Ferristatin II Inibixxi b'mod effiċjenti r-replikazzjoni ta' SARS-CoV-2 fiċ-Ċelloli Vero

Kuntatt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Astratt

Sindromu respiratorju akut sever koronavirus 2 (SARS-CoV-2) ikompli jkollu impatt sinifikanti fuq is-saħħa pubblika globali. Ġew deskritti mekkaniżmi multipli għad-dħul taċ-ċelluli SARS-CoV-2; madankollu, ir-rwol tar-riċettur tat-trasferiment 1 (TfR1) fl-infezzjoni SARS-CoV-2 irċieva ftit attenzjoni. Aħna użajna ferritin II biex ninduċi d-degradazzjoni ta 'TfR1 fuq il-wiċċ taċ-ċelloli Vero u biex nistudjaw il-konsegwenzi ta' tali trattament fuq il-vijabbiltà taċ-ċelloli u r-replikazzjoni ta 'SARS-CoV-2. Aħna wrejna li ferritin II mhuwiex tossiku għaċ-ċelloli Vero f'konċentrazzjonijiet sa 400 µM. Skont id-dejta tal-mikroskopija konfokali, id-distribuzzjoni tat-trasferimenti ttikkettjati u d-dominju li jgħaqqad ir-riċettur (RBD) tal-proteina Spike hija affettwata b'mod sinifikanti mit-trattament minn qabel ta '18-il siegħa b'100 µM ferritin II f'mezz ta' kultura. L-assorbiment tal-proteina RBD huwa inibit għal kollox mit-trattament tal-ferritin II, għalkemm din il-proteina tibqa' marbuta mal-wiċċ taċ-ċellula. Is-sejbiet ġew ikkonfermati tajjeb mill-inibizzjoni sinifikanti tal-infezzjoni SARS-CoV-2 taċ-ċelloli Vero minn ferritin II b'valuri IC50 ta '27 µM (għall-virus Wuhan D614G) u 40 µM (għall-virus Delta). Tnaqqis sinifikanti fit-titer infettiv tal-varjant Omicron SARS-CoV-2 kien innutat f'konċentrazzjoni ta' ferritin II baxxi daqs 6.25 µM. Aħna nipoteżi li l-ferritin II jimblokka d-dħul taċ-ċellula ospitanti medjata minn TfR1-SARS-CoV-2; madankollu, huma meħtieġa aktar studji biex jiċċaraw il-mekkaniżmi sħaħ ta' din l-inibizzjoni tal-virus, inkluż l-effett tal-ferritin II fuq riċetturi oħra tas-SARS-CoV-2, bħal ACE2, Neuropilin-1, u CD147. L-inibizzjoni tad-dħul virali billi timmira r-riċettur fuq iċ-ċelloli ospitanti, aktar milli l-proteina suxxettibbli għall-mutazzjoni virali, hija strateġija terapewtika promettenti tal-COVID-19.

Kliem ewlieni: SARS-CoV-2;riċettur tat-trasferiment 1; ferritin II; dominju li jgħaqqad ir-riċettur (RBD); Ċelloli Vero

Alexey Sokolov , Irina Isakova-Sivak *, Natalia Grudinina , Daria Mezhenskaya , Elena Litasova , Valeria Kostevich, Ekaterina Stepanova , Alexandra Rak , Ivan Sychev, Olga Kirik u Larisa Rudenko

Istitut tal-Mediċina Sperimentali, 197376 San Pietruburgu, ir-Russja

1. Introduzzjoni

Il-pandemija tal-marda tal-koronavirus 2019 (COVID-19) ikkawżata minn koronavirus 2 tas-sindromu respiratorju akut sever (SARS-CoV-2) għadha toħloq piż soċjoekonomiku sinifikanti għall-popolazzjoni tad-dinja. Enżima 2 li tikkonverti l-anġjotensin (ACE2) hija meqjusa bħala r-riċettur ewlieni taċ-ċelluli ospitanti li SARS-CoV-2 juża biex jidħol fiċ-ċelloli [1–4]; madankollu, ġew identifikati diversi riċetturi u ko-riċetturi alternattivi li kapaċi jiffaċilitaw id-dħul taċ-ċelluli SARS-CoV-2 u l-infettività, bħal Neuropilin-1, CD147, tyrosine-protein kinase receptor UFO (AXL) u oħrajn [5–10]. Barra minn hekk, żewġ passi ta' qsim proteolitiku huma meħtieġa għal dħul effettiv tas-SARS-CoV-2 fiċ-ċelloli wara l-ingaġġ ta' riċettur taċ-ċellula ospitanti minn proteina spike virali (S). L-ewwel pass jinvolvi l-qsim tal-konfini S1–S2 minn furin protease f'ċellula infettata, filwaqt li l-qsim tas-sit S20 huwa dipendenti fuq proteases taċ-ċelluli fil-mira, bħal TMPRSS2 u cathepsin L, li jattivaw proteini S fil-membrana tal-plażma u fil-plażma. endolysosome, rispettivament (revedut fi [11]).

