Il-Konjugat Dendrimer–tesaglitazar Jinduċi Ċaqliq fil-Fenotip tal-Mikroglia U Ittejjeb l-Amyloid Phagocytosis† Parti 2

Assaġġi bijoloġiċi in vitro

Kultura taċ-ċelluli. Il-linja taċ-ċelluli mikrogliali murini BV2 ġiet miksuba mill-Isptar tat-Tfal ta 'Michigan Cell Culture Facility.

F'dawn l-aħħar snin, ix-xjentisti sabu li l-kultura taċ-ċelluli hija relatata mill-qrib mal-memorja tal-bniedem. Studji wrew li permezz tal-istudju tal-kultura taċ-ċelluli, il-mekkaniżmi molekulari fil-memorja u l-proċess tat-tagħlim jistgħu jiġu skoperti, u b'hekk itejbu l-kapaċità konjittiva u l-memorja tal-bniedem.

Il-kultura taċ-ċelluli tirreferi għall-proċess tat-tqegħid ta 'ċelluli bijoloġiċi f'mezz ta' kultura li jkun fih nutrijenti essenzjali biex jikbru u jirriproduċu taħt kundizzjonijiet in vitro. Iċ-ċelloli huma l-unitajiet bażiċi tal-ħajja, u l-kultura taċ-ċelluli tipprovdi lix-xjenzati bi pjattaforma biex jistudjaw l-imġiba taċ-ċelluli u l-attivitajiet tal-ħajja. Permezz tal-istudju taċ-ċelloli, ix-xjentisti skoprew ħafna informazzjoni dwar it-tkabbir tan-newroni u l-konnessjonijiet sinaptiċi. Dawn is-sejbiet jistgħu mhux biss jgħinu lill-bnedmin jifhmu aħjar kif jaħdem il-moħħ iżda jgħinu wkoll biex jiżviluppaw trattamenti u mediċini ġodda.

Ir-riċerka f'dawn l-aħħar snin wriet li l-kultura taċ-ċelluli hija wkoll relatata mill-qrib mal-memorja tal-bniedem. Ix-xjentisti sabu li l-formazzjoni u ż-żamma tal-memorja tal-bniedem teħtieġ ħafna regolamentazzjoni molekulari u twassil tas-sinjali. Dawn il-mekkaniżmi ta 'twassil u regolazzjoni tas-sinjali għandhom ħafna xebh mal-mekkaniżmi fil-kultura taċ-ċelluli. Billi jistudjaw il-mekkaniżmi ta 'twassil u regolazzjoni tas-sinjali fil-kultura taċ-ċelluli, ix-xjentisti jistgħu jifhmu aħjar il-memorja umana u l-mekkaniżmi ta' tagħlim.

Barra minn hekk, xi studji wrew ukoll li l-kultura taċ-ċelluli tista 'ttejjeb il-memorja tal-bniedem u l-kapaċità tat-tagħlim b'ċerti modi. Pereżempju, bl-użu ta 'metodu msejjaħ "stimulazzjoni elettrika", l-attività taċ-ċelloli u l-konnessjoni bejn in-newroni jistgħu jiġu stimulati, u b'hekk itejbu l-kapaċità konjittiva tal-bniedem u l-effetti tat-tagħlim. Għalkemm dan il-metodu għadu fl-istadju ta 'riċerka fil-laboratorju, huwa mistenni li jsir metodu ġdid ta' taħriġ konjittiv fil-futur.

