Il-kurkumina ttaffi s-senescence taċ-Ċelloli Stem Mesenchymal tal-Mudullun tal-Klieni Waqt l-Espansjoni In Vitro Parti 2

Jekk jogħġbok ikkuntattjaoscar.xiao@wecistanche.comgħal aktar informazzjoni

2.5.Autophagy Inovoloes fl-Eżerċizzju tal-Effett Protettiv tal-Kur f'cBMSC Senescence

Biex tesplora l-effett tal-awtofaġija indotta minn Cur fuq is-senescence cBMSC, il-livell tal-awtofaġija ġie modulat permezz tal-użu ta' RAP(200 nM) jew 3-MA (5 mM).3-MA teżerċita azzjoni inibitorja sinifikanti fuq l-attività awtofaġika, manifestat mir-regolazzjoni baxxa sinifikanti tal-espressjoni tal-mRNA tal-katina ħafifa tal-proteina 1 assoċjata mal-mikrotubuli 3(LC3), ġene relatat mal-awtofaġija (ATG)7, ATG12, u unc51-bħal kinażi li jattiva l-awtofaġija{12} {14}}(ULK1); it-tnaqqis tal-proporzjon ta' espressjoni ta' proteina 1 katina ħafifa 3 tat-tip Ⅱ/I (LC3-I/I) assoċjata mal-mikrotubuli; u l-espressjoni miżjuda ta 'p62 meta mqabbla mal-grupp ta' kontroll (Figura 5A, B). Għaldaqstant, meta mqabbel mal-grupp Cur, kien osservat tnaqqis fl-attività awtofaġika fil-grupp 3- MA flimkien ma 'Cur (Figura 5A, B). B'kuntrast, ġiet osservata żieda fl-attività awtofaġika fil-grupp RAP, kif muri mill-espressjoni mRNA regolata 'l fuq ta' LC3, ATG12, u ATG7; iż-żieda fil-konverżjoni ta' LC3-I għal LC3-II; u d-degradazzjoni ta 'p62 (Figura 5A, B).

L-ewwelnett, l-attività awtofaġika ġiet investigata b'mod sistematiku. Il-formazzjoni ta 'vakuoli awtofaġiċi (imsejħa wkoll autophagosomes) ġiet evalwata permezz ta' osservazzjoni morfoloġika, u r-riżultati indikaw li kien hemm aktar vakuoli awtofaġiċi u tikek LC3 fil-grupp Cur u grupp RAP meta mqabbla mal-grupp ta 'kontroll, filwaqt li numru mnaqqas ta' vakuoli awtofaġiċi u ġew osservati inqas tikek LC3 fil-gruppi 3-MA u 3-MA flimkien ma 'Cur (Figura 5C, E). Barra minn hekk, it-tbajja' ta' LysoTracker indikat li l-aċidifikazzjoni liżosomali tjiebet minn RAP u Cur f'cBMSCs u naqset f' il-gruppi 3-MA u 3-MA flimkien ma' Cur (Figura 5D). Ir-riżultati juru li Cur u RAP jeżerċitaw effett pożittiv simili fuq l-attivazzjoni awtofaġika u li l-attività awtofaġika hija mrażżna minn 3-MA.daqs tal-pene cistanche,Madankollu, l-effetti ta' inibizzjoni ta' 3-MA fuq l-awtofaġija jistgħu jiġu parzjalment salvati bl-impjieg ta' Cur.

