Flavanols tal-kawkaw tad-dieta jtejbu l-funzjoni mitokondrijali fil-muskoli skeletriċi u jimmodifikaw il-metaboliżmu tal-ġisem kollu fil-ġrieden b'saħħithom

għal aktar informazzjoni, ikkuntattja:tina.xiang@wecistanche.com

Astratt: Disfunzjoni mitokondrijali hija rrappurtata b'mod wiesa 'f'diversi mard u tikkontribwixxi għall-patoġenesi tagħhom. Aħna evalwajna l-effett taflavanols tal-kawkawsupplimentazzjoni fuq il-funzjoni mitokondrijali u l-metaboliżmu kollu, u esplorajna jekk id-deacetylase sirtuin mitokondrijali -3 (Sirt3) hijiex involuta jew le. Esplorajna l-effetti ta '15-il jum ta' supplimentazzjoni CF f'tip selvaġġ u Sirt3-/ġrieden. Il-metaboliżmu tal-ġisem kollu ġie vvalutat b'kalorimetrija indiretta, u sar test ta' tolleranza għall-glukożju orali biex jiġi vvalutatmetaboliżmu tal-glukożju. Il-funzjoni respiratorja mitokondrijali ġiet ivvalutata f'fibri permeabilizzati u l-kontenut tan-nukleotidi tal-piridina (NAD plus u NADH) ġie kkwantifikat. Fit-tip selvaġġ, is-supplimentazzjoni tas-CF immodifikat b'mod sinifikanti l-metaboliżmu tal-ġisem kollu billi ppromwoviet l-użu tal-karboidrati u tejbet it-tolleranza tal-glukożju. Is-supplimentazzjoni CF indotta żieda sinifikanti tal-massa mitokondrijali, filwaqt li seħħ adattament kwalitattiv sinifikanti biex tinżamm il-produzzjoni ta 'H2O2 u stress ossidattiv ċellulari. Is-supplimentazzjoni CF indotta żieda sinifikanti fil-kontenut ta 'NAD plus u NADH. L-effetti kollha msemmija hawn fuq kienu mċappsa fil-ġrieden Sirt3-7. B'mod kollettiv, is-supplimentazzjoni tas-CF taw spinta lill-metaboliżmu NAD li jistimula l-metaboliżmu tas-sirtuins u l-funzjoni mitokondrijali mtejba, li x'aktarx ikkontribwixxa għall-adattament osservat tal-metaboliżmu tal-ġisem kollu, b'kapaċità akbar li tuża karboidrati, tal-inqas parzjalment permezz ta 'Sirt3.

Kliem ewlieni: flavanols tal-kawkaw; Metaboliżmu NAD; massa mitokondrijali; metaboliżmu tal-glukożju; muskolu skeletriku

ikklikkja biex tikseb aktar informazzjoni

1. Introduzzjoni

Il-mitokondrija huma organelli subċellulari li huma involuti f'funzjonijiet ċellulari multipli, bħat-trasduzzjoni tal-enerġija permezz ta' fosforilazzjoni ossidattiva mitokondrijali u fil-produzzjoni tal-perossidu tal-idroġenu mitokondrijali jew attivazzjoni tal-mewt taċ-ċelluli medjata mill-mitokondrija [1-3]. Evidenza emerġenti tissuġġerixxi li disfunzjoni mitokondrijali hija involuta f'ħafna patoloġiji u għandha rwol ċentrali fil-patoġenesi tagħhom [4]. Il-grupp tagħna rrapporta indeboliment mitokondrijali f'pazjenti b'dijabete tat-tip 1 ħafna qabel kumplikazzjonijiet kliniċi [5]. Barra minn hekk, tnaqqis fil-kapaċità ossidattiva mitokondrijali jseħħ mat-tixjiħ anke f'nies b'saħħithom [6]. Għalhekk, identifikazzjonijiet ta 'strateġiji biex itaffu dawn id-disfunzjonijiet jew itejbu l-massa mitokondrijali huma opportunitajiet biex tiġi evitata, jew għall-inqas biex titnaqqas, l-inċidenza ta' ħafna disturbi jew tiżdied il-kapaċità aerobika ta 'suġġetti b'saħħithom.

F'dan il-kuntest, l-identifikazzjoni ta 'komposti sikuri u naturali li jtejbu l-funzjoni mitokondrijali u l-metaboliżmu tal-ġisem kollu bi jew mingħajr effetti sekondarji limitati hija ta' interess. Fost il-komposti naturali,flavanols tal-kawkaw(CF) huma kkunsidrati molekuli promettenti peress li l-konsum tagħhom intwera li jaffettwa b'mod pożittiv is-saħħa kardjovaskulari, ir-reżistenza għall-insulina, jew il-funzjoni immuni [7]. Tabilħaqq, CF intwera li ttejjeb il-metaboliżmu tal-glukożju, u amministrazzjoni għal żmien qasir ta 'CF hija segwita minn żieda fis-sensittività għall-insulina, anke f'pazjenti ipertensivi intolleranti għall-glukożju [8,9].

Fost il-flavanols, (-)-epicatechin (EPI) huwa l-monomeru l-aktar komunement misjub fis-CF, u l-EPI huwa meqjus bħala l-molekula bijodisponibbli u bijoattiva ewlenija tas-CF [10]. Korp konsistenti ta 'evidenza jindika li s-supplimentazzjoni tal-EPI ittejjeb il-funzjoni u/jew il-kontenut mitokondrijali fil-muskolu skeletriku [11]. Is-supplimentazzjoni tal-EPI tistimula mogħdijiet multipli li jikkonverġu fuq il-koattivatur gamma tar-riċettur attivat mill-proliferatur tal-peroxisome 1-alfa (PGCl ) u kumplessi ta' traskrizzjoni nukleari ewlenin. L-EPI jtejjeb direttament il-ġenerazzjoni ta 'ossidu nitriku, li jistimula l-bijoġenesi mitokondrijali [11]. Fl-istess ħin, is-sirtuins 1 u 3 huma wkoll stimulati minn supplimentazzjoni EPI [11]. L-użu ta 'proanthocyanidins, oligomeriċiflavonojdili fihom EPI, intwera li jżid il-livelli intraċellulari ta' nicotinamide adenine dinucleotide(NAD plus ) permezz taż-żieda ta' diversi prekursuri għal NADbiosynthesis u jirregolaw il-livelli ta' sirtuin-1 mRNA fil-fwied tal-firien [12]. Il-familja tas-sirtuin (Sirt), deacetylase dipendenti fuq NAD, tinkludi seba 'membri li huma differenti mid-distribuzzjoni subċellulari tagħhom, l-ispeċifiċità tas-sottostrat, u l-funzjonijiet ċellulari [13]. Sirt1, membru studjat b'mod estensiv ta 'din il-familja, jistimula l-bijoġenesi mitokondrijali billi jippromwovi d-deacetylation ta' PGCl, u b'hekk isaħħaħ l-attività traskrizzjoni tiegħu [14]. Sirte, sensor metaboliku ewlieni, ġie stimulat wara l-amministrazzjoni tal-EPI [12,15-17]. Madankollu, l-influwenza ta 'EPI fuq sirtuini oħra ma ġietx esplorata. Il-valutazzjoni tal-effett EPI se tkun partikolarment interessanti fuq sirtuins li jinsabu fil-mitokondrija (Sirt3, Sirt 4, u Sirt5), li huma magħrufa li jimmodulaw l-attività taċ-ċiklu Krebs u l-enzimi tal-katina respiratorja [18]. Sirt3, li huwa espress ħafna f'tessuti b'fatturat metaboliku għoli u kontenut mitokondrijali, huwa ta' interess partikolari fir-rigward tar-rwol kritiku tiegħu fiż-żamma tal-funzjoni mitokondrijali normali permezz ta' deacetylation riversibbli tal-proteina lisina [19-21] Barra minn hekk, Sirt3 għandu rwol importanti fil- regolazzjoni tal-metaboliżmu tal-ġisem kollu [20. Sirt3 intwera li jinbidel fil-muskoli skeletriċi ta 'mudelli ta' dijabete tat-tip 1 u 2 u mard kardjovaskulari [22,23]. Barra minn hekk, ġie ssuġġerit li l-attivazzjoni ta 'Sirt3 tista' tirrappreżenta strateġija terapewtika promettenti għat-titjib tal-funzjoni u l-metaboliżmu mitokondrijali [23,24]. Għalhekk, huwa ta 'interess li jiġi ddeterminat jekk Sirt3 huwa l-bażi ta' parti mill-effetti ta 'benefiċċju tas-supplimentazzjoni tas-CF fuq il-metaboliżmu tal-ġisem kollu u l-funzjoni mitokondrijali.

