GRP78 Espressjoni Żejjed Tqajjem ROŻA1-Mitofaġija Neuroprotettiva Medjata mill-IP3R Parti 3

3.1.3. Induzzjoni tal-mitofaġija permezz ta 'espressjoni żejda ta' GRP78 Medja Newroprotezzjoni

Aħna ipoteżijna li n-newroprotezzjoni medjata mill-GRP78- tista 'tkun permezz ta' awtofaġija selettiva tal-mitokondrija biex tħaffef it-tneħħija ta 'organelli difettużi.

F'dawn l-aħħar snin, aktar u aktar studji wrew li l-mitokondrija għandhom rwol importanti fil-formazzjoni u ż-żamma tal-memorja. Il-mitokondrija huma organu importanti fiċ-ċelloli li huma responsabbli biex jipproduċu l-enerġija. Barra minn hekk, il-mitokondrija huma wkoll involuti fir-regolamentazzjoni tal-metaboliżmu taċ-ċellula kollu u l-bilanċ tar-reazzjonijiet redox. Studji reċenti sabu wkoll li l-mitokondrija tista 'wkoll taffettwa s-solidifikazzjoni tal-memorja fit-tul billi tirregola l-bidliet fl-eċitabilità newronali.

Il-mitokondrija huma responsabbli għall-metaboliżmu ossidattiv fiċ-ċelloli, u l-enerġija taċ-ċelluli hija trażmessa prinċipalment permezz ta 'adenosine triphosphate (ATP) fil-mitokondrija. In-newroni, bħala unitajiet ta 'trasmissjoni ta' informazzjoni tal-ġisem tal-bniedem, għandhom domanda ta 'enerġija partikolarment għolja, għalhekk il-funzjoni normali tal-mitokondrija b'saħħitha tagħhom hija essenzjali għall-karatteristiċi fiżjoloġiċi tan-newroni u l-funzjoni normali tas-sistema nervuża. Ir-riċerkaturi sabu li fl-istat ta 'mard jew tixjiħ, is-saħħa tal-mitokondrija se ssirilhom ħsara u l-funzjoni tagħhom tonqos, u dan jirriżulta fi tnaqqis fil-funzjoni newronali u l-kapaċità tal-memorja affettwata.

Il-formazzjoni u ż-żamma tal-memorja teħtieġ koordinazzjoni kumplessa bejn newroni, sinapsi u mitokondrija fl-istess ħin. Fis-sinapsi fit-tarf tan-newroni, il-mitokondrija jinsabu bejn in-newroni u ċ-ċelloli gliali li jappoġġjaw in-newroni. Dawn is-sinapsi jippreżentaw struttura speċifika u huma plastik ħafna, li jistgħu jiġu aġġustati skont il-ħtiġijiet tal-memorja u t-tagħlim. Il-mitokondrija huma bħaċ-"ċentru tal-produzzjoni" tas-sinapsi, li jipprovdu newroni u sinapsi bl-enerġija u s-sustanzi li jeħtieġu, li jistgħu jirregolaw malajr l-eċitabbiltà tan-newroni u jżommu l-plastiċità u l-istabbiltà fit-tul tas-sinapsi.

Direzzjoni oħra ta 'riċerka relatata mal-mitokondrija u l-memorja hija li jiġu trattati ċ-ċelloli permezz ta' fatturi relatati mat-trasformazzjoni (tip ta 'proteina). Dan it-trattament jista 'jtejjeb il-funzjoni mitokondrijali, iżid ir-rata metabolika, u jipproteġi s-saħħa tan-newroni u s-sinapsi. Ibbażat fuq dawn l-istudji, huwa ssuġġerit li billi nsaħħu s-saħħa tal-mitokondrija, nistgħu ntejbu l-memorja u l-kapaċità intellettwali tagħna filwaqt li nnaqqsu r-riskju ta 'Alzheimer u mard newroloġiku ieħor.

Fil-qosor, il-mitokondrija huma parti integrali mill-formazzjoni u l-manutenzjoni tal-memorja. Is-saħħa tal-mitokondrija hija essenzjali għall-funzjoni normali tan-newroni u s-sinapsi u għaż-żamma tal-plastikità u l-istabbiltà fit-tul. Għandna nagħtu attenzjoni għad-dieta, l-eżerċizzju u d-drawwiet tal-istil tal-ħajja biex inżommu s-saħħa tal-mitokondrija, innaqqsu r-riskju ta 'Alzheimer u mard newroloġiku ieħor, u nsaħħu l-intelliġenza u l-memorja tagħna. Wieħed jista 'jara li għandna bżonn intejbu l-memorja, u Cistanche jista' jtejjeb b'mod sinifikanti l-memorja minħabba li jista 'wkoll jirregola l-bilanċ ta' newrotrasmettituri, bħal żieda fil-livelli ta 'acetylcholine u fatturi ta' tkabbir, li huma importanti ħafna għall-memorja u t-tagħlim. Barra minn hekk, Cistanche deserticola jista 'jtejjeb il-fluss tad-demm u jippromwovi l-kunsinna ta' ossiġnu, li jista 'jiżgura li l-moħħ jikseb nutriment u enerġija adegwati, u b'hekk itejjeb il-vitalità u r-reżistenza tal-moħħ.