Fil-qosor, hemm konnessjoni mill-qrib bejn il-kultura taċ-ċelluli u l-memorja tal-bniedem. Permezz tal-istudju taċ-ċelloli, nistgħu nifhmu aħjar il-mekkaniżmu konjittiv tal-bniedem u l-mekkaniżmu tal-memorja u ngħinu wkoll biex jiġu żviluppati metodi ġodda ta 'trattament u metodi ta' taħriġ konjittiv. Ejja nħarsu 'l quddiem għall-kontribut tat-teknoloġija tal-kultura taċ-ċelluli lill-umanità fil-futur! Wieħed jista 'jara li għandna bżonn intejbu l-memorja, u Cistanche jista' jtejjeb b'mod sinifikanti l-memorja minħabba li Cistanche għandu effetti antiossidanti, anti-infjammatorji u kontra t-tixjiħ, li jistgħu jgħinu jnaqqsu l-ossidazzjoni u r-reazzjonijiet infjammatorji fil-moħħ, u b'hekk jipproteġu s-saħħa tal- sistema nervuża. Barra minn hekk, Cistanche jista 'wkoll jippromwovi t-tkabbir u t-tiswija taċ-ċelloli tan-nervituri, u b'hekk itejjeb il-konnettività u l-funzjoni tan-netwerks newrali. Dawn l-effetti jistgħu jgħinu biex itejbu l-memorja, il-ħila tat-tagħlim, u l-veloċità tal-ħsieb, u jistgħu wkoll jipprevjenu l-okkorrenza ta 'disfunzjoni konjittiva u mard newrodeġenerattiv.

Ikklikkja taf supplimenti biex tingħata spinta lill-memorja

Iċ-ċelloli BV2 ġew ikkultivati ​​fil-midja Modified EaglesMedium (DMEM) ta 'Dulbecco b'10% serum fetalbovine inattivat bis-sħana (HI FBS) u 1% penicillin/streptomycin (P/S) at37 grad u 5% CO2.

Ladarba ċ-ċelloli laħqu l-konfluwenza fil-kunjett tal-kultura, iċ-ċelloli ġew mgħoddija fi flixkun ġdid li juża 0.05% trypsin–ethylenediamine tetra-acetic acid (EDTA). Għall-esperimenti, ċelluli BV2 ġew miżrugħa f'DMEM b'5% HIFBS u 1% P/S. 24-48 siegħa wara, iċ-ċelloli ġew stimulati b'100 ng ml-1 (300 EU ml-1) ta 'LPS għal 3 sigħat biex iċ-ċelloli jkunu jistgħu jidħlu f'fenotip pro-infjammatorju (M1) biex jissimulaw l-ambjent newroinfjammatorju preżenti f'ħafna mard newroloġiku.

Iċ-ċelloli mbagħad ġew kotrattati b'LPS u jew Tesa ħielsa jew D-Tesa f'konċentrazzjonijiet li jvarjaw għal 48 idejn imbagħad is-supernatant u ċ-ċelloli nġabru għall-ipproċessar. Ċelloli qatt ittrattati b'LPS (Nru LPS) u ċelloli ttrattati b'LPS biss f'kull ħin (LPS biss) servew bħala l-gruppi ta' kontroll. Is-soluzzjonijiet ta' stokk ta' Tesa u D-Tesa ħielsa ġew sterilizzati bl-użu ta' filtri ta' poly(ether sulfones) 0.2 µm.

D-Tesa kien solubbli fil-midja taċ-ċelluli. Tesa ġiet solubilizzata billi uża dimethylsulfoxide (DMSO) f'inqas minn 0.1% (v/v) konċentrazzjoni finali. Ċitotossiċità, analiżi ta 'ossidu nitriku, u TNF-ELISA. Għall-assaġġ taċ-ċitotossiċità, iċ-ċelloli ġew ittrattati kif deskritt hawn fuq fi 96-platt tal-bir, u mbagħad iċ-ċitotossiċità ta' Tesa ħielsa u D-Tesa ġiet evalwata b'assaġġ MTT skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur.

Għall-assaġġ tal-ossidu nitriku, iċ-ċelloli ġew ittrattati kif deskritt hawn fuq fi 12-pjanċi tal-bir, u mbagħad inġabru supernatanti minn ċelloli trattati u immedjatament il-livelli tal-ossidu nitriku ġew kwantifikati billi ssegwi l-protokoll tal-manifattur għar-Reaġent ta' Griess.

Għat-TNF-ELISA, iċ-ċelluli ġew ittrattati kif deskritt hawn fuq fi pjanċi 12-bjar, u mbagħad inġabru supernatanti minn ċelloli ttrattati u nħażnu f'-80 grad sakemm ikunu lesti għal aktar proċessar.

