Farnesyltransferase Inhibitor LNK-754 Jitnaqqas id-Distrofija Assonali U Inaqqas il-Patoloġija Amilojde fil-ġrieden Parti 1

Astratt

Sfond:

Id-depożizzjoni tal-plakka amilojde u d-deġenerazzjoni assonali huma avvenimenti bikrija fil-patoġenesi tal-AD. A jfixkel il-mikrotubuli fin-newrites distrofiċi presinattiċi, li jirriżulta fl-akkumulazzjoni ta' organelli indeboliti endolisosomali u awtofaġiċi li jittrasportaw l-enzima li jaqsam il-proteina prekursur tal-amilojde (BACE1). Konsegwentement, newrites distrofiċi jiġġeneraw A 42 u jikkontribwixxu b'mod sinifikanti għad-depożizzjoni tal-plakka.

Id-deġenerazzjoni assonali hija disturb newroloġiku li jikkawża ħsara lill-axons tan-newroni, u b'hekk jaffettwa l-konduzzjoni tan-nervituri. L-immunità hija linja importanti ta 'difiża għall-ġisem tal-bniedem biex jirreżisti l-invażjoni ta' mikrobi u viruses barranin. Allura, hemm relazzjoni bejn id-deġenerazzjoni assonali u l-immunità?

L-ewwel, id-deġenerazzjoni assonali mhix marda kkawżata mis-sistema immuni, għalhekk m'hemmx għalfejn tinkwieta dwar l-immunità li taffettwaha b'mod negattiv. Għalkemm il-kawża speċifika tad-deġenerazzjoni assonali mhix magħrufa, xi studji jissuġġerixxu li d-deġenerazzjoni assonali tista 'tkun relatata ma' reazzjonijiet infjammatorji fis-sistema immuni. Ir-rispons infjammatorju huwa mekkaniżmu protettiv tas-sistema immuni kontra l-invażjoni ta 'patoġeni barranin. Madankollu, jekk tkun attivata żżejjed, tikkawża ħsara infjammatorja lin-newroni u tippromwovi d-deġenerazzjoni assonali.

It-tieni nett, sistema immuni b'saħħitha tista 'ttejjeb ir-reżistenza tal-ġisem u tnaqqas ir-riskju ta' infezzjoni u mard, li huwa speċjalment importanti għal pazjenti b'deġenerazzjoni assonali. Minħabba li s-sistema nervuża ta 'pazjenti b'deġenerazzjoni assonali ġiet imħassra, il-kapaċità ta' awto-tiswija tal-ġisem hija relattivament dgħajfa. Jekk ibatu minn mard ieħor, il-kundizzjoni tmur għall-agħar u taffettwa aktar il-kwalità tal-ħajja tagħhom. Għalhekk, iż-żamma ta 'dieta sana u drawwiet ta' għajxien u t-tisħiħ tal-immunità jistgħu jgħinu biex jitnaqqas ir-riskju ta 'mard ieħor. Fl-istess ħin, jista 'jtejjeb ir-rispons immuni tal-ġisem u jippromwovi t-tiswija tal-axons u r-restawr tal-konduzzjoni tan-nervituri.

Fil-qosor, għalkemm m'hemm l-ebda konnessjoni meħtieġa bejn id-deġenerazzjoni assonali u l-immunità, sistema immuni b'saħħitha tista 'tipprovdi l-protezzjoni u l-appoġġ meħtieġa għal pazjenti b'deġenerazzjoni assonali. Għalhekk, għandna nagħtu attenzjoni għall-importanza li nżommu s-sistema immuni, nibdew minn aspetti bħad-dieta u d-drawwiet tal-għajxien, u ntejbu b'mod attiv il-livell immuni tal-ġisem biex nibdew bażi soda għas-saħħa u l-lonġevità. Wieħed jista 'jara li għandna bżonn intejbu l-memorja, u Cistanche deserticola jista' jtejjeb b'mod sinifikanti l-memorja minħabba li Cistanche deserticola huwa materjal mediċinali tradizzjonali Ċiniż li għandu ħafna effetti uniċi, li wieħed minnhom huwa li jtejjeb il-memorja. L-effikaċja tal-laħam ikkapuljat ġejja mid-diversi ingredjenti attivi li fih, inklużi l-aċidu, il-polisakkaridi, il-flavonoids, eċċ. Dawn l-ingredjenti jistgħu jippromwovu s-saħħa tal-moħħ b'diversi modi.

