Attività Estroġenika Ta' Glycosides Minn Cistanche Deserticola Bħala Aġġuvant tar-Riċetturi tal-Estroġenu in Vitro

INTRODUZZJONI

Cistanche deserticola("Rou Cong Rong" fiċ-Ċiniż), mediċina tal-ħxejjex tradizzjonali Ċiniża li l-ewwel irreġistrat fiShenNongBenCaoJing, intuża għat-trattament ta 'defiċjenza tal-kliewi, impotenza, stitikezza senile, u defiċjenza tad-demm għal eluf ta' snin.[1] Huwa mqassam prinċipalment fir-reġjuni tad-deżert tal-Majjistral taċ-Ċina, bħal Gansu u Xinjiang.[2]Ir-riċerka farmakoloġika moderna wriet li C. deserticola jista’ javvanza funzjonijiet mediċinali wesgħin, bħar-regolamentazzjoni tal-ormoni, immunomodulazzjoni, antiossidativa, newroprotettiva, anti-infjammatorja, uattività estroġenika.[3,4] Glycosides ta 'Cistanches(GCs) tqiesu bħala wieħed mill-komponenti attivi ewlenin b'diversi effetti bijoloġiċi.

Ir-riċetturi tal-estroġenu- (ERs- ) u ER huma s-sottotipi tal-ERs li jistgħu jirregolaw il-funzjonijiet fiżjoloġiċi.[7] Dawn il-proteini jistgħu jirregolaw it-traskrizzjoni tal-ġeni fil-mira billi jorbtu ma' sekwenzi regolatorji tad-DNA assoċjati fin-nukleu taċ-ċellula. Iż-żewġ sottotipi huma espressi b'mod notevoli fis-sistemi kardjovaskulari u nervuż ċentrali.[8,9] ER teżisti prinċipalment fil-glandola mammarja, l-utru, l-ovarji, l-għadam, l-organu riproduttiv maskili, u l-prostata. ER huwa preżenti prinċipalment fil-prostata, l-ovarji, u l-bużżieqa tal-awrina.[10,11] Barra minn hekk, hemm xi rwoli fiżjoloġiċi komuni għaż-żewġ sottotipi, bħal fl-iżvilupp u l-funzjoni tal-ovarji u l-protezzjoni tas-sistema kardjovaskulari.[ 12,13] Riċerka preċedenti fil-grupp tagħna żvelat il-mekkaniżmu tal-GCs simili estroġeniku bil-metodu ta 'analiżi metabolomika.[14] Fi studju kontinwu, analiznajna l-mekkaniżmu ta 'attività estroġenika ta' GCs fuq linji ta 'ċelluli MCF-7 relatati ma' ERs.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIBATTIVITÀ ESTROGENIKAPHGS75% ECH 30% ACT 12%

MATERJALI U METODI

Strumenti

L-inkubatur ECO-170P-230 kien minn New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., il-qarrej tal-mikroplate Bio-Rad 680 u l-apparat tal-elettroforeżi kienu minn Bio-Rad Laboratories, Inc., il-mikroskopju CX21 kien minn Olympus Co., Ltd., Is-sistema tal-immaġini tal-ġel GIS-2019 kienet minn Tanon Science and Technology Co., Ltd., il-pjanċa tal-qiegħ ċatt kienet minn Corning Inc., iċ-ċitometrija tal-fluss EPICS-XL kienet minn Beckman-Coulter Inc., u StepOnePlus Real-Time polymerase chain reaction ( PCR) kienet minn Thermo Fisher Scientific.

Kimiċi u reaġenti

Il-GCs ġew ippreparati fil-laboratorju tagħna bħala l-metodu rrappurtat qabel,[14] u l-purità tal-GCs ġiet iddeterminata li kienet 52% (l-acteoside intuża bħala markatur biex jiddetermina l-GCs) permezz ta 'spettrofotometrija ultravjola. Estradiol (E2) inxtara minn Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, iċ-Ċina). Serum bovin tal-fetu (FBS) u RPMI-1640 kienu minn Gibco Co., Ltd., pjanċa tal-qiegħ ċatt ta’ 96 bir kienet minn Corning Inc., u dimethyl sulfoxide (DMSO) u 3-[4,5-dimethyl-2-thiazolyl ]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) inxtraw mingħand Sigma-Aldrich Corporation. Reaġent TRIzol, Reverse Transcription (RT) Kit, u TB Green™ RT-PCR Kit inxtraw minn TaKaRa Co., Ltd., Dalian, iċ-Ċina. Anti-ER Rabbit pAb, anti-ER Rabbit pAb, u antikorpi -actin inxtraw minn Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Il-kimiċi komuni l-oħra kollha nxtraw minn fornituri kummerċjali standard.

