Klonazzjoni tal-Ġeni, Identifikazzjoni Funzjonali, Analiżi Strutturali U Espressjoni tas-Sucrose Synthase Minn Cistanche Tubulosa

Astratt:Sucrose synthase għandu rwol kruċjali fil-passaġġ tal-metaboliżmu taz-zokkor tal-pjanti billi jikkatalizza l-produzzjoni ta 'uridine diphosphate (UDP)-glucose, li jservi bħala donatur ta' glikosil bijoattiv għal diversi proċessi metaboliċi. F'dan l-istudju, ġene sucrose synthase jismu CtSus ġie kklonat minnuCistanche tubulosa, mediċina tradizzjonali Ċiniża magħrufa għall-għonja tagħhakontenut ta’ diversi glikosidi, ibbażat fuq ir-riżultati tal-analiżi tat-traskriptome. Il-qafas ta' qari miftuħ ta' CtSus kien twil 2 418 bp li jikkodifika 805 aċidi amminiċi. L-analiżi tas-sekwenza wriet oqsma kkonservati assoċjati mal-familja tas-sukrożju tal-pjanti kemm fir-reġjuni N-terminali u C-terminali tal-proteina CtSus. L-analiżi filoġenetika wriet li CtSus jaqsam relazzjoni evoluttiva mill-qrib ma 'sucrose synthasesminn pjanti oħra fl-istess ordni. L-identifikazzjoni funzjonali ta 'CtSus saret permezz ta' catalysiscoupling taċ-ċelluli kollha ma 'UGT71BD1, enzima glycosyltransferase karatterizzata. Ir-riżultati wrew li l-introduzzjoni ta 'CtSus tejbet b'mod sinifikanti r-rata ta' konverżjoni ta 'glycosylation katalizzata minn UGT71BD1. L-espressjoni solubbli ta' CtSus f'Escherichia coli inkisbet aktar bl-użu tal-vettur ta' espressjoni pCold™ TF. Assaġġ enżimatiku in vitro indika l-attività ta 'CtSus biex jikkatalizza l-formazzjoni ta' UDP-glukożju fil-preżenza ta 'sukrożju u UDP. Ir-riżultati tar-reazzjoni tal-katina kwantitattiva tal-polimerażi f'ħin reali wrew li l-mudelli ta 'espressjoni tal-ġene CtSus f'partijiet differenti ta' C. tubulosa u l-kulturi taċ-ċelluli tas-sospensjoni ta 'C. tubulosa taħt stress tan-nixfa kkorrelati ma' mudelli ta 'akkumulazzjoni osservati għal phenylethanol glycosides, rispettivament. Barra minn hekk, l-aċidi amminiċi ewlenin u l-interazzjonijiet tagħhom bejn l-enzima u s-sottostrat ġew esplorati bbażati fuq tbassir tal-istruttura tal-proteini u riżultati ta 'docking molekulari. B'mod ġenerali, is-sejbiet tagħna jidentifikaw sucrose synthase CtSus responsabbli għall-provvista tad-donatur glycosyl attiv UDP-glucose matul il-bijosintesi ta 'prodotti glycoside f'C. tubulosa u pprovdew ukoll element tal-ġene li jista' jiġi utilizzat fil-kostruzzjoni tar-razza tal-inġinerija għall-produzzjoni tal-prodotti glycoside.

Kliem ewlieni: Cistanche tubulosa; sucrose synthase; glikosidi; UDP-glukożju; katalisi enżimatika