Ikklikkja taf 10 modi biex ittejjeb il-memorja

L-inibituri tal-farnesyltransferase (FTase) reċentement ġew investigati għar-ripożizzjoni lejn it-trattament ta 'disturbi newrodeġenerattivi u jimblukkaw l-azzjoni tal-farnesyltransferase (FTase) biex jikkatalizzaw il-farnesylation, modifika ta' wara t-traduzzjoni li tirregola l-proteini involuti fil-funzjoni tal-lysosome u l-istabbiltà tal-mikrotubuli. Fl-imħuħ AD postmortem, FTase u s-sinjalar downstream tiegħu huma regolati 'l fuq. Madankollu, l-impatt tal-FTIs fuq il-patoloġija tal-amilojde u n-newrites distrofiċi mhuwiex magħruf.

Metodi:

Aħna ttestjajna l-effetti tal-FTIR LNK-754 u lonafarnib fil-mudell tal-ġurdien 5XFAD tal-patoloġija tal-amilojde.

Riżultati:

Fi ġrieden 5XFAD ta' 2-xhur ittrattati b'mod kroniku għal 3 xhur, LNK-754 naqqas il-piż tal-plakka amilojde, u iperfosforilazzjoni tau, u attenwat l-akkumulazzjoni ta' BACE1 u LAMP1 f'newrites distrofiċi. Fi ġrieden 5XFAD ta' 5-xhur ittrattati b'mod akut għal 3 ġimgħat, LNK-754 naqqas id-daqs ta' newrite distrofika u l-akkumulazzjoni ta' LysoTracker-Green fin-nuqqas ta' effetti fuq depożiti A. Trattament akut b'LNK-754 tejbet il-memorja u d-defiċits fit-tagħlim fil-ġrieden amyloid hAPP/PS1.

B'kuntrast ma' LNK-754, it-trattament b'lonafarnib kien inqas effettiv fit-tnaqqis tal-plakki, iperfosforilazzjoni tau, u newrites distrofiċi, li setgħu jirriżultaw minn qawwa mnaqqsa kontra FTase meta mqabbla ma' LNK-754. Aħna investigajna l-effetti tal-FTIs fuq it-traffikar assonali tal-organelli endolisosomali u sibna li lonafarnib u LNK-754 tejbu t-trasport assonali retrograd fin-newroni primarji, u indika li l-FTIs jistgħu jappoġġaw il-maturazzjoni tal-endosomi axonali tard f'liżosomi. Barra minn hekk, it-trattament FTI żied il-livelli ta 'LAMP1 fin-newroni primarji tal-ġrieden u l-imħuħ tal-ġrieden 5XFAD, u wera li l-FTIs stimulaw il-bijoġenesi ta' organelli endolisosomali.

Konklużjonijiet:

Aħna nuru dejta ġdida biex tissuġġerixxi li LNK-754 ippromwoviet it-traffikar assonali u l-funzjoni tal-kompartimenti endolisosomali, li aħna ipotetizzaw li naqsu distrofija assonali, naqqset l-akkumulazzjoni ta 'BACE1, u inibixxa d-depożizzjoni tal-amilojde fil-ġrieden 5XFAD. Ir-riżultati tagħna jaqblu ma 'xogħol preċedenti li jidentifika FTase bħala mira terapewtika għat-trattament tal-proteinopatiji u jista' jkollu implikazzjonijiet terapewtiċi importanti fit-trattament tal-AD.