Ikklikkja taf modi kif ittejjeb il-memorja tiegħek

B'appoġġ għal din l-ipoteżi, GRP78 ġie ppruvat li jippromwovi makroawtofaġija [4] (minn hawn 'il quddiem imsejħa awtofaġija).

Fittixna niddeterminaw jekk l-awtofaġija kinitx meħtieġa għal GRP78-newroprotezzjoni indotta bl-użu ta' diversi modulaturi awtofaġiċi karatterizzati tajjeb: rapamycin, li jattiva l-awtofaġija billi jinibixxi mTORC1, u żewġ inibituri tal-fluss awtofaġiku: 3-methyladenine ({{4 }}MA), inibitur tal-klassi III phosphatidylinositolkinase PI3K, u LY294002, inibitur tal-klassi I PI3K.

It-tliet modulaturi tal-awtofaġija naqsu s-sopravivenza kemm fil-gruppi GFP kif ukoll f'GRP78 f'ċelloli ttrattati b'Tun meta mqabbla mal-vettura (Figura 4A). Dawn ir-riżultati ssuġġerew li l-bidu korrett tal-awtofaġija, permezz tal-mogħdija PI3K-Beclin1, u l-fluss tard kien meħtieġ, għalkemm mhux suffiċjenti, għall-effetti newroprotettivi tal-espressjoni żejda ta 'GRP78 f'ċelloli ER-istressed.

Figura 3. L-espressjoni żejda ta 'GRP78 issalva disfunzjoni mitokondrijali f'ċelloli NSC34 stressati. (A) Immunoblot u bar graph li juru l-livelli ta 'GRP78 f'ċelloli NSC34 nukleofettati b'vettur tal-plasmid biex jesprimu żżejjed GRP78 jew kontroll proteinas mhux relatat (GFP). (B) Perċentwal ta' sopravivenza ta' ċelluli NSC34 li jesprimu GFP- jew GRP78-(jfisser ± SEM) wara 24 siegħa f'mezz li fih 1 µg/mL tunicamycin (Tun) (xellug) jew 10 µM nocodazole (lemin) determinat bl-użu ta' analiżi MTT (n=4; * p < 0.005,** p < 0.001 vs. GFP, it-test t ta' Student ). (C) Analiżi kwantitattiva tal-fluworexxenza MitoSOX f'ċelloli li jesprimu żżejjed GFP orGRP78 u ttrattati b'Tun jew vettura (xellug) jew efavirenz (EFV) bħala kontroll jew vettura (lemin). (D) Analiżi kwantitattiva tal-fluworexxenza TMRM f'ċelloli li jesprimu żżejjed GFP jew GRP78 u ttrattati b'Tun jew vettura (xellug) jew EFV jew vettura (lemin) (GFP-Veh huwa l-grupp ta 'kontroll). (E) Xellug: Analiżi rappreżentattiva tal-konċentrazzjoni O2 (bl-użu ta 'elettrodu O2 tat-tip Clark) bħala funzjoni tal-ħin f'ċelloli li jesprimu żżejjed GFP jew GRP78 u ttrattati b'Tun. Dritt: Il-konsum ta’ O2 wara 5 sigħat ta’ Tuntreatment f’ċelloli li jesprimu żżejjed GFP jew GRP78 (GFP-Veh huwa l-grupp ta’ kontroll) (n=4; * p < 0.05 vs. Veh-GFP, # p < 0.05 vs.GRP78, ANOVA f'direzzjoni waħda).

Figura 4. It-tikkettar tal-mitokondrija għall-mitofaġija huwa privileġġjat minn espressjoni żejda GRP78. (A) Grafika tal-bar tal-perċentwali ta' ċelluli NSC34 vijabbli (medja ± SEM) nukleofettati jew bi plasmidi GFP jew GRP78 u ttrattati b'Tun jew kombinazzjoni ta'Tun b'modulaturi awtofaġiċi: rapamycin (RAPA), 3MA, jew LY -902, dwar vettura ta' kontroll (Veh), determinata b'assaġġ MTT 24 siegħa wara t-trattament (GFP-Veh huwa l-grupp ta' kontroll) (n=4-8, * p <0.05 vs.

Veh-GFP; # p < 0.05 vs. Tun-GFP).(B) Immaġini konfokali rappreżentattivi ta' ċelluli nukleofettati bil-plasmid PARK2-HA waħdu (fuq, pannelli tan-nofs, kontroll) jew bi Plażmid GRP78 (pannelli tal-qiegħ) ittrattat jew b'vettura (Veh) jew Tun (5 h) u immunostained għal HA (aħdar) u HSP60 (aħmar); bar tal-iskala=10 µm. (C) Medja ± SEM tal-koeffiċjent ta 'korrelazzjoni ta' Pearson tal-ko-lokalizzazzjoni ta 'Parkin u Hsp60 minn gruppi Veh, Tun, u Tun + GRP78 (n=4; * p < 0.05 vs Parkin-Veh, # p < 0.05 vs.