DICHEN CISTANCHE TIKKULTIVA BAŻIJIET FI YUTIAN, HOTAN, XINJIANG

Servizz ta 'Appoġġ Ta' Wecistanche-L-akbar esportatur ta' cistanche fiċ-Ċina:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Cistanche tubulosa (Schenk) R. Wighthija pjanta parassitika erbaċeja perenni tal-ġeneru Cistanche fil-familja Orobanchaceae. Huwa materjal mediċinali tradizzjonali Ċiniż rari u prezzjuż, indiġenu għal Xinjiang u Inner Mongolia. Huwa ħelu, mielaħ u sħun fin-natura, u għandu l-funzjonijiet ta 'yang tal-kliewi tonifying, benefiċċju essenza u demm, u niedja l-imsaren uittaffi l-istitikezza. Huwa magħruf bħala l-"ġinseng tad-deżert" [1]. Ir-riċerka moderna sabet liCistanche tubulosafihvarjetà ta 'komponenti kimiċibħalphenylethanoid glycosides, terpeni ta' etere iridojdiu l-glikożidi tagħhom, lignans u l-glikożidi tagħhom, esteri oligosakkaridi, polisakkaridi, polioli, oligosakkaridi, steroli u l-glikożidi tagħhom, glikożidi monoterpenojdi, zokkor, aċidi amminiċi u żjut volatili [2,3], speċjalment il-komposti tal-glycoside huma l-aktar ingredjenti attivi importanti. Fost dawn, il-komposti ta 'phenylethanoid glycoside għandhom l-ogħla kontenut fil-materjal mediċinali oriġinali u għandhom firxa wiesgħa ta' attivitajiet farmakoloġiċi bħal newroprotezzjoni u anti-aging [4]. Il-bijosintesi tal-komposti tal-glikosidi msemmija hawn fuq tinvolvi passi multipli ta’ reazzjonijiet ta’ glikosilazzjoni, li huma katalizzati minnglycosyltransferases fil-pjanti, u l-provvista ta' donaturi attivi ta' glycosylhija essenzjali f'dan il-proċess. Donaturi taz-zokkor attivi komuni fl-organiżmi jinkludu uridine diphosphate (UDP), thymidine diphosphate (TDP), u guanosine diphosphate (GDP). Fosthom, UDP-glucose huwa l-aktar donatur attiv komuni ta 'glycosyl fil-pjanti. Jista 'mhux biss jiġi rikonoxxut direttament minn glucosyltransferase biex jikkatalizza r-reazzjoni ta' trasferiment ta 'glucosyl, iżda jista' jintuża wkoll bħala prekursur biex jipparteċipa fis-sintesi ta 'tipi oħra ta' donaturi ta 'glycosyl. Pereżempju, UDP-glucose jista' jintuża bħala sottostrat biex jiġġenera UDP-rhamnose taħt il-katalisi ta' 4,6-dehydratase, 3,5-isomerase u 4-reductase[5]; UDP-glucose jista 'jintuża bħala sottostrat biex jikkatalizza s-sintesi ta' UDP-xylose permezz ta 'UDP-glucose dehydrogenase u UDP-xylose synthase; UDP-xylose jista' jiġi kkatalizzat aktar minn UDP-xylose epimerase biex jiġġenera UDP-arabinose[6]; UDP-glucose u UDP-galactose huma diastereomeri u jistgħu jiġu kkonvertiti f'xulxin permezz ta' epimerase[7,8]. Għalhekk, is-sinteżi ta 'UDP-glucose għandha influwenza importanti fuq il-provvista ta' donaturi attivi ta 'glycosyl fil-pjanti u l-modifika ta' glycosylation ta 'metaboliti sekondarji.

