Echinacoside Jittardja s-Senescence Ċellulari taċ-Ċelloli Fibroblastiċi tal-Bniedem MRC-5

Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

L-ingredjent attiv ta 'Cistanche: Kif jagħmel echinacoside kontra t-tixjiħ?

Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1

F'dan l-istudju, ġew investigati l-effetti ta 'echinacoside, wieħed mill-phenylethanoids iżolati miz-zkuk ta' Cistanches salsa, mediċina veġetali tradizzjonali Ċiniża, fuq ċelluli fibroblastiċi tal-pulmun tal-embriju uman MRC-5. L-attività tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli ġiet evalwata b'Alamar Blue, li turi li t-trattament b'echinacoside jista 'jittardja s-senescence. Ir-riżultati taċ-ċitometrija tal-fluss juru li echinacoside jista 'jqajjem ċelluli fil-fażi G1 biex jidħlu fil-fażi S u l-fażi G2, u jista' jtejjeb id-degradazzjoni tal-ROS. Ir-riżultati mill-assaġġ tal-kometa jindikaw li l-echinacoside jista 'jipproteġi ċ-ċelloli mill-ħsara fid-DNA, parzjalment jiċċara l-mekkaniżmu tal-effetti tiegħu. Ir-riżultati kollha ta 'hawn fuq jissuġġerixxu li echinacoside għandu attività potenzjali kontra s-senescence.

Cistanche deserticola għandha ħafna effetti, ikklikkja hawn biex tkun taf aktar

1. Introduzzjoni

Ċelloli normali kkultivati ​​in vitro jipproliferaw għal numru limitat ta' rduppjar tal-popolazzjoni (il-'limitu ta' Hayflflick') u jidħlu fi stadju ta' senescenza replika. Iċ-ċelloli senescent jgħaddu minn arrest tat-tkabbir taċ-ċelluli fil-fażi G1 u bidla fil-morfoloġija u l-metaboliżmu, inkluż tkabbir ċellulari, żieda fil-bijoġenesi tal-lysosome, u espressjoni ta' attività ogħla ta' -galactosidase f'pH 6 (assoċjat mas-senescence -galactosidase, SA- - -Gal ) (Hayflflick u Moorhead 1961; Dimri 1995). L-akkumulazzjoni ta 'ċelluli senescent tippronjostika t-tnaqqis relatat mal-età filtessut/organufunzjonijiet. Biex taċċessa l-mod kif tittardja jew treġġa' lura t-tixjiħ, l-isforzi biex jiġu skoperti sustanzi attivi kontra t-tixjiħ qatt ma waqfu.Echinacosidehuwa wieħed mill-phenylethanoids iżolati minn zkuk ta 'Salsa ta' cistanches, mediċina veġetali tradizzjonali Ċiniża, li għandha attivitajiet bijoloġiċi potenzjali, kemm bħala antiserum kif ukollkontra l-għejaaġent (Deng et al. 2004; Xiong et al. 1996). Ġie rrappurtat ukoll li jġib ruħu in vitro bħala potentiħielsaradikalikennies(Facino et al. 1995) u esebitinewroprotettivattivitajietin vitro u in vivo (Koo et al. 2005; Geng et al. 2007). Echinacoside jista 'jkun kandidat għal sustanza kontra t-tixjiħ, u attività kontra t-tixjiħ tista' tkun waħda mill-proprjetajiet bijoloġiċi tagħha. Għalhekk, ikkurajna linja taċ-ċelluli fibroblastiċi tal-pulmun tal-embriju tal-bniedem senescent MRC-5 b'echinacoside, u nistennew li tista' tirretardja jew ireġġa' lura s-senescence.