Parkin-Tun, ANOVA one-way). (D) Xellug, Western blots għal proteini indikati fil-frazzjonijiet mitokondrijali (mito) u cytosolic (cyto) miġbura minn ċelluli li jesprimu żejjed GFP- orGRP78-trattati b'vettura jew Tun għal 5 sigħat. Il-proteini analizzati huma OPA-1, CV- , PDI, GRP78, residwi Ubiquitinated, LC3, u actin. Dritt, bar graphs tal-bidla medja ta' darbiet ta' GRP78 fiż-żewġ frazzjonijiet miġbura u LC{{1{{20}}}}II fil-frazzjoni mitokondrijali relattiva għall-actin (cytosol) jew is-subunità beta tal-kumpless V (CV-B) (mitokondrija) fil-grupp GFP. (E) Grafika tal-bar tal-perċentwali ta' ċelluli vijabbli (jfisser ± SEM) li jesprimu żżejjed proteini GFP jew GRP78 u ttrattati b'Tun waħdu jew flimkien ma' CCCP, CSA, jew BAPTA-AM, determinati b'assaġġ MTT 24 siegħa wara t-trattament li jirrigwarda vettura ta' kontroll ittrattata ċelluli. (F) Bar graph simili tal-vijabbiltà taċ-ċelluli għal ċelloli ttrattati b'thapsigargin (THA) b'CCCP jew mingħajr (GFP-Veh huwa l-grupp ta' kontroll) (n=4-8, fi 3 esperimenti differenti, * p < 0.05 vs. . kontroll-Veh;# p < 0.05 vs GRP78-Tun).

Parkin mhux dejjem jipparteċipa fil-mitofaġija peress li jista 'jiġi attivat ukoll permezz ta' mekkaniżmi alternattivi [46]. Biex niżguraw jekk Parkin huwiex involut fl-effett medjat tal-GRP78-, iddeterminajna l-post subċellulari ta 'Parkin b'tikketta HA espressa f'ċelloli NSC34 bi u mingħajr stress ER.

Permezz ta 'mikroskopija konfokali, osservajna li Parkin kien imqassam madwar iċ-ċellula NSC34 wara 5 sigħat ta' trattament ta 'vettura jew Tun (Figura 4B). B'kuntrast, f'ċelloli li jesprimu żżejjed GRP78, kien hemm żieda fil-ko-lokalizzazzjoni ta' Parkin ma 'HSP60, proteina mitokondrijali. , li jissuġġerixxi l-mira ta 'din il-formitofaġija tal-organelle (Figura 4B, C).

Barra minn hekk, iżolajna l-frazzjonijiet mitokondrijali u ċitosoliċi minn ċelloli li esprimew iżżejjed jew GFP jew GRP78 u ġew ittrattati b'Tun jew vettura bħala kontroll f'5 sigħat wara l-insult. Il-purità tal-frazzjonijiet mitokondrijali miġbura miġbura ġiet ikkonfermata bl-analiżi tal-preżenza ta 'OPA1 u CV, u n-nuqqas ta' proteina residenti ER, il-proteindisulfide isomerase (PDI) (Figura 4D).

Interessanti, aħna osservajna wkoll tendenza li tiżdied l-abbundanza ta 'GRP78 fil-frazzjonijiet mitokondrijali miġbura ta' ċelloli ER-stressed meta mqabbla mal-kontroll. Innota li għalkemm l-istimolu Tun jista 'wkoll jinduċi żieda fil-livelli GRP78 fiċ-ċitosol, dan ma deherx fil-frazzjoni mitokondrijali.

Espressjoni żejda sfurzata ta 'GRP78 ippromwoviet tendenza li tiżdied kemm l-akkumulazzjoni ta' PINK1 kif ukoll ta 'Parkin fil-frazzjoni themitokondrijali (Figura 4D u Figura S4). Huwa rrappurtat li l-preżenza ta 'Parkinamplifies l-akkumulazzjoni ta' Ub u ttejjeb il-mitofaġija meta mqabbla mal-preżenza ta 'PINK waħdu [42,47]. Għaldaqstant, l-immunoblotting ta 'Ubiquitin (Ub) żvela differenzi fil-profil tiegħu fil-frazzjonijiet mitokondrijali minn ċelluli li jesprimu GRP 78- meta mqabbla mal-grupp GFP (Figura 4D).

F'kundizzjonijiet stressanti, l-ubiquitylation tal-proteini mitokondrijali twassal għal reklutaġġ ta 'komponenti ta' makkinarju awtofagożomi li jibda bl-akkumulazzjoni tal-iżoforma lipidata ta 'LC3, u LC3II [42,48].

Proteina LC3II abbundanti ġiet osservata fil-frazzjoni mitokondrijali b'tendenza li tiżdied preżenza ogħla fiċ-ċelloli enfasizzati li jesprimu GRP78 iżżejjed fir-rigward ta 'dawk b'GFP f'kundizzjonijiet simili (Figura 4D). tikkettjar għal mitofaġija.