Kliem ewlieni:

Il-marda ta' Alzheimer, Neurites distrofiċi, Inibituri ta' Farnesyltransferase.

Sfond

Il-marda ta' Alzheimer (AD) hija marda newrodeġenerattiva progressiva li hija l-aktar kawża komuni ta' dimenzja fil-popolazzjoni li qed tixjieħ u hija kkaratterizzata minn indeboliment sinifikanti fit-tagħlim u l-memorja. Fil-livell molekulari, il-karatteristiċi distintivi tal-moħħ AD huma l-akkumulazzjoni ta 'plakki amyloid-(A) u l-preżenza ta' inklużjonijiet tau iperfosforilati.

Fl-istadji bikrija, asintomatiċi ta 'AD, A jakkumula fil-moħħ għal aktar minn għoxrin sena jew aktar qabel il-bidu ta' indeboliment tal-memorja [1-3]. Konsegwentement, it-tnaqqis tal-livelli tal-moħħ A kien il-fokus ċentrali tal-istrateġiji ta 'trattament għall-AD [4]. Bħalissa, l-unika terapija li timmodifika l-mard approvata kondizzjonalment mill-FDA hija antikorp anti-A li jneħħi forom aggregati ta 'A mill-moħħ [5], li jikkonferma li l-immirar ta' A fil-moħħ huwa approċċ promettenti għat-trattament tal-AD.

Madankollu, il-biċċa l-kbira tal-provi kliniċi ffukati fuq A fallew minħabba tħassib dwar is-sigurtà jew l-effikaċja, u issa saret enfasi fuq miri bbażati fuq ipoteżi differenti ta’ AD, inklużi propagazzjoni tau, infjammazzjoni, dishomeostasis tal-kalċju u fatturi newrovaskulari [4, 6, 7] ]. Barra minn hekk, hemm interess dejjem jikber fil-potenzjal terapewtiku li jiġu attivati ​​mogħdijiet degradattivi lisosomali bħala metodu biex jitnaqqsu l-proteini patoġeniċi, karatteristika komuni fil-mard newrodeġenerattiv [8-12].

Disfunzjoni estensiva tal-mogħdijiet endolisosomali u awtofaġiċi hija dokumentata tajjeb bħala avveniment bikri tal-patoġenesi tal-AD. Ħafna loci ġenetiċi ta 'suxxettibilità AD huma marbuta ma' trasport endolysosomal subċellulari u funzjoni lisosomali [13], u organelli endolisosomali u awtofaġiċi disfunzjonali mkabbra jakkumulaw fil-moħħ AD fi ħdan newrites distrofiċi [14, 15].

Neurites distrofiċi jidhru li jinbdew fuq korriment newronali, u f'AD dan huwa propost li jkun id-destabilizzazzjoni tal-mikrotubuli minn A [16]. Dan jirriżulta f'nefħa assonali fokali li jfixklu t-traffikar normali u l-mogħdijiet ta 'degradazzjoni ta' proteini ewlenin involuti fil-produzzjoni A, inkluż BACE1 [16, 17]. Bħala riżultat, id-distrofiji jiġġeneraw A 42 u jikkontribwixxu b'mod sinifikanti għad-depożizzjoni tal-plakka extraċellulari u għad-distrofija assonali [18], u jibdew passaġġ ta 'feed-forward li jirriżulta f'telf sinaptiku, newrodeġenerazzjoni, u defiċits konjittivi [16].

Strateġiji terapewtiċi li jtejbu t-trasport u l-attività ta 'organelli endolisosomali u awtofaġiċi jistgħu jipprevjenu d-distrofija newritika jsostnu d-degradazzjoni ta' proteini patoġeniċi, u jkunu mekkaniżmu kritiku għat-tnaqqis tal-livelli BACE1 u A fl-AD.

