Guy JM Cameron, et al

Korriment akut tal-kliewi(AKI) jista 'jkun fatali u huwa fattur ta' riskju definit tajjeb għall-iżvilupp ta 'kronikakliewimard. Iċ-ċelloli limfoid intrinsiċi tal-Grupp 2 (ILC2s) huma produtturi innati ta' ċitokini tat-tip-2 u huma regolaturi kritiċi tal-omeostasi fl-organi periferali. Madankollu, l-għarfien tagħna tal-funzjoni tagħhom fil-kliewihija relattivament limitata. Evidenza reċenti tissuġġerixxi li ż-żieda fin-numri ILC2 permezz ta' amministrazzjoni sistemika ta' interleukin rikombinanti (IL)-25 jew IL-33 tipproteġi kontra ħsara renali. Filwaqt li l-ILC2s jistgħu jiġu indotti biex jipproteġu kontra l-AKI indott minn iskemi jew kimiċi, l-impatt tad-defiċjenza jew it-tnaqqis tal-ILC2 fuq is-severità tal-ħsara renali mhux magħruf. L-ewwelnett, il-fenotip u l-post ta 'ILC2s fil-kliewiġew evalwati taħt kundizzjonijiet omeostatiċi.KilwaILC2s esprimew b'mod kostituttiv livelli għoljin ta' IL-5 u kienu jinsabu fil-viċin tal-vaskulatura renali. Biex tittestja r-rwol funzjonali tal-ILC2s fil-kliewi, intuża mudell sperimentali ta' ħsara tal-iskemija-riperfużjoni tal-kliewi (IRI) u s-severità tal-ħsara ġiet evalwata f'tip selvaġġ, ILC2-mnaqqsa, ILC2-defiċjenti, u ILC{{4} }ġrieden eżawriti. B'mod sorprendenti, ma kien hemm l-ebda differenzi fl-istopatoloġija, depożizzjoni ta 'collagen, jew espressjoni ta' mRNA ta 'fatturi assoċjati mal-ħsara (Lcn2), infjammatorji (Cxcl1, Cxcl2, u Tnf), jew matriċi extraċellulari (Col1a1, Fn1) wara IRI fin-nuqqas ta' ILC2s. Din id-dejta tissuġġerixxi li n-nuqqas ta 'ILC2s ma tbiddilx is-severità tal-korriment renali, li jissuġġerixxi tkeċċija possibbli. Għalhekk, mekkaniżmi oħra ta' attivazzjoni taċ-ċelluli immuni medjata tat-tip 2-x'aktarx li jikkumpensaw fin-nuqqas ta' ILC2s. Għalhekk, telf ta' ILC2s mhux probabbli li jżid is-suxxettibilità għal, jew is-severità ta' AKI.

Kliem ewlieni:ILC2, grupp 2 taċ-ċellula limfojde intrinsika, IL-5, IL-13,kliewi, renali, IRI, iskemija-riperfużjoni korriment

Għal aktar informazzjoni jekk jogħġbok ikkuntattja:emily.li@wecistanche.com

Cistanche tubulosa jipprevjeni mard tal-kliewi, ikklikkja hawn biex tikseb il-kampjun

INTRODUZZJONI

Korriment akut tal-kliewi(AKI) u l-patoloġiji assoċjati tagħha għandhom effetti profondi fuq is-saħħa tal-bniedem (1). Kawża komuni ta 'AKI hija iskemija renali, li primarjament taffettwa l-epitelju tubulari minħabba d-densità mitokondrijali għolja u l-attività metabolika f'dawn iċ-ċelloli (2); riveduti f’Devarajan (3) u Bonventre u Yang (4). Necrosis tubulari akuta tfixkel l-eskrezzjoni tal-iskart, tbiddel l-ilma u l-iżbilanċ tal-elettroliti, u tikkawża reazzjonijiet infjammatorji robusti; riveduta f’Bonventre u Yang (4). L-influss ta 'newtrofili u monoċiti jikkontribwixxi għall-ħsara, madankollu ċelluli immuni innati oħra jistgħu jiffaċilitaw ir-ritorn għall-omeostasi (5); riveduta fi Friedewald u Rabb (6). Iċ-ċelloli limfoid innati (ILCs) huma żieda riċenti għal din il-familja u huma kategorizzati fi 3 gruppi bbażati fuq il-fatturi ta 'traskrizzjoni li huma meħtieġa għall-iżvilupp tagħhom u miċ-ċitokini effetturi li jipproduċu (7). ILCs tal-Grupp 2 (ILC2s) huma produtturi qawwija ta' ċitokini tat-tip 2, prinċipalment interleukin (IL)-5 u IL-13 (8, 9). Dawn iċ-ċelloli jippromwovu wkoll l-irkupru tat-tessuti wara insult f'organi multipli u għandhom diversi funzjonijiet in vivo (10). Pereżempju, wara infezzjoni virali respiratorja bil-virus tal-influwenza, ILC2s jikkoordinaw it-tiswija tal-epitelju tal-passaġġ tal-arja billi jipproduċu l-fattur tat-tkabbir amphiregulin (AREG) (11). Aktar reċentement, ILC2s ġew investigati f'mudelli ta 'korriment renali inkluż korriment ta' iskemija-riperfużjoni (IRI), u korriment indott minn kimiċi nefrotossiċi b'doxorubicin jew cisplatin (12-16). L-IRI tal-kliewi tipikament tinkiseb billi tirrestrinġi temporanjament il-fluss tad-demm lejn il-kliewi għal 20-30 min, billi timmudella trawma minn trapjant jew intervent kirurġiku (17-21). B'mod kollettiv, dawn l-istudji juru li l-amministrazzjoni in vivo ta 'ċitokini tal-ġrieden rikombinanti li jattivaw ILC2s, jiġifieri IL-25 jew IL{-33, hija biżżejjed biex tnaqqas is-severità tal-ħsara taċ-ċelluli epiteljali tubulari (12-16). Riżultati simili nkisbu bit-trasferiment adottiv ta 'ILC2s attivati ​​ex vivo (12, 15). Filwaqt li l-ILC2s jistgħu jiġu kkaġunati b'mod artifiċjali biex jipproliferaw u jipproteġu kontra l-konsegwenzi ta' ħsara ta' korriment tal-kliewi sperimentali, l-impatt tad-defiċjenza ta' ILC2-għadu mhux mifhum kompletament. Tabilħaqq, ċelluli immuni oħra, li għandhom interazzjonijiet kumplessi mal-ILC2s bħal ċelluli T regolatorji (Treg) u makrofaġi attivati ​​alternattivament (AAM; magħrufa wkoll bħala M2) huma kritiċi għal dan l-effett renoprotettiv (22-25). F'dan l-istudju, fittxejna li nikkaratterizzaw aktar l-ILC2s fil-kliewi, il-post tagħhom f'dan l-organu, u niddeterminaw ir-rwol funzjonali tagħhom fl-IRI bl-użu ta 'approċċ ta' telf ta 'funzjoni. Hawnhekk, sibna likliewiILC2s jesprimu b'mod kostituttiv IL- 5 u jinsabu primarjament fil-viċin tal-vaskulatura renali, fi ħdan l-adventizja. Barra minn hekk, aħna nuru li tnaqqis, defiċjenza, jew tnaqqis tal-ILC2s kellhom impatt minimu fuq is-severità tal-IRI. Filwaqt li l-attivazzjoni tal-ILC2s u l-amplifikazzjoni assoċjata tal-immunità lokali tat-tip 2 preċedentement intweriet li tnaqqas il-konsegwenzi ħżiena tal-AKI, ir-riżultati tagħna jiżvelaw li korriment komparabbli sseħħ fl-assenza tal-ILC2s, li jissuġġerixxi li l-ILC2s jistgħu jkunu żejda fl-IRI meta immuni kumpensatorji oħra. ċelluli bħal ċelluli T huma preżenti.