Jekk jogħġbok ikklikkja hawn biex tkun taf aktar

Biex tikkonferma jekk l-awtofaġija tipparteċipax fir-regolamentazzjoni tas-senescence CB MSc, aħna eżaminajna aktar il-fenotipi assoċjati mas-senescence wara li ppromwovejna jew soppressjoni l-awtofaġija permezz ta 'trattament farmakoloġiku. Ir-riżultati wrew li numru mnaqqas ta' ċelluli SA- -gal-pożittivi kienu preżenti fil-gruppi Cur u RAP, filwaqt li numru akbar ta' ċelluli SA- -gal-pożittivi kienu osservati fil-{{5} }Grupp MA meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll. Ta 'min jinnota li n-numru ta' ċelloli pożittivi għal SA- -gal żdied b'mod sinifikanti fil-grupp 3-MA flimkien ma 'Cur meta mqabbel mal-grupp Cur (Figura). Ir-riżultati ta' analiżi RT-qPCR indikaw li t-trattament b'RAP u Cur żied il-livell ta' espressjoni ta' SOX-2 u Nanog u naqqas il-livell ta' espressjoni ta' IL-6, TNF-a, p21, u p16 meta mqabbla mal-grupp ta' kontroll. Madankollu, l-inibizzjoni tal-awtofaġija minn 3-MA irregolat 'l fuq l-espressjoni ta' p16, p21, TNF- , u IL-6 (Figura 6C-E). Barra minn hekk, meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll, l-effiċjenza tal-formazzjoni tal-kolonji ta' cBMSCs żdiedet fil-gruppi Cur u RAP, filwaqt li n-numru u d-daqs ta 'CFU-F naqsu b'mod sinifikanti fil-grupp 3-MA. Barra minn hekk, intwera li l-effett imsaħħaħ ta 'Cur fuq in-numru ta' cBMSCs li jiffurmaw il-kolonji jista 'jiġi abolit permezz ta' prekondizzjonament b'3- MA (Figura 6B).cistanche trabDin l-evidenza tindika li RAP u Cur jistgħu jtejbu s-senesxxenza cBMSC, filwaqt li 3-MA taggrava s-senescenza cBMSC u ttaffi l-effetti ta' benefiċċju eżerċitati minn Cur.

Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-inibizzjoni tal-awtofaġija b'{0}}MA taċċellera s-senescence cBMSCs, filwaqt li l-attivazzjoni tal-awtofaġija b'Cur u RAP ittaffi s-senescence cBMSC (Figura 6F). Notevolment, l-effetti protettivi eżerċitati minn Cur ġew attenwati permezz ta 'trattament minn qabel b'3-MA (Figura 6F), li jissuġġerixxi li l-awtofaġija indotta minn Cur hija mekkaniżmu molekulari potenzjali għat-titjib tas-senescence cBMSC.

3. Diskussjoni

L-organiżmi jsewwu kontinwament it-tessuti midruba u jtardjaw il-proċessi relatati mas-senescence minħabba l-karatteristiċi distintivi funzjonali tal-MSCs li jirrisjedu b'mod estensiv f'diversi tessuti u organi [15]. Sfortunatament, l-età u l-mard huma fatturi ewlenin għas-senescenza tal-MSC in vivo, u d-differenzi interni u esterni fl-ambjenti ċellulari jaċċelleraw il-kultura in vitro tas-senescenza tal-MSC, li t-tnejn jaffettwaw b'mod negattiv il-kapaċità tagħhom għall-immunosoppressjoni, id-divrenzjar u l-migrazzjoni, u fl-aħħar mill-aħħar inaqqsu l-effikaċja tal-awto. -tiswija u trapjant f'MSCs [7,14,49-51].estratt tas-salsa cistancheOja u l-kollegi indikaw li l-BMSCs umani waqfu l-proliferazzjoni fil-ħames sad-disa’ passaġġ ta’ kulturi ta’ grad kliniku u wrew fenotipi ta’ senescence tipiċi, bħal morfoloġija ipertrofika u ċatta, l-attivazzjoni ta’ inibituri taċ-ċiklu taċ-ċelluli kinase p16 u p21, rata ta’ proliferazzjoni mnaqqsa. , u attività msaħħa ta' SA- -gal [52]. Evidentement, l-espansjoni in vitro inevitabbilment toħloq id-dehra prematura ta 'senescence fl-MSCs, li huma kkunsidrati bħala sistema mudell importanti għar-riċerka in vitro dwar ix-xjuħija ċellulari [42, A4, A5]. L-istudju preżenti tagħna sab li s-cBMSCs qabel it-tielet passaġġ wrew morfoloġija uniformi iżda kienu osservati li jgħaddu minn serje ta 'bidliet f'termini ta' morfoloġija ċellulari, fiżjoloġija, u espressjoni tal-ġeni wara s-6 passaġġ (Figuri 2 u 7), konsistenti ma 'senescence prematura. .

