u Fig Supplementari S9a). Għal dan il-għan, ittrattati minn qabel il-kontroll u l-END-MSCs senescent b'A-1210477 l-inibitur speċifiku tal-MCL-1, u mbagħad applikajna glycosides kardijaċi biex ninduċi analiżi. Ta 'min jinnota, A-1210477 innifsu ma kellu l-ebda effett fuq il-kapaċità ta' proliferazzjoni taċ-ċelloli ta 'kontroll u fuq il-vijabbiltà ta' dawk senescent kif indikat fuq il-kurvi tat-tkabbir (Fig. 1le). L-applikazzjoni sussegwenti ta 'glikosidi kardijaċi wasslet għat-tnaqqis fin-numru ta' ċelloli vijabbli, madankollu l-effett kien aktar evidenti f'ESCs senescent (Fig.11f). Għalhekk, l-inibizzjoni tal-MCL-1 b'A-1210477 ippredisponi ESCs senesxxenti lejn mewt indotta minn ouabain li jindika għall-analiżi. L-aħħar evidenza għar-reżistenza għall-apoptożi miksuba matul is-senescence END-MSCs tkun barriera intrinsika għal analiżi effettiva attivata minn glikosidi kardijaċi.

Diskussjoni

Fi ħdan l-istudju preżenti, ittestjajna l-effetti senolitiċi ta 'glikożidi kardijaċi, jiġifieri ouabain u bufalin, fuq hMSCs. Iż-żewġ komposti ġew identifikati reċentement li għandhom effett ċitotossiku selettiv fuq ċelluli senescent (mudelli ta’ senescence indotti minn onkogene/ther-apy) ta’ oriġini differenti, inklużi ċelloli primarji IMR-90,HUVEC, ARPE-19,T/ Ċ-28 u ċelluli tal-kanċer SK-Help,A549,SK-Mel-5,MCF7,HCT116, HaCat,H1299,U373-MG,H1755[25,26].B'mod mhux mistenni, aħna ma setgħux jiżvelaw xi effetti ċitotossiċi preferenzjali la ta' ouabain u lanqas ta' bufalin fuq END-MSCs senescent meta mqabbla ma' dawk ta' kontroll. Importanti, in-nuqqas ta 'analiżi ġie vverifikat bl-użu ta' hMSCs miksuba minn tessut xaħmi, polpa dentali u ġelatina Warton, u diversi mudelli ta 'senescence. Dan tal-aħħar wassalna għas-suġġeriment li r-reżistenza għall-analiżi indotta mill-glikoside kardijaku tista 'tkun il-karatteristika komuni tal-hMSCs. Fl-istess ħin, stajna ninduċu l-apoptożi preferenzjali f'senescent A549 u SK-Help, u b'hekk nirriproduċu l-effett senolitiku tal-glikosidi kardijaċi deskritti fl-artikoli rilevanti [25,26]. B'ċelluli reżistenti u sensittivi għall-analiżi indotta mill-ouabain (reżistenti għall-ouabain/sensittivi għall-ouabain) disponibbli, ippruvajna niċċaraw il-kawżi fundamentali sottostanti din id-differenza. Il-mekkaniżmu molekulari komuni tal-azzjoni tal-glikosidi kardijaċi jorbot man-Nat/K plus -ATPase u jimblokka l-attività tiegħu. Billi idrolizza l-ATP din l-enzima tiżgura l-ippumpjar ta’ Na plus 'il barra miċ-ċellula u timporta K plus fiċ-ċelloli u b'hekk iżżomm gradjent elettrokimiku fiżjoloġiku, omeostasi jonika, pH ċellulari, u volum taċ-ċelluli li huma essenzjali għas-sopravivenza u l-funzjonament taċ-ċelluli [47]. Għalhekk, spekulajna li l-abbiltà senolitika ta 'ouabain tista' tiddependi fuq is-severità ta 'żbilanċ K plus /Nat fiċ-ċelloli ttrattati. F'konformità ma 'dan is-suġġeriment, aħna żvelaw li ouabain indotta depolarizzazzjoni aktar evidenti tal-membrana tal-plażma u waqgħa ta' MMP f'A549 senescent sensittiv għal ouabain.