Hekk kif it-tfittxija tkompli għal trattament effettiv tal-AD, in-numru ta 'mediċini repurposed fi provi kliniċi għall-AD kiber sostanzjalment peress li mediċini evalwati klinikament għandhom problemi ta' sigurtà u effikaċja magħrufa, u b'hekk aċċelleraw il-proċess tal-iżvilupp tad-droga [7, 19]. F'dawn l-aħħar snin, studji identifikaw l-FTIs bħala klassi ta 'mediċini b'potenzjal li jerġgħu jintużaw għat-trattament ta' mard newrodeġenerattiv.

L-FTIs jinibixxu l-farnesylation, modifika wara t-traduzzjoni li tirregola proteini li fihom farnesyl pyrophosphate huwa modifikat b'mod kovalenti għal residwi ta 'cysteine ​​fil-proteini li fihom motif CAAX [20]. L-FTIs kienu inizjalment iddisinjati biex jimblokkaw l-attività onkoġenika ta 'Ras billi jinibixxu l-prenilazzjoni tiegħu iżda twaqqfu fi provi kliniċi għat-trattament tal-kanċer wara l-iskoperta ta' mogħdijiet alternattivi ta 'prenilazzjoni ta' Ras [21, 22].

Madankollu, jeżistu ħafna sottostrati ta 'FTase [23-25], li jwasslu għall-evalwazzjoni ta' FTIs għal firxa wiesgħa ta 'disturbi, inkluż mard kardjovaskulari, epatite D, u proġerja [20, 26]. Barra minn hekk, FTIs wrew wegħda lejn mard newrodeġenerattiv ikkaratterizzat mill-akkumulazzjoni ta 'aggregati ta' proteini. F'mudelli ta 'proteinopatiji ta' annimali gerriema u ta 'kultura taċ-ċelluli, FTIs jinduċu attività lisosomali u l-proteolysis ta' proteini tossiċi speċifiċi għall-mard [8, 9, 27, 28].\

Preċedentement, urejna li LNK-754, FTI ittestjat fi provi tal-kanċer, tejjeb it-traffikar tal-hydrolase lisosomali, u naqas l-aggregati ta’ alpha-synuclein (-synuclein) fin-newroni derivati ​​mill-pazjent tal-marda ta’ Parkinson (PD) u mudelli tal-ġrieden PD [8 ].

Studji oħra rrappurtaw riżultati simili ta' FTIs lejn it-tnaqqis tal-aggregati tal-proteini; it-trattament ta' mudelli ta' kultura taċ-ċelluli ta' PD b'FTI-277 -synuclein imnaqqas [28] u lonafarnib, FTI approvat mill-FDA għat-trattament tal-proġerja [29], żiedet l-attività liżosomali u naqqas l-inklużjonijiet ta' tau f'mudell tal-ġrieden ta' tawopatija [ 9]. Barra minn hekk, studju reċenti wera li knockout ġenetiku ta 'FTase newronali fil-mudell tal-ġurdien APP/PS1 ta' AD impedixxa l-ġenerazzjoni A [30]. Il-fokus ta 'studji tal-passat li jevalwaw l-FTIs għall-proteinopatiji kien ir-rwol tas-sottostrati tal-FTase fl-attività tal-lisosomi u l-awtofaġija.

Madankollu, l-FTIs huma magħrufa wkoll li jippromwovu l-istabbiltà tal-mikrotubuli (MT) u jissinerġizzaw ma 'mediċini li jistabbilizzaw l-MT biex itejbu l-aċetilazzjoni tat-tubulina, permezz ta' mogħdija indipendenti minn Ras [31-33]. L-istabbilizzazzjoni tal-MT tinibixxi l-patoloġija tal-AD fil-ġrieden APP/PS1 [34], u bħalissa, bosta aġenti stabilizzanti tal-MT qed jiġu investigati klinikament għat-trattament tal-AD [35]. Għalhekk, evidenza sostanzjali tissuġġerixxi li l-FTIs jistgħu jibbenefikaw mard ikkaratterizzat minn mekkaniżmi tal-omeostasi tal-proteini li ma jiffunzjonawx bħall-AD. Xorta waħda, il-miri u l-mogħdijiet li jgħaqqdu l-farnesylation tal-proteini ma 'aggregati ta' proteini mnaqqsa f'mard newrodeġenerattiv mhumiex mifhuma bis-sħiħ.