Is-sinteżi ta 'UDP-glukożju fil-pjanti tista' tinkiseb permezz tal-mogħdija tas-syntażi, il-mogħdija tal-fosforilażi u l-mogħdija tal-kinażi. Fosthom, sucrose synthase jista 'jikkatalizza direttament ir-reazzjoni bejn UDP u sucrose biex jiġġenera UDP-glucose u fruttosju, kif ukoll ir-reazzjoni inversa [9]. F'sens wiesa ', sucrose synthase jappartjeni għas-sottofamilja glycosyltransferase-4, li tinkludi varjetà ta' glycosyltransferases, bħal sucrose synthase phosphatase, trehalose synthase u trehalose phosphorylase [10]. Sucrose synthase ġie identifikat għall-ewwel darba fir-raħs tal-qamħ [11]. Minn dakinhar, ir-riċerkaturi identifikaw mijiet ta 'ġeni ta' sucrose synthase minn varjetà ta 'pjanti bħal fażola mung (Vigna radiata), ross (Oryza sativa), qamħ (Zea mays), sojja (Glycine max) u ħawħ (Amygdalus persica). Huma involuti fi proċessi metaboliċi multipli fil-pjanti, inkluż it-trasport u d-distribuzzjoni tas-sukrożju, sinteżi tal-lamtu, sinteżi taċ-ċelluloża u kompożizzjoni tal-ħajt taċ-ċelluli, stress bijotiku u abijotiku, eċċ., U għandhom rwol regolatorju ewlieni fl-allokazzjoni tas-sors tal-karbonju tal-pjanti [12]. Barra minn hekk, ibbażat fuq l-istudju tal-funzjonijiet fiżjoloġiċi, ir-riċerkaturi użaw ukoll is-sukrożju synthase miksub bħala element tal-ġeni għas-sintesi enżimatika tal-komposti tal-glycoside, u kisbu riżultati ideali. Pereżempju, Masada et al. [13] koespressa l-ġene sucrose synthase AtSus-1 minn Arabidopsis thaliana u l-ġene glycosyltransferase CaUGT2 minn Catharanthus roseus in vitro, u uża sistema ta’ enzimi doppji b’pot wieħed biex jikkatalizza r-reazzjoni ta’ glikosilazzjoni tal-curcumin, li żiedet il- rendiment ta 'curcumin glycoside b'7 darbiet. Fl-istess ħin, l-ammont ta 'donatur UDP-glucose użat kien biss wieħed minn għaxra tal-ammont inizjali.

Bungaruang et al. [14] bniet sistema katalitika akkoppjata bl-użu ta' sucrose synthase GmSuSy mis-sojja u glycosyltransferase OsUGT mir-ross. Huma kisbu modifika ta 'glycosylation ta' nothofagin billi żiedu biss ammont żgħir ta 'UDP (1.0 mmol·L-1) u sukrożju. Meta mqabbel mal-katalisi ta 'enżima waħda ta' OsUGT, il-produzzjoni ta 'prodotti ta' glycosylation żdiedet bi tliet ordnijiet ta 'kobor, minn μmol·L-1 għal mol·L-1.

Ir-rikkezza u d-diversità tal-komposti tal-glycoside f'Cistanche tubulosa jissuġġerixxu li għandu jkun fih sucrose synthase b'saħħtu relatat mal-modifika tal-glycosylation ta 'metaboliti sekondarji, iżda din l-enzima ma ġietx irrappurtata f'pjanti tal-ġeneru Cistanche. F'dan id-dokument, Cistanche tubulosa, materjal mediċinali inkluż fil-farmakopea, intuża bħala l-materjal. Permezz ta 'analiżi tat-traskriptome u analiżi komparattiva tat-traskriptome ta' partijiet differenti, intużaw tekniki ta 'bijoloġija molekulari biex jiġu minjieri u identifikati ġene tas-sukrożju synthase CtSus. Twettqu analiżi tal-bijoinformatika, bijotrasformazzjoni taċ-ċelluli kollha, espressjoni u purifikazzjoni prokarjotika, analiżi tal-attività katalitika tal-enżimi in vitro, u analiżi tal-espressjoni tal-ġeni f'partijiet differenti ta 'Cistanche tubulosa u sistemi ta' kultura tat-tessuti tal-pjanti taħt stress tan-nixfa biex tiġi esplorata l-funzjoni ta 'CtSus u l-korrelazzjoni tagħha ma' il-bijosintesi ta 'komposti ta' glycoside f'Cistanche tubulosa, li tistabbilixxi pedament għall-istudju tal-mogħdija bijosintetika ta 'komposti ta' glycoside f'Cistanche tubulosa.