F'dan l-istudju, użajna approċċ integrattiv biex ninvestigaw, fil-ġrieden, l-effett ta' supplimentazzjoni ta' 15-ġurnata CF. Aħna ipoteżijna li s-supplimentazzjoni tas-CF kienet: (i) timmodifika l-metaboliżmu tal-ġisem kollu umetaboliżmu tal-glukożju, (ii) iżidu l-funzjoni mitokondrijali fil-muskoli ossidattivi u glikolitiċi f'fibri permeabilizzati, u (ii) jagħtu spinta lill-metaboliżmu NAD. Esplorajna wkoll l-involviment putattiv ta 'Sirt3 fil-bijoġenesi mitokondrijali indotta minn CF u l-metaboliżmu tal-ġisem kollu. L-ipoteżijiet tagħna kienu li l-effetti tas-CF fuq il-metaboliżmu tal-ġisem kollu u l-massa mitokondrijali kienu se jitnaqqsu fil-ġrieden Sirt3-7.

2. Metodi

2.1. Annimali u Dieta

Għal dan l-istudju, 129S1/SvlmJ 10-ġrieden maskili ta’ ġimgħa nxtraw minn Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA). Biex niddeterminaw jekk is-sirtuins humiex involuti fil-massa mitokondrijali indotta mill-amministrazzjoni tas-CF u fl-adattament tal-funzjoni, użajna wkoll 10-ġrieden maskili knock-out Sirt3 ta’ ġimgħa ta’ ġim kollu fuq l-istess razza bħal wild-type [25]. Is-Sirt3/ġrieden intużaw biex jesploraw l-involviment ta 'Sirt3 f'bijoġenesi mitokondrijali indotta minn CF u adattamenti tal-metaboliżmu tal-ġisem kollu. Il-ġrieden inżammu f'kamra f'temperatura regolata ta' 23-25 grad u dawl ikkontrollat ​​(12-h ċikli ta' dawl u dlam). L-annimali kellhom aċċess għal chow tal-gerriema u ilma tal-vit ad libitum.

Wara mill-inqas ġimgħa ta 'drawwa fil-faċilità tal-annimali, annimali sperimentali rċevew supplimentazzjoni CF permezz ta' gavage orali ta 'estratt naturali (302.1 mg/kg piż tal-ġisem darbtejn kuljum għal 15-il jum) sospiż mill-ġdid f'karbossimetilċelluloża (Sigma-Aldrich, St. Louis , Mo, l-Istati Uniti). Il-kompożizzjoni tat-trab tal-kawkaw hija deskritta fit-Tabella 1 u nkisbet minn Naturex (Quart de Poblet, Spanja). Il-kompożizzjoni ġiet stabbilita bil-metodu ta 'kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja u 100 mg tal-estratt huwa ekwivalenti għal medja ta '475 mg ta' żerriegħa tal-kawkaw niexfa. Il-ġrieden ta 'kontroll irċevew vettura komposta minn kontenut simili ta' theobromine u kaffeina maħlula f'carboxymethylcellulose permezz ta 'gavage orali. Id-doża ta 'kuljum ġiet determinata skont il-gwida tal-industrija li tikkonverti d-doża umana għal dożi ekwivalenti għall-annimali bbażati fuq l-erja tas-superfiċje tal-ġisem, u aħna mmultiplikajna d-doża umana bi 12.3 [26]. Il-gavage orali sar minn tekniku b'esperjenza.

2.2. Ġbir tat-Tessuti1

Erbgħa u għoxrin siegħa wara l-aħħar gavage orali, annimali mhux sawm ġew anestetizzati bl-użu ta 'ketamine u xylazine (rispettivament: 100 u 10 mg/kg). Il-ġbir tat-tessuti sar immedjatament wara li nkisbet l-anestesija. Is-soleus u l-porzjon abjad tal-gastroknemius tneħħew. Il-kampjuni jew ġew iffriżati immedjatament fin-nitroġenu likwidu u maħżuna fi grad-80 għal analiżi sussegwenti jew użati biex jippreparaw fibri tal-muskoli mqaxxra.

2.3. Valutazzjonijiet tal-Attività Metabolika u Fiżika

Il-kalorimetrija indiretta u l-attività fiżika spontanja tkejlu bl-użu tas-Sistema Komprensiva tal-Monitoraġġ tal-Annimali tal-Laboratorju (CLAMS; Columbus Instruments, Columbus, OH, USA). Il-ġrieden kienu miżmuma individwalment fil-kmamar fi 28 grad, b'dawl minn 07h00 sa 1900 u aċċess ad libitum għal annimali gerriema u ilma tal-vit. Il-ġrieden ġew akklimatizzati mal-gaġeġ metaboliċi għal tlett ijiem qabel l-ewwel jum tal-ġbir tad-dejta. Il-ġbir tad-dejta sar fil-ħmistax-il jum tas-supplimentazzjoni. Il-konsum tal-ossiġnu (VO2), il-produzzjoni tad-dijossidu tal-karbonju (VCO2), u l-proporzjon tal-iskambju respiratorju (RER) tkejlu bi fluss tal-arja ta’ 0.5 L/min u kampjun ta’ arja ta’ 0.4 L/ min. Perċentwali ta' frekwenza kumulattiva relattiva (PCRF) ta' RER ġiet determinata fuq perjodu ta' 24-h kif deskritt qabel minn Riachi et al. (2004). Fil-qosor, PCRF kien determinat biż-żieda tal-frekwenza ta 'kull punt tad-dejta mas-sekwenza ta' inkrement preċedenti (minn 0.65 għal 1.20 b'inkrement ta '0.01)[27]. Il-flessibilità metabolika kienet determinata mill-inklinazzjoni Hill (valur H) u l-50 perċentil (EC50) tal-kurva PRCF u billi tkejjel l-amplitudni RER fuq 24 siegħa (Riachi et al.2004). L-attività fiżika ġenerali ġiet immonitorjata bl-użu ta 'sistema ta' sensorju mħaddma bir-raġġ infra-aħmar li sabet attività tal-assi x u z. Kienu vvalutati kemm l-għadd totali (kull darba li jitkisser raġġ) kif ukoll l-għadd ambulatorju (kull darba li jitkisser travu ġdid). Għadd ta' X-total (X-TOT) huwa rreġistrat meta l-annimal jiċċaqlaq orizzontalment aktar minn 0.5 pulzieri u huwa rappreżentattiv ta' attivitajiet ripetittivi fuq skala żgħira, bħall-grif u l-grooming. L-għadd X-ambulatorju (X-AMB) ikejjel il-lokomozzjoni attwali billi jirreġistra għadd biss meta l-annimal ikisser raġġ ġdid. Għadd Z-total (Z-TOT) huwa rreġistrat meta jseħħ 1.5 pulzieri ta' moviment vertikali, jiġifieri, trobbija (Abreu-Vieira 2016). Għall-istima ta 'karboidrati u xaħamossidazzjoniminn VO2 u VCO2, użajna t-tabella tal-kwozjent respiratorju nonprotein minn Péronnet u Massicotte li qabel kienet użata fil-ġrieden [28,29].

2.4. Massa totali tal-ġisem u tax-xaħam

Il-massa tax-xaħam totali u l-massa dgħif totali ġew determinati fi ġrieden mhux anestetizzati permezz ta 'analiżi kwantitattiva ta' interferenza ta 'reżonanza bl-użu tal-analizzatur ta' reżonanza manjetika EchoMRI tal-ġisem kollu (Echo Medical System, Houston, TX, USA). Il-massa tax-xaħam totali tirrappreżenta s-somma tax-xaħam kollu fil-ġisem. Il-massa dgħif totali kienet tinkludi prinċipalment il-muskoli u l-organi ta’ ġewwa. Il-massa tal-muskoli skeletriċi hija magħrufa li tirrappreżenta l-akbar porzjon tal-massa dgħif totali.

2.5.Test ta' Tolleranza għall-Glukożju Orali (OGTT)

Il-gliċemija tkejjel bl-użu ta’ qatra demm miġbura mid-denb b’glukometru (Accu-Chek Performa, Roche, Arġentina). OGTT sar fuq ġrieden li kienu sajmin għal 5 sa 6 sigħat. Il-kejl sar fl-aħħar jum tas-supplimentazzjoni tas-CF. Wara l-kejl tal-gliċemija bażali (ħin O), il-ġrieden ġew imbagħad injettati per os b'soluzzjoni ta '20 fil-mija glukożju f'ilma sterili f'doża ta' 1.5 g glukożju·kg piż tal-ġisem-1. Il-gliċemija ġiet imkejla fi 15, 30, 60,90, u 120 min wara l-injezzjoni tas-soluzzjoni tal-glukożju. L-erja inkrementali tal-kurva tal-glukożju mbagħad ġiet ikkalkulata bħala kejl tat-tolleranza tal-glukożju.