MATERJALI U METODI

Ġrieden

Tmien sa tnax-il ġimgħa tat-tip selvaġġ maskili (WT; C57BL/6JAusb), vettura (Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus trattat bis-salina), ILC2-imnaqqsa (Roraflfl/ plus Il7rcre/ plus ), ILC{{ 8}}defiċjenti (Roraflfl/flfl Il7rcre/ plus ), ILC2- imnaqqsa (Diptheria toxoid ittrattat [DTx] Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus ), u IL-5/IL-13 ġrieden reporter doppju (Il5venus/ plus tadam Il13td/ plus ) ġrieden inkisbu minn Bioresources Awstraljan (Moss Vale, Awstralja). Il5td tadamCre; Rosa26-ġrieden reporter-tracker tal-CAG-RFP inkisbu minn Jackson Labs (ref# 030926 u 007914). Il-ġrieden kollha li għaddew minn kirurġija kienu miżmuma taħt kundizzjonijiet speċifiċi ta 'konteniment fiżiku mingħajr patoġenu 2, f'gaġeġ ventilati individwalment. Il-ġrieden kienu esposti għall-arja normali tal-kamra f'ambjent sterilizzat waqt l-operazzjoni. Il-ġrieden tħallew jakklimatizzaw ġimgħa qabel ma nbdew l-esperimenti u nżammu fuq ċiklu ta' 12-siegħa jum/lejl b'aċċess għal chow standard tal-laboratorju u ilma ad libitum.

Ċitometrija tal-Fluss u Analiżi t-SNE

Kliewiu l-pulmuni nġabru minn ġrieden reporter. Is-sospensjonijiet ta 'ċellula waħda ġew ippreparati kif deskritt fi "Preparazzjoni ta' sospensjonijiet ta 'ċellula waħda mill-pulmun tal-ġurdien bi trattament ta' Collagenase D" (Miltenyi Biotec GmbH, 2008; Bergisch Gladbach, il-Ġermanja). Iċ-ċelloli ġew imblukkati bi blokk Fc (purifikat kontra l-ġurdien CD16/32; Biolegend, San Diego, USA) għal 30 min u mtebbgħin b'antikorpi konjugati b'mod fluworexxenti kontra antiġeni tal-wiċċ taċ-ċelluli fil-mira (Tabella Supplimentari 1). Il-passi tat-tbajja 'u l-ħasil saru b'buffer tat-tebgħa BSA (BD Biosciences, North Ryde, Awstralja). Il-kampjuni ġew akkwistati fuq ċitometru tal-fluss BD LSR Fortessa X20. Id-dejta taċ-ċitometrija tal-fluss ġiet analizzata bl-użu ta 'FlowJo v10.5.3 (Tree Star, Ashland, USA). L-inkorporazzjoni tal-ġar stochastic distribwit t-t (t-SNE) twettqet fuq ILC2s (CD45 plus Lineage [TCR [TCR TCR δ CD8 CD4 ]CD11b GR-1 B220 TER-119 CD3 NK-1 .1 ] IL7R flimkien ma’ CD90.2 flimkien ma’ ST2 flimkien ma’ FSClowSSClow single cells). Bl-użu tal-plugin tat-teħid tal-kampjuni bl-addoċċ, in-numru ta 'avvenimenti f'kull kampjun ġie normalizzat biex ikun ugwali għall-inqas, imqarreb 'l isfel għall-eqreb 10 avvenimenti. Il-popolazzjonijiet kollha ġew magħquda f'fajl .fcs wieħed billi ikkonkatenaw il-popolazzjonijiet imnaqqsa fil-kampjun. L-analiżi t-SNE saret fuq il-kampjun konkatenat li fih il-popolazzjonijiet gated mill-kampjuni kollha tal-kliewi u tal-pulmun flimkien. Għal dan, il-kanali kkumpensati li ma ntużawx għal gating ġew evalwati taħt is-settings t-SNE li ġejjin: Iterazzjoni 1000, Perplexity 20, Eta 224. Intużaw istogrammi biex juru l-espressjoni differenzjali tal-antiġeni tal-wiċċ taċ-ċelluli u ċ-ċitokini fil-pulmun ukliewi

Immunofluworexxenza Il5td tadamCre; Rosa26-ġrieden li jsegwu l-ġrieden tar-reporter tal-CAG-RFP ġew ewtanizzati u mxerrda b'mod intrakardijaku b'salina buffered b'fosfat (PBS) u mbagħad 4 fil-mija paraformaldehyde (PFA) f'PBS. Il-kliewi tneħħew u nżammu f'4 fil-mija PFA frisk għal 24 siegħa f'4◦C u mbagħad maħsula f'PBS. Tliet mitt sezzjoni mikrometru ġew ippreparati bl-użu ta 'vibratome. Sussegwentement, sezzjonijiet tat-tessut ġew inkubati f'buffer ta' permeabilizzazzjoni (PBS/0.2 fil-mija Triton X{-100/0.3M glycine) imbagħad imblukkati f'PBS/0.2 fil-mija Triton X- 100/5 fil-mija serum tal-ħmar f'4◦C matul il-lejl. Il-kampjuni ġew maħsula f'PBS/0.2 fil-mija Tween-20 darba, imbagħad inkubati b'antikorpi primarji dilwiti f'PBS/0.2 fil-mija Tween-20/3 fil-mija serum tal-ħmar f'temperatura tal-kamra sal-għada. Sussegwentement, il-kampjuni ġew maħsula f'PBS/0.2 fil-mija Tween-20 għal 30 min, 3-4 darbiet, imbagħad inkubati b'antikorpi sekondarji dilwiti f'PBS/0 .2 fil-mija Tween-20/3 fil-mija serum tal-ħmar f'temperatura ambjentali għal 6–8 sigħat. Il-kampjuni ġew maħsula f'PBS/0.2 fil-mija Tween-20 għal ġurnata u mbagħad deidrati f'serje ta' etanol axxendenti (20, 30, 50, 70, 95, 100 fil-mija), 10 min kull pass . Fl-aħħarnett, is-sezzjonijiet tal-kliewi ġew ikklerjati bit-tixrib f'methyl salicylate (M-2047; Sigma-Aldrich, Castle Hill, l-Awstralja) u mbagħad immuntati f'methyl salicylate frisk fuq coverslip jew chamber konkavi. L-immaġini ġew maqbuda b'Nikon A1R laser scanning confocal inklużi 405, 488, 561, u 650 linji tal-laser għal eċċitazzjoni u immaġini b'16X / 0.8 jew 25X1.1, NA Plan Apo għanijiet ta 'immersjoni fl-ilma fuq distanza twila ta' ħidma. Z passi ġew akkwistati kull 6µm. L-immaġini ġew ipproċessati b'ImageJ (NIH, Bethesda, MD, US) u s-softwer Bitplane Imaris v8 (Andor Technology PLC, Belfast, N. Ireland). Rikostruzzjonijiet tal-wiċċ ta 'vini tad-demm ittikkettjati b'aktina tal-muskolu lixx alfa saru b'Imaris u psewdokuluriti bbażati fuq l-arkitettura u l-volum karatteristiċi tagħhom biex jiġu viżwalizzati arterji u vini kbar. Intużaw l-antikorpi u dilwizzjonijiet li ġejjin: Living Colors anti-DsRed Rabbit Polyclonal Pan Antibody (1:500; TaKaRa, Mountain View, USA), mogħoż polyclonal anti-alpha-smooth muscle actin antibody (1:200; Abcam, Cambridge, UK) ), Antikorp monoklonali eFluor 660 LYVE1 (1:300, klonu ALY7, eBioscience), antikorp CD3 tal-ħamster Armenjan kontra l-ġurdien (1:100, klonu 145-2C11, Biolegend), Alexa Fluor R 488 ħmar kontra l-mogħża IgG (H plus L), Alexa Fluor R 555 donkey anti-fenek IgG (H plus L) Alexa Fluor R 647 mogħoż anti-hamster IgG (H plus L) cross-adsorbed (1:400, ThermoFisher Scientific).