cistanche għall-bejgħghalkapaċità immuni

Minbarra l-miri ta' dħul taċ-ċelluli ospitanti ta' SARS-CoV-2 studjati sew, hemm evidenza li r-riċettur tat-transferin 1 (TfR1) jista' jkun ko-riċettur alternattiv għad-dħul ta' SARS-CoV-2 [12]. TfR1, glikoproteina tal-membrana homodimeric tat-tip II ta '95 kDa, hija espressa b'mod abbundanti fuq il-membrana tal-plażma tal-biċċa l-kbira taċ-ċelloli umani u timmedja d-dħul ta' transferrin (Tf) fiċ-ċelloli għall-kunsinna tal-ħadid [13]. Tabilħaqq, hemm firxa wiesgħa ta 'viruses umani u żoonotiċi li jistgħu jinvadu ċ-ċelloli ospitanti permezz tal-interazzjoni ma' TfR1 u fatturi oħra fil-mogħdija tal-assorbiment tal-ħadid, inklużi arenaviruses tad-Dinja l-Ġdida, virus tal-immunodefiċjenza umana, parvoviruses, virus tal-epatite Ċ, alphaviruses, u oħrajn. [14]. Għalhekk, l-immirar tal-mogħdija tad-dħul virali medjata minn TfR1- tirrappreżenta strateġija terapewtika promettenti għall-infezzjoni tas-SARS-CoV-2. Studji bikrija ta 'screening identifikaw żewġ komposti ta' daqs żgħir (NCI11079 u NCI306711) li kellhom effett inibitorju sinifikanti fuq l-assorbiment tal-ħadid medjat minn Tf miċ-ċelloli HeLa. Il-kompost NCI306711 jimmira lil TfR1 billi jinduċi l-internalizzazzjoni u d-degradazzjoni tiegħu u kien jismu "ferritin" minħabba l-proprjetà mhux tas-soltu tiegħu li jinibixxi t-trasport tal-ħadid permezz tal-mogħdija dipendenti fuq il-kolesterol [15]. Molekula żgħira oħra, ferritin II (NSC8679), taġixxi b'mod simili għall-ferritin u tiddegrada TfR1 permezz ta' mogħdija taċ-ċattra tal-lipidi sensittivi għan-nystatin [16]. Fid-dawl ta' din id-dejta, ippruvajna nivvalutaw l-abbiltà tal-ferritin II li jinibixxi r-replikazzjoni ta' SARS-CoV-2 fiċ-ċelloli Vero-CCL81 u nesploraw il-mekkaniżmi potenzjali ta' din l-inibizzjoni.

2. Materjali u Metodi

2.1. Viruses, Proteini, u Komposti Kimiċi

Is-SARS-CoV-2 jiżola hCoV-19/St_Petersburg-3524S/2020 (nisel Wuhan D614G), hCoV-19 /Russja/SPE-RII-32759V/2021 (nisel Delta), u hCoV-19/Russia/SPE RII-6086V/2021 (nisel Omicron) inkisbu mill-Istitut tar-Riċerka Smorodintsev ta Influwenza (San Pietruburgu, ir-Russja). Ix-xogħol kollu b'viruses infettivi sar fil-laboratorju tal-livell ta' bijosigurtà 3 (BSL-3). Proteina rikombinanti li tikkorrispondi mad-dominju li jgħaqqad ir-riċettur (RBD) tal-proteina SARS-CoV-2 S ġiet espressa f'ċelloli ewkarjotiċi minn BIOCAD JSC (St.Petersburg, ir-Russja). Serum uman saturat bil-ħadid TF (Fe2-TF) kien iżolat mis-serum tad-demm uman permezz ta' kromatografija ta' skambju joniku fuq DEAE-Toyopearl, UNOsphere S, u filtrazzjoni tal-ġell fuq Sephadex G-75 Superfine, kif deskritt qabel [17]. Ferristatin II (Figura 1) inxtara minn Sigma (C-1144, St. Louis, MO, USA). Il-kompost ġie dilwit f'150 mM NaCl, 10 mM Na-phosphate buffer, pH 7.4 (PBS) sal-konċentrazzjoni finali ta '4 mm, u s-soluzzjoni ġiet iffiltrata minn membrana sterili b'daqs tal-pori ta' 0.22 µm (Sartorius, il-Ġermanja) .

2.2. Il-Propagazzjoni tal-Virus SARS-CoV-2 u l-Valutazzjoni tal-Kapaċità ta' Inibizzjoni tal-Virus Ferristatin II

Il-viruses ġew propagati fuq ċelluli Vero CCL81 bl-użu ta 'DMEM supplimentat b'1 × antibijotiku-antimikotiku, 10 mM HEPES, u 2 fil-mija FBS (kollha minn Capricorn, Ebsdorfergrund, il-Ġermanja), (DMEM / 2 fil-mija FBS). Tittri infettivi ġew determinati b'assaġġ ta' 50 fil-mija Tissue Culture Infection Dose (TCID50), kif deskritt f'[18] u espress f'lgTCID50/mL.