2.6.Analiżi qRT-PCR

The forward (F) and reverse (R) primers of the selected genes used in this study are presented in Table 2. Total RNA was obtained from pulverized frozen white gastrocnemius muscle using Trizol reagent (Invitrogen Life Technologies, Rockville, MD, USA). The purity, integrity, and quantity of RNA were evaluated using a microplate reader (Synergy H1(Biotek Instruments, Winooski, Vermont). The sample was considered pure when the ratio OD260/OD280 was>1.8. cDNA ġie sintetizzat minn RNA totali (2 μL) bl-użu tas-supermix ta' traskrizzjoni inversa iScript għal RT-qPCR (Biorad, Hercules, CA, USA). Il-prodotti RT totali ġew analizzati permezz ta 'reazzjoni kwantitattiva tal-katina tal-polimerażi (PCR) bl-użu ta' 2x Platinium SYBR Green qPCR SuperMix-UDG skont l-ispeċifikazzjonijiet tal-manifattur (Invitrogen Lige Technologies, Burlington, Canada). Iċ-ċikliżmu nkiseb f'ċiklatur CFX96 (Biorad, Hercules, California; kundizzjonijiet: 95 grad C għal 10 min u 40 ċiklu ta '95 grad għal 30 s, 55 grad għal 45 s u 72 grad għal 45 s). Fl-aħħar ta 'kull ġirja, in-nuqqas ta' formazzjoni ta 'primer-dimer u l-preżenza ta' amplicon uniku ġew ikkonfermati bl-użu tal-kurva tat-tidwib. Il-valuri tal-limitu taċ-ċiklu(Ct) intużaw wara l-metodu 2-A△Ct biex janalizzaw id-dejta tal-qPCR, jew b'ß-Actin jew HPRT1 bħala ġene tad-dar【30】. Il-valuri kwantitattivi RT-PCR kienu relatati ma 'dawk tal-grupp ta' kontroll, li ġew issettjati għal 1.

2.7. Attivitajiet ta' Enżimi

Il-kejl tal-attività speċifika tal-kumplessi tal-katina tat-trasport tal-elettroni u citrate synthase sar spettrofotometrikament kif deskritt qabel [31]. Muskoli gastrocnemius bojod iffriżati pulverizzati (~ 30 mg) ġew omoġenizzati b'omoġenizzatur tal-mikrobead li jivvibra f'500 uL ta 'buffer ta' omoġenizzazzjoni (120 mM KCl, 20 mM ta 'HEPES, 2mM ta' MgCl2,1 mM ta 'EGTA, u 5 mg · mL-Iof BSA , pH7.4) segwit biż-żieda ta '500 μL ta' midja ipotonika (25 mM fosfat tal-potassju u 5 mM MgCl, pH 7.2). Il-kampjuni mbagħad ġew sottomessi għal tliet rawnds taċ-ċikli tal-iffriżar u t-tidwib fin-nitroġenu likwidu. Il-kampjuni ġew ċentrifugati għal 10 min f'600 × g f'4 gradi, u s-supernatant inżamm fuq is-silġ sakemm l-analiżi. Il-kontenut tal-proteina ġie ddeterminat fis-supernatant fi tliet kopji bl-użu ta’ Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

L-attività ta' citrate synthase (CS) ġiet determinata spettrofotometrikament f'412 nm wara t-tnaqqis ta' 2 mM 5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) fil-preżenza ta' 0.1 mM acetyl -CoA u 12 mM ta 'aċidu ossaloketiku f'200 mM Tris buffer (pH 7.4). L-assaġġ NADH-decylubiquinone oxidoreductase(kumpless I) sensittiv għar-rotenone sar f'340 nm bl-użu tal-aċċettatur 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-n-decyl-14-benzoquinone （ 80 μM） u NADH bħala donatur ta 'elettroni (200 μM) f'10 mM Tris buffer (pH 8.0). Iż-żieda ta '4μM ta' rotenone intużat biex tikkwantifika l-attività sensittiva għar-rotenone. L-attività taċ-cytochrome oxidase (kumpless IV) twettqet f'550 nm bl-użu ta 'ċitokromu ċ imnaqqas 10μM bħala donatur u 2.5 mM ta' n-dodecyl-ß-maltoside biex jippermeabilizza ż-żewġ membrani mitokondrijali f'100 mM buffer tal-potassju (fosfat tal-potassju.70).

L-assaġġi kollha tal-enżimi ġew determinati fi tliet kopji, u r-riżultati kienu relatati ma 'dawk tal-grupp ta' kontroll, li ġew issettjati għal 100.

2.8. Valutazzjoni Mitokondrijali

Ir-respirazzjoni mitokondrijali u l-produzzjoni ta' H2O2 mitokondrijali ġew studjati in situ f'fibri permeabilizzati saponin bl-użu ta' muskoli bojod gastrocnemius u soleus|1]. Fil-qosor, il-fibri ġew separati taħt il-mikroskopju binokulari f'soluzzjoni A f'4 gradi (f'mM:2.77 CaK2 EGTA,7.23 K, EGTA,6.56 MgCl2, 20 taurini,0.5 DTT,5{ {50}} K-methane sulfonates, 20 imidazoles, 5.7 Na2 ATP u 15 creatine-phosphate, pH 7.1) u permeabilizzati f'soluzzjoni A b'50 ug·mL-Iof saponin għal 30 min f'4 gradi. Il-funzjoni respiratorja mitokondrijali ġiet iddeterminata f'ossimetru mgħammar b'elettrodu tat-tip Clark (Oxygraph, Hansatech Instruments, Glasgow). Il-kamra kienet mimlija b'1 mL ta' Soluzzjoni B (f'mM:2.77 CaK, EGTA, 7.23 K, EGTA,6.56 MgCl,, 20 taurine, 0.5 DTT, 50 K-methane sulfonates, u 20 imidazoles, pH 7.1) u wara r-reġistrazzjoni kontenut ta' ossiġnu tal-linja bażi fil-kamra, mazz wieħed ta' 1-2 mg piż xott ta' myofibres permeabilizzati tpoġġa fil-kamra, li mbagħad ġiet issiġillata magħluqa. Wara l-qari tal-linja bażi, saru ż-żidiet li ġejjin b'mod sekwenzjali: palmitoyl carnitine u malate (160 μM∶5 mM), glutamate (10 mM), succinate (25 mM), rotenone (0.5 μm), the uncouple (0.5 μm), the uncouple (CCM), 1 μM. -A （8 uM）, u N, N', N'-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride u ascorbate (0.9:9 mM). Ir-respirazzjoni kienet imkejla fi 23 grad taħt tħawwad kontinwu. Fl-aħħar ta 'kull test, il-fibri tneħħew bir-reqqa miċ-ċellula xylografika, imnixxfa, u mnixxfa mill-inqas 24 siegħa f'~80C għad-determinazzjoni tal-piż tal-fibra. Ir-rati ta' konsum ta' O2 (JO2) ġew espressi f'nmol O2 min-1.(mg piż xott)-I. Il-kejl kollu sar mill-inqas f'żewġ kopji.

Ir-rilaxx nett ta 'H2O2 minn mitokondrija respiring tkejjel f'qatet ta' fibri permeabilizzati bis-sonda fluworexxenti Amplex Red（20 μM∶emissjoni-eċċitazzjoni∶563-587 nm), kif deskritt qabel [32]. Wara t-tħejjija ta' fibri permeabilizzati, kampjuni

destinati għall-kejl ta' H2O2 ġew laħlaħ tliet darbiet f'buffer Z(f'mM:110 K-Mes, 35 KCl,1 EGTA,5 K2HPO4, 3MgCl,6H2O, u 0.5 mg:mL{{ {14}} BSA, pH7.3 f'4 gradi). Gzuz tal-fibra ({{20}}.3-1.0 mg piż xott) ġew inkubati f'37 grad f'mikrokuvette tal-kwarz b'taħwid manjetiku kontinwu f'600 uL ta' buffer Z (pH 7.3 f'37C) supplimentat b'1.2 U·mL-I horseradish peroxidase. Il-qari tal-fluworexxenza tal-linja bażi ttieħed fin-nuqqas ta' xi substrati respiratorji eżoġeni. Iż-żidiet li ġejjin imbagħad saru sekwenzjali: glutamate (5 mM), succinate (5 mM), rotenone (0.5 uM), ADP (10 mM), u antimycin-A (8 μM). Fl-aħħar ta 'kull test, il-fibri kienu jitneħħa bir-reqqa mill-cuvette, imħassar, u mnixxef biex jiġi ddeterminat il-piż tal-fibra. Ir-rati ta' produzzjoni ta' H2O2 kienu espressi f'AU·min-1.(mg piż xott)-I u għal kull kapaċità ta' oxphos li tikkorrispondi għar-respirazzjoni mitokondrijali massima taħt stat ta' fosforilazzjoni. Il-kejl kollu sar mill-inqas f'żewġ kopji.