F'dan l-istudju, ivvalutajna jekk it-trattament farmakoloġiku b'FTIs jistax itejjeb il-patoloġija AD assoċjata ma 'A. Aħna evalwajna l-effetti ta 'LNK-754 u lonafarnib, żewġ FTIs magħrufa li jnaqqsu l-aggregati tal-proteini f'disturbi newrodeġenerattivi, fuq il-piż tal-plakka u newrites distrofiċi fil-mudell tal-ġrieden 5XFAD ta' patoloġija amilojde. Ir-riżultati tagħna jipprovdu għarfien dwar il-mogħdijiet affettwati mill-inibizzjoni tal-FTase u jappoġġjaw bil-qawwa aktar investigazzjoni fir-ripurposing tal-FTIs bħala terapewtika għall-AD u mard newrodeġenerattiv ieħor ikkaratterizzat minn akkumulazzjoni tal-aggregazzjoni tal-proteini.

materjali u metodi

Annimali u trattamenti tad-droga

Ix-xogħol kollu tal-annimali sar mill-approvazzjoni tal-Kumitat tal-Kura u l-Użu tal-Annimali Istituzzjonali tal-Università Northwestern (IACUC). Il-ġrieden ġew mitmugħa dieta standard ta' annimali gerriema u ilma ad libitum u miżmuma b'ċiklu standard ta' 12-siegħa ta' dawl/dlam. Ġrieden 5XFAD fuq sfond C57BL6 (Jackson Laboratories) inżammu billi qasmu ġrieden C57BL6 maskili hemizygous pożittivi għal transġeni ma ġrieden C57BL6 femminili transġene-negattivi (Jackson Laboratories).

Fil-protokoll ta 'trattament kroniku tagħna, it-trattamenti tad-droga nbdew fl-età ta' 2 xhur, l-età li fiha tibda d-depożizzjoni tal-plakka [36, 37]. Fil-protokoll ta 'trattament akut, it-trattament tad-droga nbeda fl-età ta' 5 xhur wara li d-depożizzjoni tal-plakka u d-deġenerazzjoni assonali huma mifruxa [38, 39].

LNK{{0}} ġie sintetizzat minn Link Medicine (Massachusetts USA) u lonafarnib inkiseb minn Cayman Chemical Company (Ann Harbor, MI). Għat-trattamenti tal-annimali, LNK-745 u lonafarnib ġew ippreparati f'soluzzjoni msaħħna ta' 0.5% carboxymethylcellulose (Sigma-Aldrich) bħala vettura f'konċentrazzjoni ta' 0.10mg/mL sakemm tinħall u s-soluzzjoni kienet ċara.

Alikwoti għall-injezzjoni ġew iffriżati f'-20 grad u mbagħad iddewweb u maħżuna f'4 gradi għal kull ġimgħa ta 'trattament. Il-ġrieden ġew ittrattati wara protokoll stabbilit magħruf li jtejjeb l-attività liżosoma [8]. Fil-protokoll ta' trattament kroniku, ġrieden 5XFAD ta' 2-xahar ġew injettati b'injezzjoni intraperitoneali (ip) b'jew vettura, LNK754, jew lonafarnib kuljum bl-użu ta' siringa ta' l-insulina ta' 29-gauge għal 12-il ġimgħa sakemm il-ġrieden kellhom 5 xhur. Fil-kors ta' trattament akut, 5-ġrieden 5XFAD ta' xahar ġew injettati kuljum għal 3 ġimgħat.