Għall-evalwazzjoni tal-kapaċità ta 'newtralizzazzjoni tal-virus tal-ferritin, użajna assaġġ ta' mikronewtralizzazzjoni modifikat. Il-ġurnata ta 'qabel l-esperimenti, iċ-ċelluli Vero ġew miżrugħa fi {{0}}pjanċi ta' kultura sew (3 × 104 ċelluli kull bir) f'DMEM supplimentat b'1 × antibijotiku-antimikotiku u 10 fil-mija FBS. L-għada, il-medju tneħħa, u ċ-ċelloli ġew infettati b'100 TCID50 ta' SARS-CoV-2 ippreparat fuq DMEM/2 fil-mija FBS għal 2 sigħat f'37 ◦C, 5 fil-mija CO2. Diversi bjar baqgħu mhux infettati bħala kontroll negattiv. Imbagħad, l-inoculum tneħħa, u ċ-ċelloli ġew koperti b'150 µL ta 'dilwizzjonijiet ta' ferritin II b'żewġ darbiet ippreparati fuq DMEM/2 fil-mija FBS, filwaqt li l-bjar ta 'kontroll negattiv u pożittiv kienu koperti bil-midja biss. Kull dilwizzjoni tal-ferritin II ġiet ivvalutata fi tliet kopji. Il-pjanċi ġew inkubati għal 48 siegħa (għall-virus Wuhan G614D) jew 72 siegħa (għall-viruses Delta u Omicron) f'37 ◦C, 5 fil-mija CO2, sakemm deher effett ċitopatiku ċar fil-bjar ta 'kontroll pożittiv. Is-supernatanti nġabru bir-reqqa f'tubi ta '0.2 mL għall-kwantifikazzjoni tat-titer virali u ċ-ċelloli ġew iffissati b'10 fil-mija formaldehyde f'4 ◦C għal 24 siegħa.

Il-pjanċi fissi ġew trasferiti għal-laboratorju BSL{{0}} għal proċedura ELISA bbażata fuq iċ-ċelluli. Dan kien jinkludi ħasil b'PBST (PBS bi 0.05 fil-mija ta' Tween 20), permeabilizzazzjoni taċ-ċelluli b'0.1 fil-mija Triton X-100 f'temperatura tal-kamra għal 15-il minuta, imblukkar bi 3 fil-mija ħalib xkumat f'37 ◦C għal siegħa, u ħasil intensiv bil-PBST. Imbagħad, l-antikorp purifikat tal-fenek poliklonali kontra l-RBD (BIOCAD JSC, San Pietruburgu, ir-Russja) ġie miżjud f'konċentrazzjoni ta '1.5 µg/mL għal siegħa, segwit minn ħasil b'PBST u ż-żieda ta' kontra l-fenek sekondarju anti-IgG HRP- antikorp konjugat (BioRad, Hercules, CA, USA) għal siegħa f'37 ◦C. Il-pjanċi ġew żviluppati bl-użu ta' 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Ir-reazzjoni twaqqfet b'soluzzjoni 1M H2SO4, u r-riżultati nqraw f'450 nm bl-użu tal-xMark Microplate Spectrophotometer (BioRad, Hercules, CA, USA). Biex jiġi kkalkulat it-titer IC50, intużat analiżi ta 'rigressjoni mhux lineari b'erba' parametri, ibbażata fuq il-valuri OD450 ta 'ċelluli negattivi għall-virus u pożittivi għall-virus, kif deskritt f'[18].

fejn tixtri cistanche

It-titri ta' SARS-CoV-2 fis-supernatanti taċ-ċelluli ġew ikkalkulati permezz ta' RT-PCR kwantitattiv f'ħin reali. L-RNA ġie ppurifikat minn 100 µL ta' medium tal-kultura taċ-ċelluli, kif ukoll minn SARS-CoV-2 b'titri magħrufa għall-ġenerazzjoni tal-kurvi standard tal-assaġġ. Kampjuni ta 'RNA ġew ippurifikati b'kit ta' estrazzjoni ta 'RNA (Biolabmix, Novosibirsk, ir-Russja) skond il-protokoll tal-manifattur. Ir-reazzjoni RT-PCR saret f'duplikati bi forwarding primer 50 -CAATGGTTTAACAGGCACAGG-30 u reverse primer 50 -CTCAAGTGTCTGTG GATCACG-30 [19] bl-użu ta' One-Tube RT-PCR SYBR kit (Evrogen, Moska, Russja) fuq Quantstudio 1 Real-Time PCR System (Thermofifisher Scientific, Waltham, MA, USA), biż-żieda ta '50x Rox bħala żebgħa ta' referenza.

Iċ-ċiklu tal-limitu (Ct) ġie kkalkulat għal kull kampjun b'Software ta' Disinn u Analiżi QuantStudio v1.5.1, u l-kurva standard ġiet iġġenerata fuq kull pjanċa ta 'reazzjoni. It-titer tal-virus f'kull bir ġie kkalkulat bl-użu ta' valuri Ct normalizzati għal kurvi standard ikkalkulati fuq il-bażi tat-titrazzjoni standard tal-virus u espressi f'lgTCID50/mL. Biex jiġi ddeterminat jekk ferritin II jistax jinibixxi l-passi inizjali tat-twaħħil virali maċ-ċelloli, 100 TCID50 ta’ SARS-CoV-2 tħalltu ma’ dilwizzjonijiet ta’ ferritin II, u wara siegħa inkubazzjoni f’37 ◦C, din it-taħlita ġiet miżjuda ma’ Vero ċelluli, segwit minn inkubazzjoni addizzjonali ta '1h f'37 ◦C. Wara l-assorbiment virali, l-inoculum tneħħa, u ċ-ċelloli ġew koperti b'150 µL ta 'midja friska DMEM/2 fil-mija FBS. Wara 48 siegħa ta 'inkubazzjoni f'37 ◦C, 5 fil-mija CO2, u CPE viżibbli f'ċelloli ta' kontroll pożittiv, il-pjanċi ġew iffissati u soġġetti għal ELISA bbażata fuq iċ-ċelluli kif deskritt hawn fuq.