B'mod ġenerali, l-impatt ta 'Nat/K flimkien ma' -ATPase li jinibixxi fuq is-sopravivenza taċ-ċelluli intwera li kien speċifiku għat-tip taċ-ċellula. Pereżempju, ouabain intwera li jsaħħaħ l-apoptosi f'limfoċiti, ċelloli Jurkat u ċelloli epiteljali tal-klieb, filwaqt li naqas milli jikkawża mewt f'ċelloli epiteljali minn aorta tal-far, ċelloli tal-granuli ċerebrali tal-far, u limfoċiti tubulari prossimali renali tal-ħnieżer LLC-PK1 minkejja modulazzjoni simili. tal-proporzjon katjoniku [48-54]. Wieħed mill-mekkaniżmi proposti ta 'azzjoni proapoptotic ouabain huwa t-tnaqqis ta' intraċellulari li jiffavorixxi tnaqqis apoptotiku, attivazzjoni ta 'caspases, u bidu ta' programmar apoptotic [46, 47]. Meta wieħed iqis it-telf komparabbli K flimkien ma 'l-effett oppost fuq l-induzzjoni tal-mewt miksuba għal mudelli reżistenti għall-ouabain u sensittivi għall-ouabain, aħna ssuġġeriejna d-differenzi fis-sistemi ta' kumpens tal-katjoni. It-tnaqqis fil-livell K plus intraċellulari għandu essenzjalment iwassal għall-attivazzjoni tal-importazzjoni K plus mill-ispazju extraċellulari biex jikkumpensa għan-nuqqas ta 'dan il-katjoni. Għalhekk, l-effettività tar-restawr K plus tista' tkun il-bażi ta' predispożizzjoni għall-apoptożi fuq trattament ta' ouabain. Biex nittestjaw dan is-suġġeriment, applikajna analiżi bijoinformatika kumplessa li tqabbel l-alterazzjonijiet fil-firem transcriptomic matul is-senescence ta 'ċelluli reżistenti għall-ouabain (END-MSCs) u ċelluli sensittivi għall-ouabain (A549 u IMR-90). Aħna osservajna regolazzjoni qawwija qawwija tal-proċessi relatati mal-importazzjoni tal-jone tal-potassju matul is-senescenza END-MSCs, filwaqt li matul is-senescenza tal-A549 u l-IMR sensittivi għal oua-bain-90 dawn il-proċessi baqgħu ma nbidlux jew saħansitra naqsu. Ibbażat fuq dan nistgħu nispekulaw li END-MSCs senescent jistgħu jlaħħqu b'mod effettiv ma 'K indott minn ouabain flimkien ma' tnaqqis permezz ta 'sistemi ta' importazzjoni ta 'katjoni attiva, li jipprevjeni l-induzzjoni tal-apoptożi. Għall-kuntrarju, l-A549 senescent tagħna u l-IMR-90 li huma sensittivi għall-bain jidhru li huma inqas kapaċi jegħlbu t-telf K plus, u għalhekk huma suxxettibbli għall-apoptożi. ċelluli A549 senescent, li juru żbilanċ joniku evidenti tipiku għal ċelluli li qed imutu.

Minflok ma tkun il-karatteristika unika tal-apoptożi indotta mill-ouabain, qatra ta 'kontenut intraċellulari K plus hija probabbilment il-karatteristika komuni ta' mewt apoptotika attivata minn diversi stress, eż. trattament ta 'staurosporine u stress ossidattiv [46]. Għaldaqstant, kapaċità mnaqqsa ta 'A549 senescent biex tirrestawra K plus ċitoplasmika għandha finalment twassal għal tnaqqis fir-reżistenza ġenerali għall-istress. Madankollu, dan il-kunċett jikkontradixxi d-definizzjoni moderna ta 'senescence taċ-ċelluli, li tiddikjara li ċ-ċelloli senescent huma reżistenti ħafna għall-apoptożi [16]. Għandu jiġi enfasizzat b'mod speċifiku li r-reżistenza mtejba għall-apoptożi ffurmat il-bażi għall-iżvilupp analitiku [16, 17].