Preparazzjoni tal-kampjun

Preparazzjoni ta' glycosides ta' soluzzjoni ta' stokk ta' Cistanches

L-estratt GC ġie maħlul f'DMSO biex jagħmel soluzzjoni stokk b'konċentrazzjoni ta' 0.1051 g/ml u maħżun f'4 gradi. RPMI-1640 ħieles mill-fenol aħmar intuża biex iddilwixxi s-soluzzjoni stokk għal diversi konċentrazzjonijiet qabel l-użu.

Preparazzjoni ta 'soluzzjoni ta' estradiol stokk

L-estratt E2 ġie maħlul f'DMSO biex jagħmel soluzzjoni stokk b'konċentrazzjoni ta' 0.27 mg/ml u maħżun f'4 gradi. RPMI-1640 ħieles mill-fenol aħmar intuża biex iddilwixxi s-soluzzjoni stokk għal diversi konċentrazzjonijiet qabel l-użu.

Preparazzjoni ta' serum bovin tal-fetu ttrattat b'dextran bil-faħam

Mitt millilitru ta 'FBS tħallat ma' 250 mg ta 'trab tal-faħam attivat u 25 mg ta' dextran. Wara l-inkubazzjoni għal 45 min f'55 grad, it-taħlita ġiet ċentrifugata f'4 gradi, 1000 rpm għal 15 min. Is-supernatant ġie ffiltrat bl-użu tal-membrana Millipore Express PES biex jikseb il-faħam tal-kannol trattat bid-dextran (CDT)-FBS u maħżun f'-20 grad.

Kultura taċ-ċelluli

Il-linji taċ-ċelluli tal-kanċer tas-sider uman MCF-7 inkisbu mill-ġbir tal-kultura tat-tip Amerikan (ATCC). Barra minn hekk, iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​b'medja RPMI-1640 li fiha 10% FBS u 1% penicillin-streptomycin f'37 grad taħt atmosfera umidifikata ta '5% CO2. Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​fil-medju RPMI-1640 ħieles mill-fenol aħmar li kien fih 5% CDT-FBS 4 ijiem qabel l-assaġġ MTT sabiex l-estroġenu fiċ-ċelloli jkun jista’ jitneħħa.

Analiżi tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli ta' estradiol fuq linji taċ-ċelluli MCF-7

Il-proliferazzjoni taċ-ċelluli ġiet imkejla bl-użu tal-assaġġ MTT għaċ-ċelloli MCF-7.[15,16] E2 ġie maħlul f'midja ta' kultura RPMI-1640 li kien fiha 0.1% DMSO f'konċentrazzjonijiet finali ta' {{27 }}.1, 1, 10, 100, u 1000 nM. Linji taċ-ċelluli MCF-7 ġew ikkultivati ​​f'medja RPMI-1640 ħielsa mill-fenol aħmar għal 4 ijiem. Wara l-ħasil b'salina buffered bil-fosfat (PBS) tliet darbiet, 100 µL ta 'medja RPMI-1640 ħielsa mill-FBS ġew miżjuda fi pjanċi ta' 96-well f'1.5 × 104 għal kull bir u inkubati f'37 grad għal 24 siegħa. Sussegwentement, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'diversi konċentrazzjonijiet tas-soluzzjoni E2 għal 72 siegħa. Imbagħad, 100 µL ta’ soluzzjoni MTT (0.5 mg/mL) ġew miżjuda ma’ kull bir. Iċ-ċelloli ġew inkubati għal 4 sigħat. Fl-aħħarnett, ġew miżjuda 150 µL ta 'DMSO biex jinħall il-kristalli ta' formazan. L-assorbiment tkejjel f'570 nm minn qarrej tal-mikroplate, u r-rata ta 'proliferazzjoni (PR) ġiet ikkalkulata.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-FUNZJONI SESSWALI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analiżi tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli ta' glycosides ta' Cistanches fuq linji taċ-ċelluli MCF-7

