Astratt

Għan: Biex tinvestiga l-effetti ta' formula li fiha Cistanche (li tissostitwixxi l-ħwawar oriġinali li jrawmu d-demm u li jtonifikaw il-kliewi) fuq l-espressjoni tat-trasformazzjoni tal-fattur ta' tkabbir- 2 (TGF{{- 2), remodeling sklerali, u t-trasport tal-ilma fil-firien tal-mijopija ta' deprivazzjoni tal-forma (FDM) billi tirregola l-caveolin (caveolin)1/A (FDM) mogħdija.

Metodi: Ġew magħżula erbgħin firien SD maskili ta 'grad SPF, fosthom 30 intużaw biex jiġi stabbilit il-mudell FDM. Wara mudellar b'suċċess, il-firien ġew maqsuma fil-grupp FDM, grupp pirenzepine (PIR) u grupp ta 'formula Cistanche, b'10 firien f'kull grupp. L-10 firien mhux immudellati li jifdal servew bħala l-grupp normali. Il-grupp normali u l-grupp FDM ma rċevew l-ebda intervent. Il-grupp PIR ġie ttrattat bi qtar għall-għajnejn PIR darbtejn kuljum (filgħodu u filgħaxija), filwaqt li l-grupp tal-formula Cistanche ingħata amministrazzjoni intragastrika tal-formula li fiha Cistanche. Żball refrattiv u tul assjali tal-firien ġew skoperti bl-użu ta 'retinoskopju u strument dijanjostiku. It-tbajja 'HE intużat biex josservaw il-bidliet morfoloġiċi tat-tessut sklerali. Tbajja immunoistokimika ġiet użata biex tiskopri l-espressjoni ta' TGF- 2 fit-tessut sklerali. Western blot intuża biex jiddetermina l-livelli ta 'espressjoni relattivi tal-proteini AQP1 u CAV1 fit-tessut sklerali. Twettqet RT-PCR biex tkejjel il-livelli ta' espressjoni relattiva ta' mRNA tat-trasportatur tal-glutamate-aspartate (GLAST) u tat-trasportatur tal-glutamat 1 (GLT-1) fit-tessut sklerali. Riżultati: Meta mqabbel mal-grupp normali, l-iżball refrattiv, il-livell ta 'espressjoni TGF- 2, u l-livelli ta' espressjoni relattiva tal-proteini AQP1 u CAV1 fil-grupp FDM, il-grupp tal-formula Cistanche, u l-grupp PIR naqsu b'mod sinifikanti, filwaqt li t-tul assjali u l-livelli ta 'espressjoni relattiva ta' GLAST mRNA u GLT-1 mRNA kollha żdiedu b'mod sinifikanti <00. Meta mqabbel mal-grupp FDM, l-iżball refrattiv, il-livell ta 'espressjoni TGF- 2, u l-livelli ta' espressjoni relattiva tal-proteini AQP1 u CAV1 fil-grupp tal-formula Cistanche u l-grupp PIR żdiedu b'mod sinifikanti, filwaqt li t-tul assjali u l-livelli ta 'espressjoni relattiva ta' GLAST mRNA u GLT-1 mRNA naqsu b'mod sinifikanti (kollha P <0.00.05). Meta mqabbel mal-grupp tal-formula Cistanche, l-iżball refrattiv, il-livell ta 'espressjoni TGF- 2, u l-livelli ta' espressjoni relattiva tal-proteini AQP1 u CAV1 fil-grupp PIR naqsu b'mod sinifikanti, filwaqt li t-tul assjali u l-livelli ta 'espressjoni relattiva ta' GLAST mRNA u GLT-1 mRNA żdiedu b'mod sinifikanti (kollha P < 0.05). Ir-riżultati tat-tbajja 'HE wrew li ma kien hemm l-ebda tibdil anormali fl-istruttura ta' kull saff tar-retina fil-grupp normali; ir-retina tal-grupp FDM kienet irqaq u bidliet vakuolari severi dehru fis-saff taċ-ċelluli tal-ganglion; il-ħxuna tar-retina tal-grupp tal-formula Cistanche u l-grupp PIR żdiedet, l-arranġament taċ-ċelluli kien bażikament regolari, in-numru ta 'ċelluli tal-ganglioni żdied, u ċ-ċelloli f'kull saff kienu rranġati b'mod dens, bl-aktar prestazzjoni sinifikanti fil-grupp tal-formula Cistanche. Konklużjoni: Il-formula li fiha Cistanche għandha ċertu effett pożittiv fuq it-trattament ta 'FDM, u l-mekkaniżmu tagħha jista' jkun relatat mar-regolazzjoni tal-espressjoni ta 'CAV1, AQP1, u TGF - 2, kif ukoll tibbilanċja u ttejjeb scleral remodeling u funzjonijiet tat-trasport tal-ilma.