2.3. Valutazzjoni tal-Effett Ċitotossiku ta' Ferristatin II

Iċ-ċitotossiċità tal-ferritin II għaċ-ċelloli Vero ġiet ivvalutata mill-{{0}}(4,5-Dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide ( MTT) assaġġ tat-tnaqqis [20]. Dilwizzjonijiet doppji tal-ferritin II ġew ippreparati f'medja DMEM/2 fil-mija FBS li jibdew minn konċentrazzjoni ta '400 µM u miżjuda mal-bjar ta' 96-pjanċi tal-bir b'monosaffi taċ-ċelluli Vero. Wara 48 siegħa ta 'inkubazzjoni, il-midja tneħħa u ċ-ċelloli ġew maħsula bil-mod b'PBS sħun. Ir-reaġent MTT 0.5 mg/mL ġie miżjud ma 'kull bir f'volum ta' 100 µL, u l-pjanċa ġiet inkubata aktar f'37 ◦C għal 2 sigħat. Imbagħad, ir-reaġent tneħħa u ċ-ċelluli ġew maħsula bil-PBS u mnixxfa bl-arja, segwita biż-żieda ta '100 µL ta' 96 fil-mija etanol biex jinħall il-kristalli ta 'formazan. L-intensità tal-kulur ġiet irreġistrata bl-użu ta 'spettrofotometru f'wavelength ta' 535 nm. Bjar tal-pjanċa mhux miżrugħa b'ċelluli Vero intużaw bħala kontrolli negattivi. L-inibizzjoni ta '50 fil-mija tal-vijabbiltà taċ-ċelluli (CC50) ġiet ikkalkulata b'analiżi ta' rigressjoni mhux lineari b'erba 'parametriċi bl-użu ta' softwer GraphPad Prizm.

2.4. Tikkettjar ta' Transferrin tas-Serum Uman u Proteina RBD Rikombinanti

Ir-reazzjoni tal-ittikkettar twettqet f'aktar 4 ◦C għal 12-il siegħa billi żiedet soluzzjoni ta' 5 mM ta' NHS-ester 5-TAMRA (Lumiprobe, #47120) f'dimethylsulfoxide ma' soluzzjonijiet ta' 30 µM Fe2-TF jew RBD f'200 mM NaHCO3, li jżomm il-proporzjon 5-TAMRA: proteina=8:1 (mol/mol). Wara t-tneħħija taż-żebgħa żejda, il-grad ta 'l-ittikkettar kien stmat bil-proporzjon ta' A541 u A280, li kien 3.5 u 3.2 mol TAMRA għal kull mol Fe2-TF u RBD, rispettivament

2.5.Studju ta 'Ferristatin II Effett ta' TF u RBD Uptake minn Vero Cells

Iċ-ċelloli Vero ġew ikkultivati ​​għal 18-il siegħa f'DMEM/2 fil-mija FBS mingħajr ferritin Il u biż-żieda ta '100 uM ferritin Il b'coverslips għall-mikroskopija mqiegħda qabel fuq il-qiegħ tal-pjanċi tal-kultura. Imbagħad, il-medju ġie sostitwit għal 15-il siegħa b'mezz mingħajr FBS li kien fih 1.2 μM Fe2-TF-TAMRA （0.25 mg/mL） jew 1.2 μM RBD-TAMRA (0.1 mg/mL). Wara l-inkubazzjoni, iċ-ċelloli ġew maħsula bil-mod darbtejn b'PBS, iffissati b'4 fil-mija paraformaldehyde (w/) f'PBS għal 10min, maħsula darbtejn b'PBS għal 30min. Imbagħad, nuklei taċ-ċelloli ġew imtebba 'b'360nM DAPI għal 5min, maħsula b'PBS u coverslips, u mmuntati fuq il-pjastri bl-użu ta' reżina polimerizzanti għall-mikroskopija tal-fluworexxenza (DAKO, Glostrup, id-Danimarka). L-immaġini ġew akkwistati bl-użu ta 'mikroskopju tal-iskannjar tal-lejżer konfokali Axio Observer.Z1/7 (Carl Zeiss, Jena, il-Ġermanja), b'objettiv Plan-Apochromat 63 × / 1.40 Żejt DIC M27. Intuża laser A561 nm biex teċita fluworexxenza TAMRA, a { {28}} nm filtru intuża biex jirreġistra l-fluworexxenza, intuża laser 405 nm biex teċita DAPI. u filtru 400-570 nm intuża biex jirreġistra l-fluworexxenza. L-immaġini ġew akkwistati u pproċessati bl-użu tas-softwer ipprovdut mal-mikroskopju.