Cistanche jista 'anti-aging

Ammont dejjem jikber ta 'evidenza tindika li l-istimulazzjoni farmakoloġika hija approċċ promettenti biex jiġu salvati l-MSCs mis-senescence [53,54]. B'dan f'moħħu, għadd ta 'komposti naturali u sintetiċi ġew investigati b'mod estensiv sabiex jiġi ddeterminat il-potenzjal anti-infjammatorju, antiossidant, u kontra s-senescence tagħhom in vivo u in vitro [15,55]. Bħala kompost fenoliku li jseħħ b'mod naturali, Cur qajjem attenzjoni kbira minħabba l-effetti ta 'benefiċċju tiegħu fuq il-bijoloġija MSC [36,37,56,57]. Madankollu, l-effetti kumplessi tal-espożizzjoni tal-Kur fuq l-MSCs għandhom jiġu kkunsidrati bir-reqqa qabel l-implimentazzjoni ta 'riċerka bijomedika differenti. Yang u l-kollegi rrappurtaw li konċentrazzjonijiet għoljin ta 'Cur (50 u 100 uM) jistgħu jinduċu effetti tossiċi akuti f'BMSCs umani in vitro, filwaqt li l-espożizzjoni kontinwa (7 d) għal 10uM ta' Cur jinibixxi l-proliferazzjoni tal-BMSC tal-bniedem u jinduċi l-apoptożi taċ-ċelluli [58]. Interessanti, studju ieħor indika li t-trattament b'Cur(<20 um)for="" 5="" days="" ameliorates="" h,="" o,-induced="" oxidative="" stress="" in="" human="" adscs[56].="" additionally,="" cur="" preconditioning="" （1="" μm="" and5um）="" for="" 24="" or="" 48h="" can="" help="" to="" maintain="" cellular="" viability="" and="" improve="" the="" lifespan="" of="" rat="" adscs[36,57.="" our="" results="" demonstrated="" that="" cur(1="" um="" and="" 10="" μm）="" was="" able="" to="" maintain="" the="" viability="" of="" cbmscs="" and="" alleviate="" cbmsc="" senescence="" after="" exposure="" for="" 24="" h,="" while="" the="" colony-forming="" efficiency="" of="" cbmscs="" was="" significantly="" decreased="" at="" a="" dose="" of="" 10="" μm（figure="" 3）.="" therefore,="" the="" beneficial="" effects="" of="" cur="" （10="" umd="" may="" be="" attributed="" to="" short-term="" stimulation,="" and="" it="" can="" impair="" the="" proliferation="" potential="" of="" cbmscs="" in="" the="" long="">