Il-kapaċità ta 'ritenzjoni tal-kalċju mitokondrijali (CRC) ġiet ivvalutata f'fibri ghost bojod tal-muskolu gastrocnemius kif deskritt qabel [33]. Fil-qosor, il-fibri ġew inkubati f'microcuvette tal-kwarz taħt taħwid kontinwu f'600 μL ta 'buffer CRC (f'mM∶250 sukrożju, 10 MOPS, 0.005 EGTA, u 10P;-Tris, pH7.3). Il-fibri mbagħad ġew esposti għal polz wieħed ta' 20 nM ta' Ca2 plus. Bidliet fil-konċentrazzjoni tal-kalċju ekstramitokondrijali ġew immonitorjati b'mod fluworometriku bl-użu ta' Calcium green 5N (1 mM: emissjoni-eċċitazzjoni:505-535 nm). Is-suxxettibilità tal-pori tat-tranżizzjoni tal-permeabilità (PTP) ġiet evalwata billi tkejjel il-ħin meħtieġ għall-ftuħ tal-PTP, u CRC ttieħed bħala l-ammont totali ta 'Ca' akkumulat mill-mitokondrija qabel ir-rilaxx tiegħu. Fl-aħħar ta 'kull test, il-fibri tneħħew bir-reqqa mill-kuvette, imblukkati, u mnixxfa biex jiġi ddeterminat il-piż tal-fibra. Il-valuri CRC kienu espressi f'nM ta' Ca2 flimkien ma' kull mg ta' piż xott.

2.9. Analiżi Western Blot

Proteini mill-muskoli bojod gastrocnemius u soleus ġew dilwiti f'Laemmli buffer u separati fuq Mini-PROTEAN TGX Stain-Free 10 fil-mija ġels tal-poliakrilamide precast (Biorad); standard intern kien mgħobbi fuq kull ġel. Is-separazzjoni elettroforetika saret f'200 V għal 35 min fil-buffer tal-migrazzjoni (25 mM TrisBase, 0.2 M glycine, u 1 fil-mija SDS (p/v)). It-teknoloġija Stain-Free(SF) fiha kompost tri halo proprjetarju li jirreaġixxi mal-proteini, u jagħmilhom jinstabu permezz ta 'espożizzjoni UV. L-immaġini SF twettqu bl-użu tas-softwer ChemiDoc MP Imager u Image Lab4.0.1 (Biorad, Hercules, California, USA)b'ħin ta' attivazzjoni tat-tebgħa 5-min, u l-mudelli tal-proteini totali ġew għalhekk viżwalizzati. Proteini mbagħad ġew trasferiti fuq folja ta 'nitrocellulose 0.2 um bl-użu tas-Sistema ta' Trasferiment Trans-Blot Turbo (Biorad). Il-kwalità tat-trasferiment kienet ikkontrollata minn membrani tal-immaġini bl-użu tat-teknoloġija SF. Wara l-pass tat-trasferiment, il-proteini tal-karbonil ġew derivatizzati b'dinitrophenylhydrazine dilwit f'2N HCL u finalment ġew maħsula b'mod estensiv bil-metanol. Il-membrani ġew imblukkati b'5 fil-mija ħalib niexef bla xaħam f'salina b'Tris-buffered li fih Tween-20 (TBST: 15 mM Tris/HCl, pH7.6,140 mM NaCl, u 0.05 fil-mija Tween-20) għal 1 siegħa f'temperatura tal-kamra. Membrani mbagħad ġew inkubati fi gradi 4 matul il-lejl jew 2 sigħat f'temperatura tal-kamra bl-antikorpi primarji li ġejjin: proteina karbonil antikorp primarju (Anti-DNP; #STA-308, Cell Biolabs) u SOD2 (#Ab13533, Abcam). Wara tliet ħasliet ta' 10 min f'TBST, il-membrani ġew ittestjati b'antikorpi sekondarji għall-proteina karbonil (HRP-conjugate; #STA-308, Cell Biolabs) u SOD2 (anti-fenek IgG-HRP konness; #7074, Cell Signalling) f'soluzzjoni ta 'imblukkar għal 2 sigħat f'temperatura tal-kamra u finalment ġew maħsula b'mod estensiv bit-TBST. Id-dilwizzjoni tal-antikorpi primarji u sekondarji ġiet ottimizzata għal kull antikorp. L-iskoperta tal-kimiluminixxenza twettqet bl-użu ta 'ECL Clarity (Biorad), u l-qbid ta' l-immaġini sar b'ChemiDocMP. L-immaġini kollha ġew analizzati bl-użu tas-softwer Image Lab 4.0.1. In-normalizzazzjoni tal-intensitajiet tas-sinjali tal-proteini twettqet wara l-kwantifikazzjoni tal-livelli rispettivi tal-proteini totali fuq immaġini SF, kontroll tal-kampjuni u standards interni.

2.10. Kejl NAD

Il-livelli totali ta' NAD u NADH tkejlu f'gastroknemius abjad omoġenizzat bl-użu ta' kit kummerċjali (#K337-100, Biovision, USA) u wara l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Fil-qosor, il-ġabra totali ta 'NAD (NADt= NADt u NADH) ġiet estratta. Għal kull wieħed mill-kampjuni estratti, nofs il-kampjun kien imsaħħan għal 60 grad għal 30min biex jiddekomponi NADt filwaqt li nżamm NADH intatt. Iż-żewġ kampjuni NADt u NADH tħalltu ma 'enzima taċ-ċikliżmu NAD, u l-assorbiment tkejjel f'450nm. NADt u NADH ġew ikkwantifikati billi tqabbel mal-kurva standard NADH u nnormalizzaw għal mg ta 'proteina. Fl-aħħarnett, il-proporzjon ta 'NAD plus (NADt-NADH) għal NADH ġie kkalkulat. L-assaġġi kollha saru fi tliet kopji.

2.11. Statistika

Id-dejta hija rrappurtata bħala medja ± devjazzjoni standard (SD). In-normalità tad-dejta ġiet evalwata bl-użu tat-test tan-normalità D'Agostino-Pearson. L-analiżi tad-dejta saret bl-użu tat-test t tal-Istudent u l-ANOVA f'żewġ direzzjonijiet (grupp u ħin) għal kejl ripetut segwit mit-test post hoc ta 'Bonferroni bl-użu ta' Prism8.4.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Ġie applikat livell fuq żewġ naħat ta' 5 fil-mija għal żball tat-tip I.

3. Riżultati

3.1. Kompożizzjoni tal-Ġisem u Metaboliżmu tal-Ġisem sħiħ

Ħmistax-il jum ta' supplimentazzjoni tas-CF, fi ġrieden tat-tip selvaġġ(WT), ma mmodifikax il-piż tal-ġisem (p=0.091), massa dgħif (p=0.{{24} }73)u l-massa tax-xaħam evalwata mill-EchoMRI (p=0.89;Figura 1A). Ir-rati ta' konsum ta' O2 espressi għal kull massa dgħif kienu ogħla b'mod sinifikanti fiċ-ċiklu tad-dlam (8±8 fil-mija , p=0.042), filwaqt li baqgħu simili fiċ-ċiklu tad-dawl (p =0 .392; Figura 1B.). Ma kien hemm l-ebda tibdil fl-attività lokomotriċi (dejta mhux murija). Il-ġrieden CF wrew żieda sinifikanti fin-nefqa tal-enerġija tal-ġisem kollu bi 15±15 fil-mija (p =0.042;Figura 1C) u f' teħid ta 'ikel(0.08±0.01 vs.0.11±0.01 g għal kull piż tal-ġisem dgħif, rispettivament grupp CF u WT, p=0.013, Figura 1D).