Il-proliferazzjoni taċ-ċelluli ġiet imkejla bl-użu tal-assaġġ MTT għaċ-ċelloli MCF-7. GCs ġew maħlula f'medja tal-kultura RPMI-1640 li kien fihom 0.1% DMSO f'konċentrazzjonijiet finali ta' 0.{0175, 0.175, 1.75, 17.5, u 175 µg /ml. Linji taċ-ċelluli MCF-7 ġew ikkultivati ​​f'medja RPMI-1640 mingħajr fenol aħmar li fih 5% CDT-FBS għal 4 ijiem. Wara l-ħasil mill-PBS tliet darbiet, 100 µL ta 'medja RPMI-1640 ħielsa mill-FBS ġew miżjuda fi pjanċi ta' 96-bir f'1.5 × 104 għal kull bir u inkubati f'37 grad għal 24 siegħa. Sussegwentement, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'diversi konċentrazzjonijiet tas-soluzzjoni GCs għal 24, 48, u 72 siegħa, rispettivament. Imbagħad, 100 µL ta’ soluzzjoni MTT (0.5 mg/mL) ġew miżjuda ma’ kull bir. Iċ-ċelloli ġew inkubati għal 4 sigħat. Fl-aħħarnett, ġew miżjuda 150 µL ta 'DMSO biex jinħall il-kristalli ta' formazan. L-assorbiment tkejjel f'570 nm minn qarrej tal-mikroplate, u l-PR ġie kkalkulat. RPMI-1640 mingħajr fenol aħmar u medju li fih E2 (2.725 × 10−3 µg/ml) kienu l-gruppi negattivi u pożittivi, rispettivament.

Analiżi tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli ta' glycosides ta' Cistanches b'fulvestrant fuq linji taċ-ċelluli MCF-7

Il-proliferazzjoni taċ-ċelluli ġiet imkejla bl-użu tal-assaġġ MTT għaċ-ċelloli MCF-7. Il-GCs ġew maħlula f'midja tal-kultura RPMI-1640 li fiha 0.1% DMSO f'konċentrazzjonijiet finali ta '1.75, 17.5, u 175 µg/ml. Linji taċ-ċelluli MCF-7 ġew ikkultivati ​​f'medja RPMI-1640 mingħajr fenol aħmar li fih 5% CDT-FBS għal 4 ijiem. Wara l-ħasil mill-PBS tliet darbiet, 100 µL ta 'medja RPMI-1640 ħielsa mill-FBS ġew miżjuda fi pjanċi ta' 96-bir f'1.5 × 104 għal kull bir u inkubati f'37 grad għal 24 siegħa. Sussegwentement, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'diversi konċentrazzjonijiet tas-soluzzjoni GCs u inkubati b'fulvestrant (6.06 × 10-5 µg/ml) għal 48 siegħa. Imbagħad, 100 µL ta’ soluzzjoni MTT (0.5 mg/mL) ġew miżjuda ma’ kull bir. Iċ-ċelloli ġew inkubati għal 4 sigħat. Fl-aħħarnett, ġew miżjuda 150 µL ta 'DMSO biex jinħall il-kristalli ta' formazan. L-assorbiment tkejjel f'570 nm minn qarrej tal-mikroplate, u l-PR ġie kkalkulat. RPMI-1640 mingħajr fenol aħmar u medju li fih E2 (2.725 × 10−3 µg/ml) kienu l-gruppi negattivi u pożittivi, rispettivament.