Riċentement, l-attivitajiet bijoloġiċi ta 'Cur ġew irrappurtati b'mod estensiv fuq diversi mudelli in vitro jew in vivo, partikolarment fir-rigward tal-modulazzjoni tal-karatteristiċi bijoloġiċi tal-MSCs. L-attività kontra t-tixjiħ ta 'Cur ġiet diskussa ta' spiss, u Cur instab li juri effetti ta 'benefiċċju fuq ix-xjuħija u mard relatat ma' l-età fil-livelli organiżmi u ċellulari. Madankollu, il-mekkaniżmu sottostanti r-regolamentazzjoni tiegħu huwa kkumplikat minħabba d-dożi u l-forom differenti ta 'Cur, kif ukoll il-mekkaniżmu tat-tixjiħ [19]. Bħala mekkaniżmu intraċellulari ewlieni tad-degradazzjoni tal-molekula u t-tibdil tal-organelle, l-awtofaġija għandha rwol ewlieni fil-protezzjoni tal-MSCs kontra l-kundizzjonijiet tal-istress u ż-żamma tal-omeostasi ċellulari. Il-modulazzjoni tal-awtofaġija hija kkunsidrata bħala strateġija ġdida għat-titjib tal-funzjonijiet tal-MSC [59]. Skont dejta miġbura minn studji sostanzjali, il-promozzjoni jew is-soppressjoni tal-awtofaġija minn Cur f'diversi mudelli ta 'ċelluli jeżerċitaw effetti ċitoprotettivi sodisfaċenti [38-40].cistanche zokkId-dejta tagħna wriet li ġiet osservata żieda fl-attività awtofaġika wara l-espożizzjoni għal Cur, kif identifikat mir-regolazzjoni 'l fuq ta' ġeni relatati mal-awtofaġija (LC3, ULK1, Atg7, u Atg12), ġenerazzjoni ta 'LC3-II, żieda fin-numru ta' vakuoli awtofaġiċi u organelli vesikulari aċidużi, u tnaqqis sinifikanti fil-livell tal-proteina p62 (Figura 4). Barra minn hekk, il-liżosoma huwa meqjus bħala organelle indispensabbli għall-awtofaġija, filwaqt li d-disregolazzjoni tal-pH liżosomali u l-alterazzjoni tal-attività vacuolar H plus -ATPase (v-ATPase) ġew osservati fil-proċess ta 'senescence MSC, u b'hekk jippromwovu l-aċidifikazzjoni u l-awtofaġija liżosomali u jikkontribwixxu. biex jittardja s-senescenza tal-MSC [60]. Yan u l-kollegi indikaw li Cur jista 'jattiva l-funzjoni liżosoma tal-fibroblasti embrijoniċi tal-ġrieden (MEFs) u jinduċi awtofaġija, li sservi bħala sinjal ta' sopravivenza kruċjali [38]. Bl-istess mod, osservajna li t-trattament ta 'Cur itejjeb l-aċidifikazzjoni liżosomali f'cBMSCs (Figura 4), li jissuġġerixxi li Cur jista' jkun involut fl-attivazzjoni tal-funzjoni liżosomali, li hija indispensabbli biex tittejjeb l-attività awtofaġika.

L-awtofaġija hija prinċipalment mekkaniżmu ċitoprotettiv, u ammont dejjem jikber ta 'evidenza indikat li l-proprjetajiet kontra t-tixjiħ ta' komposti naturali u sintetiċi huma korrelatati mal-modulazzjoni awtofaġika [29,54,61,62]. Madankollu, l-effetti tal-modulazzjoni awtofaġika fuq is-senescenza tal-MSC u l-mekkaniżmi korrispondenti għadhom ma ġewx evalwati u esplorati bis-sħiħ. Rapporti inizjali indikaw li l-awtofaġija hija mekkaniżmu predominantement ċitoprotettiv u li livell miżjud ta 'awtofaġija jista' jdewwem is-senescenza ċellulari billi jnaqqas l-akkumulazzjoni ta 'metaboliti tossiċi u jirrestawra l-funzjoni tal-organelli [63]. Interessanti, investigazzjonijiet reċenti wrew ukoll li għadd akbar ta’ vakuoli awtofaġiċi u proteini relatati mal-awtofaġija (LC3-II, ATG7, u ATG12) ġew osservati matul is-senescenza tal-MSC, filwaqt li l-inibizzjoni tal-awtofaġija b’bafilomycin A1 u {{11 }}MA intwera li jnaqqas il-perċentwal ta' ċelloli pożittivi għal SA- -gal u l-espressjoni ta' p16 u p21 [35]. Biex tiġi spjegata aktar ir-relazzjoni bejn l-awtofaġija indotta minn Cur u l-effetti tagħha fuq is-cBMSCsenescence, l-awtofaġija ġiet modulata bi trattament minn qabel b'rapamicin jew 3-MA. Ovvjament, l-attività awtofaġika nstabet li kienet attenwata minn 3-MA, filwaqt li RAP u Cur (1 uM) intwerew li jtejbu l-awtofaġija b'mod sinifikanti (Figura 5). B'mod konsistenti mar-rapporti preċedenti [5], is-sejbiet tagħna juru wkoll li l-inibizzjoni tal-awtofaġija minn 3-MA aċċellerat is-senescence ċellulari f'cBMSCs. Intwerew cBMSCs. Għaldaqstant, meta l-awtofaġija ġiet inibita minn 3-MA, l-effetti protettivi eżerċitati minn Cur naqsu (Figura ), li jissuġġerixxi li l-awtofaġija indotta minn Cur hija mekkaniżmu molekulari potenzjali għat-titjib tas-senescence cBMSC (Figura 7).