 

 

SUPPLIMENT TAL-ĦWAWA TA' CISTANCHE GĦAT-TITJIB TAL-FUNZJONI TAL-KLIEWA

 

 

Kliem ewlieni

Mijopija ta' privazzjoni tal-forma; Formula li fiha Cistanche; Fattur tat-tkabbir tat-trasformazzjoni- 2; Aquaporin 1; Caveolin-1; Rimodelazzjoni sklerali; Trasport bl-ilma

 

F'dawn l-aħħar snin, bil-bidliet fl-istili ta 'ħajja tan-nies u l-iżvilupp kontinwu ta' apparat elettroniku, l-inċidenza tal-mijopija kienet qed tiżdied. Bħala marda komuni, saret problema tas-saħħa globali. Mijopija ta 'deprivazzjoni tal-forma (FDM) hija tip speċjali ta' mijopija, li ġeneralment tkun ikkawżata minn ċaħda jew tnaqqis ta 'stimulazzjoni viżwali għall-għajnejn. FDM mhux biss jinterferixxi mal-proċess ta 'remodeling sklerali iżda jwassal ukoll għal bidliet anormali fil-forma tal-boċċa tal-għajnejn u disturbi tal-funzjoni tat-trasport tal-ilma, li jistgħu jaggravaw aktar il-ħsara u d-deformazzjoni tat-tessut sklerali. Aquaporin 1 (AQP1) hija proteina eżistenti b'mod wiesa 'li l-funzjoni ewlenija tagħha hija li tippromwovi t-trasport rapidu ta' molekuli ta 'l-ilma tul il-membrani taċ-ċelluli. Fl-għajn, id-distribuzzjoni u l-funzjoni ta 'AQP1 huma relatati mal-bilanċ dinamiku tal-fluwidu intraokulari. Caveolin-1 (CAV1) hija proteina involuta fil-formazzjoni ta 'mikrostrutturi tal-membrana taċ-ċelluli u t-trasduzzjoni tas-sinjali. Fl-għajn, CAV1 huwa prinċipalment preżenti fiċ-ċelloli epiteljali tal-pigment tar-retina u ċelloli fotoreċetturi, u huwa relatat mat-trażmissjoni ta 'sinjali viżwali u l-istabbiltà tal-ambjent intraokulari. Fattur tat-tkabbir ta' trasformazzjoni- 2 (TGF- 2) huwa ċitokin plejotropiku b'effetti bijoloġiċi multipli bħall-promozzjoni tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli, id-divrenzjar, u l-migrazzjoni. Fl-ambjent intraokulari, TGF- 2 għandu rwol importanti fl-iżvilupp u l-manutenzjoni tal-kornea u l-isklera. Fil-preżent, it-trattament ewlieni għall-FDM huwa t-terapija tad-droga.

Fil-mediċina tradizzjonali Ċiniża (TCM), il-formazzjoni tal-mijopija hija maħsuba li hija relatata ma 'fatturi bħal qi u demm insuffiċjenti, u defiċjenza ta' essenza tal-kliewi. Il-kliewi hija meqjusa bħala l-"pedament konġenitali" u hija relatata mill-qrib mal-funzjoni tal-għajnejn. TCM isostni li "il-kliewi jirregola l-essenza, u l-essenza ssostni l-għajnejn; il-fwied jinfetaħ fl-għajnejn, u biżżejjed demm tal-fwied jiżgura viżjoni ċara". Għalhekk, it-tonifikazzjoni tal-kliewi u n-nutrizzjoni tad-demm dejjem kienet prinċipju terapewtiku importanti għall-mard tal-għajnejn ikkawżat minn sindromi ta 'defiċjenza fit-TCM.