Mat-tlestija tat-trattamenti, il-ġrieden ġew anestetizzati u mxerrda, u l-imħuħ inġabru għal aktar analiżi (ara t-taqsimiet hawn taħt). Għal esperimenti ta' kultura taċ-ċelluli, LNK-754 u lonafarnib ġew maħlula f'DMSO u miżjuda ma' kulturi ta' newroni primarji tal-ġrieden f'konċentrazzjoni ta' 10nM għal 48 siegħa. It-trattament tal-vettura kien ammont ekwivalenti ta' DMSO. Iċ-ċelloli nġabru u ġew analizzati kif deskritt hawn taħt.

Antikorpi

L-antikorpi użati għal esperimenti ta' immunofluworexxenza kienu far anti-LAMP1 (#1D4B, DSHB), fenek anti-A 42 (#700254, Invitrogen), fenek anti-BACE1 (#ab108394, Abcam), fenek anti-III tubulin (#ab18207, Abcam). Għall-immunoblotting, l-antikorpi użati kienu fenek anti-actin (#926–42,210, LI-COR), fenek antip44/42 MAPK (pErk1/2) (#CS9101, Cell Signaling Technology), fenek anti-44/42 (Erk1/2) (#CS137F5, Cell Signaling Technology), fenek anti-LAMP1 (#CS3234, Cell Signaling Technology), ġurdien anti-BACE (3D5; Zhao et al., 2007), ġurdien anti-APP (6E10) ( #803001, BioLegend), fenek anti-p-tau (ser404) (#CS20194, Cell Signaling Technology), ġurdien anti-Tau1 (#MAB3420, Millipore Sigma), prelamin-A, (#MABPT858, Millipore Sigma) u ġrieden kontra -HDJ-2 (#sc-59,554, Santa Cruz). Antikorpi sekondarji kontra l-fenek jew il-ġurdien minn Vector Laboratories intużaw għal immunoblots.

Ittestjar tal-imġieba

Annimali u trattament tad-droga

Analiżi tal-imġieba saru minn reMYND, Inc. bl-użu tal-mudell tal-ġurdien hAPP/PS1 b'espressjoni speċifika għan-newroni ta' mutant kliniku tal-proteina prekursur tal-amilojde umana flimkien ma' mutant kliniku tal-presenilin uman 1 [40]. Dan il-ġurdien transġeniku doppju juri l-akkumulazzjoni spontanja u progressiva ta 'A fil-moħħ, li eventwalment jirriżulta fi plakek amilojdi fi ħdan is-subikulum, l-ippokampus u l-kortiċi fl-età ta' 6 xhur. Għal dan l-istudju ntużaw 48 ġrieden hAPP/PS1 femminili fi sfond FVB x C57Bl/6J ta' 6 xhur, flimkien ma' 12-il kontroll tat-tip selvaġġ femminili imqabbla mal-età fl-isfond FVB x C57Bl/6J. L-amministrazzjoni ta' 0.9mg/kg/jum ta' LNK-754 saret għal kull gavage orali, darba kuljum, għal 12-il jum konsekuttiv. Is-sagrifiċċju tal-annimali sar sagħtejn wara d-dożaġġ finali.