Taħt kundizzjonijiet fiżjoloġiċi, l-awtofaġija sseħħ f'livell bażali fiċ-ċelloli ewkarjotiċi kollha biex tinżamm l-omeostasi ċellulari. Madankollu, diversi kundizzjonijiet ta 'stress jistgħu jwasslu għal awtofaġija anormali, li għandha influwenza fuq id-destin taċ-ċelluli sakemm l-awtofaġija ma tiġix restawrata għal livell ottimali [41,44,64]. L-evidenza tagħna kkonfermat li l-awtofaġija indotta minn Cur turi effetti ta 'benefiċċju fuq ir-regolamentazzjoni tas-senescence cBMSC. F'dan ix-xenarju, diversi stimuli li jipproduċu stress u settings extraċellulari għandhom jiġu kkunsidrati bir-reqqa qabel it-trattament ta 'Cur, u jkun interessanti li jiġi investigat jekk l-awtofaġija indotta minn Cur tistax ittejjeb b'mod selettiv il-funzjoni ta' MSCs f'doża u tul predeterminati. Barra minn hekk, sistema ta 'konsenja tal-kurkumina bbażata fuq in-nanoteknoloġija wriet livelli aħjar ta' solubbiltà u bijodisponibilità fil-fażi akwea [65,66]; tista' tkun għodda promettenti li biha tittardja u tikkontrobatta s-senescenza tal-MSC. It-tweġiba għall-mistoqsija dwar jekk l-awtofaġija hijiex il-mekkaniżmu sottostanti primarju fid-dewmien tas-senescenza tal-MSC għadha teħtieġ aktar dettalji li se jiġu pprovduti minn riċerka futura.

4. Materjali u Metodi

4.1.Annimali

Inġabru kampjuni tal-mudullun minn 6 klieb rurali Ċiniżi nisa adulti b'saħħithom (12-ta' xahar). L-istudji kollha ġew approvati mill-Kumitat tal-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Fakultà tal-Università Agrikola ta 'Sichuan (l-approvazzjoni nru.2020-0608) u mwettqa skont l-istandards etiċi tal-liġijiet tal-protezzjoni tal-annimali tar-Repubblika Popolari taċ-Ċina.

4.2. Preparazzjoni ta' Soluzzjoni tal-Kurkumina

Cur(HPLC akbar minn jew ugwali għal 98 fil-mija, numru CAS:458-37-7; Solar Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China) ġie maħlul f'DMSO għal konċentrazzjoni ta' stokk ta' 20 mmol/ L. iffiltrat minn membrana ta' filtru mikroporuża organika ta' 0.22 μm u maħżuna fi -80 grad . Soluzzjonijiet ta' Cur differenti ġew ippreparati f'mezz għal studju in vitro.