L-ewwel aċċenn tar-reżistenza għall-istress akbar taċ-ċelloli senescent tmur lura għall-1995 meta fibroblasti senescent replikali nstabu li kienu aktar reżistenti għall-irtirar tas-serum meta mqabbla ma 'dawk ta' kontroll [55]. Dan l-istudju inizjali kien segwit minn numru limitat ta 'investigazzjonijiet li jindikaw li ċ-ċelloli senescent huma aktar reżistenti għad-dawl UV, staurosporine, thapsigargin, u tensjonijiet oħra mill-kontropartijiet proliferanti tagħhom [56, 57]. Madankollu, aħna 'l bogħod mill-ewwel li jqajmu l-kwistjoni tar-reżistenza mtejba għall-apoptożi bħala l-karatteristika ġenerali taċ-ċelloli senescent. Għalhekk, fir-reviżjoni ppubblikata fl-2003, ġie rrappurtat li "... ir-reżistenza għall-apoptożi mhijiex karatteristika ġenerali taċ-ċelloli senescent, li jistgħu wkoll ikunu suxxettibbli għall-apoptotiċi skont it-tip ta 'ċellula u stimoli apoptotiċi..."[58]. Tabilħaqq, bosta dejta wriet sensittività ogħla taċ-ċelloli senescent għall-apoptożi kkaġunata mill-istress milli taċ-ċelloli tal-kontroll [59-61]. Pereżempju, HUVECs senescent kienu aktar suxxettibbli għall-apoptożi indotta minn LDL jew TNFa ossidizzati meta mqabbla maċ-ċelloli ta' kontroll[61]. Minkejja l-kontroversja ovvja, l-aħħar dubju deher fl-2015 u deher kif ġej: "Jidher dubjuż li r-reżistenza għall-apoptożi globali hija karatteristika ġenerali taċ-ċelluli tas-senescence"[62].Fl-istess sena, ġie ppubblikat l-ewwel studju li jikxef analiżi [16 ]. F'dan l-istudju, l-awturi enfasizzaw l-espressjoni akbar ta 'netwerks ta' ġeni favur is-sopravivenza f'ċelloli senescent li kkontribwew għar-reżistenza msaħħa tagħhom għall-apoptosi. Għalhekk, inizjalment, senolytics irrappreżentaw il-mediċini biex jimmiraw proteini li jipproteġu ċelluli senescent mill-apoptożi. L-iskoperta ta' analitiċi flimkien mar-riżultati impressjonanti tat-tneħħija taċ-ċelluli senes-cent bl-użu ta' ġrieden transġeniċi INK-ATTAC wasslu għal għadd kbir ta' studji li jfittxu l-kom-pounds ġodda b'attività emolitika [16-26,63]. Matul l-aħħar sentejn, ġew ippubblikati ħafna reviżjonijiet dwar l-analitika [13-15,64-66]. Madankollu, mill-2015, ir-reżistenza mtejba tal-apoptosi taċ-ċelloli senescent ma kinitx kwistjoni ta 'dibattitu, għalkemm, fil-fatt, ma ġietx ittestjata f'dawn l-istudji.

Interessanti, meta tqabbel il-firem transcriptomic ta 'ċelluli reżistenti għall-ouabain (END-MSCs) u ċelluli sensittivi għall-ouabain (A549 u IMR-90), sibna li s-senescence biss ta' END-MSCs kienet akkumpanjata mill-akkwist ta' notevoli. profil anti-apoptotiku. Għall-kuntrarju, is-senescence ta 'A549 u IMR-90 hija kkaratterizzata minn regolazzjoni sinifikanti 'l fuq ta' ġeni pro-apoptotic, inklużi BAD, BAX, BOK, BAK-1, NOXA, eċċ. Importanti, dawn ir-riżultati ġew estiżi bl-użu ta 'ċelluli oħra reżistenti għall-ouabatin DP-MSCs. Minn naħa waħda, dawn ir-riżultati jipprovdu spjegazzjoni molekulari addizzjonali għan-nuqqas ta 'analiżi indotta minn ouabain fl-hMSCs, u, min-naħa l-oħra, juru b'mod ċar li A459 u IMR-90 isiru predisposti għall-apoptożi matul is-senescenza. Ta' min jinnota, id-dejta tagħna dwar alterazzjonijiet traskritomiċi fil-ġeni relatati mal-apoptosi fl-IMR senescent-90 ikkoinċidiet mar-riżultati ppreżentati, iżda mhux diskussi, fl-artiklu ppubblikat minn Guerrero et al., bħala s-settijiet tad-dejta għall-kontroll u l-IMR senescent{ {19}} ċelluli oriġinaw minn dan l-istudju [25]. L-analiżi preċiża tal-mappa tas-sħana pprovduta f'dan l-istudju żvelat regolazzjoni 'l fuq ta' BAX, BAD, BAD, BAKI, u NOXA f'senes-cent IMR-90 meta mqabbla maċ-ċelloli tal-kontroll. Barra minn hekk, Baar et al. żvela wkoll upregulation "mhux mistennija" ta' proapoptotic u downregulation ta' ġeni antiapoptotic fl-IMR senescent-90, u semma li l-IMR senescent-90 għandu jkun ippreparat biex jgħaddi minn apoptosi [21].