Assaġġ taċ-ċiklu taċ-ċelluli

Il-GCs ġew maħlula f'midja tal-kultura RPMI-1640 li fiha 0.1% DMSO f'konċentrazzjonijiet finali ta '1.75, 17.5, u 175 µg/ml. Linji MCF-7-ċelluli ġew ikkultivati ​​f'medja RPMI-1640 mingħajr fenol aħmar li fih 5% CDT-FBS għal 4 ijiem. Wara l-ħasil mill-PBS tliet darbiet, 1 mL ta 'medja RPMI-1640 ħielsa mill-FBS ġie miżjud fi pjanċi ta' 6-well f'2.5 × 105 għal kull bir u inkubati f'37 grad għal 24 siegħa. Sussegwentement, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'diversi konċentrazzjonijiet tas-soluzzjoni GCs u inkubati b'fulvestrant (6.06 × 10-5 µg/ml) għal 48 siegħa. Sussegwentement, iċ-ċelloli nġabru u maħsula b'PBS tliet darbiet, ċentrifugati f'4 gradi, 1000 rpm għal 10 min, u ffissati b'70% etanol f'-20 grad, matul il-lejl. Wara l-ħasil b'PBS darbtejn, iċ-ċelloli ġew imtebba 'b'soluzzjoni PI (50 mg/mL) li kien fiha 1 mg/mL ta' RNase A u 0.1% Triton X-100 għal 30 min fid-dlam f'4 gradi. Iċ-ċiklu taċ-ċelluli ġie skopert bl-użu ta 'ċitometrija tal-fluss, u l-indiċi ta' proliferazzjoni (PI) ġie kkalkulat kif ġej. RPMI-1640 mingħajr fenol aħmar u medju li fih E2 (2.725 × 10−3 µg/ml) kienu l-gruppi negattivi u pożittivi, rispettivament.

PI {{0}} (S + G2 M)/(G0 /G{1  + S + G2 M) × 100%

Iżolament ta 'RNA u analiżi kwantitattiva ta' reazzjoni tal-katina tal-polimerażi f'ħin reali

Biex jitkejjel il-livell ta' mRNA, intuża assaġġ RT-quantitative PCR (qPCR). L-RNA ċellulari totali ġie estratt b'reaġent TRIzol. Għal qPCR, RNA ġie traskritt b'lura għal cDNA minn 4 µg ta' RNA totali bl-użu ta' kit RT. L-analiżi RT-PCR twettqu bl-użu tat-TB Green™ RT-PCR Kit. Il-protokolli kollha twettqu skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-par primer użat għall-amplifikazzjoni ta' ER kien 5'-GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG-3' ('il quddiem) u 5'-TGGCTGGACACATATAGTCGTT-3' (reverse); il-par primer użat għall-amplifikazzjoni tal-ER kien 5'-AGTGCCGCTCTTGGGAGAGCTG-3' ('il quddiem) u 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (reverse). Il-kundizzjonijiet tal-PCR għal ER u ER kienu 94 grad għal 3 min segwiti minn 37 u 40 ċiklu, rispettivament, ta '94 grad għal 30 s, 58 grad għal 2 min, u 72 grad għal 2 min. Il-par tal-primer użat għall-amplifikazzjoni ta' GAPDH kien 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' ('il quddiem) u 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (wara). Il-kundizzjonijiet tal-PCR għal GAPDH kienu 94 grad għal 3 min segwiti minn 30 ċiklu ta '94 grad għal 30 s, 58 grad għal 2 min, u 72 grad għal 2 min. Kull darba li l-esperiment RT-qPCR ġie ripetut aktar minn darbtejn. Għal dan, GAPDH intuża bħala kontroll intern. L-espressjoni tal-ġeni relattiva ta 'ER / ER ta' transfettanti dwar ċelluli ta 'kontroll ġiet ikkalkulata: 2-(∆∆Ct).

Western blotting

L-espressjoni tal-proteini ER u ER ġiet skoperta mill-analiżi tal-western blot bħala l-metodu rrappurtat b'modifiki minuri. Fil-qosor, iċ-ċelloli MCF-7 tkabbru fi pjanċi ta '6-well f'2.5 × 105 ċelluli kull bir u ttrattati b'GCs fil-konċentrazzjoni finali ta' 1.75, 17.5, u 175 µg/ml għal 48 siegħa, rispettivament. Wara l-inkubazzjoni, l-estratti taċ-ċelluli sħaħ ġew ippreparati bl-użu ta' buffer RIPA li kien fih 1 mM PMSF. Proteini fl-estratti taċ-ċelluli sħaħ ġew separati b'elettroforeżi tal-ġell ta' 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide u mbagħad trasferiti għal membrani ta' polyvinylidene difluoride. Il-membrana ġiet imblukkata b'5% (w/v) ħalib xkumat maħlul fil-buffer TBST u inkubata b'antikorpi primarji u sekondarji min-naħa tagħhom. Antikorpi marbuta kienu osservati.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIBATTIVITÀ ESTROGENIKAPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analiżi statistika

Ir-riżultati ġew espressi bħala mezzi u devjazzjonijiet standard, u s-sinifikat statistiku twettqet bl-użu tat-test t ta' Student b'softwer SPSS 21.0 (IBM Co., Ltd. America). P<0.05 was considered statistically significant. 