4.3. Kultura taċ-Ċelloli u Espansjoni

cBMSCs inkisbu mill-mudullun. Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​f'medju komplut li jikkonsisti f'Dulbecco's Modified Eagle Medium (LG-DMEM, Gibco Grand Island, NY, USA), 10 fil-mija serum bovin tal-fetu (FBS, TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, Ċina). ), u 1 fil-mija penicillin/streptomycin. F'konfluwenza ta' 80-90 fil-mija, iċ-ċelloli aderenti ġew rilaxxati b'Trypsin Digestion Solution (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, iċ-Ċina) u espandew aktar fi proporzjon ta' 1:2-1:3 [67 ].

4.4. Tkabbir taċ-Ċelloli Curie

Biex tiġi ddeterminata l-abbiltà proliferattiva ta 'cBMSCs f'passaġġi (P) 3,6, u 9, iċ-ċelluli ġew miżrugħa fi tliet 48-pjanċi bir (2500 ċellula/bir). Wara 48 siegħa ta 'inkubazzjoni, iċ-ċelloli ġew rilaxxati b'Trypsin Digestion Solution u magħduda b'emoċitometru. Il-proċedura tal-għadd taċ-ċelluli ġiet ripetuta kull 48 siegħa u sostnuta għal 14 d.

4.5.Sejbien ta' Immunofenotip ta' cBMSCs permezz ta' Flow Cytometry

Fit-tielet passaġġ, cBMSCs ġew maħsula bil-PBS u trypsinized. Iċ-ċelloli (3 × 105 ċelluli/mL) ġew sospiżi mill-ġdid fil-buffer tat-tbajja ', u s-sospensjonijiet taċ-ċelluli （100 μL） ġew inkubati b'antikorpi monoklonali b'tikketta fluworexxenti FITC, PE, jew APC kontra l-antiġeni tal-wiċċ CD45, CD34, u ITGB1 (eBioscience, San Diego, CA, USA) u CD31, CD90, u CD105 nonfluorescent-tikkettjati (Biosynthesis biotechnology Co.Ltd. Beijing, China) għal 15-il minuta f'4 gradi. Iċ-ċelloli ġew maħsula bil-PBS u inkubati b'IgG tal-mogħoż kontra l-fenek konjugat bil-FITC għal 15-il minuta f'4 gradi. L-antiġeni tal-wiċċ ġew skoperti permezz ta 'ċitometrija tal-fluss (FACS Calibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). L-analiżi tad-dejta saret bis-softwer CytExpert.

4.6. Assaġġ tad-Differenzjazzjoni In Vitro

cBMSCs ġew ibbanjati f'densità ta '5 × 104 ċelluli/mL fi 6-pjanċi ta' bir. Fi 70-80 fil-mija ta 'konfluwenza, il-mezz sħiħ ġie sostitwit b'mezz ta' induzzjoni ta 'divrenzjar osteoġeniku jew adipoġeniku u mibdul kull 3 ijiem (Cvagen, Suzhou, iċ-Ċina). Id-depożizzjoni tal-kalċju ġiet skoperta permezz ta 'tbajja' ta' Alizarin Red S (Solarbio, Beijing, Ċina) wara 3 ġimgħat ta 'induzzjoni osteoġenika u akkumulazzjoni ta' qtar tal-lipidi ġiet osservata bl-użu ta 'tbajja 'Oil Red O (Solarbio, Beijing, China) wara 2 ġimgħat ta' induzzjoni adipoġenika.

4.7.Effett tal-Kur fuq il-Vijabilità Ċellulari

Il-vijabbiltà ċellulari tas-cBMSCs ġiet iddeterminata bl-użu tas-CCK-8kit (Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, iċ-Ċina).cistanche tubulosa benefiċċji u effetti sekondarjicBMSCs ġew ikkultivati ​​minn qabel fi 96-platt tajjeb għal 24 siegħa. cBMSCs ġew ittrattati b'Cur f'konċentrazzjonijiet differenti (0.1, 0.5, 1, 5, u 1{ {14}} umol/L) għal 12h, 24h, 48h, u 72h. Iċ-ċelloli ġew ittrattati b'0.1 fil-mija ta' DMSO, li ntuża bħala kontroll. Wara l-inkubazzjoni b'10 μL ta' soluzzjoni CCK-8 għal kull bir għal 2 sigħat, id-densità ottika ġiet imkejla minn microplate reader f'450 nm (Thermo Scientific, Waltham, MA, l-Istati Uniti). Il-vijabbiltà relattiva taċ-ċelluli ġiet ikkalkulata skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur.