Imbagħad il-kampjuni ġew imdewweb fuq is-silġ u t-TNF-ELISA tmexxiet billi segwiet il-protokoll tal-manifattur. Għal dawn l-istudji, kemm D-Tesa kif ukoll Tesa ħielsa ġew ivvibrati u vortex sakemm it-tnejn kienu solubbli kompletament. Biex solubilize Tesa ħielsa, l-ewwel ġie solubilizzat f'DMSO qabel ma ġie dilwit, fejn il-konċentrazzjoni finali ta 'DMSO kienet taħt 0.1% (v/v) għall-kampjuni kollha ta' Tesa ħielsa.

Peress li D-Tesa kien solubbli fil-midja taċ-ċelluli, DMSO ma ġiex miżjud ma 'dawk il-kampjuni. Għal studji allin vitro, ammont ekwivalenti ta' mediċina ħielsa jew konjugata ġiet applikata għaċ-ċelloli kemm fil-gruppi ħielsa Tesa kif ukoll D-Tesa.

PCR kwantitattiv f'ħin reali (qRT-PCR). Iċ-ċelloli ġew ittrattati kif deskritt hawn fuq fi 12-pjanċi tal-bjar, u wara li nġabru s-supernatant, iċ-ċelloli nġabru f'Invitrogen™ TRIzol™ Reagent (minn Fisher Scientific) u RNA ġie estratt billi ssegwi l-protokoll tal-manifattur. Il-konċentrazzjoni u l-purità ta 'l-RNA riżultanti ġew analizzati bl-użu ta' Nanodrop.

Ammonti ekwivalenti ta' RNA minn kull kampjun ġew ikkonvertiti għal cDNA billi ssegwi l-protokoll tal-manifattur għall-Kit ta' Traskrizzjoni Reverse ta' CapacitycDNA Għoli (minn Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific).

Is-cDNA li rriżulta ġie utilizzat għall-analiżi tal-qRT-PCR bl-użu tar-reaġent aħdar FAST-SYBR u billi ssegwi l-protokoll tal-manifattur. Il-valuri Ct ġew ikkalkulati mill-magna u d-dejta ġiet analizzata bl-użu tal-metodu 2−ΔΔCt.

Għal kull markatur differenti, il-valur ΔΔCt ġie kkalkulat billi naqqas il-ΔCt għall-grupp Nru LPS mill-ΔCt għal kull kampjun. Il-valur ΔCt kien il-valur Ct għall-ġene ta 'interess nieqes is-Ct għal GAPDH għal kull kampjun partikolari.

Ladarba l-2−ΔΔCt ġie kkalkulat għall-gruppi kollha, imbagħad ġew kollha normalizzati għall-grupp Nru LPS, u b'hekk taw il-livell ta' espressjoni relattiva tal-grupp Nru LPS ta' 1.0 għall-markaturi kollha. -PCR huma murija fit-tabella hawn taħt. Is-sekwenzi kollha huma miktuba minn 5′→3′.

Barra minn hekk, primers disponibbli kummerċjalment inxtraw minn BIORAD għal iNOS/Nos2 (qmmuCID0023087), TLR4 (qmmuCID0023548), CD206/Mrc1 (qmmuCID0012670), TGF- 1 (qmmuCID0017320), ILq{4920}0}, ILq{4920}0} (qmmuced0024846), CD36 (qmmuced0014852), Ide(qmmuced0049796), MMP9 (qmmuced0021296), CCL1(qmmuced0038249), TLR8 (qmmuced0039837), CD86(qmmuced0021296), (qmmuced0021296), (qmmuced0038249), CD{22}(qmmuced0049796), (qmmuced0038249), (qmmucid0018821). Assaġġ tal-fagoċitożi.

L-impatt tal-onfagoċitosi ta' Tesa u D-Tesa ħielsa ta' -amyloid ġie determinat permezz ta' metodu rappurtat qabel.47 Fil-qosor, HiLyte™ Flour 488-ittikkettat -amyloid1–42 (minn Anaspec Inc.) ġie maħlul f'DMSO (konċentrazzjoni finali DMSO). taħt 0.5% (v/v)) u dilwit għal 5 µg ml-1 f'PBS.