Il-ġrieden kollha ġew ġenotipati permezz ta 'reazzjoni tal-katina tal-polimerażi (PCR) fl-età ta' 3 ġimgħat u rċevew numru ta 'identità uniku, ladarba r-riżultati tal-PCR kienu magħrufa. Il-ġrieden kollha ġew iċċekkjati doppjament bit-tieni PCR qabel il-bidu tal-istudju. Il-ġrieden kollha kienu għomja randomised u mqabbla mal-età. Il-ġrieden ingħataw numru bl-addoċċ bil-kompjuter u allokati b'mod każwali għal trattament. L-annimali reġgħu ġew imqiegħda fil-gaġeġ mill-grupp tat-trattament 15-il jum qabel il-bidu tal-istudju biex ikunu jistgħu jiffamiljarizzaw ruħhom mal-kuntest il-ġdid tal-gaġġa. Il-ġrieden kellhom aċċess liberu għal ilma sterili u ffiltrat minn qabel u chow standard tal-ġurdien (Snif® Ms-H, Snif Spezialdiäten GmbH, Soest, il-Ġermanja). L-ikel kien maħżun f'kundizzjonijiet niexfa u friski f'kamra tal-ħażna b'ventilazzjoni tajba. L-ammont ta 'ilma u ikel kien iċċekkjat kuljum, ipprovdut meta meħtieġ u standard aggornat darba fil-ġimgħa. Il-ġrieden kienu inizjalment miżmuma taħt ritmu maqlub bil-lejl (14-il siegħa dawl/10 sigħat dlam) li jibdew fis-7 pm f'gaġeġ tal-metall standard tat-tip RVS T2 (erja ta '540 cm2).

Il-gaġeġ huma mgħammra b'art solidi u saffi ta 'mifrex tal-friex. In-numru ta' ġrieden għal kull gaġġa kien limitat mil-leġiżlazzjoni lokali dwar il-benessri tal-annimali. 15-il jum qabel il-bidu tat-trattament, il-ġrieden ġew imqiegħda mill-ġdid f'gaġeġ macrolon T2 ventilati individwali u ttrasportati lejn il-laboratorju għall-akklimazzjoni għall-ambjent tal-laboratorju bi tħejjija għat-trattament. Fil-laboratorju, ir-ritmu ġurnata-lejl inbidel għal 12-il siegħa dawl/12-il siegħa dlam, li jibda fis-7 pm

Labirint tal-ilma Morris

Il-Labirint tal-Ilma Morris sar fil-ġranet 8-12 tat-trattament, u l-annimali ġew sagrifikati direttament wara t-test tas-sonda. Il-pool (bastiment abjad u ċirkolari b'dijametru ta '1m) kien fih ilma f'20 grad b'dijossidu tat-titanju bħala addittiv bla riħa u mhux tossiku biex jaħbi l-pjattaforma tal-ħarba (1ċm taħt il-livell tal-ilma). L-għawm ta’ kull ġurdien ġie mmarkat bil-vidjo u analizzat (Ethovision, Noldus Information Technology, Wageningen, l-Olanda). Qabel it-taħriġ, kull ġurdien tpoġġa fuq il-pjattaforma għal 15-il sekonda. Għal testijiet tan-navigazzjoni fil-post, il-ġrieden ġew imħarrġa biex isibu l-pjattaforma moħbija f'seba 'blokki ta' tliet provi fuq erbat ijiem konsekuttivi.

Kull prova tikkonsisti f’test ta’ għawm sfurzat ta’ massimu ta’ 120 sekonda, segwit minn 10 minuti ta’ mistrieħ. Il-ħin li kull ġurdien meħtieġ biex jillokalizza l-pjattaforma ġie mkejjel. Is-seba' blokki konsekuttivi jirriżultaw f'kurva tat-tagħlim. 24 siegħa wara l-aħħar taħriġ, kull annimal kellu prova ta 'sonda bil-pjattaforma mneħħija. Il-ġrieden tħallew ifittxu għal 60 sekonda, u tkejlu l-ħin tat-tfittxija tal-kwadrant u l-qsim tal-pożizzjoni oriġinali tal-pjattaforma. Matul it-test finali tas-sonda, il-ġrieden tħallew ifittxu l-post preċedenti tal-pjattaforma għal 60 sekonda wara li l-pjattaforma tneħħiet.