Materjali u metodi

Materjali Pjanti friski ta 'Cistanche tubulosa inġabru mill-Belt ta' Hotan, Xinjiang, iċ-Ċina, u l-identifikazzjoni bijoloġika saret mill-Professur Tu Pengfei tal-Università ta 'Peking; is-sistema tal-kultura taċ-ċelluli tas-sospensjoni ta 'Cistanche tubulosa ġiet stabbilita mill-grupp ta' riċerka tagħna fl-istadju bikri [15]; E. coliFast-T1 inxtara minn Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.; E. coli BL21 (DE3) inxtara minn Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pCold™ I u pCold™ TF vectors inxtraw minn Bio-Tech (Beijing) Co., Ltd.; Il-kontroll tal-UDP-glukożju nxtara minn Xi'an Qiyue Biotechnology Co., Ltd., u sottostrati ta 'aesculin u resveratrol inxtraw minn Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.

DICHEN CISTANCHE TIKKULTIVA BAŻIJIET F'HOTAN, XINJIANG

L-estrazzjoni tal-RNA u s-sinteżi tal-cDNA L-RNA ġie estratt skont l-istruzzjonijiet tal-Kit tal-Pjanti OMEGA RNA (Cat R6827-01, Omega Bio-Tek). L-elettroforeżi tal-ġel tal-agarose u l-ispettrofotometru Nanodrop 2000 intużaw biex jiskopru l-purità, il-konċentrazzjoni u l-integrità tal-RNA. Il-kampjuni kwalifikati ta 'RNA ġew traskritti b'lura bl-użu tal-kit ta' traskrizzjoni inversa TransScript® OneStep gDNA Removal u cDNA Synthesis SuperMix (Cat AT311-02, Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.) biex tiġi sintetizzata l-ewwel katina ta 'cDNA.

Minjieri ta 'ġeni ta' sucrose synthase u klonazzjoni ta 'ġeni CtSus Is-sekwenza ta' aċidu amminiku ta 'l-Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 identifikata funzjonalment (numru ta' adeżjoni GenBank: AED92894.1)[16] intużat bħala mudell. Ġeni tas-sukrożju synthase ġew skrinjati mid-dejta tat-transcriptome ta 'C. tubulosa permezz ta' allinjament lokali tas-sekwenza ta 'Blastp, flimkien ma' annotazzjoni tal-ġeni tat-transcriptome, analiżi tal-FPKM (abbundanza tal-espressjoni tal-ġeni) u analiżi komparattiva tad-dejta tat-transcriptome. Primers speċifiċi ġew iddisinjati bbażati fuq l-informazzjoni dwar is-sekwenza tal-ġeni kandidati pprovduta mid-dejta tat-traskriptome tat-tieni ġenerazzjoni ta 'C. tubulosa (Tabella 1). C. tubulosa cDNA intuża bħala mudell u l-amplifikazzjoni tal-PCR tal-ġene fil-mira saret bl-użu ta 'enżima PCR ta' fedeltà għolja (Cat P505-d1, Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.). Il-prodott ta' amplifikazzjoni tal-PCR ġie ppurifikat bl-użu tal-FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit (Cat DC201-01, Nanjing Novozymes Biotech Co., Ltd.) u mbagħad ikklonat skont il-kit ta' klonazzjoni veloċi (Cat C112-01, Nanjing Novogene Biotech Co., Ltd.) kien konness mal-vettur tal-klonazzjoni pCE2 TA/Blunt-Zero skont l-istruzzjonijiet operattivi, trasferit f'ċelloli kompetenti Fast-T1, u kkultivat matul il-lejl f'37 grad. Il-plasmid ġie estratt u sottomess lil Beijing Liuhe BGI Genomics Co., Ltd. għall-identifikazzjoni tas-sekwenzjar.

Tabella 1 Sekwenza tan-nukleotidi ta' primers użati f'dan l-istudju. qPCR: Reazzjoni kwantitattiva-polymerasechain f'ħin reali

Analiżi bijoinformatika ta 'sucrose synthase CtSus minn Cistanche tubulosa....