Wara t-trattament taċ-ċelloli b'Tesa u D-Tesa bl-iskema ta 'trattament deskritta hawn fuq, is-soluzzjoni -amyloid ġiet applikata għaċ-ċelloli għal sagħtejn. Imbagħad, iċ-ċelloli ġew maħsula tliet darbiet b'Soluzzjoni Balanced Salt Hank b'katjoni divalenti (kalċju u manjesju), imneħħija mill-bjar bl-użu ta 'trypsin, u sospiżi mill-ġdid f'buffer FACS (minn Invitrogen).

Il-kampjuni ġew maħżuna fuq is-silġ, u immedjatament tħaddmu fuq Sony Cell Sorter SH800 flow cytometrymachine, u d-dejta ġiet analizzata bis-softwer assoċjat.

Il-bieb kien issettjat bl-użu ta 'ċelluli mhux ittrattati b'-amyloid fluworexxenti, u r-riżultati murija huma l-perċentwali ta' ċelluli minn kull grupp li wrew fluworexxenza fuq il-fluworexxenza fl-isfond.

L-intensità fluworexxenti medja (MFA) ta' HiLyte™ 488--amyloid ittikkettat ġiet irrappurtata wkoll għal kull grupp. Dan l-assaġġ sar in duplikat.Statistika. Id-dejta kollha murija hija r-riżultat ta 'tliet esperimenti separati, kull wieħed imwettaq fi tliet kopji sakemm ma jkunx innutat mod ieħor. GraphPad Prism 5 u Microsoft Excel intużaw biex iwettqu l-istatistika.

Twettqu t-testijiet tal-Istudenti b'żewġ denbu, flimkien ma' BonferroniCorrection. It-test ta' Grubbs intuża biex jiddetermina l-outliers. GraphPad Prism 5 għall-Windows intuża biex jippjana d-dejta (San Diego, CA). Id-dejta murija hija l-medja + SEM.

Riżultati u diskussjoni

Sinteżi u karatterizzazzjoni ta' D-Tesa

Biex tippermetti kunsinna intraċellulari mmirata għal ċelluli mikrogliali attivati ​​fil-moħħ, Tesa kien konjugat b'mod kovalenti fuq il-wiċċ ta 'G4-PAMAM-OH b'rabtiet esteri li jistgħu jinqatgħu bejn il-mediċina u d-dendrimer-linker (Fig. 1).

Fl-ewwel pass, Tesa (1) kienet irreaġixxa ma 'tetramethylene glycol azide (TEG-azide) (2) biex tipproduċi Tesa-TEG-azide (3), li għandha linkagebetween ester tad-droga u linker (Fig. 1A).

L-HPLC tal-kompost (3) wera ħin ta 'żamma ta' 13.4 minuti b'purità akbar minn 99% (Fig. S1B†). L-ispettru tal-massa ta '(3) wera peakat 610.13 [M + 1]+ li jikkorrispondi għall-piż molekulari Tesa-TEG-azide li jikkonferma aktar il-formazzjoni tal-prodott (Fig. S2†). Separatament, G4-PAMAM-OH dendrimer (4) ġie reazzjoni ma 5- aċidu hexynoic bl-użu ta 'reazzjoni esterifikazzjoni toproduce D-YNE (5) (Fig. 1B).

Fl-aħħarnett, Tesa-TEG-azide (3) u D-YNE (5) ġew irreaġitti mir-reazzjoni ta 'ikklikkja ta' ramm-catalyzedazide-alkyne cycloaddition (CuAAC) effiċjenti ħafna biex tipproduċi D-Tesa (6) (Fig. 1B).48 L-1H NMR. ikkonfermat is-sintesi b'suċċess tas-sustanzi intermedji kollha u l-prodott finali; D-Tesa (6) kien fih il-qċaċet karatteristiċi ta 'dendrimer u protoni druglinker li juru s-sinteżi ta' suċċess ta 'D-Tesa (Fig. 2A).