Sabiex insaħħu l-osservazzjoni tagħna, qabbilna r-reżistenza tal-kontroll u l-END-MSCs senescent u l-A459 mal-istress stimoli-ossidattiv li jinduċi l-apoptożi l-aktar komuni u staurosporine. Skont ir-riżultati tal-analiżi bijoinformatika tagħna, END-MSCs senescent irriżultaw li kienu ferm aktar reżistenti għall-istress miċ-ċelloli ta 'kontroll. Fl-istess ħin, A549 senescent wera li r-reazzjoni opposta kienet kemmxejn aktar suxxettibbli minn ċelluli ta 'kontroll għaż-żewġ tipi ta' stimuli stressanti. Għalhekk, l-azzjoni senolitika tal-glikosidi kardijaċi, għall-inqas għal A549, tista 'tkun medjata mill-predispożizzjoni ta' ċelluli senescent ta 'din l-oriġini għall-apoptożi meta mqabbla mal-kontropartijiet ta' kontroll tagħhom, filwaqt li n-nuqqas ta 'senolysis indotta minn ouabain fl-hMSCs tista' tiġi spjegata biż-żieda fil- reżistenza apoptotika ġenerali matul is-senescence ta 'dawn iċ-ċelloli. Barra minn hekk, id-dgħjufija tad-"difiża antiapoptotika" mill-inibizzjoni tal-MCL-1 ippredisponi END-MSCs għal senolysis indotta minn glikożidi kardijaċi. Għalkemm stajna niksbu s-senoliżi mixtieqa ta' END-MSCs billi ninibixxu l-MCL-1, l-istrateġija biex timmodula l-espressjoni tal-ġeni konkreti anti-apoptotiċi biex tippredisponi hMSCs senescent għal senolysis ma tidhirx promettenti ħafna, peress li l-espressjoni id-dinamika tal-ġeni konkreti anti- jew pro-apoptotic tista 'tvarja bejn ċelluli ta' oriġini varji. Aħna nemmnu li l-akkwist tal-hekk imsejjaħ profil "anti-apoptotic" matul is-senescenza taċ-ċelluli, aktar milli alterazzjonijiet fil-ġeni konkreti anti- jew pro-apoptotic, huwa responsabbli għar-reżistenza għall-ouabain, f'dan ir-rigward il-possibbiltà li jaqilbu l-profil kollu tista ' jidhru aktar raġonevoli.