Biex tiddetermina r-rilevanza possibbli tal-induzzjoni tal-mitofaġija għall-effett newroprotettiv medjat minn espressjoni żejda ta 'GRP78, aħna vvalutajna l-alterazzjonijiet indotti minn attivaturi u inibituri tal-mitofaġija. Aħna użajna carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP) biex inkunu kimiċi tneħħi l-akkoppjar tal-fosforilazzjoni ossidattiva u tinduċi l-mitofaġija billi tikkollassa l-potenzjal tal-membrana mitokondrijali [49,50], kif ukoll żewġ inibituri tal-mitofaġija: BAPTA-AM, kelatur permeant taċ-ċelluli ta 'Ca intraċellulari. 2+ u cyclosporin A (CSA), inibitur tal-pori tat-transizzjoni tal-permeabilità tat-temitokondrija (mPTP) li jimblokka l-effluss ta' Ca2+ mill-mitokondrija [51].

Għalkemm it-trattament CCCP f'NSC34 ma kienx biżżejjed biex inaqqas b'mod notevoli l-vijabbiltà, kif irrappurtat b'mod wiesa ', sibna li l-istess trattament fuq ċelluli stressed ER żied is-sopravivenza tiegħu, irrispettivament minn jekk GRP78 kienx espress iżżejjed jew le (Figura 4E).

Importanti, l-effett newroprotettiv promoss minn GRP78 espressjoni eċċessiva ta 'ċelluli tensjoni onER tneħħa fil-preżenza ta' jew CSA jew BAPTA-AM (Figura 4E). huwa importanti għall-effett newroprotettiv promoss minn GRP78.

Possibbiltà waħda għal GRP78 li jinduċi mitofaġija tista' tkun li tiffaċilita l-azzjoni meħtieġa medjata minn Ca2+-, forsi permezz tal-azzjoni tar-riċettur ta' inositol 1,4,5 trifosfat (IP3R) residenti fl-ER li l-ftuħ tiegħu jippermetti fluss ta' Ca2+ mill-ER sal-mitokondrija. Ridna nesploraw din il-possibbiltà billi nwaqqfu l-attivazzjoni ta 'IP3R bl-użu ta' thapsigargin(THA), inibitur ta' Ca2+ ATPase [52].

Thapsigargin huwa magħruf ukoll li jipproduċi stress ER fiċ-ċelluli peress li dan it-trattament inaqqas il-ħażniet ta' Ca2+ mill-ER, u għalhekk iżid l-espressjoni ta' GRP78 bħala parti mir-rispons tal-proteina mhux mitwija kanoniku [53]. Il-Figura 4F turi li thapsigargin jaffettwa l-vijabbiltà taċ-ċelluli b'mod simili għat-trattament ta 'tunicamycin f'ċelluli ta' kontroll GFP u li t-trattament konkomitanti ta 'CCCP jipprevjeni l-mewt taċ-ċelluli kif osservat b'Tun.

Madankollu, l-espressjoni żejda sfurzata ta 'GRP78 ma kinitx kapaċi timblokka l-effett detrimentali ta' thapsigargin kif għamlet bl-insult ta 'tunicamycin. Din l-osservazzjoni tikkonferma l-involviment meħtieġ tal-fluss ta 'Ca2+ fl-effett newroprotettiv ta' GRP78, probabbilment permezz ta 'IP3R.

3.1.4. Neuroprotezzjoni Medjata minn GRP78 Jiddependi fuq PINK1 u IP3R

Biex tibda l-identifikazzjoni tal-medjaturi tal-effett newroprotettiv GRP78, użajna t-teknoloġija shRNA. L-ewwel, aħna vverifikajna li l-shRNA magħżul naqqas l-espressjoni ta 'GRP78, PINK1, jew IP3R, rispettivament (Figura S4A-C) u li ma kkompromettewx il-vijabbiltà taċ-ċelloli ta' kontroll (Figura S4D). L-ewwel ikkonfermajna li l-espressjoni ta 'GRP78 innifisha kienet meħtieġa kemm għan-newroprotezzjoni medjata minn GRP 78- kif ukoll minn CCCP biex tiffaċċja stress indott minn Tun (Figura 5A).

Sussegwentement, is-sajlenser jew PINK1 jew IP3R imblukkat l-effett newroprotettiv promoss minn espressjoni żejda GRP78 jew trattament CCCP (Figura 5A). Barra minn hekk, sibna li l-bidla GRP78, normalment imqassma f'distribuzzjoni spotty bla xkiel madwar in-nukleu, tkun ko-lokalizzata għal IP3R f'fokus ta' speckle meta kienet espressa żżejjed (Figura 5B).

Flimkien dawn ir-riżultati ssuġġerew li GRP78 jimmodula l-mitofaġija protettiva fil-mudell in vitro tagħna, u jeżerċita din in-newroprotezzjoni b'mod ROŻ1- u dipendenti fuq l-IP3R.