Is-supplimentazzjoni tas-CF immodifikat b'mod sinifikanti l-metaboliżmu tal-ġisem kollu: l-effett ewlieni ta' RER ogħla fil-grupp CF kien osservat fuq 24 siegħa (p=0.023, Figura 2A) u RER medju fuq 12-il siegħa kien ogħla fil-grupp CF f'ċikli tad-dawl u tad-dlam( flimkien ma' 5±3 fil-mija, p=0.035 u flimkien ma' 9±4 fil-mija, rispettivament, p=0.026). Barra minn hekk, is-supplimentazzjoni tas-CF ippromwoviet l-użu tal-karboidrati (CHO)(51± 13 fil-mija tal-konsum tal-enerġija tiddependi fuq l-ossidazzjoni tas-CHO fil-grupp CF vs.37 ±12 fil-mija fil-grupp ta 'kontroll matul iċ-ċiklu tad-dawl, p=0.108 u 71±21 fil-mija fil-grupp CF vs.47±24 fil-mija fil-grupp ta 'kontroll matul iċ-ċiklu dlam, p=0.004; Figura 2B.). Madankollu, meta espress f'kJ, ma kien hemm l-ebda differenza fl-ossidazzjoni tas-CHO u lanqas fl-ossidazzjoni tal-aċidu xaħmi (CHOossidazzjoni: 3.7±1.4 kcal·d-1 fil-kontroll vs.4.4±1.7 kcal.massa tal-ġisem dgħif-1. d-1 f'CF,p=0.33 u ossidazzjoni tal-aċidu xaħmi: 2.3± 1.0 kcal·d-Iin kontroll vs.2.6±0.87 kcal.massa tal-ġisem dgħif-1.d{{ 50}}f'CF,p=0.608).Analiżi ta' PRCF ta' RER żvelat żieda fil-valuri EC50 fil-grupp CF (p=0,009; Figura 2D) li jfisser li CF jinduċi bidla lejn użu akbar ta’ karboidrati. Tnaqqis fl-inklinazzjoni tal-Hill kien osservat fil-grupp CF (valuri H: 25.16±4.44 fil-kontrolli vs.12.79±3.96 fil-grupp CF,p<0.001). moreover,="" the="" rer="" amplitude="" over="" 24h="" was="" increased="" by="" 31±="" 31%="" in="" the="" cf="" group="" (p="0.035)." cf="" supplementation="" improved="" glucose="" tolerance="" following="" oral="" glucose="" administration="" from="" unchanged="" baseline="" blood="" glucose="" levels="" after="" an="" overnight="" fast="" (figure="" 2e,p="0.003)." the="" area="" under="" the="" capillary="" blood="" glucose="" curve="" was="" lower="" in="" the="" cf="" group(1018±135="" vs.="" 1181±="" 170="" mm·120="" min,="" p="0.005;" figure="">

3.2. Bijoenerġetika Mitokondrijali

Aħna ttestjajna l-effett tas-supplimentazzjoni tas-CF fuq l-enerġija tal-mitokondrija fil-muskolu gastrocnemius abjad u soleus fil-ġrieden WT. Ġiet osservata respirazzjoni mitokondrijali ogħla bl-użu ta 'sottostrati IV kumplessi fil-muskoli abjad tal-gastroknemius u tas-soleus (p=0.004 u p=0.028, rispettivament; Figura 3A, B). Ma ġiet osservata l-ebda modifika tal-proporzjonijiet ta' respirazzjoni CII/CI u CIV/CI (p =0.899 u p =0.701 għall-gastroknemius abjad u p=0.693 u p{{{ 11}}.912 għall-muskoli tas-soleus, rispettivament, data mhux murija). Barra minn hekk, l-attivitajiet kumplessi, I, IV, u citrate synthase żdiedu b'mod sinifikanti fil-muskolu gastroknemius abjad (rispettivament: flimkien ma' 31 ± 27 fil-mija ,p=0.004; flimkien ma' 28 ± 38 fil-mija ,p=0 .027; plus 35±38 fil-mija ,p= 0.009; plus 14±13 fil-mija ,p{=0.040;Figura 3C).Il-ħila tal-mitokondrija li jossidaw palmitoyl-carnitine għandha t-tendenza li tiżdied f' il-gastroknemius abjad ( plus 24±12 fil-mija ,p =0.096; Figura 3D), filwaqt li ma ġiet osservata ebda differenza fis-soleus (p =0.363). Ir-rati relattivi ta 'respirazzjoni stimulata bil-palmitoyl-carnitine ma nbidlux meta espressi f'funzjoni ta' respirazzjoni kumplessa I (62±11 fil-grupp ta 'kontroll vs.64±20 fil-grupp CF fil-gastrocnemius abjad u 70 ± 18 vs.72± 16 fis-soleus). Sussegwentement, esplorajna s-sensittività għall-ftuħ tal-PTP indott minn Ca plus fil-gastroknemius abjad. Kif muri fil-Figura 3E, la l-ħin għall-ftuħ tal-PTP u lanqas il-kapaċità ta 'żamma ta' Ca² ma ġew modifikati wara s-supplimentazzjoni tas-CF (p=0.608 u p=0.943, rispettivament).

Il-valutazzjoni tal-mRNA tal-ġeni involuti fil-bijoġenesi mitokondrijali wriet upregulation ta '70 fil-mija tal-mRNA NRF1, filwaqt li ma ġiet irrappurtata ebda differenza għal PGCl, Tfam, CS, ND1, ND2, SDHa u Cox2 (Tabella 3). Esplorajna, fuq ftit kampjuni, l-effett tas-supplimentazzjoni tas-CF fuq superkumplessi mitokondrijali (Figura S1, Materjali Supplimentari). L-analiżi densitometrika tissuġġerixxi li s-supplimentazzjoni tas-CF żiedet il-kontenut ġenerali tas-superkumplessi mingħajr adattament kwalitattiv jew arranġamenti mill-ġdid. Tabilħaqq, id-densità respiratorja tjiebet bi 58 fil-mija bl-użu ta 'sondi kumplessi I u complexⅡ u b'93 fil-mija bl-użu ta' sonda kumplessa I. Bl-istess mod, il-kontenut kumpless I u kumpless III inkorporat f'superkumplessi kienu ogħla fil-grupp CF.

Is-supplimentazzjoni tas-CF tnaqqas l-emissjoni ta 'ROS mitokondrijali. Filwaqt li l-emissjoni H2O2 baqgħet mhux mibdula kemm fil-gastrocnemius abjad kif ukoll fis-soleus meta espressa għal kull piż xott (Figura 4A, B, rispettivament), ir-rati naqsu meta espressi għal kull kontenut mitokondrijali (Figura 4C). Effett pożittiv ewlieni tas-supplimentazzjoni tas-CF kien osservat f’diversi kundizzjonijiet fil-gastroknemius abjad (p<0.048; figure="" 4c).="" the="" mitochondrial="" h2o2="" emission="" was="" also="" significantly="" reduced="" when="" expressed="" peroxidative="" phosphorylation="" capacity="" assessed="" by="" state="" 4="" respiration="" using="" complex="" i+ii="" substrates="" by="" 26±13%="" in="" the="" white="" gastrocnemius="" (p="0.044)and" by="" 29±12%="" in="" the="" soleus(p="0.024;" figure="">

3.3. Markers ta' Stress Ossidattiv fil-Muskoli Skeletriċi

Il-livell ta 'stress ossidattiv tal-proteini ċellulari fil-ġrieden WT ma kienx affettwat mis-supplimentazzjoni tas-CF peress li l-kontenut ċellulari ta' SOD2 kien simili fil-gruppi sperimentali u ta 'kontroll fil-gastrocnemius abjad u s-soleus (Figura 4E). Barra minn hekk, ma ġiet osservata l-ebda differenza fil-karbonilazzjoni tal-proteini fil-gastrocnemius abjad u s-soleus (Figura 4F). Barra minn hekk, l-ebda differenza fl-espressjoni tal-mRNA catalase u MnSod ma ġiet osservata wara supplimentazzjoni CF (Tabella 3).

3.4.NAD Metaboliżmu

Il-ġabra totali ta 'nukleotidi tal-piridina żdiedet wara s-supplimentazzjoni tas-CF b'36±33 fil-mija (p=0.012). Speċifikament, il-kontenuti ta' NAD u NADH żdiedu fil-gastroknemius abjad (rispettivament b'69±60 fil-mija, p{{6). }}.026 u 29± 42 fil-mija ,p=0.017;Figura 5A,B)u l-proporzjon NAD plus /NADH kellhom it-tendenza li jiżdiedu fil-grupp CF (p =0.084).Le. ġie osservat effett sinifikanti għal Sirt3 mRNA (p=0.096), NMNAT mRNA (p=0.094), u Sirt1 mRNA (p =0.869; Tabella 3 ).

3.5. Rispons tal-Metaboliżmu tal-Ġisem kollu u Ċellulari Wara Supplimentazzjoni tas-CF f'Sirt3-/ Ġrieden

Aħna eżaminajna l-effett tas-supplimentazzjoni tas-CF fil-ġrieden Sirt{{0}}. Il-kompożizzjoni tal-ġisem bħala piż, massa dgħif, u massa tax-xaħam ma kinux differenti bejn is-CF u l-gruppi ta' kontroll (p= 0.52,p=0.66,p=0.45,rispettivament; Figura 6A). Bl-istess mod, in-nefqa ta' kuljum tal-enerġija ma kinitx affettwata minn supplimentazzjoni tas-CF ({{10}}.38±0.{{4{0}}1 Kcal.lean body massa-1.jum-1 fil-kontrolli vs. 0.39 ± 0.01 Kcal·massa tal-ġisem dgħif-1.jum-1 f'CF, p=0.502; Figura 6B). Ir-RER kien simili bejn iż-żewġ gruppi fiċ-ċikli tad-dawl u tad-dlam (p=0.301; Figura 6C), u l-ossidazzjoni tas-sottostrat ma kinitx affettwata minn supplimentazzjoni tas-CF (44 ± 17 fil-mija tal-konsum tal-enerġija tiddependi fuq l-ossidazzjoni tas-CHO fil- grupp ta 'kontroll vs. 50 ± 11 fil-mija fil-grupp CF matul il-fażi tad-dawl, p=0.209 u 65±19 fil-mija fil-grupp ta' kontroll vs.77±21 fil-mija fil-grupp CF matul il-fażi mudlama, p=0.395; Figura 6D). Il-flessibbiltà metabolika vvalutata mill-amplitudni RER fuq 24 siegħa baqgħet simili bejn iż-żewġ gruppi (0.19± 0.05 fil-kontroll vs.0.20±0.03 f'CF,p=0.604), filwaqt li l-inklinazzjoni PRCF naqset fil-grupp CF (Valuri H: 17.77±4.38 fil-kontroll vs.12.79±3.93 f'CF,p=0.039).