2. Investigazzjonijiet u riżultati

L-ewwelnett, aħna żidna echinacoside fil-mezz tal-kultura biex tivverifika l-influwenza tiegħu fuq it-tkabbir taċ-ċelluli u ċ-ċikli taċ-ċelluli. Ġie osservat li l-vijabbiltà taċ-ċelluli b'espożizzjoni ta '48 siegħa għal echinacoside żdiedet b'mod evidenti relattiv għall-kontroll, peress li l-konċentrazzjoni żdiedet (Fig. 1A), li jindika li echinacoside għen ċelluli senescent jipproliferaw. Riżultat tat-tbajja 'SA-Gal wera li l-livell ta' SA--Gal naqas ovvjament wara t-trattament ta 'echinacoside (dejta mhux murija), li tissuġġerixxi li parti miċ-ċelloli senescent ġew maqluba mis-senescence. Biex jiġi kkonfermat jekk iċ-ċelluli senescent kinux tabilħaqq imbuttati biex jipproliferaw minn echinacoside, ġiet introdotta ċitometrija oħra biex tiċċekkja l-alterazzjoni tal-fażi taċ-ċiklu taċ-ċelluli taċ-ċelluli senescent MRC-5 wara t-trattament b'echinacoside. Fl-istudju tagħna, osservajna li bil-konċentrazzjoni ta 'Echinacoside miżjuda, il-proporzjon taċ-ċelloli fil-perjodu G1 tnaqqas gradwalment. Għall-kuntrarju, aktar ċelloli ġew misjuqa biex jidħlu fil-fażi S u l-fażi G2 (Fig. 1B). L-akkumulazzjoni ta 'foċi heterochromatin assoċjati mas-senescence (SAHF) hija bijomarkatur speċifiku ieħor ta' ċelluli senescent (Shay u Wright 2001). Ċelloli senescent murija fokus tad-DNA bil-punt li kienu viżwalizzati minn tbajja Hoechst (Fig. 1C). B'kuntrast, iċ-ċelloli MRC-5 ittrattati bl-echinacoside dehru li kellhom inqas SAHF.

Il-livell ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS) jiżdied hekk kif iċ-ċelloli jersqu lejn il-limitu ta 'Hayflflick (Hutter et al. 2002). Trattament kontinwu ta 'ċelloli b'livelli sub-letali ta' ROS mhux biss iżid il-livell ta 'prodotti ta' ħsara ossidattiva bħal lipofuscin (Sitte et al. 2001) iżda wkoll jikkawża arrest permanenti tat-tkabbir akkumpanjat mill-attivazzjoni tal-p{3}}inibitorju tat-tkabbir. mogħdija (Toussaint et al. 2000). Għalhekk, fil-livell ċellulari, ROS għandu rwol ewlieni fl-induzzjoni tas-senescence. Iż-żebgħa fluworexxenti FL DCFH-DA intuża biex ikejjel il-kontenut ta 'ROS b'ċitometrija sħabi. Intwera li meta mqabbel mal-kontroll, il-kontenuti ta 'ROS naqsu b'mod evidenti f'ċelloli inkubati b'echinacoside (Fig. 2A). Dawn ir-riżultati jindikaw liechinacosidejista 'jaġixxi bħala anti-ossidant, inaqqas il-produzzjoni ta' ROS jew jaċċellera t-tneħħija ta 'ROS.

Speċijiet ta 'ossiġnu reattiv akkumulat (ROS) jikkawżaw l-indeboliment notevoli ta' makromolekuli fiċ-ċelloli, inklużi proteini, DNA u telomeri (Kovtun et al. 2007). Il-ħsarat ossidattivi tad-DNA jqanqlu arrest ta' tkabbir G1 dipendenti p{53-, wara l-espressjoni ta' p21Waf-1/SDI-1/Cip1 (Chen et al. 1998) u senescenza taċ-ċelluli fil-fibroblasti tal-bnedmin normali. Użajna assaġġ tal-kometa biex inkejlu l-ħsara fid-DNA u t-tiswija tagħha. Id-daqs tal-frammenti tad-DNA u n-numru ta 'waqfiet jiddeterminaw il-migrazzjoni u l-mudell tal-kometa li tidher. Il-kontenut tad-DNA tad-denb (prodott tat-tul tad-denb u l-kontenut tad-DNA tad-denb) jiżdied mal-ħsara. Ir-riżultati tagħna juru li t-trattament minn qabel b'echinacoside jista 'jippromwovi parzjalment it-tiswija tal-ħsara fid-DNA, għall-inqas jipproteġi ċ-ċelloli minn leżjonijiet tad-DNA kkawżati minn H2O2 (Fig. 2B). Abbażi ta' dawn il-fatti, nikkonkludu li l-echinacoside għandu attività kontra s-senescence tal-inqas fiċ-ċelloli MRC-5. Ir-riżultati tal-istudju tagħna juru li echinacoside jista 'jnaqqas l-akkumulazzjoni ta' ROS, jipproteġi ċ-ċelloli mill-ħsara fid-DNA, jippromwovi ċelloli MRC-5 mill-fażi G1 fil-fażijiet S u G2, u b'hekk ittejjeb il-proliferazzjoni taċ-ċelloli. B'mod ġenerali, l-effetti ta 'echinacoside fuq ċelluli MRC-5 jistgħu jinqasmu f'żewġ aspetti: biex jippromwovu l-proliferazzjoni taċ-ċelluli u biex titnaqqas l-akkumulazzjoni ta' ROS. Għalkemm il-mekkaniżmu preċiż tas-senescence taċ-ċelluli għadu mhux magħruf u n-netwerk tar-regolamentazzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelluli għadu kontroversjali, urejna li echinacoside jista 'jipproteġi ċ-ċelloli mill-ħsara ossidattiva. Aħna, għalhekk, nispekulaw liechinacosidejista' jkun kandidat tajjeb għar-regolazzjoni tas-senescence, minkejja li l-mekkaniżmu preċiż sottostanti jibqa' kwistjoni miftuħa u għaddejjin aktar studji.