Cistanche, magħrufa bħala l-"ġinseng tad-deżert" u waħda mid-"disa 'mediċini immortali" fit-TCM, għandha storja ta' aktar minn 2,000 sena bħala ingredjent mediċinali. Irreġistrat bħala materjal mediċinali ta 'nutrizzjoni tal-ogħla grad fil-klassiċi tat-TCM tal-qedem, Cistanche huwa apprezzat ħafna għall-effetti tiegħu ta' tonifikazzjoni tal-kliewi, riforniment tal-essenza, demm nutrizzjoni, u nixfa niedja. B'differenza minn ħafna ħxejjex aromatiċi TCM oħra, Cistanche tikber esklussivament fid-deżerti, prinċipalment parassiti fuq l-għeruq ta 'Tamarix ramosissima f'reġjuni bħal Xinjiang, Inner Mongolia, u Gansu fiċ-Ċina. L-ambjent uniku tad-deżert jagħtih b'ingredjenti attivi sinjuri, inklużi echinacoside, verbascoside, u flavonoids, li ġew ippruvati xjentifikament li għandhom proprjetajiet antiossidanti qawwija, inaqqsu l-apoptożi taċ-ċelluli, u jippromwovu l-proliferazzjoni taċ-ċelluli.

Ir-riċerka moderna wriet li Cistanche għandu effetti sinifikanti ta 'nutrizzjoni tal-kliewi. Jista 'jnaqqas l-apoptożi taċ-ċelluli tal-kliewi, jippromwovi l-proliferazzjoni taċ-ċelluli tal-kliewi, isewwi ċ-ċelloli tal-kliewi bil-ħsara, u jkabbar il-vini tad-demm tal-kliewi, u b'hekk ittejjeb il-funzjoni tal-kliewi. Barra minn hekk, Cistanche jista 'jtejjeb l-immunità billi jippromwovi l-proliferazzjoni tal-limfoċiti, jirreżisti l-għeja billi jżid il-produzzjoni tal-glikoġenu tal-fwied, u jeżerċita effetti kontra t-tixjiħ permezz ta' tneħħija ta 'radikali ħielsa. Dawn l-attivitajiet bijoloġiċi huma konsistenti ħafna mat-teorija tat-TCM ta '"tonifikazzjoni tal-kliewi u essenza nutrittiva", u jipprovdu wkoll bażi xjentifika għall-applikazzjoni tagħha fit-trattament tal-mard tal-għajnejn. Ibbażat fuq il-prinċipju terapewtiku tat-TCM tat-tonifikazzjoni tal-kliewi u d-demm nutrittiv, u li jgħaqqad il-karatteristiċi farmakoloġiċi moderni ta 'Cistanche, dan l-istudju ssostitwixxa l-ħxejjex aromatiċi oriġinali li jrawmu d-demm u li jtonifikaw il-kliewi b'Cistanche biex jiffurmaw formula ġdida li fiha Cistanche, u esplora l-effikaċja u l-mekkaniżmu tagħha fit-trattament ta' idea ġdida bbażata fuq il-ħxejjex għat-trattament ta 'FDM. terapiji għall-mijopija.

1 Materjali u Metodi

1.1 Annimali Sperimentali

Erbgħin firien SD maskili ta 'grad SPF, li jiżnu 180-200 g u ta' 6-8 ġimgħat, inxtraw minn Beijing Keyu Animal Breeding Center [Liċenzja Nru: SCXK (Jing) 2022-0004] u mrobbija regolarment fil-Laboratorju tal-Annimali tal-Isptar tal-għajnejn taċ-Ċina Akkademja tax-Xjenzi Mediċi Ċiniżi. Dan l-esperiment kien konformi mad-dispożizzjonijiet rilevanti tar-"Regolamenti dwar l-Amministrazzjoni ta 'Annimali Sperimentali" u ġie approvat mill-Kumitat tal-Etika Medika tal-Isptar tal-għajnejn taċ-Ċina Akkademja tax-Xjenzi Mediċi Ċiniżi (Nru tal-lott: YKEC-KT-2024-017-P001).