Is-softwer onlajn ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) intuża biex janalizza l-proprjetajiet fiżikokimiċi tal-proteina; is-softwer onlajn TMHMM (https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM{{0}}.0/) intuża biex ibassar l-istruttura transmembrana tal-proteina; is-softwer onlajn SOPMA (https://npsa-rabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) intuża biex ibassar l-istruttura sekondarja tal-proteina; is-softwer onlajn SMART (http://smart.embl.de/) intuża biex ibassar id-dominju kkonservat tas-sekwenza tal-aċidu amminiku tal-proteini; is-softwer DANMAN intuża biex iqabbel is-sekwenzi ta 'amino acids ta' CtSus ma 'dawk ta' sucrose synthases minn speċi oħra; Is-siġra filoġenetika nbniet permezz ta' analiżi tal-clusters bl-użu tal-metodu tal-għaqda tal-ġirien bl-użu tas-softwer MEGA11, b'ripetizzjoni bootstrap ta' 1,000 darbiet.

Analiżi ta 'espressjoni ta' CtSus f'partijiet differenti ta 'Cistanche tubulosa u taħt stress ta' nixfa

Primers PCR kwantitattivi tal-fluworexxenza f'ħin reali għal CtSus u l-ġene ta 'referenza interna DNAj ġew iddisinjati bl-użu ta' softwer DNAMAN [17] (Tabella 1). Il-livell ta 'espressjoni relattiva tal-ġene CtSus f'ċelloli ta' sospensjoni ta 'Cistanche tubulosa f'partijiet differenti ta' Cistanche tubulosa u taħt stress tan-nixfa ġie analizzat permezz ta 'PCR kwantitattiv ta' fluworexxenza f'ħin reali. Analiżi PCR kwantitattiva tal-fluworexxenza f'ħin reali saret bl-użu tal-Kit SuperMix TransStart® Top Green qPCR (Cat AQ131-01, Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.). Il-programm ta 'amplifikazzjoni adotta metodu f'żewġ stadji: 94 grad għal 30 s; 94 grad għal 5 s, 60 grad għal 30 s, ripetut għal 40 ċiklu; kien immexxi fuq is-Sistema ta 'Sejbien ta' PCR Real-Time Bio-Rad CFX Connect™ (Laboratorju Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Il-metodu 2–ΔΔCT intuża biex janalizza l-espressjoni relattiva tal-ġene CtSus fi gruppi sperimentali differenti. GraphPadPrism 9 intuża għall-analiżi tas-sinifikat u biex tfassal bar graph.

Kostruzzjoni ta 'vettur ta' espressjoni prokarjotika u espressjoni eterologa tal-ġene CtSus Ibbażat fuq ir-riżultati tas-sekwenzjar tal-ġeni, primers speċifiċi li fihom armi tal-omoloġija tal-vettur u siti ta 'restrizzjoni (Tabella 1) ġew iddisinjati għall-amplifikazzjoni tal-PCR. Il-ġene fil-mira CtSus inbena f'vetturi ta' espressjoni pET-28a, pET-24b, pCold™ I u pCold™ TF bl-użu ta' teknoloġija ta' klonazzjoni bla xkiel bl-użu ta' ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit (CatC115-01 , Nanjing Novogene Biotech Co., Ltd.). Il-plażmidi tal-vetturi ta' espressjoni rikombinanti mibnija b'suċċess ġew estratti u ttrasformati f'ċellula kompetenti ta' espressjoni ta' Escherichia coli Transetta (DE3). Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​f'mezz likwidu LB li kien fih 50 µg·mL-1 kanamycin sulfate (b'pET-28a u pET-24b bħala vettori tal-espressjoni) jew 1{{ 22}}0 µg·mL-1 ampicillin (b'pCold™ I u pCold™ TF bħala vettori tal-espressjoni) u 50 ug·mL-1 chloramphenicol, rispettivament, f'37 grad u 200 r·min{{ 15}} bi tħawwad sakemm il-valur A600 tas-soluzzjoni batterjali laħaq 0.4-0.6. Żid isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside (IPTG) f'konċentrazzjoni finali ta' 0.5 mmol·L-1 biex tinduċi espressjoni ta' proteina. Inkuba f'temperatura kostanti li tħawwad fi 23 grad (b'pET-28a u pET-24b bħala vettori tal-espressjoni) jew 15-il grad (bil-pCold™ I u pCold™ TF bħala vettori tal-espressjoni), 180 r· min-1 għal 16-il siegħa (b'pET28a u pET-24b bħala vettori tal-espressjoni) jew 24 siegħa (bil-pCold™ I u pCold™ TF bħala vettori tal-espressjoni), imbagħad iġbor il-batterja biċ-ċentrifugazzjoni.