NMR tal-konjugat finali D-Tesa wera li medja ta 'għaxar molekuli ta' Tesa kienu mwaħħla ma 'kull dendrimer. HPLC ikkonferma konjugazzjoni kovalenti ta 'suċċess, peress li D-Tesa wera bidla kemm mid-D-YNE kif ukoll mit-TesaTEG-azide (Fig. 2B u S1†).

Tesa għandha solubilità akwea fqira, stmata li hija 0.0035 mg mL-1.49 Il-konjugazzjoni ta 'Tesa onhydroxyl dendrimer tejbet is-solubilità fl-ilma tagħha diversi ordnijiet ta' kobor minn din l-istima. D-Tesa kien solubilità fl-ilma fi 22 mg mL-1, u peress li Tesa jinkludi ~ 19% ta 'themass ta' D-Tesa, 4.2 mg ml-1 ekwivalenti ta 'Tesa ġie solubilizzat (Fig. 3A).

Is-solubilità miżjuda mogħtija mid-dendrimer iżżid il-faċilità tal-formulazzjoni u tneħħi l-ħtieġa għal eċċipjenti potenzjalment tossiċi.50 Dawn il-benefiċċji huma kollha flimkien mal-kapaċità superjuri tad-dendrimer li jwassal mediċini b'xejn madwar il-BBB għall-mikroglia in vivo, u potenzjalment inaqqsu l- doseneeded biex jinkiseb effett terapewtiku.18-28 Fl-aħħar nett, D-Tesa kellu daqs medju ta' 7.75 ± 0.29 nm (Fig. S3†), u zeta-potenzalof 2.86 ± 0.38 mV (kejl N=5 u N=3, rispettivament).

Ħelsien tad-droga

Iddisinjajna D-Tesa biex tirrilaxxa Tesa intraċellulari fi ħdan il-pH baxx u l-ambjent ta 'konċentrazzjoni għolja ta' esterase inendosomi/liżosomi ta 'mikroglia attivata. Preċedentement irrappurtajna li d-dendrimeri PAMAM prinċipalment jidħlu fiċ-ċelluli permezz ta’ endoċitożi tal-fażi fluwida, u l-vesikoli li fihom il-konjugati jittrasformaw f’liżosomi.51

Inkubajna D-Tesa f’37 grad f’buffer taċ-ċitrat tas-sodju (pH 5.5) fil-preżenza ta’ esterases biex nimitaw il-kundizzjonijiet tal-liżosomi, kif imwettaq qabel.52–54 Investigajna wkoll ir-rilaxx taħt kundizzjonijiet li jimitaw il-kundizzjonijiet tal-plażma (salina buffered bil-fosfat [PBS). ] buffer, pH 7.4).

Taħt kundizzjonijiet tal-plażma, madwar 1.5% biss ta 'Tesa jiġi rilaxxat wara 48 siegħa, u inqas minn 20% ta' Tesa jiġi rilaxxat sal-25 jum li jissuġġerixxi l-istabbiltà tal-plasma tal-konjugat (Fig. 3B).

Taħt kundizzjonijiet liżosomali, madwar 60% ta 'Tesa jinħeles minn D-Tesa fl-ewwel 48 siegħa, u fi żmien 19-il jum, kważi 100% ta' Tesa huwa rilaxxat. Dawn ir-riżultati juru li D-Tesa jipprovdi rilaxx sostnut u attivat tal-mediċina b'xejn għall-ewwel ġimagħtejn inkubati taħt kundizzjonijiet liżosomali fiżjoloġikament rilevanti.

Barra minn hekk, ir-rilaxx minimu ta’ Tesa fil-kundizzjonijiet simulati tal-plażma (grupp ta’ pH 7.4) matul l-ewwel 48 siegħa huwa sinifikanti, peress li dan huwa l-ħin tipiku taċ-ċirkolazzjoni tal-G4-PAMAM-OH qabel it-tneħħija tal-kliewi, Tesa sominimal x’aktarx tiġi rilaxxata mill- konjugati qabel ma jaslu l-mikroglia.24

D-Tesa naqas l-espressjoni tal-markaturi M1 u żdied il-markaturi M2

Biex tevalwa l-abbiltà ta 'D-Tesa li jinduċi bidla fil-fenotip M1 għal M2, aħna evalwajna l-abbiltà ta' D-Tesa li tbiddel l-espressjoni ta 'markaturi M1 u M2 in vitro bl-użu ta' linja taċ-ċelluli mikrogliali murini (BV2).