Korriment Iskemija-Riperfużjoni unilaterali

L-anestesija kirurġika ġiet indotta minn inalazzjoni ta 'isoflurane ta' 4 fil-mija u miżmuma b'inalazzjoni kontinwa ta 'isoflurane ta' 1-1.5 fil-mija permezz ta 'kon imnieħer. Matul il-proċedura, il-ġrieden inżammu fuq pjattaforma kirurġika miżmuma f'37 ± 1◦C permezz ta 'tapit tas-sħana diġitali kkontrollat ​​minn termostat. Nefrectomija tal-kliewi tal-lemin saret fl-annimali kollha. Biex jinduċu iskemija unilaterali, il-vini tal-kliewi tax-xellug ġew ikklampjati ħdejn il-pediklu renali għal 29-min bl-użu ta' morsa vaskulari sterili mhux trawmatika (Coherent Scientific; Hilton, Awstralja) li tapplika forza suffiċjenti biex tipprevjeni d-demm lejn u minnkliewimingħajr ħsara irriversibbli lill-bastimenti. Riperfużjoni uniformi u rapida tal-kliewiġie osservat wara li tneħħiet il-morsa vaskulari fil-ġrieden kollha. Il-feriti tal-muskoli u tal-ġilda ġew magħluqa bl-użu ta’ sutura 5/0 vicryl (Johnson & Johnson Medical, North Ryde, Awstralja), il-ġilda mbagħad ġiet issiġillata bl-użu ta’ kolla dermali (Provet, Charlestown, Awstralja) biex tipproteġi l-ferita u jipprevjenu l-infezzjoni. Annimali ta 'kontroll ġew soġġetti għal operazzjoni finta b'ħin ta' anestesija identiku u rċevew biss nefrectomija kontralaterali. Għal analġeżija effettiva, il-ġrieden irċevew 0.1 mg/kg ta’ buprenorphine taħt il-ġilda 30 min qabel l-operazzjoni u mbagħad 0.05-0.1 mg/kg kull 8-12-il siegħa, kif meħtieġ. L-annimali kienu tipikament miftuma mill-analġeżija sa 4 ijiem wara l-kirurġija mingħajr l-ebda sinjali ta 'uġigħ jew dwejjaq kif definit mill-karatteristiċi tal-wiċċ bl-użu tal-iskala standard tal-grimace tal-ġurdien; kif deskritt (26). Il-ġrieden kollha baqgħu ħajjin sal-endpoint predeterminat.

Tnaqqis ta' ILC2s in vivo

ILC2s ġew eżawriti f'Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus ġrieden b'injezzjoni intraperitoneali ta' 0.025 mg/kg ta' DTx (Sigma-Aldrich) kif deskritt qabel (27). DTx ingħata 30 minuta qabel l-operazzjoni u kuljum wara sa l-aħħar punt. Biex tikkonferma t-tnaqqis ta' ILC2-, subsett ta' annimali naïve irċieva DTx għal 3 ijiem. Kontroll Icosdtr/ plus Cd4cre/ plus ġrieden irċevew injezzjoni intraperitoneali salina.

Istoloġija

Imneħħijakliewikienu immedjatament sezzjoni nofs lonġitudinali permezz tal-hilum. Nofs ġie ffissat f'10 fil-mija ta 'formalin buffered, li jkun fih 4 fil-mija formaldehyde għal 24 siegħa qabel il-ħażna temporanja f'10 fil-mija etanol, inkorporazzjoni tal-paraffin, u sezzjoni. Erba 'mikrometri, sezzjonijiet maqtugħin lonġitudinali kienu mtebbgħin b'aċidu perjodiku-Schiff (PAS) u trikromju ta' Masson. L-istopatoloġija ġiet ikkwantifikata billi viżwalizza d-dilatazzjoni tat-tubuli, l-apoptożi, jew il-formazzjoni mitfugħa minn investigatur single-blinded bl-użu ta 'metodu semi-kwantitattiv stabbilit sew (28), b'alterazzjonijiet minuri kif deskritt (15). Ittieħdet medja tal-punteġġ minn sezzjonijiet duplikati mtebbgħin PAS minn kull annimal. Punteġġ ta' 0=0 fil-mija tat-tubuli kienu affettwati mill-karatteristiċi istopatoloġiċi ta' hawn fuq; 1=1–10 fil-mija; 2=11–25 fil-mija; 3=26–50 fil-mija; 4=51–75 fil-mija; 5=76–100 fil-mija . Id-depożizzjoni tal-kollaġen ġiet evalwata bl-użu tat-trikromju ta 'Masson u l-kollaġen ġie identifikat bħala kontenut ta' metil blu bejn it-tubuli li jmissu magħhom.