Liżi buffer (20 mmol·L-1 NaH2PO4-Na2HPO4, 0.5 mol·L-1 NaCl, 20 mmol·L{{10} } imidazole, 3% glycerol, 100 mmol·L-1 phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mg·mL-1 lysozyme, pH 7.4), ġie miżjud, u ċ-ċelloli tkissru għal 8 min u ċċentrifugati. Is-supernatant u l-preċipitat ittieħdu rispettivament. Is-supernatant ġie adsorbit mill-kolonna ta 'affinità HisTrap FF (Cat 17531901, Cytiva) mimlija b'mili Ni Sepharose 6 Fast Flow biex jassorbi l-proteina fil-mira li fiha t-tikketta His. Wara l-elużjoni b'konċentrazzjonijiet differenti ta 'imidazole, kull frazzjoni ttieħdet għall-iskoperta ta' SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis). Il-frazzjonijiet li kien fihom il-proteina fil-mira ġew ikkombinati, ikkonċentrati permezz ta' ċentrifugazzjoni u mneħħija minn melħ b'tubu ta' ultrafiltrazzjoni (Millipore), u maħżuna f'buffer [li fih 50 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 7.5), 0.2 mol·L{{ 30}}NaCl, 1 mmol·L-1 dithiothreitol, 3% glycerol] għal reazzjonijiet sussegwenti ta' kataliżi enżimatika in vitro.

Kataliżi taċ-ċelluli sħaħ CtSus Il-plasmid pCold™ I-CtSus u l-plasmid tal-espressjoni pET-28a-UGT71BD1[18] tal-glycosyltransferase UGT71BD1, li kienu ġew identifikati mill-grupp ta’ riċerka aktar kmieni, ġew trasformati simultanjament fl-espressjoni kompetenti E. coli Transetta (DE3). Batterji rikombinanti pożittivi li fihom ġeni kemm CtSus kif ukoll UGT71BD1 ġew magħżula u mlaqqma f'medju LB (medju ta' tkabbir) li kien fih 50 ug·mL-1 kanamycin sulfate, 10{0 ug ·mL-1 ampicillin u 50 ug·mL-1 chloramphenicol fi proporzjon ta' 1:100 (V/V). Il-kultura ġiet ikkultivata f'37 grad sakemm il-valur A600 tas-soluzzjoni batterjali kien 0.4-0.6, u mbagħad IPTG ġie miżjud f'konċentrazzjoni finali ta '1 mmol·L-1. Il-kultura kompliet fi 15-il grad u 180 r·min-1 għal 24 siegħa. Il-kultura ġiet ċentrifugata f'4 gradi u 4 000 r·min-1. Iġbor iċ-ċelloli. Inokula ċ-ċelloli miġbura f'medju M9 (medju ta' fermentazzjoni) fi proporzjon ta' 40 mL medju ta' kultura għal kull gramma ta' batterja, u żid 75 μmol·L-1 sukrożju u 25 μmol·L-1 aesculetin (1) jew resveratrol (2) sottostrati għall-gruppi ta 'reazzjoni. Kompli tħawwad il-kultura għal 24 siegħa, ċentrifuga f'4000 × g, 4 gradi għal 30 min, żid metanol biex tkisser ultrasonikament il-preċipitat, żid 2 darbiet il-volum ta 'metanol mas-supernatant, ċentrifuga f'4000 × g, 4 grad għal 30 min, ħu s-supernatant u għaqqad, evapora s-solvent taħt pressjoni mnaqqsa, dewweb mill-ġdid fil-metanol, iffiltra permezz ta 'membrana tal-filtru ta' 0.22 μm, u skopra l-prodott ta 'reazzjoni billi tuża kromatografu likwidu ta' prestazzjoni għolja Agilent 1260. CAPCELL PAK C18 COLUMN (250 mm × 4.6 mm, 5 µm) intużat bħala l-kolonna analitika, 0.1% ilma ta 'aċidu formiku (A) u metanol (B) intużaw bħala l-fażi mobbli, u l-gradjent ta' elużjoni kien: {{61 }} min, 30%-90% B; 25-27 min, 90%-100% B; 27-33 min, 100% B. Il-parametri tal-ispettrometrija tal-massa kienu modi joniċi pożittivi u negattivi, u skans sħaħ awtomatiċi ta' MS1, MS2, u MS3 f'diversi stadji.