4. Diskussjoni

It-tisħiħ tal-mekkaniżmi endoġeni ta 'newroprotezzjoni jista' jagħti għodod terapewtiċi effiċjenti biex jipprevjenu proċessi newrodeġenerattivi wara leżjonijiet trawmatiċi jew mard [3,54,55].Il-chaperone residenti ER GRP78 jinsab f'salib it-toroq ta 'diversi minn dawn il-mekkaniżmi li jippromwovu n-newroprotezzjoni meta espress iżżejjed f'diversi mard. mudelli [4].

Biex niddeterminaw il-mekkaniżmi sottostanti, użajna mudell ta 'avulsjoni ta' l-għeruq tas-sinsla [55] li tfixkel il-konnettività motoneuron u tikkawża proċess newrodeġenerattiv retrograd [20].

Il-mewt tal-motoneuron f'dan il-mudell hija kkaratterizzata minn stress ER, fluss awtofaġiku imblukkat, u mhix apoptotika peress li ma ġew osservati l-ebda forom attivi ta 'caspase 3 jew 12, li jindika li l-apoptosis mhix l-eżekutur finali tal-mewt newronali [20]. Skont, qabel ivverifikajna b'approċċi ta 'proteomika li l-karatteristiċi anti-apoptotiċi jseħħu b'mod parallel ma' dawk apoptotiċi wara l-RA, li jimblukkaw eżekuzzjoni effettiva tal-apoptożi [25].

F'dak il-kuntest newrodeġenerattiv, l-espressjoni żejda ta 'GRP78 eżerċitat newroprotezzjoni tal-mutur [20,26,27]. Hawnhekk, inizjalment, użajna analiżi komparattiva u kwantitattiva imparzjali tal-proteome biex niskopru l-bażi primarja għal din in-newroprotezzjoni.

B'mod mhux mistenni, il-mitokondrija kienu l-mira ewlenija, b'kontenut ta 'proteina tal-organelle ridott akkumpanjat minn dekorazzjonijiet ta' mitokondrija miġbuda ġo veżikoli fi ħdan motoneuroni bil-ħsara li esprimew GRP78 żżejjed.

Dawn l-osservazzjonijiet issuġġerew il-preżenza ta 'mitophagy bħala element ewlieni għan-newroprotezzjoni. Esperimenti Deeperin vitro vvalidaw din l-ipoteżi peress li GRP78 medja newroprotezzjoni billi (i) irrestawra r-respirazzjoni tal-mitokondrija u l-livelli ROS, (ii) jistimula t-traslokazzjoni tal-mitokondrija PINK1/PARKIN, ittikketta l-organelle għal mitofaġija, u (iii) jiddependi fuq il-funzjoni tal-IP3R bħala medjatur essenzjali.

Sa fejn nafu tagħna, dan huwa l-ewwel studju li juri li l-espressjoni żejda tal-GRP78 tippromwovi l-mitofaġija protettiva. Minbarra r-rwol tal-GRP78 fil- chaperoning ta’ proteini li jintwew ħażin u funzjonijiet oħra ta’ dawl tal-qamar bħala proteina li torbot il-kalċju [4,56], aħna żidna l-azzjoni pro-attiva tagħha għal jistimula l-mitofaġija. Barra minn hekk, l-istudju tagħna jingħaqad ma' sett ta' studji reċenti li jgħaqqdu l-istress ER ma' disfunzjoni mitokondrijali [57-59].

Sibna karatteristiċi għal mitofaġija in vivo meta GRP78 kien espress iżżejjed u promoss in-newroprotezzjoni. L-istess ġie osservat bl-użu ta 'mudelli in vitro li jimitaw xi karatteristiċi tal-proċess newrodeġenerattiv li jseħħ wara RA bħal stress ER [20,26].

Il-kontroll tal-kwalità tal-mitokondrija permezz tal-mitofaġija huwa kruċjali biex jimmonitorja l-kontenut mitokondrijali u l-omeostasi tal-metaboliżmu. Fil-letteratura, għadu kontroversjat jekk l-induzzjoni tal-mitofaġija tippromwovix is-sopravivenza jew il-mewt taċ-ċelluli f'diversi mard minħabba l-crosstalk estensiv tagħha mas-sinjalar tal-apoptożi [60], għalkemm ġie deskritt li t-tneħħija tal-mitokondrija bil-ħsara għandha rwol fundamentali f'mard newrodeġenerattiv bħall-marda ta' Alzheimer , marda ta 'Parkinson, jew inaging [61].

Preċedentement, ġie rrappurtat li GRP78 jinibixxi l-apoptożi kkawżata mill-istress ER billi jipprevjeni l-induzzjoni CHOP [62,63], l-attivazzjoni ta 'caspase 7 [5], jew billi jattiva l-assi tas-sinjalar PI3K-AKT-mTOR [4]. Intwera wkoll li jżomm livelli baxxi ta 'stress ossidattiv u ħsara lid-DNA [4,64]. B'mod partikolari, fiċ-ċelloli tal-kanċer, intwera li GRP78 jnaqqas ir-ROS billi jattiva sinjali tal-proteina kinase RNA-likeendoplasmic reticulum kinase (PERK)-NRF2 [65,66], li jwassal għal regolazzjoni 'l fuq ta' ġeni relatati mal-antiossidanti kif ukoll it-tisħiħ tal-livelli tal-proteini tal-kanċer. enżimi glikolitiċi [67].