Estrazzjoni RNA, Traskrizzjoni Reverse, u qPCR

Inżamm nofs kilwa waħda għall-analiżi tal-espressjoni tal-ġeni. It-tessut ġie omoġenizzat f'400 µl ta' PBS bl-użu ta' TissueLyser LTTM (Qiagen, Chadstone Centre, Awstralja) permezz ta' 50 oxxillazzjoni kull sekonda għal 2 min. Mitejn mikrolitru tal-kampjun tneħħew għal analiżi oħra. Millilitru wieħed ta' TRI Reagent R (Sigma-Aldrich) ġie miżjud mal-200 µl li jifdal tal-kampjun, li rċieva 50 oxxillazzjoni oħra kull sekonda għal 1-2 min sakemm omoġenizzat kompletament. Wara 5 min ta 'inkubazzjoni f'temperatura tal-kamra u ċentrifugazzjoni fi 12,000xg għal 10 min, is-supernatant ġie estratt u vortex b'250 µl ta' kloroform (Sigma-Aldrich). Wara l-inkubazzjoni għal 10 minuti f'temperatura tal-kamra u ċ-ċentrifugazzjoni fi 12,000xg għal 15-il minuta, is-supernatant ġie estratt u mxerred b'500 µl ta' 70 fil-mija isopropanol (Sigma-Aldrich). Il-kampjun reġa' ġie inkubat għal 10 min f'temperatura tal-kamra imbagħad ġie ċentrifugat fi 12,000xg għal 10 min. Is-supernatant ġie mormi mingħajr ma tfixkel il-pellet b'ħafna RNA. Il-pellet inħasel darbtejn b'1 ml ta' 75 fil-mija etanol ta' grad RNA (Sigma-Aldrich), ċentrifugat f'10,000xg għal 5 min u s-supernatant ġie mormi kull darba. Il-pellet kien imnixxef bl-arja f'temperatura tal-kamra għal qosor qabel ma jerġa' jiġi sospiż fi 80–100 µl ta' ilma distillat doppju mingħajr UltraPureTM DNase/RNase (ddH2O; Thermo-Fisher Scientific) u mbagħad inħażen f'80◦C qabel it-traskrizzjoni inversa. . Immedjatament qabel it-traskrizzjoni inversa, ir-rendiment tal-RNA ġie determinat permezz ta' valutazzjoni spettrofotometrika bl-użu ta' Nanodrop2000TM (Thermo-Fisher Scientific). Ħames mikrolitri ta 'kull kampjun ġew dilwiti f'ddH2O b'tali mod li 1,000 ng ta' RNA kienu mgħobbija għal kull kampjun. Wara t-trattament ta 'DNAse (Sigma-Aldrich), cDNA ġie ġġenerat bl-użu tal-proċeduri operattivi standard tal-enzima M-MLV (Thermo-Fisher Scientific, North Ryde, Awstralja) bl-użu ta' ċiklatur termali T100TM (Laboratorji BioRad, Gladesville, Awstralja). Bl-użu ta 'metodoloġija bbażata fuq SYBR, qPCR twettqet bl-użu ta' CFX384 TouchTM (Laboratorji BioRad) skont proċeduri operattivi standard. Kull sett ta 'primer ġie ttestjat gradjent biex tiddetermina t-temperatura ottima għall-amplifikazzjoni (Tabella Supplimentari 2). Il-kwantifikazzjoni taċ-ċiklu ġiet interpretata bl-użu ta 'rigressjoni għal kull mira, l-espressjoni tal-ġeni ġiet normalizzata relattiva għal hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (Hprt). Il-kurvi tat-tidwib ġew ivvalutati għal sinjali ta 'dimerizzazzjoni tal-primer u amplifikazzjoni mhux speċifika. Fuq kull pjanċa, intuża mill-inqas kontroll negattiv wieħed u kontroll bla mudell għal kull mira biex jiġi żgurat li l-kontaminazzjoni ma kinitx preżenti f'kull taħlita prinċipali jew id-ddH2O użat.

RT2 Profiler Array

RT² ProfifilerTM PCR Array Mouse Extracellular Matrix & Adhesion Molecules (Qiagen) twettqet skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur u d-dejta ġiet imtella’ mbagħad analizzata mill-għodda onlajn, disponibbli minn https://dataanalysis. qiagen.com/pcr/arrayanalysis.php. Din il-firxa tippermetti profil ta' 84 ġene f'massimu ta' 4 kampjuni, għalhekk, ammonti ugwali ta' cDNA għal kull replika fi grupp ġew miġbura minn ġrieden WT fil-jum 1, 3, jew 7 wara l-IRI, u sham miġbura minn kull replika minn kull waħda. ta’ dawn il-punti ta’ żmien. Għal kull mira, il-bidla tat-tinja wara l-IRI tqabbel ma' espressjoni finta.

Analiżi Statistika

Id-dejta kollha ġiet analizzata bis-softwer Graphpad Prism v8.02 bl-użu ta' t-tests mhux parametriċi mhux imqabbda (Mann-Whitney U-test). P < 0.05="" ġie="" stabbilit="" bħala="" l-limitu="" għad-determinazzjoni="" tad-differenzi="" statistikament="" sinifikanti.="" ∗p="">< 0.05,="" ns="" mhux="" sinifikanti.="" id-dejta="" kollha="" hija="" espressa="" bħala="" medja="" ±="" sem.="" f'kull="" analiżi,="" kien="" hemm="" n="4–8" repliki="" għal="" kull="" grupp="" u="" r-riżultati="" kienu="" rappreżentattivi="" ta'="" mill-inqas="" żewġ="" esperimenti.="" id-daqs="" tal-kampjun="" għal="" kull="" esperiment="" huwa="" deskritt="" fil-leġġenda="" tal-figura="">

RIŻULTATI

ILC2s Renali Jesprimu IL-5 b'mod Kostituttiv u Huma Lokalizzati għall-Vaskolatura Renali taħt Kundizzjonijiet Omeostatiċi

Twettqet analiżi dettaljata tal-fenotip renali ILC2 u l-post taħt kundizzjonijiet omeostatiċi. Kien hemm b'mod sinifikanti aktar ILC2s (CD45 flimkien ma 'Lineage IL- 7R flimkien ma' CD90.2 flimkien ma 'ST2 flimkien ma' ċelluli singoli FSClowSSClow), fil-kliewi meta mqabbla mal-pulmun meta rappreżentati bħala perċentwal ta 'CD45 totali flimkien ma' ċelluli singoli (Figura 1A; Figuri Supplimentari 1A, B). L-analiżi t-SNE tal-ILC2s tal-kliewi u tal-pulmun uriet raggruppament uniku, għalkemm dawn il-gruppi ma kinux kompletament distinti minn xulxin (Figura 1B). Madankollu, ILC2s tal-kliewi kellhom espressjoni ferm aktar baxxa ta 'CD25, espressjoni konsistenti ta' ICOS u KLRG1, iżda espressjoni ogħla ta 'IL-5 meta mqabbla ma' ILC2s tal-pulmun (Figura 1C). ILC2s tal-kliewi kellhom espressjoni kostituttiva ogħla ta 'IL-5 minn IL-13 (Figura 1D; Figuri Supplimentari 1C, D). L-ILC2s ġew determinati li huma t-tip ta' ċelluli ewlenin li jipproduċu IL-5 fil-kliewi, b'kontribuzzjoni negliġibbli minn ċelluli tat-tip T helper-2 (TH2) (Figura 1E, Figuri Supplimentari 1E, F). Għalhekk, IL-5 intuża bħala markatur surrogat biex jidentifika l-post ta 'ILC2s fil-kliewi tal-ġurdien, kif ġie deskritt għal organi periferali multipli (29-31). Dan inkiseb bl-użu ta' ġrieden li jesprimu Cre-recombinase marbuta ma' IL-5 qasmu għal tracker tan-nisel tat-tadam Rosa (30, 31). Ċelloli IL-5 flimkien (l-aktar ILC2s) instabu matul il-kliewiiżda kienu primarjament lokalizzati għall-vaskulatura maġġuri, kif viżwalizzat b'tbajja pożittiva tal-actina tal-muskoli alfa-lixx (-SMA) (Figura 2A; Figuri Supplimentari 2A, B), konsistenti mar-rapport reċenti tagħna (29). ILC2s instabu li huma assoċjati kemm mal-bastimenti tal-kliewi interlobulari kif ukoll arkuati fil-kortiċi u r-reġjuni medullari, kif muri mill-espressjoni tar-riċettur hyaluronan endoteljali limfatiku -1 (LYVE1) (Figura 2B). Immaġini ulterjuri wrew li ftit ħafna miċ-ċelloli CD3 plus (l-aktar ċelloli TH2) ikkontribwew għas-sinjal IL-5 plus endoġenu (Figura 2C). ILC2s ġew identifikati fl-adventitia tal-bastiment bl-użu ta 'rikostruzzjonijiet tal-wiċċ pseudocolored tal-arterjali -SMA.