Sejbien ta' attività katalitika ta' l-enżimi CtSus in vitro Il-proteina rikombinanti miksuba mill-kromatografija ta' affinità tal-kolonna HisTrap FF imsemmija hawn fuq kienet soġġetta għat-tneħħija tat-tikketta terminali bl-użu tal-Fattur Xa. Is-sistema tad-diġestjoni tal-enżimi kienet kif ġej: il-proteina rikombinanti ġiet aġġustata għal konċentrazzjoni ta' 1 mg·mL-1, u 1 μL Fattur Xa ġie miżjud ma' 50 μL tal-proteina rikombinanti f'buffer ta' 20 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8.0), 100 mmol·L-1 NaCl, u 2 mmol·L-1

CaCl2 fi 23 grad għal 6 sigħat. Is-sistema ta' reazzjoni kienet 100 μL. Il-prodott tas-sistema tad-diġestjoni ta 'l-enżimi kien soġġett għal separazzjoni ta' proteina sekondarja permezz ta 'kromatografija ta' affinità HisTrap FF biex tinkiseb il-proteina fil-mira bit-tneħħija ta 'tikketta għal reazzjonijiet sussegwenti ta' kataliżi ta 'enżimi in vitro. Is-sistema ta' reazzjoni ta' l-enżima kienet kif ġej: 10mmol·L-1 UDP, 100 mmol·L-1 sukrożju, 50 mmol·L-1 MgCl2, 60 ug proteina CtSus, Tris-HCl (pH 7.0) supplimentat għal 100 μL, irreaġixxa f'banju ta 'l-ilma fi 30 grad għal 6 sigħat, u l-metodi ta' analiżi ta 'wara t-trattament u HPLC twettqu kif deskritt f'referenza [19].

Tbassir ta 'struttura tridimensjonali u analiżi ta' docking molekulari tal-proteina CtSus AlphaFold2 intużaw biex ibassru l-istruttura tridimensjonali tal-proteina CtSus [20]. Il-molekula tal-ligand ġiet idroġenata u ċċarġjata bl-użu tas-softwer AutoDock Tools 1.5.6. Il-but tal-irbit tas-sottostrat inkiseb bl-allinjament mal-proteina mudell AtSus1 (PDBID 3S28). Il-ktajjen tal-ġenb tar-residwi tal-amino acid madwar il-kavità ġew issettjati biex ikunu flessibbli.

Il-kaxxa tal-grilja kienet issettjata għal 40 × 40 × 40 Å3, u l-ispazjar tal-grilja kien 0.375 Å. Docking molekulari sar f'AutoDock Vina [21]. Is-softwer PyMOL 2.0 intuża biex jivviżwalizza l-mudell bl-aħjar affinità (kcat·mol-1

).

Analiżi statistika GraphPad Prism 9 intuża għall-analiżi statistika. Id-dejta sperimentali ġiet espressa bħala medja ± devjazzjoni standard. It-test t intuża għal tqabbil bejn żewġ gruppi, u ntużat analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda għal tqabbil bejn gruppi multipli. Id-differenza tqieset statistikament sinifikanti meta P < 0.05.