3. Riżultati

Aħna użajna żewġ razez ta' SARS-CoV-2 antiġenikament distanti biex nivvalutaw l-abbiltà tal-ferritin II li jinibixxi r-replikazzjoni virali fiċ-ċelloli Vero. Fl-ewwel stadju, ivvalutajna l-inibizzjoni virali fil-preżenza kostanti tal-kompost fil-medju tal-kultura. L-iskoperta ta 'antiġen virali f'ELISA bbażata fuq iċ-ċelluli sabet li l-valuri IC50 għall-ferritin II kienu 26.5 u 40.4 µM għall-viruses Wuhan D614G u Delta, rispettivament (Figura 2A). Il-kwantifikazzjoni tat-titri tal-virus fil-midja tal-kultura kkonfermat li r-rilaxx tal-virus miċ-ċelloli infettati fil-mezz tal-kultura kien inibit minn ferritin II, li jibda minn konċentrazzjoni ta' 25 µM, u l-valuri IC50 ikkalkulati mit-tnaqqis fit-titri TCID50 kienu 24.0 u 25.2 µM għall-viruses Wuhan D614G u Delta, rispettivament. Barra minn hekk, meta l-kompost ġie miżjud f'konċentrazzjoni ta '100 µM, ma seħħet l-ebda replikazzjoni virali fiċ-ċelloli Vero (Figura 2B).

cistanche u tongkat ali

Minħabba d-differenzi sinifikanti fil-proteini RBD tal-varjanti Wuhan D614G u Omicron SARS-CoV-2, dawn tal-aħħar ma setgħux jiġu skoperti f'ELISA bbażata fuq iċ-ċelluli bl-użu tal-antikorp anti-RBD disponibbli, peress li tqajjem għal l-RBD tar-razza oriġinali tas-SARS-CoV-2. Madankollu, it-tnaqqis fit-titri virali infettivi fil-preżenza ta 'ferritin II kien saħansitra aktar evidenti fil-varjant Omicron meta mqabbel maż-żewġ razez l-oħra ta' SARS-CoV-2: tnaqqis ta' għaxar darbiet fit-titer virali kien innutat f'ferritin II. konċentrazzjoni baxxa daqs 6.25 µM, bl-ebda replikazzjoni tal-virus ma sseħħ f'konċentrazzjonijiet ta '50 µM u aktar (Figura 3). Huwa importanti li wieħed jinnota li din l-inibizzjoni ta' SARS-CoV-2 seħħet biss meta ferritin II kien preżenti b'mod kostanti fil-medju tal-kultura, filwaqt li dan l-effett ma kienx osservat meta ċ-ċelloli ġew ittrattati minn qabel bil-kompost jew meta virus/ferritin. It-taħlita II intużat fil-pass ta' adsorbiment segwit minn inkubazzjoni mingħajr is-sustanza (dejta mhux murija).

We further assessed the cytotoxic effect of ferritin II on Vero-CCL81 cells. The presence of this compound in the culture medium at a concentration up to 400 µM had no negative effect on the viability of the cells, suggesting that the inhibition of SARS-CoV-2 replication was not due to the cell's metabolic dysfunctions (Figure 4). Therefore, the selectivity indices (determined as a ratio of CC50 to IC50 values) for ferritin II were >10, >15, and >64 għar-razez Wuhan D614G, Delta, u Omicron SARS-CoV-2, rispettivament.

Biex nesploraw il-mekkaniżmi possibbli tal-inibizzjoni tas-SARS-CoV-2 mill-ferritin II, studjajna l-effett tas-sustanza fuq id-dħul virali b'assaġġ sostitut tal-assorbiment tal-RBD. Għalhekk, iddeterminajna kif konċentrazzjoni mhux tossika ta '100 µM ta' ferritin II tista 'taffettwa l-assorbiment ta' RBD tikkettat b'tetramethylrhodamine (TAMRA) miċ-ċelloli Vero. TfR1, mira għall-azzjoni tal-ferritin II, hija magħrufa li timmedja d-dħul tat-Tf; għalhekk, it-TF ittikkettat bit-TAMRA intuża bħala kontroll pożittiv. Il-kultivazzjoni ta 'ċelluli Vero fil-preżenza ta' 100 µM ferritin II għal 18-il siegħa mingħajr ma żżid proteini ttikkettjati ma kellha l-ebda effett sinifikanti fuq il-morfoloġija tan-nuklei taċ-ċelluli (Figura 5, pannell ta 'fuq (Mock)), indirettament jindika n-nuqqas ta' nekrożi taċ-ċelluli u apoptożi. L-inkubazzjoni ta 'ċelloli b'TF-TAMRA mingħajr trattament ta' ferritin II rriżultat f'akkumulazzjonijiet ta 'proteini ttikkettjati ġewwa ċ-ċelloli, mingħajr ma affettwa r-reġjun nukleari mtebba' DAPI (trijade tan-nofs tax-xellug ta' immaġini (TF-TAMRA) fil-Figura 5). It-trattament ta 'ċelloli b'100 µM ferritin II irriżulta fi tnaqqis sinifikanti fl-inklużjoni ta' TF ittikkettat (trijade tan-nofs tal-lemin ta 'immaġini (TF-TAMRA) fil-Figura 5). L-inkubazzjoni ta 'ċelluli b'RBD-TAMRA mingħajr trattament bil-ferritin II, bħal fil-każ ta' TF ittikkettat, irriżultat fl-akkumulazzjoni ta 'proteini ttikkettjati fiċ-ċitoplasma taċ-ċellula, mingħajr ma affettwat ir-reġjun nukleari (trijade tal-qiegħ tax-xellug (RBD-TAMRA) fil-Figura 5 ). Meta ċ-ċelloli ġew ittrattati b'100 µM ferritin II, seħħet ridistribuzzjoni tas-sinjal TAMRA. Minflok ma nkorpora l-RBD ittikkettat fiċ-ċelluli, is-sinjal TAMRA ġie mqassam b'mod uniformi fuq il-wiċċ taċ-ċellula, b'porzjon żgħir biss tat-tikketta li jifforma gruppi parzjalment jikkoinċidu t-tebgħa DAPI tan-nuklei, li jindika lokalizzazzjoni tal-wiċċ tat-tikketta TAMRA (qiegħ trijade tal-lemin (RBD-TAMRA) fil-Figura 5). Ir-riżultati murija fil-Figura 5 jindikaw li t-trattament taċ-ċelloli Vero b'100 µM ferritin II jaffettwa l-inkorporazzjoni tal-RBD ittikkettat fiċ-ċelloli. Meta wieħed iqis li bħalissa m'hemm l-ebda dejta disponibbli dwar l-effett tal-ferritin II fuq ir-riċettur ACE2, ma jistax jiġi eskluż li l-effett osservat huwa dovut għall-irbit ta' RBD ittikketjat mal-wiċċ taċ-ċellula, iżda n-nuqqas ta' TfR1 fuq iċ-ċelloli jipprevjeni l-inkorporazzjoni. ta' RBD fiċ-ċelloli ttrattati bil-ferritin II.