Tnaqqis, Defiċjenza, jew Tnaqqis ta' ILC2s Ma Jbiddilx is-Severità ta' Korriment Sperimentali ta' Iskemija-Riperfużjoni Renali fil-Ġrieden

Given ILC2s were present in the kidney and localized to the renal vasculature, the impact of ILC2 reduction, deficiency, or depletion on the severity of experimental renal IRI was assessed. This was achieved by using ILC2-reduced (Roraflfl/+Il7rcre/+)-deficient (Roraflfl/flfl Il7rcre/+), and -depleted (DTx-treated Icosdtr/+Cd4cre/+) mice compared to WT and vehicle (saline-treated Icosdtr/+Cd4cre/+) controls. These mice have been previously described as appropriate tools for assessing ILC2 function in vivo in other organs such as the lung (27, 32). Here we show that these tools are also appropriate for assessing ILC2 function in the kidney. Indeed, kidney ILC2s were significantly lower in the ILC2-reduced, -defificient, and -depleted groups compared to WT or saline-treated controls (Figure 3A). Time-course analysis of IRI in wild-type mice identified day 7 as the most appropriate time point for the assessment of injury severity due to the presence of histopathological features of acute tubular necrosis, collagen deposition and increased mRNA expression of extracellular matrix, injury-associated, and inflflammatory factors (Supplementary Figures 3, 4). At day 7, 25/84 extracellular matrix factors were increased >2-darbiet meta mqabbla mal-kontrolli finti, filwaqt li 1/84 u 6/84 żdiedu f'jum 1 u 3, rispettivament (Figura Supplimentari 4A). IRI indotta nekrożi tubulari akuta kkaratterizzata minn tubuli dilatati u formazzjoni mitfugħa, meta mqabbla ma 'kontrolli finti (Figura 3B, Figuri Supplimentari 3A, 4B). Dan kien ikkwantifikat bħala punteġġ ta 'korriment tubulari u s-severità tal-ħsara kienet simili fil-ġenotipi kollha (Figura 3C). L-IRI indotta wkoll depożizzjoni tal-kollaġen, immarkata b'kontenut ta 'methyl blue bejn it-tubuli fil-medulla u l-kortiċi, meta mqabbla ma' kontrolli finti (Figura 3D; Figura Supplimentari 3B). Id-depożizzjoni tal-collagen ma kinitx affettwata min-nuqqas ta 'ILC2s. L-IRI żiedet ukoll l-espressjoni tal-mRNA ta 'fatturi assoċjati mal-ħsara, kimokini, u ċitokini pro-infjammatorji (Figuri 3E-J, Figuri Supplimentari 4C-K). Lipocalin assoċjat man-newtrofili ġelatinażi, (Lcn2; NGAL), bijomarkatur ta 'ħsara renali (33, 34), żdied b'IRI u mhux affettwat minn tnaqqis, defiċjenza jew tnaqqis ta' ILC2 (Figura 3E). CXC motif chemokine ligand 1 (Cxcl1) u Cxcl2 żdiedu wkoll b'mod sinifikanti mill-IRI fil-ġenotipi kollha (Figuri 3F, G). Bl-istess mod, il-fattur tan-nekrożi tat-tumur taċ-ċitokine pro-infjammatorju (Tnf) żdied b'IRI, meta mqabbel mal-kontrolli finti (Figura 3H). B'mod konsistenti mad-depożizzjoni tal-kollaġen viżibbli, l-espressjoni tal-mRNA tal-fatturi tal-matriċi extraċellulari tal-katina tal-collagen tat-tip I alfa 1 (Col1a1), u fibronectin 1 (Fn1) żdiedu b'IRI fil-ġenotipi kollha (Figuri 3I, J).

DISKUSSJONI

L-ILC2s huma regolaturi kritiċi tal-omeostażi tat-tessuti, iżda r-rwol tagħhom fil-kliewi għad irid jiġi eluċidat bis-sħiħ. Filwaqt li l-ILC2s jistgħu jiġu indotti biex jipproliferaw u jipproteġu kontra l-konsegwenzi ħżiena ta 'korriment renali sperimentali, għadu mhux magħruf x'jiġri fin-nuqqas ta' dawn iċ-ċelloli. L-ewwel eżaminajna jekk in-numri ILC2, bħala proporzjon ta 'CD45 flimkien ma' ċelloli ematopojetiċi, humiex differenti fil-pulmun u fil-kliewi. ILC2s ammontaw għal proporzjon akbar ta 'ċelluli CD45 plus fil-kliewi milli fil-pulmun. L-analiżi t-SNE raggruppat ILC2s miż-żewġ siti b'mod differenti, madankollu, ir-raggruppamenti ma kinux kompletament distinti bejn dawn it-tessuti. Kien hemm differenzi fl-antiġen tal-wiċċ taċ-ċelluli tagħhom u fl-espressjoni taċ-ċitokini tat-tip 2, b'ILC2s tal-kliewi li jesprimu ammonti akbar ta' IL-5. Tabilħaqq, ILC2s tal-kliewi esprimew b'mod kostituttiv livelli għoljin ta' IL-5 taħt kundizzjonijiet omeostatiċi. ILC2s kienu wkoll is-sors ewlieni ta' IL-5 fil-kliewi, b'kontribut negliġibbli miċ-ċelloli TH2. Għalhekk, IL-5 intuża bħala markatur surrogat biex jiddetermina l-lokazzjoni ta 'dawn iċ-ċelloli fil-kliewi. ILC2s ġew identifikati fil-kliewi u kienu lokalizzati kważi esklussivament tul il-vaskulatura renali. F'dawn l-istudji, intuża Cre-recombinase marbuta ma' IL-5 flimkien ma' sekwenza flox-stop-flox upstream ta' cassette CAG-RFP-WPRE fil-locus ROSA26 espress b'mod kostituttiv biex jinstabu l-ILC2s. LYVE1, li huwa espress minn ċelluli endoteljali limfatiċi renali, intuża biex jiddefinixxi aktar il-post ta 'dawn iċ-ċelluli fil-kliewi tal-ġurdien (35). Kif mistenni, it-tbajja' LYVE1 kienet inkorporata fit-tessut konnettiv tal-arterji tal-kliewi tal-kortiċi, iżda mhux fi ħdan il-medulla peress li ma jeżisti l-ebda netwerk limfatiku li jingħaraf f'dan ir-reġjun tal-kliewi (35-37). Preżumibbilment, ILC2s jinsabu qrib il-vaskulari peress li ċ-ċelloli endoteljali renali huma sors ewlieni ta' IL-33 fil-kliewi (38, 39). Waqt li tikkonferma l-osservazzjoni tagħna mill-FACS ta' sospensjonijiet tal-kliewi b'ċellula waħda, ILC2s reġgħu nstabu li huma l-produtturi ewlenin ta' IL-5 fis-sezzjonijiet tat-tessut tal-kliewi, b'kontribut minimu minn ċelluli CD3 flimkien ma' T. Filwaqt li dawn l-istudji juru l-post ta’ ILC2s fil-kliewi bl-użu ta’ ġrieden reporter, għad irid jiġi determinat jekk ILC2s jinsabux ukoll ħdejn il-vaskulatura fil-kliewi tal-bniedem, u jekk il-lokazzjoni ta’ ILC2s hijiex mibdula b’reazzjoni għal ħsara renali. Għalkemm rapporti multipli sabu li n-numri ILC2 ma jinbidlux minħabba ħsara fil-kliewi, il-fenotip u l-istat ta 'attivazzjoni tagħhom wara l-ħsara jeħtieġu aktar spjegazzjoni (12-16). Sussegwentement, aħna kkaratterizzajna r-rwol funzjonali ta 'ILC2s fil-kliewi bl-użu ta' approċċ ta 'telf ta' funzjoni. Biex niksbu dan, ħadna vantaġġ mill-ġrieden ILC2-defiċjenti u mnaqqsa, u ġrieden li jistgħu jitnaqqsu b'mod kondizzjonali mill-ILC2s wara l-amministrazzjoni ta' DTx (27). Aħna vvalidajna l-użu ta 'dawn l-għodod għall-knockdown jew l-ablazzjoni ta' ILC2s fil-kliewi. Ingħażel mudell sperimentali ta 'IRI, minħabba l-prossimità ta' ILC2s għall-vaskulatura renali. Għalkemm il-karatteristiċi tal-korriment kienu evidenti b'mod viżibbli wara l-IRI, tnaqqis, defiċjenza jew tnaqqis fl-ILC2s ma biddilx l-istopatoloġija grossa fil-kliewi, u lanqas ma kkawża mortalità. Tabilħaqq, remodeling indott mill-IRI u depożizzjoni tal-kollaġen seħħew indipendentement minn ILC2s. Filwaqt li huwa possibbli li punt ta 'żmien aktar kmieni wara l-korriment jista' jkun identifika differenzi fl-istopatoloġija u l-espressjoni tal-ġeni, il-punt ta 'żmien fl-istudju tagħna ppermetta wkoll valutazzjoni tad-depożizzjoni tal-kollaġen, karatteristika importanti ta' remodeling li hija regolata minn ILC2s (16, 32, 40). –44). Huwa wkoll plawsibbli li tnaqqis fl-ILC2s matul