1.2 Reaġenti u Strumenti Ewlenin

Cistanche tubulosa (mixtrija minn Chengdu WeCistanche Bio-Tech. Co., Ltd., b'ingredjenti attivi inklużi echinacoside Greater minn jew ugwali għal 30.0%, verbascoside Greater minn jew ugwali għal 12.0%, u totali phenethyl alcohol glycosides Greater minn jew ugwali għal 75.0%) kien użat bħala l-materjal mediċinali tal-qalba. Pirenzepine (PIR, Suzhou Hongsen Pharmaceutical Co., Ltd.); Qtar għall-għajnejn Tropicamide kompost (Hebei Jinyao Yongguang Pharmaceutical Co., Ltd., speċifikazzjoni 5 mL); 4 g·L⁻¹ Oxybuprocaine Hydrochloride Qtar għall-għajnejn (Shandong Bausch & Lomb Freda Pharmaceutical Co., Ltd.); Antikorp AQP1 (Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.); Antikorp CAV1 (Wuhan Botu Biotechnology Co., Ltd.); -actin antikorp (Shanghai Jingke Chemical Technology Co., Ltd.); IgG kontra l-fenek tal-mogħoż (Wenzhou Kemiao Biotechnology Co., Ltd.); HE Staining Kit (Shanghai Zeye Biotechnology Co., Ltd.).

1.3 Metodu tal-Immudellar u Raggruppament

Intużaw tletin far biex jiġi stabbilit il-mudell FDM. Il-firien ġew anestetizzati b'injezzjoni intraperitoneali ta' pentobarbital sodium (30 mg·kg⁻¹). Wara t-tindif u d-diżinfettar tal-għajn tal-lemin bil-povidone-jodju, maskra opaka tal-għajnejn ġiet imwaħħla mal-għajn tal-lemin. Il-maskra tal-għajnejn ġiet iċċekkjata kuljum għal distakk jew tnixxija ħafifa, u reġgħet inkollata jekk maħlula. L-għajn tax-xellug tħalla mhux ittrattata. Wara 4 ġimgħat ta 'deprivazzjoni ta' forma monokulari, retinoskopija binokulari u kejl tat-tul axjali saru fuq il-firien. Il-kriterji ta 'suċċess għall-immudellar: wara cycloplegia, żball refrattiv tkejjel b'retinoskopju jew rifrattometru awtomatiku, u l-għajn mċaħħda wriet bidla mijopika sinifikanti fl-istatus refrattiv [ie, id-differenza fl-iżball refrattiv binokulari Akbar minn jew ugwali għal 2 D kienet ikkunsidrata bħala mmudellar ta' suċċess, u l-bidla mijopika medja tal-kontroll mijopiku tqabbel ma 'l-eye ± 4. 1.2) D]. It-30 firien kollha ġew immudellati b'suċċess u maqsuma fil-grupp FDM, grupp PIR, u grupp tal-formula Cistanche, b'10 firien f'kull grupp. L-10 firien mhux immudellati li jifdal servew bħala l-grupp normali.

1.4 Metodi ta' Intervent

Il-grupp normali u l-grupp FDM ma rċevew l-ebda intervent. Il-grupp PIR ingħata 5 qatriet ta 'qtar PIR għall-għajnejn fl-għajn tal-lemin darbtejn kuljum (filgħodu u filgħaxija) b'intervall ta' 2 minuti għal 15-il jum. Il-grupp tal-formula Cistanche ġie intervjenit bil-formula li fiha Cistanche. Cistanche tubulosa (50 g, l-ingredjent ewlieni) ġiet decocted bl-ilma u kkonċentrata għal soluzzjoni mediċinali b'konċentrazzjoni ta '1000 g·L⁻¹. Il-firien ngħataw amministrazzjoni intragastrika f'doża ta' 12.70 g·kg⁻¹ darba kuljum għal 15-il jum. Id-dożaġġ ta 'Cistanche ġie ddeterminat abbażi tal-esperjenza tal-applikazzjoni klinika tiegħu u r-riċerka farmakoloġika moderna, li tiżgura konċentrazzjonijiet effettivi ta' ingredjenti attivi bħal echinacoside u verbascoside.