Minflok, sibna li l-espressjoni żejda GRP78 irregolat enzimi glikolitiċi (eż., ENO1 u ENO2) (Tabelli supplimentari). Dawn ir-riżultati jistgħu jissuġġerixxu li fil-mudell tagħna, l-attenwazzjoni osservata ta 'ROS tista' tkun pjuttost relatata ma 'żieda mitofaġija, għalkemm id-dettalji tal-mekkaniżmu involut għandhom jiġu investigati aktar. Disfunzjoni mitokondrijali hija kundizzjoni komuni f'mard newrodeġenerattiv [68], u mitofaġija kienet involuta fil-Parkinson's [49,69], Huntington's [70,71], u l-mard ta' Alzheimer u t-Tauopathies [72].

Diversi awturi rrimarkaw li permezz ta 'regolazzjoni xierqa tal-mogħdijiet tal-mitofaġija, il-ġisem jista' jevita speċi ossidattivi ta 'ħsara, u jirregola l-bilanċ redox u l-omeostasi [73]. Għalhekk, l-espressjoni żejda ta' GRP78 permezz ta' din l-induzzjoni kkontrollata ta' mitofaġija tista' titqies bħala strateġija newroprotettiva f'dawn il-mard. Il-kelazzjoni BAPTA-AM ta 'Ca2+ tista' tintervjeni f'diversi passi tul il-mogħdija tal-fluss awtofaġiku, li timblokka mhux biss il-bidu tal-awtofaġija iżda wkoll jinibixxi passi fil-formazzjoni u l-ipproċessar tal-awtofagosomi [74].

B'kuntrast, l-użu ta' aġent ieħor li jaffettwa l-fluss ta' Ca2+, bħal asthapsigargin, ta riżultati sorprendenti. Thapsigargin jimblokka reticulumCa2+ ATPases sarco-endoplasmic (SERCAs), li jsostni l-elevazzjoni ċitosolika ta' Ca2+, iżda wkoll iqanqal stress ER permezz ta' tnaqqis kroniku tal-ħażniet ta' Ca2+ intraċellulari u l-akkumulazzjoni ta' proteini mhux mitwija.

F'din is-sitwazzjoni, osservajna li l-espressjoni żejda ta 'GRP78 ma setgħetx issalva ċelluli li jmutu, u ssuspettajna li jista' jkun minħabba li thapsigargin jimpedixxi wkoll l-azzjoni tal-IP3R [52].Attività IP3R bażika u fluss kontinwu ta' Ca2+ ta' livell baxx minn ER għal mitokondrija huma essenzjali biex jippromwovu r-respirazzjoni mitokondrijali u l-bijoenerġija taċ-ċelluli [75].

GRP78 jinteraġixxi ma' MAMs ma' kumpless iffurmat mir-riċettur sigma-1 (SIGR1) u IP3R [76,77]. Fuq ERstress, l-interazzjoni SIGR1-GRP78 tonqos ikkawżat mit-tnaqqis ta' Ca2+ li sussegwentement tagħti spinta lill-fluss ta' Ca2+ mill-ER għall-mitokondrija permezz tal-IP3Rs [76]. Barra minn hekk, intwera wkoll li l-IP3R kien meħtieġ għal mitofaġija indotta minn Parkin b'mod partikolari biex tippermetti r-raggruppament mitokondrijali downstream reklutaġġ ta 'Parkin [78].

Ir-riżultati tagħna jaqblu ma 'thin peress li t-tnaqqis ta' IP3R bit-teknoloġija shRNA abolit in-newroprotezzjoni eżerċitata minn espressjoni żejda ta 'GRP78 f'ċelloli enfasizzati ER. L-osservazzjoni li GRP78 jista' jiżdied fil-frazzjoni tal-mitokondrija nnifisha hija interessanti wkoll. GRP78 ġie skopert fi ħdan l-ispazju intermedju tal-membrana ta 'ġewwa u l-matriċi tal-mitokondrija, għalkemm il-funzjoni tiegħu għad trid tiġi eluċidata [79].

Madankollu, u fir-rigward tad-diversi funzjonijiet tagħha, aħna nispekulaw li jista' jkun bufferingCa2+. Jekk dan kien il-każ, il-preżenza miżjuda tagħha fi ħdan il-mitokondrija f'ċelluli stressati mill-ER meta espressa żżejjed tista' tattenwa influss massiv ta' Ca2+ biex tevita li tmexxi l-apoptożi. Esperimentazzjoni ulterjuri dwar dan tkun siewja ħafna.

Limitazzjonijiet ta' Studju u Riċerka Futura

Dan l-istudju jwitti t-triq għal analiżi futuri dwar ir-rwol newroprotettiv tal-mitofaġija dipendenti fuq GRP78-fil-mewt newronali wara newrotrawma. L-ewwel limitazzjoni ta 'dan l-istudju hija li l-mitofaġija ġiet analizzata f'tieqa ta' żmien speċifika wara RA, u peress li l-mitofaġija hija proċess dinamiku, ikun interessanti li jiġi deċifrat il-fluss tagħha u liema molekuli huma involuti.