4. Diskussjoni

SARS-CoV-2 juża mekkaniżmi multipli biex jinvadi ċ-ċelloli ospitanti u jikkawża infezzjoni virali b'suċċess, u firxa wiesgħa ta' inibituri tad-dħul taċ-ċelluli ospitanti bħalissa qed jiġu vvalutati bħala strateġiji terapewtiċi COVID-19 [21]. Fl-istudju attwali, nirrapportaw riżultati preliminari ta 'inibizzjoni ta' SARS-CoV-2 replikazzjoni in vitro bit-trattament taċ-ċelloli fil-mira bil-ferritin II, molekula ta 'daqs żgħir li tista' tiddegrada b'mod selettiv ir-riċettur ta' transferrin 1. Transferrin saturat bil-ħadid (Fe2-Tf jew holo-Tf) jippossjedi affinità għolja mar-riċetturi tiegħu, li hija espressa fuq l-uċuħ tal-biċċa l-kbira taċ-ċelloli umani u hija internalizzata f'kumpless ma 'holo-Tf permezz ta' endoċitożi medjata mir-riċettur. Il-formazzjoni tal-kumplessi bejn il-ħadid u Tf, kif ukoll bejn holo-Tf u TfR, hija dipendenti fuq il-pH u tipprovdi r-rilaxx ta 'ħadid minn Tf u Tf minn TfR fl-ambjent aċiduż ta' endosome. Ir-riċiklaġġ tal-endosoma jirriżulta f'TfR li jirritorna lejn il-membrana tal-plażma u jirrilaxxa l-forma apo ta 'Tf għal rawnd ieħor ta' kunsinna tal-ħadid liċ-ċellula. L-assorbiment tal-ħadid miċ-ċelloli tal-mammiferi huwa proċess importanti għar-regolazzjoni tat-tkabbir taċ-ċelloli tal-kanċer li m'għandhomx aġenti farmakoloġiċi b'mekkaniżmi ta' azzjoni magħrufa. Screening ta' 2000 kompost ta' daqs żgħir mil-librerija tas-Set tad-Diversità tal-Istitut Nazzjonali tal-Kanċer identifika 10 inibituri tat-trasport tal-ħadid b'valuri IC50 li jvarjaw minn 5 sa 30 µM [22]. Ferristatin II intuża bħala imblokkatur ta 'TfR1 fi studji ta' infezzjoni taċ-ċelluli permezz ta 'TfR1 bil-virus tal-epatite Ċ [23,24], virus tal-gastroenterite trasmissibbli [25], u reovirus [26] (Tabella 1). Għandu jiġi nnutat li esperimenti dwar id-degradazzjoni ta 'TfR1 bil-ferritin II huma kważi dejjem imwettqa fil-preżenza permanenti tas-sustanza fil-medju.

F'setup ta 'assaġġ simili, sibna li ferritin II ma kienx prattikament mhux tossiku għaċ-ċelloli Vero matul espożizzjoni ta' 48 siegħa għal konċentrazzjoni ta '400 µM. Din il-konċentrazzjoni hija biżżejjed għad-degradazzjoni sħiħa ta 'TfR1 fuq il-wiċċ taċ-ċelloli kkultivati ​​[16]. Minn naħa waħda, dan l-effett ġie kkonfermat mill-assorbiment imnaqqas ta' Fe2-Tf ittikkettat minn ċelluli Vero ittrattati minn qabel b'100 µM ta' ferritin II għal 18-il siegħa. L-imblukkar mhux komplut ta 'assorbiment ta' Tf ittikkettat, f'dan il-każ, jista 'jiġi spjegat min-nuqqas ta' ferritin II fiż-żmien taż-żieda ta 'proteini ttikkettjati. Min-naħa l-oħra, it-trattament taċ-ċelloli Vero bil-ferritin II biddel b'mod drammatiku l-assorbiment tal-RBD tal-proteini Spike. F'dan l-istudju preliminari, aħna ma vvalujnax il-livell ta' espressjoni ta' riċetturi oħra tas-SARS-CoV-2 taħt trattament ta' ferritin II u ma nduċiex l-knock-out ta 'dawn ir-riċetturi magħrufa biex jipprova r-rwol indipendenti ta' TfR fil-medjazzjoni tas-SARS. -Dħul taċ-ċelluli CoV-2, li huwa qasam tar-riċerka ulterjuri tagħna.