Sussegwentement, qabbilna l-effett tas-supplimentazzjoni tas-CF fuq l-attivitajiet tal-enzimi mitokondrijali. Is-supplimentazzjoni CF naqset milli żżid l-attività tal-enzima tal-kumpless I, I, IV, u CS f'Sirt3-/ġrieden kif osservat qabel f'WT (rispettivament: p=0.623,p=0 .629,p=0.283, u p{=0.791, Figura 6E).Attività akbar tal-enzimi tal-kumpless u IV kienet osservata f'WT meta mqabbla mal-ġrieden Sirt{3-7 wara supplimentazzjoni CF ( rispettivament:p=0.027 u P=0.045)

4. Diskussjoni

F'dan l-istudju, aħna nipprovdu analiżi integrattiva tal-effett tal-inġestjoni tas-CF. Aħna osservajna li l-inġestjoni kronika tas-CF tejbet ir-respirazzjoni mitokondrijali u naqqset il-produzzjoni ta 'H2O2, evalwata fl-ambjent tal-myofibre tagħhom, filwaqt li s-suxxettibilità tal-ftuħ tal-PTP ma nbidlitx. L-inġestjoni tas-CF tejbet il-metaboliżmu tan-NAD, u appoġġja l-involviment tal-mogħdijiet tas-sirtuin fuq l-adattamenti mitokondrijali osservati. Osservajna wkoll modifiki fil-metaboliżmu tal-ġisem kollu lejn kapaċità akbar li tuża l-karboidrati bħala s-sottostrat ewlieni li jissuġġerixxi li l-adattamenti mitokondrijali x'aktarx ikkontribwew għall-adattament osservat tal-metaboliżmu tal-ġisem kollu.

4.1.Metaboliżmu

L-amministrazzjoni tad-dieta ta 'flavanols tal-kawkaw ġiet identifikata bħala strateġija effettiva biex tittaffa l-intolleranza tal-glukożju, li tippermetti opportunitajiet biex ittejjeb il-mard metaboliku [34]. Ir-riżultati tagħna huma skont studji preċedenti li rrappurtaw żieda fit-tolleranza tal-glukożju wara t-teħid ta 'flavanols [35,36]. Il-mekkaniżmi proposti għal dan l-effett jinvolvu żieda fit-traslokazzjoni ta 'GLUT4 lejn il-membrana taċ-ċellula, żieda fil-fosforilazzjoni ta' AMPK, u r-regolazzjoni 'l fuq tal-espressjoni tal-ġeni UCP-2 fil-muskolu skeletali [8,37] . Barra minn hekk, l-inġestjoni tas-CF kienet assoċjata ma 'titjib fis-sensittività għall-insulina fil-bnedmin[8]. Wara 15-il jum ta 'konsum ta' ċikkulata skura, kien osservat tnaqqis tal-valutazzjoni tal-mudell tal-omeostasi tal-indiċi tar-reżistenza għall-insulina f'suġġetti b'saħħithom flimkien ma 'żieda fl-indiċi kwantitattiv tal-kontroll tas-sensittività għall-insulina u l-indiċi tas-sensittività għall-insulina [8]. Osservajna wkoll żieda konkomitanti fit-tolleranza tal-glukożju u flessibbiltà metabolika fil-ġrieden WT, li tirreferi għall-kapaċità ta 'organiżmu li jadatta l-ossidazzjoni tal-fjuwil għad-disponibbiltà tal-fjuwil [38]. Interessanti, filwaqt li l-kapaċità ossidattiva mitokondrijali indebolita u l-ossidazzjoni tas-sottostrat relatata kienu assoċjati ma 'reżistenza għall-insulina 39, taħriġ ta' eżerċizzju ta 'reżistenza żied il-kontenut mitokondrijali, sensittività għall-insulina u flessibilità metabolika [38]. Għalhekk, ir-riżultati preżenti huma speċifiċi għas-supplimentazzjoni tas-CF u mhumiex influwenzati minn attività spontanja.

L-effett pożittiv tas-CF fuq il-flessibilità metabolika, kif ukoll iż-żieda fl-attività tal-kumplessi mitokondrijali, ġew ikkontrollati fil-ġrieden Sirt3-7, u jindikaw li l-effetti pożittivi tas-CF iseħħu tal-inqas parzjalment permezz ta' Sirt3. Dawn ir-riżultati jappoġġjaw is-sejbiet preċedenti u r-rwol ċentrali ta 'Sirt3 fuq ir-regolamentazzjoni tal-flessibilità metabolika [24]. Ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu li żieda fil-funzjoni mitokondrijali tista 'ttejjeb il-flessibilità metabolika. Madankollu, minbarra l-funzjoni mitokondrijali, il-kwozjent respiratorju bażali, ir-rata tar-rimi tal-glukożju, il-kapaċità tal-ħażna tal-lipidi tat-tessut xaħmi u l-konċentrazzjoni tal-aċidu xaħmi ħieles mill-plażma ġew identifikati wkoll bħala fatturi determinanti tal-flessibilità metabolika u għandhom jiġu kkunsidrati [40]. Studji futuri għandhom jivvalutaw id-determinanti ċellulari tal-flessibbiltà metabolika aktar fil-fond biex japprofondixxu l-fehim tagħna tal-kawżi sottostanti tat-titjib tal-flessibilità metabolika wara s-supplimentazzjoni tas-CF.

Il-valutazzjoni tal-metaboliżmu tal-ġisem kollu wriet żieda fl-ossidazzjoni relattiva tas-CHO wara supplimentazzjoni tas-CF. Dan ir-riżultat jikkuntrasta ma' studju preċedenti li rrapporta żieda fil-lipolisi wara inġestjoni akuta ta' flavanols jew supplimentazzjoni ta' ġimgħatejn b'flavan-3-ols fil-ġrieden [36]. Minbarra d-differenzi fil-kompożizzjoni tal-estratt, dawn is-sejbiet kontradittorji jistgħu jirriżultaw mill-effetti plejotropiċi ta 'NO. Huwa aċċettat sew li l-inġestjoni tas-CF tistimula l-produzzjoni jew il-bijodisponibilità tal-metaboliżmu tal-NO [7]. Fuq naħa waħda, NO jistimula t-trasport u l-assorbiment tal-glukożju fil-muskoli skeletriċi. L-istimulazzjoni tal-produzzjoni ta 'NO f'myotubes derivati ​​mil-linja taċ-ċelluli mill-insulina jew il-perossidu tal-idroġenu rriżultat f'żieda ta' traslokazzjoni GLUT4, li tnaqqset bl-inibizzjoni nNOS [41]. Barra minn hekk, NO jista 'jżid it-trasport tal-glukosju f'mogħdija indipendenti mill-insulina li twassal għal żieda fil-livelli ta' GMP ċikliku u AMPK [42], li jippromwovi l-ossidazzjoni tal-glukosju fil-muskoli skeletriċi tal-firien indipendenti mid-disponibbiltà u l-ossidazzjoni tal-aċidu xaħmi [43]. Min-naħa l-oħra, NO jippromwovi l-ossidazzjoni tal-aċidu xaħmi billi jnaqqas il-livell ta 'malonyl-CoA permezz ta' inibizzjoni ta 'acetyl-CoA carboxylase u attivazzjoni ta' malonyl-CoA decarboxylase fil-muskolu skeletriku[44]. Filwaqt li osservajna bidla lejn proporzjon relattiv aktar baxx biex nużaw l-aċidu xaħmi bħala sottostrat ma CF, ma kien hemm l-ebda differenza fir-rigward tal-valuri assoluti espressi f'kJ. Dan jissuġġerixxi li ż-żieda fin-nefqa tal-enerġija osservata bis-supplimentazzjoni tas-CF tiddependi fuq żieda fl-ossidazzjoni tal-glukożju. Għalhekk, dawn ir-riżultati jappoġġjaw l-idea li l-konsum CF iżid is-sensittività għall-insulina u jippromwovi l-ossidazzjoni tal-glukożju mingħajr effett konkomitanti fuq il-kapaċità ta 'ossidazzjoni tal-aċidu xaħmi. Dawn ir-riżultati jqajmu l-mistoqsija dwar ir-rilevanza li jintużaw flavanols tal-kawkaw fil-kuntest ta 'dieta b'ħafna xaħam. Studji futuri għandhom jevalwaw effett ta 'ħsara possibbli ta' assoċjazzjoni ta 'supplimentazzjoni CF u dieta b'ħafna xaħam.