RIŻULTATI

Wara 24 siegħa ta 'trattament E2, il-proliferazzjoni taċ-ċelloli MCF-7 tjiebet [Figura 1a]. 10nM ta 'soluzzjoni E2 jistgħu jistimulaw it-tkabbir taċ-ċelloli ovvjament (123.89%). Madankollu, biż-żieda tal-konċentrazzjoni E2, il-kapaċità tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli ddgħajjef. Għalhekk, 10nM kienet l-aħjar konċentrazzjoni ta 'E2 f'dan l-esperiment. Grupp GCs fil-konċentrazzjonijiet ta '1.75, 17.5, u 175 µg/mg jista' jtejjeb il-proliferazzjoni tal-linji taċ-ċelluli MCF-7 b'mod dipendenti fuq iż-żmien u d-dożaġġ u wera differenza sinifikanti ma 'grupp negattiv [Figura 1b]. Meta mqabbel mal-grupp negattiv, il-grupp E2 wera proliferazzjoni ovvja (120.06%). Grupp ta 'medikazzjoni kombinata (CMG) (fulvestrant ma' E2 jew GCs) fil-mezz CDT-FBS ġew inkubati b'ċelluli MCF-4. Wara 72 h ta

inkubazzjoni, CMG jista 'jwassal għall-inklinazzjoni ta' PR meta mqabbel mal-grupp ta 'medikazzjoni individwali (IMG) (P< 0.01) [Figure 1c]. Flow cytometry analysis showed that GCs could slightly increase the PI value suggesting that GCs could advance G0/G1 phase cells to S and G2/M phase [Figure 2 and Table 1] and promote cell DNA synthesis. The result indicated that the mechanism of GCs on MCF‑7 was similar to that of E2. In CMG  (fulvestrant with GCs), the PI value of cell PI declined to that of IMG slightly (P < 0.05). RT‑PCR analysis indicated that the expressions of ERα and ERβ mRNA were increased compared with the control group  (P  <  0.01) in a dose‑dependent manner after being treated with different concentrations of GCs for 48 h [Figure 3a and b]. Western blot result indicating that after treatment with various concentrations of GCs for 48  h, contents of ERα and ERβ proteins in MCF‑7 increase with the GCs increased in a dosage‑dependent manner [Figure 3c‑e]. 

KONKLUŻJONI

F'din ir-riċerka, l-effett tal-GCs fuq il-proliferazzjoni u ċ-ċiklu taċ-ċelluli ta 'MCF-7 ġie ttestjat bil-metodu ta' MTT u ċitometrija tal-fluss, rispettivament.Il-GCs jistgħu jżidu l-proliferazzjoni taċ-ċelloli MCF-7fil-konċentrazzjoni ta '1.75, 17.5, u 175 µg/ml wara inkubazzjoni għal 72 siegħa. Madankollu, iż-żieda għandha tendenza li tonqos meta CCs u fulvestrant jintużaw flimkien. Il-GCs jistgħu jżidu l-valur PI taċ-ċelloli MCF-7, inaqqsu ċ-ċellula tal-fażi G1, u jżidu ċ-ċelloli tal-fażijiet S u G2.

Fulvestrant huwa antagonist speċifiku għall-ER, li jimblokka l-lokalizzazzjoni nukleari tal-ER billi jfixkel id-dimerizzazzjoni tar-riċetturi u t-trasport nukleari dipendenti fuq l-enerġija.[17] F'din ir-riċerka, konklużjoni kkonfermat li fulvestrant jista' jdgħajjef il-proliferazzjoni ta' GCs fuq ċelloli MCF-7, u jista' jaffettwa t-trasformazzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelluli. Għalhekk, dan l-istudju indika l-attività estroġenika tal-GCs, u wkoll, ER huwa l-

mira tal-GCs. Fl-esperiment RT-PCR u western blot, mRNA u espressjonijiet ta 'proteini ta' ER u ER fiċ-ċelloli MCF-7 żdiedu biż-żieda tal-konċentrazzjoni GC. Għalhekk,Il-GCs jista 'jkollhom rwol fl-attività estroġenikaskond mRNA upregulated u proteini ta 'ER u ER.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIBATTIVITÀ ESTROGENIKAPHGS75% ECH 30% ACT 12%