Madankollu, rabta relattivament uniformi ta' RBD mal-wiċċ taċ-ċelloli ttrattati bil-ferritin II jista' jindika li wħud mir-riċetturi tas-SARS-CoV-2 fuq iċ-ċelloli Vero jibqgħu funzjonali u jorbtu l-virus, iżda fin-nuqqas ta' TfR1, il-virus ma jistax jidħol fiċ-ċellula. Dan ir-riċettur huwa x'aktarx ACE2 peress li Prabhakara et al. wera żieda fl-assorbiment ta 'RBD ittikkettat flimkien ma' transferrin ittikkettat minn ċelloli li jesprimu żżejjed ACE2, li jissuġġerixxi li ACE2 jippromwovi l-assorbiment ta 'RBD permezz ta' endoċitosi medjata minn clathrin, li hija sfruttata minn TfR1 [28]. Barra minn hekk, hemm evidenza li s-SARS-CoV-2 jista' jinfetta ċelluli negattivi ACE2-bl-użu ta' mogħdijiet ta' dħul alternattivi [29]; għalhekk, analiżi aktar profonda tal-azzjoni tal-ferritin II fuq diversi tipi ta 'ċelluli hija permissiva għall-infezzjoni SARS-CoV-2 se titfa' dawl fuq ir-rwol ta' TfR1 fiċ-ċiklu tal-ħajja tal-virus. Biex tifhem kemm din is-sustanza hija promettenti għat-terapija futura tal-infezzjoni SARS-CoV-2, huwa importanti li tkun taf kif dan il-kompost jiġi metabolizzat in vivo. Il-firien ikkurati b'ferritin II kellhom livelli aktar baxxi ta 'TfR1 fil-fwied, u naqqsu s-saturazzjoni tal-ħadid fis-serum u Tf mingħajr bidliet fil-ħadid mhux heme tal-fwied [16].

Barra minn hekk, ferritin II indotta l-espressjoni ta 'hepcidin [16,30]. Fi studju ieħor, l-espressjoni tal-ġeni ġiet ivvalutata wara l-għoti ta’ ferritin II (f’żejt tal-qamħirrum) fl-istonku tal-firien Wistar f’doża ta’ 146 mg/kg/jum għal 7 ijiem. Fost il-ġeni tal-proteini li jirregolaw il-ħadid, ġiet osservata espressjoni mnaqqsa ta 'HFE u espressjoni miżjuda ta' CP, GDF15, u HAMP wara l-amministrazzjoni tal-ferritin II [31]. Ta' min jinnota, l-effett tal-ferritin II fuq il-passaġġ tas-sinjalar dipendenti p53-x'aktarx kien l-ostaklu li jillimita l-użu tiegħu biss bħala inibitur tat-TfR1 fuq il-kulturi taċ-ċelluli [31].

Ferristatin II huwa magħruf ukoll bħala iswed dirett 38, Chlorazol iswed E, CI 30235, jew CAS 1937- 37-7 u huwa komunement użat bħala żebgħa għat-tbajja tal-granuloċiti u l-onychomycosis [32,33]. Importanti, il-metaboliti tal-benzidine ta 'l-iswed dirett 38 li għandhom riskju potenzjali ta' kanċer tal-bużżieqa tal-awrina ġew osservati f'kampjuni ta 'awrina ta' ħaddiema f'unità fuq skala żgħira li mmanifatturat din iż-żebgħa [34]. Għalkemm il-ferritin II ma jistax jintuża direttament fil-bnedmin, għal din ir-raġuni, hemm argument li l-istrateġija li tinibixxi d-dħul tas-SARS-CoV-2 fiċ-ċellula billi timblokka TfR1 hija promettenti, peress li dan l-approċċ jimmira lir-riċettur fuq l-ospitanti ċelluli aktar milli l-proteina suxxettibbli għall-mutazzjoni virali. Barra minn hekk, aktar studji huma ġġustifikati biex jidentifikaw komposti kimiċi li jaġixxu bħall-molekula ferritin II, iżda mingħajr il-formazzjoni ta 'metaboliti b'riskji potenzjali għas-saħħa.

disfunzjoni erettili cistanche

Referenzi

1 Sciolo, F.; Daniele, A.; Amato, F.; Pastore, L.; Matera, MG; Cazzola, M.; Castaldo, G.; Bianco, A. ACE2: The Major Cell Entry Receptor for SARS-CoV-2. Pulmun 2020, 198, 867–877. [CrossRef] [PubMed]

2. Ni, W.; Yang, X.; Yang, D.; Bao, J.; Li, R.; Xiao, Y.; Hou, C.; Wang, H.; Liu, J.; Yang, D.; et al. Rwol tal-enzima 2 li jikkonvertu angiotensin (ACE2) fil-COVID-19. Krit. Care 2020, 24, 422. [CrossRef] [PubMed]