4.2.Funzjoni mitokondrijali

Amministrazzjoni fid-dieta ta 'flavanols tal-kawkaw intwera li ttejjeb il-funzjoni mitokondrijali, inklużi (i) respirazzjoni mitokondrijali u attivitajiet ta' enzimi tal-katina tat-trasport tal-elettroni; (i) rilaxx mitokondrijali H2O2, li jirrifletti l-produzzjoni ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv mitokondrijali (ROS); u (i) kapaċità ta 'żamma tal-kalċju mitokondrijali li tirrifletti s-suxxettibilità għall-ftuħ tal-pori ta' transizzjoni tal-permeabilità mitokondrijali (mPTP) (għal reviżjoni ara [11]. Ir-riżultati tagħna huma skond studji preċedenti; madankollu, l-istudju tagħna kien l-ewwel li evalwa l-effett ta ' Supplimentazzjoni tas-CF fuq il-funzjoni mitokondrijali vvalutata in situ f'fibra permeabilizzata u f'tipi differenti ta' muskoli.B'differenza mill-istudji preċedenti dwar mitokondrija iżolata, il-valutazzjoni tal-funzjoni mitokondrijali f'fibra permeabilizzata tippreserva l-morfoloġija mitokondrijali, interazzjonijiet funzjonali ma 'komponenti intraċellulari oħra [1] u tevita struttura mitokondrijali tfixkil matul il-proċess ta 'iżolament mitokondrijali [32] Għalhekk, huwa importanti li tistudja l-funzjoni mitokondrijali fi preparazzjonijiet tat-tessuti fejn l-istruttura mitokondrijali hija ppreservata, u l-ġabra mitokondrijali kollha hija rappreżentata biex tevalwa aħjar ir-rispons għat-trattament.

Studji preċedenti mwettqa fil-kultura taċ-ċelluli jew in vivo fil-ġrieden urew li supplimentazzjoni bl-EPI, li hija meqjusa bħala l-molekula bijoattiva ewlenija fis-CF, iżid ir-respirazzjoni massima stimulata mill-ADP (eż., respirazzjoni tal-istat 3) meta l-mitokondrija jiġu enerġizzati b'kombinazzjoni ta 'enerġija. sottostrati li jitimgħu diversi siti tul il-katina respiratorja [45-49]. B'konsistenza ma 'dawn ir-riżultati, osservajna effett ewlieni tas-supplimentazzjoni tas-CF fuq ir-respirazzjoni mitokondrijali fil-muskoli ossidattivi u glikolitiċi. Biex niddeterminaw jekk din iż-żieda hijiex relatata ma 'żieda fil-massa mitokondrijali jew ir-rimodelizzazzjoni ta' kumplessi respiratorji mitokondrijali, ivvalujna superkumplessi mitokondrijali mill-muskolu quadriceps. Dawn l-istrutturi supramolekulari huma maħsuba li jnaqqsu l-produzzjoni ROS, jistabbilizzaw jew jassistu fl-assemblaġġ ta 'kumplessi individwali, jirregolaw l-attività tal-katina respiratorja, u jipprevjenu l-aggregazzjoni tal-proteini fil-membrana mitokondrijali ta' ġewwa b'ħafna proteini [50-52]. Minkejja numru limitat ta 'miżuri, l-analiżi viżwali tar-riżultati (Materjali Supplimentari) tissuġġerixxi li s-supplimentazzjoni tas-CF tinduċi żieda fil-massa mitokondrijali, kif riflessa minn żieda fl-ispeċijiet superkumplessi kollha, aktar milli riorganizzazzjonijiet kumplessi tal-katina respiratorja speċifiċi. B'mod kollettiv, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li CF jippromwovi żieda fil-massa mitokondrijali mingħajr adattament kwalitattiv ta 'arranġamenti kumplessi tal-katina respiratorja.

Matul ir-respirazzjoni mitokondrijali, huma ffurmati ammonti varjabbli ta 'superoxide u jistgħu jiġu metabolizzati biex jiffurmaw tipi oħra ta' ROS [53]. Għalkemm il-produzzjoni eċċessiva ta 'ROS mill-mitokondrija hija involuta fi spettru wiesa' ta 'patoloġiji, konċentrazzjonijiet fiżjoloġiċi baxxi ta' ROS jista 'jkollhom effetti ta' benefiċċju, bħall-protezzjoni kontra aġenti infettivi u l-parteċipazzjoni fis-sinjalar ċellulari [2,54]. Studji preċedenti mwettqa in vivo f'annimali gerriema u bnedmin u mudelli ta 'kultura taċ-ċelluli rrappurtaw effetti ta' supplimentazzjoni CF ta 'benefiċċju fuq il-produzzjoni ta' ROS u diversi sistemi antiossidanti [11]. Pereżempju, gavage orali b'EPI matul 15-il jum iżid l-attività ta' SOD2 u catalase fil-muskoli tal-quadriceps tal-ġrieden [17]. Filwaqt li l-produzzjoni ta 'ROS mitokondrijali ma ġietx evalwata b'mod wiesa', osservajna li l-livelli ta 'produzzjoni ta' ROS kienu simili meta l-valuri kienu espressi għal kull piż tal-muskoli, filwaqt li l-produzzjoni tbaxxiet meta espressa għal kull massa mitokondrijali, li tissuġġerixxi li jseħħu adattamenti kwalitattivi biex jinżammu l-konċentrazzjonijiet fiżjoloġiċi ta 'ROS. Barra minn hekk, aħna ma osservajna l-ebda effett ta 'CF fuq SOD2 u lanqas ħsarat indotti minn ROS evalwati mill-karbonilazzjoni tal-proteini. Filwaqt li CF isaħħaħ il-ġabra ta' proteini antiossidanti, inklużi livelli ta' SOD2 u catalase irrappurtati b'mod wiesa' [16,17,55], dan l-adattament mhux dejjem kien assoċjat ma' tnaqqis fil-ħsarat indotti minn ROS [56-59]. Din id-dejta tappoġġja t-teorija li livelli baxxi ta 'produzzjoni ta' ROS huma meħtieġa għall-omeostasi taċ-ċelluli normali [2]. B'mod kollettiv, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li, fl-istess ħin għal żieda fil-massa mitokondrijali, CF tippromwovi adattamenti kwalitattivi mitokondrijali biex ittejjeb il-kapaċità antiossidant tagħha u żżomm livelli baxxi ta 'produzzjoni ROS.

4.3.Bijoġenesi mitokondrijali

Il-massa mitokondrijali hija r-riżultat tal-interazzjoni bejn il-bijoġenesi mitokondrijali u l-mitofaġija. L-istudju tagħna ffoka fuq il-bijoġenesi mitokondrijali attivata mill-konsum tal-polifenoli [60]. Il-bijoġenesi mitokondrijali hija l-proċess ċellulari li jtejjeb il-massa mitokondrijali. Dan il-proċess kumpless u regolat ħafna jinvolvi diversi fatturi ta 'traskrizzjoni, riċetturi ta' ormoni nukleari, u koattivaturi ta 'traskrizzjoni li jaġixxu kollettivament biex jikkoordinaw bidliet fl-espressjoni ta' ġeni kodifikati fid-DNA nukleari u mitokondrijali [61]. Studji preċedenti ppruvaw jidentifikaw liema mogħdija(i) jistgħu jkunu l-bażi tal-bijoġenesi mitokondrijali indotta mis-supplimentazzjoni tas-CF. L-istimulazzjoni tas-sinjalar dipendenti fuq l-NO ħarġet bħala mogħdija ċentrali involuta fil-bijoġenesi mitokondrijali. Is-supplimentazzjoni tas-CF issaħħaħ il-ġenerazzjoni ta 'NO billi tinibixxi l-enzima arginine degradanti arginase, li żżid id-disponibbiltà ta' L-arginine għall-bijosintesi NO [62,63]. Barra minn hekk, bl-użu ta 'inibitur ta' eNOS, l-effett stimulatorju ta 'epicatechin fuq il-bijoġenesi mitokondrijali kien parzjalment ikkantat [17]. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu l-involviment ta 'mogħdijiet ta' sinjalazzjoni oħra biex jistimulaw il-bijoġenesi mitokondrijali.