1.5 Metodi ta 'Sejbien

1.5.1 Evalwazzjoni ta 'Żball Rifrattiv u Bidliet fit-Tul Assjali

Sejbien ta 'żball morfoloġiku u refrattiv: Erbgħa u għoxrin siegħa wara t-tmiem tal-privazzjoni tal-forma, 3 firien ġew magħżula b'mod każwali minn kull grupp għall-iskoperta. Qabel l-esperiment, il-firien tqiegħdu f'ambjent adattat għad-dlam għal 30 minuta, imbagħad anestetizzati permezz ta 'inalazzjoni ta' isoflurane u mwaħħla fuq parentesi speċjali għall-annimali. Intużat sistema tal-immaġini OCT b'riżoluzzjoni għolja għall-iskannjar panoramiku tal-boċċa tal-għajnejn. Waqt l-iskannjar, is-sonda ġiet aġġustata biex tkun perpendikolari mal-kornea biex tikseb stampi ċari ta 'sezzjoni trasversali tar-retina u l-lenti. Kull għajn ġiet skennjata 3 darbiet konsekuttivament, u d-distanza axjali mill-wiċċ tal-kornea anterjuri għas-saff tal-epitelju tal-pigment tar-retina (jiġifieri, it-tul assjali) ġiet imkejla awtomatikament mis-softwer integrat tas-sistema biex tikkalkula l-iżball refrattiv ekwivalenti sferiku. Biex tiġi żgurata l-eżattezza tad-dejta, żewġ riċerkaturi mħarrġa professjonalment analizzaw b'mod indipendenti l-immaġini b'mod blinded. Jekk id-differenza bejn iż-żewġ riżultati tal-kejl kienet akbar minn 0.50 D, id-dejta ġiet mormija u mkejla mill-ġdid. Sejbien konfermatorju tat-tul assjali: Biex tivverifika r-riżultati tal-kejl OCT, intuża wkoll strument dijanjostiku tal-ultrasound A-scan. L-ewwel, qtar għall-għajnejn oxybuprocaine hydrochloride ġew instillati fiż-żewġ għajnejn tal-firien għal anestesija topika, u mbagħad is-sonda A-scan tpoġġiet bil-mod f'kuntatt mal-kornea. L-istrument ġie aġġustat għall-mod manwali, u l-veloċità tal-propagazzjoni ultrasonika preċiża ġiet issettjata skont il-midja intraokulari: 1540 m·s⁻¹ għall-kamra anterjuri u vitreous. Waqt it-tħaddim, kull interface kienet tinsab b'immarkar manwali, u kull għajn tkejjel 3 darbiet ripetutament biex tieħu l-valur medju. Dan l-esperiment sar b'mod blinded, u l-operaturi kollha rċevew taħriġ unifikat biex jiżguraw tekniki ta 'kejl konsistenti. L-istrument ġie kkalibrat qabel il-kejl, u xi kampjuni ġew magħżula b'mod każwali għall-ittestjar tar-ripetibbiltà biex jevalwaw il-koeffiċjenti ta 'korrelazzjoni intraklassi u interklassi (ICC). Ġew segwiti proċeduri operattivi standardizzati stretti matul l-esperiment biex jiżguraw ix-xjenzatiċità u l-affidabbiltà tad-dejta.