AKI jista 'jkun ta' detriment għall-istruttura u l-funzjoni tal-kliewi meta evalwat f'punti ta 'żmien aktar tard minħabba risponsi potenzjali ta' tiswija ħażina fin-nuqqas ta 'ILC2s. Biex jindirizzaw dan, studji futuri se jkollhom bżonn jinvestigaw ir-rwol tal-ILC2s fil-progressjoni tal-AKI għal mard kroniku tal-kliewi (45, 46).

B'mod kollettiv, dan l-istudju juri li tnaqqis, defiċjenza jew tnaqqis fl-ILC2s ma jbiddilx is-severità tal-AKI sperimentali fil-ġrieden. Filwaqt li l-attivazzjoni tal-ILC2s u l-amplifikazzjoni assoċjata tal-immunità lokali tat-tip 2 preċedentement intweriet li tnaqqas il-konsegwenzi ħżiena tal-AKI, korriment komparabbli sseħħ meta l-ILC2s huma mnaqqsa, assenti, jew imnaqqsa li tissuġġerixxi redundancy possibbli u kumpens minn ċelluli immuni oħra, bħal Treg. ċelluli , AAM, u TH2. Dan il-kunċett huwa appoġġjat minn studji li jużaw ġrieden Rag1 / jew Rag2 / li m'għandhomx ċelluli T u B maturi, f'mudelli ta'korriment fil-kliewi(13, 15, 47, 48). Fi studju wieħed, l-amministrazzjoni anti-CD90.2 intużat biex tnaqqas l-ILC2s, madankollu, dawn l-annimali kienu wkoll defiċjenti fiċ-ċelloli Treg u TH2 (15). F'din is-sistema mudell, minkejja t-tnaqqis ta 'ILC2s b'anti-CD90.2, kumpens mill-kompartiment taċ-ċelluli T mhuwiex possibbli. Id-dejta tagħna turi li telf ta 'ILC2s, meta l-kompartiment taċ-ċelluli T jibqa' intatt, għandu effetti minimi fuq is-severità tal-IRI. Id-dejta tagħna tappoġġja l-kunċett li l-ILC2s minbarra ċelloli immuni oħra, bħal Treg u AAM, jikkontribwixxu għall-AKI. Tabilħaqq, it-tnaqqis ta' Treg mar għall-agħar l-istopatoloġija wara l-IRI (15). Bl-istess mod, il-polarizzazzjoni tal-makrofagi lejn AAM tippromwovi r-riżoluzzjoni tal-ħsara (5, 12, 46, 49, 50). Huma meħtieġa aktar studji biex jiċċaraw ir-raġuni għall-preżenza ta 'ILC2s fil-kliewi, inklużi infezzjonijiet axxendenti fl-apparat urinarju u insulti renali oħra kif ukoll fil-progressjoni għalmard kroniku.

DIKJARAZZJONI TAL-ETIKA

Il-proċeduri kirurġiċi kollha ġew approvati mill-Kumitat għall-Kura u l-Etika tal-Annimali tal-Università ta 'Newcastle skont il-Kodiċi Awstraljan għall-kura u l-użu tal-annimali għal skopijiet xjentifiċi. Proċeduri għall-immaġini immunofluworexxenti ġew approvati u mwettqa skont il-linji gwida stabbiliti mill-Kumitat għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-UCSF u ċ-Ċentru tar-Riżorsi tal-Annimali tal-Laboratorju.

KONTRIBUZZJONIJIET TA' L-AWTUR

Ix-xogħol ippreżentat sar b'kollaborazzjoni mal-awturi kollha. GC wettaq il-mudell kirurġiku, ċitometrija tal-fluss, valutazzjoni istoloġika, analiżi tal-espressjoni tal-ġeni, u analizzat id-dejta. KC u ABM wettqu l-esperimenti ta 'immunofluworexxenza. SL għen bil-monitoraġġ tal-annimali u ċ-ċitometrija tal-fluss. SJ u AD ipprovdew għarfien kliniku għad-disinn tal-istudju u t-teknika kirurġika. ANM ħoloq, ipprovdiet, u ta parir dwar l-użu ta' ġrieden tat-tadam ILC2-deficient & -depleted u Il13td. PF ipprovda u ta parir dwar l-użu tal-linja tar-reporter Il5venus. PF u PH taw pariri dwar disinn sperimentali. MS iddisinjat, issorveljat, u ffaċilitat l-aspetti kollha tal-istudji. L-awturi kollha pparteċipaw fl-interpretazzjoni tad-dejta, it-tħejjija u l-editjar ta’ manuskritti għal kontenut intellettwali.

FINANZJAMENT

MS hija appoġġata minn borża ta 'studju u għotjiet mill-Kunsill Nazzjonali tar-Riċerka dwar is-Saħħa u r-Riċerka Medika (NHMRC), l-Istitut tar-Riċerka Medika Hunter, u l-Fondazzjoni għar-Riċerka tat-Tfal Hunter.