Għalhekk, aktar esperimenti li jimmodulaw il-mitofaġija (permezz ta 'approċċi farmakoloġiċi jew ġenetiċi) huma meħtieġa biex jiddeċifraw jekk l-effetti osservati in vivo humiex purament dipendenti fuq il-mitofaġija.

Dan se jippermettilna nikkonfermaw li l-espressjoni żejda ta 'GRP78 tippromwovi s-sopravivenza tal-MN permezz tal-mitofaġija. Peress li hemm crosstalk deskritt tajjeb bejn il-mitokondrija u l-apoptożi, manipulazzjonijiet ulterjuri in vitro u in vivo huma essenzjali biex jiġi deċifrat liema mekkaniżmu tal-mewt iqanqal il-mewt tal-MN fil-mudell tagħna. Dan jgħin biex jiċċara jekk GRP78 jimmodulax direttament dak il-mekkaniżmu tal-mewt taċ-ċelluli billi jimblokkah jew jekk il-preżenza tiegħu tippermettix lill-MNs ilaħħqu miegħu u jgħixu.

5. Konklużjonijiet

L-istudju preżenti kien l-ewwel li ddeskriva rwol ġdid għal GRP78 fil-modulazzjoni tal-mitofaġija biex tinkiseb protezzjoni motoneuronali. Ir-riżultati tagħna jiżvelaw li GRP78 jista 'jmexxi l-mitofaġija biex jippromwovi n-newroprotezzjoni ta' newroni tal-mutur li jiddeġeneraw wara korriment trawmatiku tan-nervituri sever, u jirrestawra l-funzjoni mitokondrijali bil-ħsara fiċ-ċelluli newronali. Barra minn hekk, din in-newroprotezzjoni medjata minn GRP78-tiddependi fuq PINK1 u IP3R. Għalhekk, l-attivazzjoni ta' mitofaġija rfinata, permezz ta' terapija tal-ġeni b'GPR78 jew kandidati oħra, tista' tintuża bħala approċċ terapewtiku ġdid għal korrimenti trawmatiċi tas-sistema nervuża. .

Materjali Supplimentari: Dawn li ġejjin huma disponibbli onlajn fuq https://www.mdpi.com/article/10.3390/biomedicines9081039/s1. Figura S1: Analiżi bijoinformatika. Figura S2: Livelli GRP78 endoġeni wara trattament Tun. Figura S3: Tun u EFV jikkawżaw disfunzjoni mitokondrijali fiċ-ċelloli NSC34.Figura S4: L-ebda titolu. Figura S5: Analiżi tal-vijabbiltà taċ-ċelluli wara shRNA nukleofection Il-materjali supplimentari jinkludu wkoll it-tabelli bil-proteini kollha misjuba fl-analiżi proteomika.

Kontribuzzjonijiet tal-Awtur: TL-R. u DR-G. iddisinja u wettaq l-esperimenti, analizza r-riżultati, u kiteb parti mill-manuskritt. MH-G. u JF għenu b'esperimenti in vivo.PM-G. u JML wettaq il-purifikazzjoni mitokondrijali. MP, CB, u NA għenu fl-analiżi funzjonali tal-mitokondrija. VP u AB ħejjew il-plażmidi u l-vectors virali GRP78 kollha użati. CC ikkonċepita, iddisinja, issorvelja, u analizza l-esperimenti kollha u kiteb il-manuskritt. L-awturi kollha qraw u qablu mal-verżjoni ppubblikata tal-manuskritt.

Finanzjament: Dan ix-xogħol kien appoġġjat prinċipalment mill- Ministerio de Economía y Competitividad ta 'Spanja (#SAF 2014-59701) u mill-Marato de TV3 (#201607.10). Aħna grati wkoll għall-appoġġ mill-finanzjament CIBERNED u Generalitat de Catalunya. CB huwa benefiċjarju tal-kuntratt ta' Miguel Servet (CP19/00077) mill-Istitut tas-Saħħa Carlos III.

Dikjarazzjoni tal-Bord ta' Reviżjoni Istituzzjonali: Il-proċeduri kollha li kienu jinvolvu l-annimali ġew approvati mill-Universitat Autònoma de Barcelona u mill-Generalitat de Catalunya u segwew id-Direttiva tal-Kunsill tal-Komunità Ewropea 2010/63/UE.

Dikjarazzjoni ta' Kunsens Informat: Mhux applikabbli.

Dikjarazzjoni tad-Disponibbiltà tad-Data: Id-dejta kollha ġġenerata jew analizzata matul dan l-istudju hija inkluża f'dan l-artikolu ppubblikat u l-fajls ta 'informazzjoni supplimentari tiegħu.

Rikonoxximenti: Nirringrazzjaw lil Marta Monserrat, Ariadna Aransanz, Miguel Chillón, Julia Lorenzo, Sara Marmolejo, u l-Grupp ta' Neuroplasticity u Riġenerazzjoni fl-UAB. Nirringrazzjaw speċjali lil Carlos Guillem (Università Complutense de Madrid) talli ġentilment ipprovda l-PARK2-HAplasmid u lil Elena Galea u Esther Dalfo fl-UAB għall-antikorpi.