Iċ-ċelloli BV2 inħolqu bl-immortalizzar taċ-ċelloli mikrogliali murini u ntwerew li huma alternattiva xierqa għaċ-ċelloli tal-mikroglia primarji biex tistudja r-rispons infjammatorju tal-mikroglia. ng ml−1 (300 endotoxinunits (EU) kull ml) LPS għal 3 sigħat.

Imbagħad, ikkotrattajna ċ-ċelloli b'LPS u Tesa jew D-Tesa b'xejn għal 48 siegħa, u mbagħad ġabar il-kampjuni. Aħna ttrattati ċ-ċelloli f'konċentrazzjonijiet ta '1.5, 15, u 150 µM Tesa ħielsa jew D-Tesa, fuq bażi ta' mediċina ekwivalenti.

L-assaġġ MTT wera li Tesaor D-Tesa ħieles f'dawn il-konċentrazzjonijiet ma kkawżax ċitotossiċità (Fig. S4†). Sar studju inizjali ta’ sejba tad-doża ma’ Tesa u D-Tesa biex tiġi determinata l-aktar doża effettiva ta’ Tesa u D-Tesa.

Trattament b'1.5 u 15 µM Tesa u D-Tesad ħielsa ma biddilx is-sekrezzjoni ta' nitric oxide jew TNF-, kif determinat mir-Reaġent Griess u TNF-ELISA, rispettivament (Fig. S5†). Ibbażat fuq dawn ir-riżultati, aħna ma analizzajniex dawn il-konċentrazzjonijiet aktar baxxi fl-assaġġi qRT-PCR tagħna.

F'ħafna mard newrodeġenerattiv, funzjoni newrotossika maġġuri ta 'proinfjammatorji, mikroglia M1 hija t-tnixxija tagħhom ta' speċi ta 'ossiġnu reattiv (eż. nitriku ossidu) li joqtol direttament in-newroni.

Aħna evalwajna l-kapaċità ta 'D-Tesa biex tikseb dan l-effett. Wara l-istimulazzjoni ta' LPS, D-Tesa naqas il-livelli ta' l-mRNA ta' nitric oxide sekreted u nitric oxide synthase (iNOS) 3.7-darbiet (p <0.0001) u 2-darbiet (p {7-) 7}}.011), rispettivament, meta mqabbla ma 'ċelluli trattati biss b'LPS (LPS-biss) (Fig. 4Aand B).

Min-naħa l-oħra, Tesa ħieles naqqas l-ossidu nitriku secreted b'mod aktar moderat (1.4-darbiet, p=0.004) u ma wassalx għal tnaqqis sinifikanti fl-espressjoni tal-mRNA tal-iNOS (Fig. 4A u B ).

D-Tesa kien ħafna aktar effettiv minn Tesain b'xejn li jrażżan is-sekrezzjoni tal-ossidu nitriku. Sussegwentement, skond ifmicroglia huma f'fenotip M1 jew M2, mikroglia upregulateeither iNOS jew Arginase 1 (Arg1) biex jimmetabolizzaw L-arginine toproduce nitriku ossidu għar-rispons tagħhom għall-qtil tal-patoġen M1, ornithine u urea għar-rispons tal-fejqan tal-feriti M2, rispettivament. 59

B'mod konsistenti mar-regolazzjoni 'l isfel tiegħu ta' iNOS, D-Tesa żied il-livelli ta' Arg1 mRNA 2-darbiet (p=0.011) meta mqabbel mal-kontroll tal-LPS biss, filwaqt li Tesa ħieles ma żiedx l-espressjoni b'mod sinifikanti (p=0 .40) (Fig. 4C).