Il-konklużjonijiet tagħna li jenfasizzaw ir-reżistenza għall-apoptożi miksuba matul is-senescenza tal-hMSCs bħala barriera intrinsika għal analiżi effettiva jistgħu jiġu estiżi ferm lil hinn mill-glikosidi kardijaċi. Notevolment, l-hMSCs senescent instabu li huma reżistenti għal komposti senolitiċi oħra. Tabilħaqq, billi analizzajna l-evidenza eżistenti sibna li diversi komposti bl-attività senolitika ddikjarata, inklużi navitoclax, nicotinamide riboside, danazol geldanamycin, ganetespib, fisetin, inibituri BCL-XL, quercetin, etomoxir, antimycin A, FOXO{2}}DRI ,17-DMAG irriżulta li ma kienx effettiv għat-tneħħija mmirata ta 'preadipocytes umani senescent (ċelluli prekursuri bħal fibroblasti derivati ​​minn tessut xaħmi uman) u hMSCs mill-mudullun [17-19, 36, 40). Id-dejta dwar in-nuqqas ta 'analiżi fl-hMSCs tikkontradixxi kemmxejn ir-riżultati ta' ispirazzjoni miksuba bl-użu ta 'mudelli ta' ġrieden in vivo, li turi riżultati pożittivi fuq applikazzjoni sistemika ta 'analitiċi [37, 38]. Pereżempju, intwera li t-tneħħija taċ-ċelluli staminali tal-glandola tal-bżieq senescent bl-użu ta 'ABT263 jista' jipprevjeni xerostomija indotta mir-radjuterapija [38]. Barra minn hekk, it-tneħħija tal-MSCs tal-mudullun senescent permezz tal-quercetin tejbet il-formazzjoni tal-mudullun [37]. Importanti, intwera li l-MSCs tal-ġrieden u tal-firien senescent b'differenza mill-hMSCs huma reattivi għall-analitika. Pereżempju, quercetin, quercetin-tin＋dasatinib, u ABT263 neħħew b'mod sinifikanti l-MSCs tal-ġrieden senescent [16]. Ukoll, 17-DMAG intwera li jnaqqas ħafna bmMSCs senescent f'mudell ta' ġrieden progeroid [19]. Għalhekk, it-titjib f'diversi organi u sistemi li jiffunzjonaw deskritt f'dawn l-istudji huwa spekulat li huwa l-konsegwenza tat-tneħħija mmirata taċ-ċelloli staminali tal-ġrieden senescent. Madankollu, dawn l-analitiċi għadhom ma wrew l-ebda tiġdid funzjonali ta 'hMSCs. Distinzjoni ovvja bħal din bejn ir-rispons tal-ġrieden u l-MSCs umani lejn l-analiżi tissuġġerixxi li titjib mit-terapiji senolitiċi jista 'ma jiġix konservat madwar l-ispeċi. Ir-riżultati miksuba għall-kompost seno-litiku UBX0101 jistgħu jitqiesu bħala illustrazzjoni tajba li tikkonferma l-aħħar dikjarazzjoni. Dan l-aġent intwera li jneħħi ċelluli senescent f'mudell tal-ġurdien ta 'osteoartrite, li naqqas b'mod sinifikanti l-uġigħ u ppromwova t-tiswija tal-qarquċa bil-ħsara [20]. Sfortunatament, UBX0101 naqas milli jnaqqas il-progressjoni tal-marda u l-uġigħ f'pazjenti b'osteoartrite bl-uġigħ moderata għal sservi matul provi kliniċi ta' fażi II [67-69]. Tqajjem tħassib simili dwar il-kombinazzjoni senolitika dasatinib＋querce-tin[68].

Fil-qosor, żewġ konklużjonijiet importanti joħorġu mid-dejta miksuba. L-ewwel wera li l-glikożidi kardijaċi ma jistgħux ineħħi l-hMSC senescent. In-nuqqas ta 'analiżi jista' jkun medjat minn K effettiv flimkien ma 'importazzjoni ċellulari u żieda fir-reżistenza għall-apoptożi f'hMSCs senescent. Dan tal-aħħar huwa aktar fundamentali u jiżvela li r-reżistenza għall-apoptożi mhijiex karatteristika ġenerali taċ-ċelloli senescent, peress li matul is-senescenza xi ċelloli jakkwistaw fenotip 'reżistenti għall-apoptożi', filwaqt li oħrajn le. Importanti, ċelluli A549 senescent li huma suxxettibbli għall-apoptosi biss jistgħu jitneħħew b'mod effettiv minn glikosidi kardijaċi. Ibbażat fuq dan nistgħu nispekulaw li l-effettività ta 'approċċi senolitiċi oħra tista' tiddependi fuq jekk iċ-ċelloli senescent humiex tabilħaqq reżistenti għall-apoptożi meta mqabbla mal-kontropartijiet proliferanti tagħhom. Fl-aħħarnett, għalkemm 'l-analitika' hija suġġett jaħraq u ħafna dejta ta' ispirazzjoni hija ppubblikata, il-konklużjonijiet dwar l-effettività tal-analiżi għandhom jittieħdu b'kawtela peress li l-eteroġeneità tas-senescenza taċ-ċelluli għadha 'puzzle'.

Dan l-artikolu huwa estratt minn Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x