3. Shang, J.; Ye, G.; Shi, K.; Wan, Y.; Luo, C.; Aihara, H.; Geng, Q.; Auerbach, A.; Li, F. Bażi strutturali tar-rikonoxximent tar-riċetturi minn SARS-CoV-2. Natura 2020, 581, 221–224. [CrossRef] [PubMed]

4. Wan, Y.; Shang, J.; Graham, R.; Baric, RS; Li, F. Rikonoxximent tar-Riċetturi mill-Koronavirus Ġdid minn Wuhan: Analiżi Ibbażata fuq Studji Strutturali ta' Għaxar snin ta' SARS Coronavirus. J. Virol. 2020, 94, e00127-20. [CrossRef] [PubMed]

5. Zhang, Q.; Chen, CZ; Swaroop, M.; Xu, M.; Wang, L.; Lee, J.; Wang, AQ; Pradhan, M.; Hagen, N.; Chen, L.; et al. Heparan sulfate jassisti SARS-CoV-2 fid-dħul taċ-ċelluli u jista' jkun immirat minn mediċini approvati in vitro. Cell Discov. 2020, 6, 80. [CrossRef]

6. Wang, K.; Chen, W.; Zhang, Z.; Deng, Y.; Lian, JQ; Du, P.; Wei, D.; Zhang, Y.; Xemx, XX; Gong, L.; et al. CD147-spike protein hija rotta ġdida għall-infezzjoni tas-SARS-CoV-2 għaċ-ċelloli ospitanti. Transduct tas-Sinjal. Mira. Ther. 2020, 5, 283. [CrossRef]

7. Wei, C.; Wan, L.; Yan, Q.; Wang, X.; Zhang, J.; Yang, X.; Zhang, Y.; Fann, C.; Li, D.; Deng, Y.; et al. Ir-riċettur tat-tip 1 tal-HDL-scavenger B jiffaċilita d-dħul tas-SARS-CoV-2. Nat. Metab. 2020, 2, 1391–1400. [CrossRef]

8. Daly, JL; Simonetti, B.; Klein, K.; Chen, KE; Williamson, MK; Anton-Plagaro, C.; Shoemark, DK; Simon-Gracia, L.; Bauer, M.; Holland, R.; et al. Neuropilin-1 huwa fattur ospitanti għall-infezzjoni SARS-CoV-2. Science 2020, 370, 861–865. [CrossRef]

9. Wang, S.; Qiu, Z.; Hou, Y.; Deng, X.; Xu, W.; Zheng, T.; Wu, P.; Xie, S.; Bian, W.; Zhang, C.; et al. AXL huwa riċettur kandidat għal SARS-CoV-2 li jippromwovi l-infezzjoni taċ-ċelloli epiteljali pulmonari u tal-bronki. Ċellula Res. 2021, 31, 126–140. [CrossRef]

10. Cantuti-Castelvetri, L.; Ojha, R.; Pedro, LD; Djannatian, M.; Franz, J.; Kuivanen, S.; van der Meer, F.; Kallio, K.; Kaya, T.; Anastasia, M.; et al. Neuropilin-1 jiffaċilita d-dħul taċ-ċelluli SARS-CoV-2 u l-infettività. Science 2020, 370, 856–860. [CrossRef]

11. Jackson, CB; Farzan, M.; Chen, B.; Choe, H. Mekkaniżmi tad-dħul tas-SARS-CoV-2 fiċ-ċelloli. Nat. Dun Mol. Cell Biol. 2022, 23, 3–20. [CrossRef] [PubMed]

12. Tang, X.; Yang, M.; Duan, Z.; Liao, Z.; Liu, L.; Cheng, R.; Fang, M.; Wang, G.; Liu, H.; Xu, J.; et al. Ir-riċettur ta' transferrin huwa riċettur ieħor għad-dħul ta' SARS-CoV-2. bioRxiv 2020. [CrossRef]

13. Hentze, MW; Muckenthaler, MU; Andrews, NC Ibbilanċjar atti: kontroll molekulari tal-metaboliżmu tal-ħadid mammiferi. Ċellula 2004, 117, 285–297. [CrossRef] 14. Wessling-Resnick, M. Qsim tal-Bieb tal-Ħadid: Għaliex u Kif ir-Riċetturi tat-Transferin Medjaw id-Dħul Viral. Annu. Dun Nutr. 2018, 38, 431–458. [CrossRef] [PubMed]

15. Horonchik, L.; Wessling-Resnick, M. L-inibitur tat-trasport tal-ħadid ta 'molekula żgħira ferritin/NSC306711 jippromwovi d-degradazzjoni tar-riċettur ta' transferrin. Chem. Biol. 2008, 15, 647–653. [CrossRef]

16. Byrne, SL; Buckett, PD; Kim, J.; Luo, F.; Sanford, J.; Chen, J.; Enns, C.; Wessling-Resnick, M. Ferristatin II jippromwovi d-degradazzjoni tar-riċettur ta' transferrin-1 in vitro u in vivo. PLoS ONE 2013, 8, e70199. [CrossRef]

17. Sokolov, AV; Voynova, IV; Kostevich, VA; Vlasenko, AY; Zakharova, ET; Vasilyev, VB Tqabbil ta 'Interazzjoni bejn Ceruloplasmin u Lactoferrin/Transferrin: Biex Jingħaqad jew Le. Biochem. Biokhimiia 2017, 82, 1073–1078. [CrossRef]