3. Sperimentali

3.1. Kultura taċ-ċelluli u trattament

Linja taċ-ċelluli fibroblastiċi tal-pulmun tal-embriju tal-bniedem MRC{{0}} (Istitut tal-Bijokimika u l-Bijoloġija taċ-Ċelloli, SIBS, CAS) inżammet f'mezz essenzjali minimu modifikat (Gibco/BRL) u supplimentat b'10 fil-mija serum tal-fetu bovin. Iċ-ċelloli MRC-5 jgħaddu minn senescence replikattiva wara passaġġi multipli taċ-ċelluli, evalwati bit-tnaqqis tal-metaboliżmu u l-waqfien tad-diviżjoni fi żmien 7 ijiem. Il-kulturi kollha nżergħu b'densità taċ-ċelluli ta' 104/cm2 sakemm ma jkunx innutat mod ieħor u tħallew jipproliferaw, mhux disturbati, għal 7 ijiem. Diversi konċentrazzjonijiet ta' echinacoside ġew miżjuda 48 siegħa qabel l-eżaminazzjoni b'solvent bħala kontroll sakemm ma jkunx iddikjarat mod ieħor. Il-konċentrazzjoni ta 'DMSO fil-kulturi kienet inqas minn 0.3 fil-mija (v/v). Għat-trattament H2O2, iċ-ċelloli ġew indotti b'250 M H2O2 għal 12-il siegħa.

3.2. Assaġġ tar-rata tas-sopravivenza

Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​u ttrattati b'echinacoside fuq pjanċi ta '96 bir. Qabel l-iskoperta, 10 fil-mija Alamar BlueTM ġie miżjud mal-mezz u inkubat għal 4 sigħat. L-assorbiment kien imkejjel bi spettrofotometru.

3.3. Analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss

Iċ-ċitometrija tal-fluss ġiet introdotta biex tkejjel il-kontenut tad-DNA u l-livelli ta 'ROS intraċellulari bl-użu ta' propidium iodide u DCFH-DA rispettivament. Iċ-ċelloli ġew ibbanjati f'densità ta '105 ċelluli/10 ml soluzzjoni taċ-ċelluli f'platti ta' dijametru ta '100 mm u supplimentati b'echinacoside għal 48 siegħa wara ż-żerriegħa taċ-ċelluli. Wara trattament ta '48 siegħa, iċ-ċelluli ġew maħsuda u maħsula f'PBS wara ċ-ċentrifugazzjoni, imbagħad sospiżi mill-ġdid f'soluzzjoni tal-PBS b'0.1 fil-mija RNase u 50 g/ml propidium iodide jew mezz ta' kultura li kien fih 10 M DCFH-DA għal 30 min. Il-kontenuti tad-DNA jew ROS ġew imbagħad determinati permezz ta 'għażla taċ-ċelluli attivata bil-fluworexxenza FL fuq Sistema ta' Ċitometrija tal-Fluss Beckman Coulter. Id-dejta ġiet analizzata permezz tas-softwer MultiCycle.

3.4. Tbajja ta' Hoechst

Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​u ttrattati b'echinacoside għal 48 siegħa fuq pjanċa ta '96 bir. Il-medju tneħħa, iċ-Ċelloli ġew maħsula b'PBS, imbagħad iffissati b'4 fil-mija formaldehyde f'PBS għal 20 min, segwit bil-ħasil bil-PBS darba, u mtebbgħin b'żebgħa Hoechst għal 10 min. Inqabdu stampi.

3.5. Elettroforeżi tal-ġel b'ċellula waħda (assaġġ tal-kometa)

L-assaġġ tal-kometa sar kif irrappurtat (Olive and Banath 2006). Immaġini tal-kometa individwali ġew analizzati bis-softwer CometScore. Rikonoxximent: Dan ix-xogħol kien appoġġjat finanzjarjament mill-Programm Nazzjonali tar-Riċerka Bażika (Proġett 973) taċ-Ċina (Nru 2007CB507406), il-Fondazzjoni Nazzjonali tax-Xjenza Naturali taċ-Ċina (Nru 30572341), u l-Fond tax-Xjenzi Mediċi Tsinghua-Yue-Yuen (THYY20070008). ).