D-Tesa, u sa ċertu punt ħielsa Tesa, qalbu l-mikroglia milli jirrilaxxa nitrikossidu ċitotossiku għall-metabolizzazzjoni tal-L-arginine għall-fejqan tal-feriti, li tikkomplika t-tnaqqis u potenzjalment it-treġġigħ lura, in-newrotossiċità kkawżata mill-mikroglia fin-newrodeġenerazzjoni.5-7,10.

It-tnaqqis tal-iNOS u l-livelli ta' ossidu nitriku mnixxija bi trattament ta' D-Tesa huwa permezz ta' xogħol preċedenti li wera li l-ligand naturali ta' PPAR (15-deoxy-Δ12,14-prostaglandin J2) naqas l-espressjoni u t-tnixxija ta' iNOS u nitric oxide f'LPS ittrattati. mikroglia primarja.60

IL-10, IL-4, u TGF- 1 huma kollha ċitokini li huma mnixxija minn mikroglia M2 attivata alternattivament li jistgħu jinduċu ambjent newroprotettiv u anti-infjammatorju fil-moħħ.58,61,62Lejn dan il-għan, D-Tesa żied l-espressjoni ta' IL-105.5-darbiet (p=0.011) u IL-4 8.2-darbiet (p=0.011) {15}}.013) meta mqabbla mal-kontroll LPS biss (Fig. 4D u E).

Free Tesa ma żiedx b'mod sinifikanti la l-livelli IL{-10 u lanqas IL{-4, għalkemm il-medji kienu 1.7-darbiet (p=0.066) u 2.{{7} } darbiet (p=0 .11) ogħla, rispettivament, għal mikroglia ttrattati b'Tesa meta mqabbla ma 'kontrolli biss-LPS (Fig. 4D u E). Barra minn hekk, D-Tesa żied l-espressjoni ta 'TGF- 1 2.3-darbiet (p=0.015) u Tesa ħielsa ma bidlitx l-espressjoni b'mod sinifikanti (Fig. 4F).

Għalhekk, D-Tesa jinduċi s-sekrezzjoni ta 'ċitokini anti-infjammatorji wara trattament LPS tal-mikroglia, li jista' ttaffi l-ambjent newrotossiku, pro-infjammatorju preżenti f'mard newrodeġenerattiv.5-7,10

Espressjoni indotta minn D-Tesa ta' markaturi tas-sottotip M2-

CD206, Ccl1, u TLR8 huma markaturi speċifiċi għas-sottotipi tal-mikroglia M2a, M2b, u M2c, rispettivament. }}darbiet (p < 0.001), Ccl1 3.5-darbiet (p < 0.005), u TLR8 5-darbiet (p < 0.01), filwaqt li Tesa ħieles ma żiedx b'mod sinifikanti l-espressjoni ta' kwalunkwe minn dawn it-tliet markaturi (Fig. 5A–C).

Din id-dejta turi li l-mikroglia ttrattata b'D-Tesa turi regolazzjoni għolja sinifikanti tal-markaturi tat-tliet sottotipi M2 kollha, li jaqbel mal-fehim li l-fenotip tal-mikroglia huwa plastik u mhux binarju.63–65.

In-nomenklatura M1/M2 tissimplifika żżejjed il-kumplessità li l-mikroglia tista 'teżisti fi spettru ta' stati ta 'attivazzjoni; tul dan il-kontinwu, ġew ikkaratterizzati tliet fenotipi distinti M2 (M2a, M2b, u M2c), u D-Tesa jinduċi espressjoni ta’ markaturi konsistenti ma’ kull wieħed minn dawn l-istati. proteini billi jirregolaw ir-riċetturi ta' kenniesa, tiswija tat-tessuti, u azzjonijiet anti-infjammatorji.

Il-mikroglia M2b huma bħal mikroglia M1 fis-sens li jesprimu IL-1 , TNF- , u IL-6; madankollu, M2b huma distinti mill-mikroglia M1 peress li jesprimu IL-10 f'livelli għoljin u jirregolaw l-espressjoni ta' iNOS. Il-makrofagi u l-mikroglia M2b jistimulaw iċ-ċelluli T Th2, li huwa indikattiv ta 'wieħed mit-teroli ta' M2b biex jinduċi rispons anti-infjammatorju.