1.5.2 HE Tbajja

Wara l-iskoperta ta 'żball refrattiv u tul axjali, il-firien ġew sagrifikati b'anestesija eċċessiva. It-tebqet il-għajn u t-tessuti tal-madwar taż-żewġ għajnejn ġew diżinfettati, u l-limbus nażali u temporali perpendikolari għall-punt tan-nofs tal-kornea ġew immarkati. Il-konġuntiva ġiet inċiża skont il-marki, u l-boċċa tal-għajnejn ġiet enukleata. Il-limbus ġie inċiż biex jitneħħa t-tessut tas-segment anterjuri u l-vitreous, u t-tessut sklerali nżamm. It-tessut scleral ġie ffissat b'40 g·L⁻¹ paraformaldehyde għal 24 siegħa, deidratat b'etanol gradjent, rutina inkorporat fil-paraffin, imnaddaf bil-xylene, immuntat b'balzmu newtrali, sezzjoni f'5 μm, imtebba 'HE, u osservat għal bidliet morfoloġiċi ta' mikroskopju scleral.

1.5.3 Tbajja immunoistokimika għal Espressjoni ta' TGF- 2 fit-Tessut Sklerali

Żewġ firien ġew magħżula minn kull grupp. Is-sezzjonijiet tat-tessut sklerali ġew soġġetti għall-irkupru u l-imblukkar tal-antiġen, inkubati bil-ġurdien anti-TGF- 2 (1:3000) għal 24 siegħa, maħsula, inkubati b'antikorp sekondarju (1:2000) għal siegħa, żviluppati b'mod rutina u mtebbgħin, immuntati b'balzmu newtrali, u ttieħdu 2-3 immaġini biex josservaw mikroskopju ottiku 2-3. Il-valur griż tal-parti pożittiva ġie skopert minn sistema ta 'analiżi tal-immaġni.

1.5.4 Sejbien Western Blot ta 'Livelli ta' Espressjoni tal-Proteina AQP1 u CAV1 fit-Tessut Sklerali

Żewġ firien ġew magħżula minn kull grupp. It-tessut sklerali ġie mneħħi, omoġenizzat, u l-proteina totali ġiet estratta biż-żieda ta 'buffer tal-liżi RIPA. Twettqu d-denaturazzjoni tal-proteini, il-kwantifikazzjoni, l-elettroforeżi, it-trasferiment tal-membrana u l-imblukkar. Antikorpi primarji AQP1 (1:1000), CAV-1 (1:3000), u antikorp -actin (1:2000) ġew miżjuda u inkubati matul il-lejl f'4 gradi. Antikorp sekondarju (1:2000) ġie miżjud u inkubat f'temperatura tal-kamra għal siegħa. Ir-reaġent ECL ġie miżjud, u l-valur tal-griż tal-proteina ġie analizzat bis-softwer Image Lab. Il-proporzjon tal-valur griż tal-faxxa fil-mira għal dak ta '-actin kien il-livell ta' espressjoni relattiv tiegħu.

1.5.5 Sejbien RT-PCR ta' GLAST u GLT-1 Espressjoni tal-mRNA fit-Tessut Sklerali

It-tessut sklerali li kien fadal tal-firien ittieħed, u l-RNA totali ġie estratt skont il-metodu Trizol. L-RNA totali tkejjel bi spettrofotometru, u cDNA ġie traskritt b'lura skont l-istruzzjonijiet tal-kit. Is-sistema ta 'reazzjoni RT-PCR ġiet ippreparata bil-kundizzjonijiet ta' reazzjoni li ġejjin: 75 grad għal 30 s, 85 grad għal 60 s, 80 grad għall-ittemprar għal 30 s, 65 grad għal estensjoni għal 30 s, total ta '40 ċiklu. B'-actin bħala r-referenza interna, il-livelli ta 'espressjoni relattiva ta' trasportatur ta 'glutamate-aspartate (GLAST) u trasportatur ta' glutamate 1 (GLT-1) ġew ikkalkulati bil-metodu 2⁻ΔΔCt. Is-sekwenzi tal-primer huma murija fit-Tabella 1. Intużat analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda għat-tqabbil bejn il-gruppi, u t-test LSD-t intuża għal tqabbil bejn il-gruppi. Il-livell tat-test:=0.05.