REFERENZI

1. Susantitaphong P, Cruz DN, Cerda J, Abulfaraj M, Alqahtani F, Koulouridis I, et al. Inċidenza dinjija ta 'AKI: meta-analiżi.Clin J Em Soc Nephrol. (2013) 8:1482–93.

2. Hall AM, Unwin RJ, Parker N, Duchen MR. L-immaġini multifoton tiżvela differenzi fil-funzjoni mitokondrijali bejn is-segmenti tan-nephron.J Am Soc Nephrol. (2009) 20:1293–302.

3. Devarajan P. Aġġornament dwar mekkaniżmi ta 'korriment iskemiku akut fil-kliewi.J Am Soc Nephrol. (2006) 17:1503–20. 

4. Bonventre JV, Yang L. Patofiżjoloġija ċellulari ta 'ħsara akuta fil-kliewi iskemika.J Clin Invest.(2011) 121:4210–21. DOI: 10.1172/JCI 45161

5. Lee S, Huen S, Nishio H, Nishio S, Lee HK, Choi BS, et al. Fenotipi makrofagi distinti jikkontribwixxu għal ħsara u tiswija tal-kliewi.J Am Soc Nephrol. (2011) 22:317–26. 

6. Friedewald JJ, Rabb H. Ċelloli infjammatorji f'insuffiċjenza renali akuta iskemika.Kidney Int.(2004) 66:486–91. 

7. Spits H, Artis D, Colonna M, Diefenbach A, Di Santo JP, Eberl G, et al. Ċelloli limfoid innati - proposta għal nomenklatura uniformi.NatRev Immunol.(2013) 13:145–9. 

8. Moro K, Yamada T, Tanabe M, Takeuchi T, Ikawa T, Kawamoto H, et al. Produzzjoni innata ta' ċitokini T(H)2 minn ċ-Kit( plus )Sca-1( plus ) limfoid assoċjati mat-tessut xaħmi.Natura. (2010) 463:540–4. 

9. Neill DR, Wong SH, Bellosi A, Flynn RJ, Daly M, Langford TKA, et al. In-nuoċiti jirrappreżentaw lewkoċit effettur innat ġdid li jimmedja l-immunità tat-tip-2.Natura. (2010) 464:1367–70. 

10. Loering S, Cameron GJM, Starkey MR, Hansbro PM. Żvilupp tal-pulmun u rwoli emerġenti għall-immunità tat-tip 2.J Pathol.(2018) 247:686–96. 

11. Monticelli LA, Sonnenberg GF, Abt MC, Alenghat T, Ziegler CG, Doering TA, et al. Iċ-ċelluli limfojdi innati jippromwovu l-omeostażi tat-tessut tal-pulmun wara infezzjoni bil-virus tal-influwenza.Nat Immunol. (2011) 12:1045–54. 

12. Huang Q, Niu Z, Tan J, Yang J, Liu Y, Ma H, et al. IL-25 iqanqal ċelluli limfoid intrinsiċi u ċelluli proġenitriċi multipotenti tat-tip 2 li jnaqqsu l-ħsara iskemika/riperfużjoni tal-kliewi.J Am Soc Nephrol.(2015) 26:2199–211. 

13. Riedel JH, Becker M, Kopp K, Duster M, Brix SR, Meyer-Schwesinger C, et al. L-espansjoni medjata mill-IL-33- taċ-ċelluli limfoid intrinsiċi tat-tip 2 tipproteġi minn glomerulosclerosis progressiva.J Am Soc Nephrol.(2017) 28:2068–80. 

14. Stremska ME, Jose S, Sabapathy V, Huang L, Bajwa A, Kinsey GR, et al. IL233, Ċitokin ibridu ġdid ta' IL-2 u IL-33, ittejjeb il-ħsara renali.J Am Soc Nephrol. (2017) 28:2681–93. 

15. Cao Q, Wang Y, Niu Z, Wang C, Wang R, Zhang Z, et al. Il-potenzjal ta' ċelluli limfoid intrinsiċi tat-tip 2 residenti fit-tessuti b'IL-33 biex tiġi evitata l-iskemija-riperfużjoni tal-kliewi.J Am Soc Nephrol.(2018) 29:961–76. 

16. Sabapathy V, Cheru NT, Corey R, Mohammad S, Sharma R. Ċitokin ibridu ġdid IL233 jimmedja r-riġenerazzjoni wara korriment nefrotossiku indott minn doxorubicin.Sci Rep. (2019) 9:3215. 

17. Cameron GJM, Jiang SH, Loering S, Deshpande AV, Hansbro PM, Starkey MR. Potenzjal terapewtiku emerġenti ta 'ċelluli limfoid innate tal-grupp 2 f'korriment akut tal-kliewi.J Pathol. (2019) 2019:5242. 

18. Singh AP, Junemann A, Muthuraman A, Jaggi AS, Singh N, Grover K, et al. Mudelli ta 'annimali ta' insuffiċjenza renali akuta.Pharmacol Rep. (2012) 64:31–44. 

19. Ramesh G, Ranganathan P. Mudelli tal-ġurdien, u metodi għall-istudju tal-mard tal-bniedem, ħsara akuta fil-kliewi (AKI).Metodi Mol Biol.(2014) 1194:421–36. 

20. Skrypnyk NI, Harris RC, de Caestecker MP. Mudell ta 'iskemija-riperfużjoni ta' ħsara akuta fil-kliewi u fibrożi ta 'wara l-korriment fil-ġrieden.J VisExp.(2013) 9:78. 

21. Wei Q, Dong Z. Mudell tal-ġurdien ta 'korriment akut tal-kliewi iskemiku: noti tekniċi u tricks.Am J Physiol Renal Physiol.(2012) 303:F1487–94? 

22. Starkey MR, McKenzie ANJ, Belz GT, Hansbro PM. Ċelluli limfoid innate tal-grupp pulmonari 2: sorpriżi u sfidi.Mukosali Immunol.(2019) 12:299–311. 

23. Jang HR, Rabb H. Ċelloli immuni f'korriment akut tal-kliewi sperimentali.Nat Dun Nephrol.(2015) 11:88–101. DOI: 10.1038/nrneph.2014.180

24. Turner JE, Becker M, Mittrucker HW, Panzer U. Limfoċiti residenti fit-tessuti fil-kliewi.J Am Soc Nephrol.(2018) 29:389–99. 

25. Jang HR, Rabb H. Ir-rispons immuni innat f'korriment iskemiku akut fil-kliewi.Clin Immunol. (2009) 130:41–50. 

26. Langford DJ, Bailey AL, Chanda ML, Clarke SE, Drummond TE, Echols S, et al. Kodifikazzjoni ta 'espressjonijiet tal-wiċċ ta' uġigħ fil-ġurdien tal-laboratorju.NatMetodi.(2010) 7:447–9.

27. Oliphant CJ, Hwang YY, Walker JA, Salimi M, Wong SH, Brewer JM, et al. Djalogu medjat minn MHCII bejn ċelluli limfoid innate tal-grupp 2 u ċelluli CD4 flimkien ma 'T isaħħaħ l-immunità tat-tip 2 u jippromwovi t-tkeċċija tal-elminti parassiti.Immunità. (2014) 41:283–95. 

28. Shih W, Hines WH, Neilson EG. Effetti ta 'cyclosporin A fuq l-iżvilupp ta' nefrite interstizjali medjata mill-immunità.Kilwa Int. (1988) 33:1113–8.