M2cmicroglia huma involuti fil-fejqan tal-feriti, remodeling tat-tessuti, sekwestrazzjoni tal-ħadid, u attivazzjoni STAT3 li tnaqqas is-sinjalazzjoni proinfjammatorja. li huma t-tnejn markaturi M2a.58D-Tesa żied l-espressjoni ta' PPAR 2.3-darbiet (p=0.0036)u STAT6 3.4- darbiet (p < 0.001), filwaqt li Tesa ħieles żdied STAT6 1.8-darbiet (p=0.011) mingħajr żieda sinifikanti fl-espressjoni PPAR (1.58-darbiet żieda, p=0.17) (Fig. 5D u E).

L-espressjoni miżjuda ta 'STAT6 u PPAR tirriżulta fil-produzzjoni tal-ġeni antiinfjammatorji u l-inibizzjoni ta' sinjali pro-infjammatorji billi jinibixxi l-attività NF-κB. Peress li l-mikroglia M2a tista 'tiġi indotta billi tiġi ttrattata l-mikroglia b'IL-4, liema sinjali permezz ta' STAT6 u PPAR, ir-regolazzjoni 'l fuq ta' dawn iż-żewġ proteini ta' sinjalazzjoni 'l isfel tista' tirriżulta f'polarizzazzjoni ta' feedforward M2a.68

Fl-analiżi tagħna, l-attivazzjoni tal-LPS żiedet il-livelli ta' IL-6, TNF- , u IL-1, u t-trattament b'D-Tesa irregola aktar l-espressjoni ta' dawn iċ-ċitokini (Fig. S6A–D†), li x'aktarx minħabba D-Tesa li jinduċi l-fenotip M2b (Fig. 5B).

Free Tesa żied l-espressjoni ta' IL-6 u ma bidlitx b'mod sinifikanti l-espressjoni ta' TNF- u IL-1 (Fig. S6A–D†). Filwaqt li dawn iċ-ċitokini jinħelew mill-mikroglia M1, il-mikroglia M2b jesprimu wkoll dawn iċ-ċitokini.58,61 CD86 huwa markatur kemm tal-mikroglia M1 kif ukoll tal-M2b, u jiżdied bit-trattament D-Tesa (Fig. S6E†).

Barra minn hekk, is-soppressor tas-sinjalar taċ-ċitokini (SOCS) huwa familja ta 'proteini intraċellulari li jirregolaw il-polarizzazzjoni fenotipika tal-mikroglia billi jrażżnu mogħdijiet ta' sinjalazzjoni multipli attivati ​​minn ċitokini.69 SOCS1 huwa membru wieħed ta 'din il-familja, u ġie muri li jinibixxi LPS/TLR4. medjat NF-κB u sinjalazzjoni JAK2, u b'hekk tnaqqas l-ammont ta 'TNF-, IL-1, u IL{-6 rilaxxati mill-mikroglia M1 permezz tal-mogħdija LPS/TLR4.

D-Tesa upregulates expressionof SOCS1 meta mqabbel mal-kontroll LPS-only (Fig. S6F†), jissuġġerixxi li ż-żieda fl-IL-6, TNF- u IL-1 esibiti minn D-Tesacould tkun dovuta għall-induzzjoni tal- Fenotip M2b u mhux permezz ta' titjib tal-LPS/TLR4, M1-fenotip li jinduċi.

Barra minn hekk, is-sinjali LPS permezz ta 'TLR4 u biex jipprevjenu attivazzjoni ċellulari eċċessiva, il-mikroglia għandhom mekkaniżmu ta' feedback negattiv li bih l-attivazzjoni ta 'TLR4 twassal għal espressjoni mnaqqsa ta' TLR4.70

It-trattament b'Tesa u D-Tesa ħielsa żied it-TLR4levels 3.6-darbiet (p <0.{001) u 3.7-darbiet (p < 0.001), rispettivament (Fig. 5F), li jissuġġerixxi li Tesa u D-Tesa biddlu l-passaġġ ta 'sinjalazzjoni ta' feedback negattiv tipiku LPS/TRL4.

For more information:1950477648nn@gmail.com