Kultura tan-newroni primarji

Forebrains ġew dissected fil Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (Thermo Fisher #14185–052) minn ġrieden C57BL6 tat-tip selvaġġ tqal (Jackson) fuq E15.5 biex jinkisbu newroni primarji. Forebbrains dissected ġew diġeriti fi 2.5% trypsin f'37 grad għal 20 minuta. Intużat pipetta Pasteur illustrata bin-nar biex tiddissoċja n-newroni fl-HBSS. In-newroni mbagħad ġew ibbanjati fuq pjanċa b'sitt well miksija b'poly-L-lysine, 2 × 106 newroni għal kull bir f'medja newrobażali supplimentata b'2% B-27, 500μM glutamina, 10% serum taż-żiemel, u 2.5μM glutamat (kollha minn Thermo Fisher).

Il-midja nbidlet sagħtejn wara għal Neurobasal b'2% B-27, 500μM glutamine, u 2.5μM glutamate. 24 siegħa wara, il-midja nbidlet għal Neurobasal flimkien ma' 2% B-27 u 500μM glutamina. Nofs bidliet fil-midja saru kull 2-3 ijiem. In-newroni primarji ġew ikkultivati ​​għal 7 ijiem u ttrattati b'vettura (DMSO) jew konċentrazzjonijiet ta' 10nM ta' LNK-754, jew lonafarnib għal 48 siegħa. In-newroni mbagħad ġew iffissati jew immaġini ħajjin kif deskritt hawn taħt.

Għall-iffissar, in-newroni ġew inkubati għal 20 minuti f'4% paraformaldehyde, 0.12M sucrose f'1XPBS, permeabilizzati f'0.5% Triton X-100, u inkubati b'antikorpi primarji matul il-lejl segwit minn antikorpi sekondarji tal-ħmar kontra l-ġurdien Alexafuor konjugati (Molecular Probes, 1:1000) u ko-mtebbgħin b'300nM DAPI. Coverslips ġew immuntati bl-użu ta 'Prolong Gold (Molecular Probes), u immaġni ġew akkwistati fuq mikroskopju konfokali Nikon A1 b'objettiv 60X (NA 1.4) u softwer NIS Elements.

Immaġini ħajjin ta 'newroni

Għal esperimenti ta' immaġini ħajjin, in-newroni ġew ippreparati bħal hawn fuq u mgħottijin f'platti tal-qiegħ tal-ħġieġ ta' 35mm (MatTek # P35G-1.5-14C) għal 7 ijiem fil-kultura. 10nM LNK-754 jew lonafarnib imbagħad ġie miżjud ma 'midja kondizzjonata, il-kulturi ta' kontroll ġew ittrattati b'DMSO bħala vettura. Wara 48 siegħa ta 'trattament, il-midja ġiet sostitwita b'midja kondizzjonata minn pjanċi paralleli ta' newroni mhux ittrattati. 25nM ta 'LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) ġie miżjud mal-midja kkundizzjonata, u n-newroni ġew inkubati għal 30 minuta f'37 grad.

L-immaġini time-lapse tan-newroni twettqet bl-użu ta 'mikroskopju Ti2 widefield. L-immaġini bdiet immedjatament wara 30 minuta u kompliet għal mhux aktar minn 30 minuta. 1-s espożizzjonijiet ittieħdu kull minuta, u 20-30 żona separata għal kull dixx ġew immaġini fi żmien 30 minuta. Il-kwantifikazzjonijiet tad-distanza u l-veloċità tal-partiċelli LysoTracker u l-analiżi tal-kimograf saru bl-użu ta 'softwer NIS Elements u deskritti fid-dettall hawn taħt. F'esperimenti separati, 1μM Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen) ġie miżjud ma 'midja kkundizzjonata, u immaġni maqbuda ta' newroni ħajjin ittieħdu għal mhux aktar minn 15-il minuta bl-użu ta 'mikroskopju konfokali Nikon A1 b'objettiv 60X. (NA 1.4) u softwer NIS Elements.

For more information:1950477648nn@gmail.com