29. Dahlgren MW, Jones SW, Cautivo KM, Dubinin A, Ortiz-Carpena JF, Farhat S, et al. Iċ-ċelluli stromali adventizjali jiddefinixxu niċeċ tat-tessut taċ-ċelluli limfoid innate tal-grupp 2.Immunità. (2019) 50:707–22. 

30. Molofsky AB, Nussbaum JC, Liang HE, Van Dyken SJ, Cheng LE, Mohapatra A, et al. Iċ-ċelluli limfojdi innati tat-tip 2 isostnu l-eosinofili tat-tessut xaħmi vixxerali u makrofaġi attivati ​​alternattivament.J Exp Med.(2013) 210:535–49. 

31. Nussbaum JC, Van Dyken SJ, von Moltke J, Cheng LE, Mohapatra A, Molofsky AB, et al. Ċelloli limfoid intrinsiċi tat-Tip 2 jikkontrollaw l-omeostażi tal-eosinofili.Natura.(2013) 502:245–8. 

32. Donovan C, Starkey MR, Kim RY, Rana BMJ, Barlow JL, Jones B, et al. Rwoli għal-limfoċiti T/B u ILC2s f'mard pulmonari ostruttiv kroniku sperimentali.J Leukoc Biol.(2019) 105:143–50. 

33. Mishra J, Ma Q, Prada A, Mitsnefes M, Zahedi K, Yang J, et al. Identifikazzjoni ta 'lipocalin assoċjat man-newtrophil gelatinase bħala bijomarkatur ġdid tal-awrina bikri għal ħsara iskemika tal-kliewi.J Am Soc Nephrol.(2003) 14:2534–43. 

34. Supavekin S, Zhang W, Kucherlapati R, Kaskel FJ, Moore LC, Devarajan P. Espressjoni tal-ġeni differenzjali wara iskemija / riperfużjoni renali bikrija.Kidney Int.(2003) 63:1714–24. 

35. Skorecki K, Chertow GM, Marsden PA, Taal MW, Alan SL, Luyckx V. Anatomija tal-kliewi: Limfatiċi. Fi:Brenner utar-RetturIl-Ktieb Elettroniku tal-Kliewi. 10 ed. Amsterdam: Elsevier (2015). p. 80–1.

36. Banerji S, Ni J, Wang SX, Clasper S, Su J, Tammi R, et al. LYVE-1, omologu ġdid tal-glikoproteina CD44, huwa riċettur limfatiku speċifiku għall-hyaluronan.J Ċellula Biol. (1999) 144:789–801. 

37. Lee HW, Qin YX, Kim YM, Park EY, Hwang JS, Huo GH, et al. Espressjoni ta' riċettur ta' hyaluronan limfatiku speċifiku għall-endotelju LYVE-1 fil-kliewi tal-ġurdien li qed jiżviluppaw.ĊellulaTessutRiż.(2011) 343:429–44.

38. Shelite TR, Liang Y, Wang H, Mendell NL, Trent BJ, Sun J, et al. L-attivazzjoni endoteljali dipendenti minn IL- 33-tikkontribwixxi għall-apoptożi u l-ħsara fil-kliewi fi ġrieden infettati bi tsutsugamushi orjentati.PLoS Negl Trop Dis.(2016) 10:e0004467.

39. Ferhat M, Robin A, Giraud S, Sena S, Goujon JM, Touchard G, et al. IL-33 endoġenu jikkontribwixxi għal korriment ta' iskemija-riperfużjoni fil-kliewi bħala alarmin.J Em Soc Nephrol. (2018) 29:1272–88. 

40. Mchedlidze T, Waldner M, Zopf S, Walker J, Rankin A, Schuchmann M, et al. Iċ-ċelluli limfoid intrinsiċi li jiddependu mill-interleukin-33-medju l-fibrożi epatika.Immunità. (2013) 39:357–71. 

41. Moretti S, Renga G, Oikonomou V, Galois C, Pariano M, Iannitti RG, et al. Mogħdija tal-mast cell-ILC2-Th9 tippromwovi l-infjammazzjoni tal-pulmun fil-fibrożi ċistika.Nat Komun. (2017) 8:14017. 

42. Hams E, Armstrong ME, Barlow JL, Saunders SP, Schwartz C, Cooke G, et al. IL-25 u ċ-ċelloli limfoid intrinsiċi tat-tip 2 jinduċu fibrożi pulmonari.ProcNatlAcad Sci L-ISTATI UNITI. (2014) 111:367–72.

43. Wohlfahrt T, Usharenko S, Englbrecht M, Dees C, Weber S, Beyer C, et al. L-għadd taċ-ċelluli limfoid innati tat-Tip 2 jiżdied f'pazjenti bi sklerożi sistemika u jikkorrelataw mal-firxa tal-fibrożi.Ann Rheum Dis.(2016) 75:623–6. 

44. Li D, Guabiraba R, Besnard AG, Komai-Koma M, Jabir MS, Zhang L, et al. IL-33 jippromwovi fibrożi tal-pulmun ST2-dipendenti bl-induzzjoni ta' makrofaġi attivati ​​alternattivament u ċelluli limfoid intrinsiċi fil-ġrieden.J Allerġija Clin Immunol. (2014) 134:1422–32. 

45. Sharp CN, Doll MA, Megyesi J, Oropilla GB, Beverly LJ, Siskind LJ. Korriment subkliniku tal-kliewi indott minn għoti ripetut ta' cisplatin jirriżulta f'mard kroniku tal-kliewi progressiv.Am J Physiol Renal Physiol.(2018) 315:F161–72? 

46. ​​Liu J, Kumar S, Dolzhenko E, Alvarado GF, Guo J, Lu C, et al. Karatterizzazzjoni molekulari tat-tranżizzjoni minn ħsara fil-kliewi akuta għal kronika wara iskemija/riperfużjoni.JCI Insight.(2017) 2:94716. 

47. Li L, Huang L, Sung SJ, Lobo PI, Brown MG, Gregg RK, et al. L-attivazzjoni taċ-ċelluli NKT timmedja l-produzzjoni ta' IFN-gamma tan-newtrofili u l-ħsara ta' iskemija-riperfużjoni tal-kliewi.J Immunol.(2007) 178:5899–911.

48. Chan AJ, Alikhan MA, Odobasic D, Gan PY, Khouri MB, Steinmetz OM, et al. Il-lewkoċiti li jipproduċu l-IL-17A innati jippromwovu korriment akut fil-kliewi permezz tal-attivazzjoni tar-riċetturi ta' inflammasome u Toll-like.Am J Pathol.(2014) 184:1411–8? 

49. Cao Q, Wang C, Zheng D, Wang Y, Lee VWS, Wang YM, et al. IL-25 jinduċi makrofaġi M2 u jnaqqas il-ħsara fil-kliewi f'mard proteinuriku tal-kliewi.J Am Soc Nephrol. (2011) 22:1229–39.

50. Chung S, Overstreet JM, Li Y, Wang Y, Niu A, Wang S, et al. TGF-beta jippromwovi l-fibrożi wara ħsara severa fil-kliewi billi jsaħħaħ l-infiltrazzjoni tal-makrofagi renali.JCI Insight.(2018) 3:123563.