Kunflitti ta' Interess: L-awturi ma jiddikjaraw l-ebda kunflitt ta' interess.

Dikjarazzjoni Speċjali: L-awturi jixtiequ jiddedikaw aċċenn speċjali b’tifkira ta’ Caty Casas, xjenzata influwenti, u persuna mill-isbaħ u kuraġġuża, li mietet qabel iż-żmien fl-età ta’ 54 sena. Kien unur u privileġġ li taqsam parti minnha ħajja, il-kapaċità professjonali tagħha, u l-valuri etiċi u umani tagħha.

Referenzi

1. Conforti, L.; Gilley, J.; Coleman, MP Deġenerazzjoni Wallerian: Mogħdija tal-mewt tal-axon emerġenti li tgħaqqad il-korriment u l-mard. Nat.Rev. Newrosci. 2014, 15, 394–409. [CrossRef]

2. Romeo-Guitart, D.; Forés, J.; Herrando-Grabulosa, M.; Valls, R.; Leiva-Rodríguez, T.; Galea, E.; González-Pérez, F.; Navarro, X.;Petegnief, V.; Bosch, A.; et al. Droga newroprotettiva għat-trawma tan-nervituri żvelata bl-użu tal-Intelliġenza Artifiċjali. Sci. Rep 2018, 8,1879. [CrossRef]

3. Romeo-Guitart, D.; Forés, J.; Navarro, X.; Casas, C. Riġenerazzjoni msaħħa u Atrofija tal-Muskoli Denervated Mnaqqsa minn NeuroHealin Mudell Pre-kliniku ta 'Avulsjoni ta' l-Għeruq Lumbari b'Implantazzjoni Mdewma mill-ġdid. Sci. Rep 2017, 7, 12028. [CrossRef]

4. Casas, C. Grp78 fiċ-Ċentru tal-Istadju fin-Newrodegeneration u l-Kanċer. Quddiem. Newrosci. 2017, 11, 1–15. [CrossRef]

5. Reddy, RK; Mao, C.; Baumeister, P.; Austin, RC; Kaufman, RJ; Lee, AS Proteina chaperone tar-retikulu endoplasmic GRP78protects ċelluli minn apoptosi indotta minn inibituri ta 'topoisomerase. Rwol tas-sit tal-irbit tal-ATP fit-trażżin tal-attivazzjoni tal--7caspase. J. Biol. Chem. 2003, 278, 20915–20924. [CrossRef] [PubMed]

6. Wang, M.; Kaufman, RJ Titwija ħażina tal-proteini fir-retikulu endoplasmiku bħala kondjuwit għall-mard tal-bniedem. Natura 2016, 529,326–335. [CrossRef] [PubMed]7. Printsev, I.; Curiel, D.; Carraway, KL Kontroll tal-Kwantità tal-Proteina tal-Membrana fir-Retikulu Endoplasmiku. J. Membru. Biol. 2016,250, 1–14. [CrossRef] [PubMed]

8. Shu, C.-W.; Sun, F.-C.; Cho, J.-H.; Lin, C.-C.; Liu, P.-F.; Chen, P.-Y.; Chang, MD-T.; Fu, H.-W.; Lai, Y.-K. GRP78 u Raf-1kooperattivament jagħtu reżistenza għall-apoptosi indotta mill-istress tar-retikulu endoplasmiku. J. Cell. Physiol. 2008, 215, 627–635. [CrossRef]

9. Cook, KL; Clarke, R. Xokk tas-sħana 70 kDa proteina 5/proteina regolata bil-glukożju 78 "AMP" ing up autophagy. Autophagy 2012, 8,1827–1829. [CrossRef]

10. Li, Z.; Wang, Y.; Newton, IP; Zhang, L.; Ji, P.; Li, Z. GRP78 huwa implikat fil-modulazzjoni tal-glikolisi aerobika tat-tumur billi jippromwovi degradazzjoni awtofaġika ta 'IKK. Ċellula. Sinjal. 2015, 27, 1237–1245. [CrossRef]

11. Cha-Molstad, H.; Yu, JE; Lee, SH; Kim, JG; Sung, KS; Hwang, J.; Yoo, YD; Lee, YJ; Kim, ST; Lee, DH; et al. Modulazzjoni ta 'attività SQSTM1/p62 permezz ta' arginilazzjoni N-terminali tal-chaperon tar-retikulu endoplasmiku HSPA5/GRP78/BiP. Autophagy 2016,12, 426–428. [CrossRef]

12. Cha-Molstad, H.; Sung, KS; Hwang, J.; Kim, KA; Yu, JE; Yoo, YD; Jang, JM; Han, DH; Molstad, M.; Kim, JG; et al.Amino-terminal arginylation timmira chaperone tar-retikulu endoplasmiku BiP għall-awtofaġija permezz tat-twaħħil ta 'p62. Nat. Cell Biol.2015, 17, 917–929. [CrossRef] [PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com