Riċentement, Aragones et al. (2016) irrappurtaw li l-proanthocyanidins tad-dieta, membri tal-familja tal-polifenoli, jagħtu spinta lill-NAD epatiku flimkien mal-metaboliżmu billi jtejbu l-mogħdija ta 'de now o NAD flimkien mal-bijosintesi u l-attività Sirte b'mod dipendenti mid-doża fil-firien[12]. Barra minn hekk, il-fwied jesporta prekursuri NADt għal organi oħra, bħall-muskoli skeletriċi, li għandhom kapaċità aktar baxxa biex jissintetizzaw NAD, u jgħollu l-possibbiltà li jestendu l-effetti osservati fil-fwied għall-organiżmu kollu [64]. Filwaqt li xi studji rrappurtaw effett tas-supplimentazzjoni tas-CF fuq il-kontenut tal-proteina Sirt1, l-attività, jew l-mRNA [12,15-17,65,66], l-involviment tal-metaboliżmu NAD fil-bijoġenesi mitokondrijali wara s-supplimentazzjoni tas-CF bl-użu ta’ telf jew gwadann ta’ funzjoni qatt ma ġiet ittestjata. Filwaqt li knock-out speċifiku għall-muskoli kien ikun preferibbli fuq il-ġrieden Sirt3 KO tal-ġisem kollu użati fl-istudju tagħna, ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu li CF itejjeb il-metaboliżmu tal-NAD, u Sirt3 huwa involut f'dan it-titjib tal-attività tal-katina tat-trasport tal-elettroni mitokondrijali indotta minn supplimentazzjoni. L-effetti pożittivi osservati fuq l-attività tal-kumplessi mitokondrijali wara s-supplimentazzjoni tas-CF ma ġewx osservati bl-użu ta' ġrieden Sirt3-7u attività akbar ta' attivitajiet kumplessi I u IV ġew osservati wara supplimentazzjoni tas-CF biss f'WT. Dawn l-osservazzjonijiet jestendu xogħlijiet preċedenti li juru li Sirt3 għandu rwol ċentrali fil-funzjoni mitokondrijali ]67. B'mod kollettiv, dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li sirtuins, permezz tal-modulazzjoni tal-metaboliżmu NAD, huma involuti fit-titjib tal-massa mitokondrijali osservati wara s-supplimentazzjoni tas-CF. 4.4.Limiti

Il-fażola tal-kawkaw hija komposta minn taħlita ta 'flavanols monomeriċi, oligomeriċi u polimeriċi. Fost il-flavanols, l-EPI jidher li huwa l-monomeru polifenoliku l-aktar abbundanti misjub fil-prodotti tal-kawkaw, li jirrappreżenta sa 35 fil-mija tal-kontenut tal-polifenol [68]. L-EPI ġie stabbilit bħala l-molekula bijoattiva ewlenija sottostanti benefiċċji assoċjati ma 'supplimenti tal-kawkaw u taċ-ċikkulata [47,69]. Madankollu, il-metaboliti EPI (EPIm) jistgħu jkunu involuti fl-effetti bijoloġiċi indotti mill-EPI osservati studji in vivo. L-EPIm jista' jilħaq konċentrazzjonijiet fil-plażma ogħla mill-EPI[70]. Barra minn hekk, ġew osservati differenzi kbar fl-EPIm madwar l-ispeċi. Tabilħaqq, 80 fil-mija tal-EPIm preżenti fil-bnedmin ma nstabitx fil-firien, filwaqt li x-xebh bejn il-ġrieden u l-bnedmin instab li kien kemmxejn aktar favorevoli peress li ż-żewġ metaboliti umani ewlenin ġew skoperti [70]. Aħna użajna estratt CF arrikkit li kien fih sa ħames darbiet aktar EPI mill-fażola tal-kawkaw mhux iffermentata[71]. Barra minn hekk, il-kontenut tal-EPI tnaqqas bi 10-20 fil-mija bil-fermentazzjoni u naqas b'mod dipendenti mit-temperatura waqt ix-xiwi [71,72]. B'mod kollettiv, din id-dejta tissuġġerixxi li għandha tingħata attenzjoni biss lill-kontenut tal-EPI meta jiġu vvalutati l-benefiċċji tas-supplimentazzjoni tal-EPI fuq is-saħħa tal-bniedem, u r-riżultati preżenti għandhom jitqiesu b'kawtela qabel ma jiġu estrapolati l-mekkaniżmi sottostanti osservati fil-bnedmin.

5. Konklużjonijiet

Supplimentazzjoni CF ta 'kuljum għal 15-il jum twassal għal titjib fil-funzjoni mitokondrijali fil-muskoli ossidattivi u glikolitiċi. Ir-riżultati preżenti jissuġġerixxu li ż-żieda fir-respirazzjoni mitokondrijali tirriżulta f'żieda fil-massa mitokondrijali filwaqt li nżamm il-livell ċellulari tal-produzzjoni ta 'ROS, li jissuġġerixxi adattamenti kwalitattivi fi ħdan il-mitokondrija. Konkomitanti mal-effett ċellulari fuq il-metaboliżmu NO deskritt qabel [73], CF jimmodula l-metaboliżmu NAD, li jistimula l-attività tas-sirtuins. Sirt3 għandu rwol ċentrali fl-adattamenti mitokondrijali u l-flessibilità metabolika wara s-supplimentazzjoni tas-CF. Peress li s-sirtuins huma miri reċenti f'diversi patoġenesi tal-mard, bħad-dijabete jew l-ażma [74,75l, aktar studji se jesploraw l-interess potenzjali li jintuża CF bħala attivatur naturali tas-sirtuins.

Referenzi

1. Kuznetsov, AV; Veksler, V.; Gellerich, FN; Saks, V.; Margreiter, R.; Kunz, WS Analiżi tal-funzjoni mitokondrijali in situ f'fibri, tessuti u ċelloli tal-muskoli permeabilizzati. Nat. Protoc. 2008, 3, 965–976. [CrossRef]

2. Sena, LA; Chandel, NS Rwoli Fiżjoloġiċi ta 'Speċi ta' Ossiġenu Reattiv Mitokondrijali. Mol. Ċellula 2012, 48, 158–167. [CrossRef]

3. Wacquier, B.; Combettes, L.; Van Nhieu, GT; Dupont, G. Interplay Bejn Intraċellulari Ca2 flimkien ma 'Oxxillazzjonijiet u Ca2 flimkien ma' Metaboliżmu Mitokondrijali stimulat. Sci. Rep 2016, 6, srep19316. [CrossRef]

4. Suomalainen-Wartiovaara, A.; Battersby, BJ Mard mitokondrijali: Il-kontribut tar-reazzjonijiet tal-istress tal-organelli għall-patoloġija. Nat. Dun Mol. Cell Biol. 2018, 19, 77–92. [CrossRef]

5. Heyman, E.; Daussin, F.; Wieczorek, V.; Caiazzo, R.; Matran, R.; Berthon, P.; Aucouturier, J.; Berthoin, S.; Descatoire, A.; LeClair, E.; et al. Provvista u Użu ta 'Ossiġenu Muskoli fid-Dijabete tat-Tip 1, Mill-Arja Ambjentali sal-Katina Respiratorja Mitokondrijali: Hemm Pass Limitanti? Kura tad-Dijabete 2020, 43, 209–218. [CrossRef]

6. Daussin, FN; Boulanger, E.; Lancel, S. Mill-mitokondrija sa sarkopenja: Rwol ta 'infjammazzjoni u implikazzjoni tal-assi RAGE-ligand. Exp. Gerontol. 2021, 146, 111247. [CrossRef] [PubMed]

7. Katz, DL; Doughty, K.; Ali, A. Kawkaw, u Ċikkulata fis-Saħħa tal-Bniedem u l-Mard. Antiossidu. Sinjal Redox. 2011, 15, 2779–2811. [CrossRef] 8. Grassi, D.; Lippi, C.; Necozione, S.; Desideri, G.; Ferri, C. Amministrazzjoni għal żmien qasir ta 'ċikkulata skura hija segwita minn żieda sinifikanti fis-sensittività għall-insulina u tnaqqis fil-pressjoni tad-demm f'persuni b'saħħithom. Em. J. Clin. Nutr. 2005, 81, 611–614. [CrossRef] [PubMed]

9. Grassi, D.; Desideri, G.; Necozione, S.; Lippi, C.; Casale, R.; Properzi, G.; Blumberg, JB; Ferri, C. Il-pressjoni tad-demm hija mnaqqsa u s-sensittività għall-insulina miżjuda f'suġġetti intolleranti għall-glukożju u bi pressjoni għolja wara 15-il jum ta 'konsum ta' Ċikkulata Skura ta 'Polyphenol Għoli. J. Nutr. 2008, 138, 1671–1676. [CrossRef]

10. Ottaviani, JI; Omm, TY; Heiss, C.; Kwik-Uribe, C.; Schroeter, H.; Keen, CL Il-konfigurazzjoni stereokimika tal-flavanols tinfluwenza l-livell u l-metaboliżmu tal-flavanols fil-bnedmin u l-attività bijoloġika tagħhom in vivo. Free Radic. Biol. Med. 2011, 50, 237–244. [CrossRef] [PubMed]