4.8. Assaġġ tal-Formazzjoni tal-Kolonji

L-effiċjenza ta 'tiġdid awtonomu ta' cBMSCs ġiet skoperta bl-użu ta 'assay ta' fibroblast ta 'unità li jifforma kolonja （CFU-F）. cBMSCs kienu miżrugħa （3× 10² ċelluli/bir） fi 6-pjanċi tal-bir. Wara ġimgħatejn ta 'kultura, iċ-ċelloli ġew iffissati b'4 fil-mija paraformaldehyde għal 30 min u osservati taħt mikroskopju maqlub (LX73, Olympus Corporation, Tokyo, Ġappun) wara t-tebgħa b'1 fil-mija vjola kristall għal 10 min. Għall-CFU-F, ġew magħduda aktar minn 50 ċellula. L-effiċjenza CFU-F ġiet ikkalkulata kif ġej:

Effiċjenza CFU-F=numru ta' CFU-F/numru ta' żerriegħa (300 ċellula)[68].

4.9. Beta-Galactosidase Tbajja Assay

L-attività ta' -galactosidase assoċjata mas-senescence (SA- -gal) f'cBMSCs ġiet stmata bl-użu tal-kit tat-tbajja' SA- -gal (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur . Wara t-tebgħa, iċ-ċelloli ġew eżaminati taħt mikroskopju maqlub. Ċelloli mtebbgħin b'mod pożittiv ġew magħduda biex tiġi vvalutata s-senescence ċellulari.

4.10.Traskrizzjoni inversa PCR kwantitattiva f'ħin reali (RT-qPCR)

L-RNA totali ġie estratt mill-gerbub taċ-ċelluli bl-użu tal-metodu tar-reaġent Trizol. cDNA ġie sintetizzat bl-użu tal-kit tar-reaġent PrimeScriptTM RT mal-gDNA Eraser (Takara, Shiga, Ġappun). PCR primers (Tabella 2) minbarra GAPDH b'referenza għal studji preċedenti [67] ġew iddisinjati bl-użu tas-softwer Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ibbażat fuq sekwenzi cDNA. Il-qPCR twettqet bl-użu ta 'TB Green PCR Mix (Takara, Shiga, Japan) fuq is-Sistema ta' Sejbien PCR CFX96 Touch Real-time (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Il-kundizzjonijiet ta' reazzjoni kienu kif ġej: 95 grad għal 30 s u mbagħad 39 ċiklu ta' 95 grad għal 5s u 60 grad għal 30 s. Twettqet analiżi tal-kurva tat-tidwib li tibda f'95 grad għal 10s, imbagħad tvarja minn 65 sa 95 grad, li tiżdied b'0.5 grad kull ċiklu. GAPDH intuża bħala kontroll intern biex tiġi normalizzata d-dejta kollha u l-espressjoni relattiva ġiet ikkalkulata permezz tal-metodu komparattiv tal-Limita taċ-Ċiklu (Ct).

4.11. Traċċar ta 'Lusomal UIsing LysoTracker

Lyso-Tracker Red (Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) intuża biex jintraċċa l-liżosomi, li jistgħu juru intensità ta 'fluworexxenza miżjuda mal-aċidifikazzjoni liżosomali. Żergħajna cBMSCs fi pjanċi 12-tajjar u ttrattatihom b'Cur għal 24 siegħa, imbagħad iċ-ċelloli ġew ittrattati b'Lyso-Tracker (60 nM) u Hoechst 33,342 (2 ug/mL) għal 20 min. Il-fluworexxenza ġiet osservata bl-użu ta 'mikroskopju ta' fluworexxenza invertita wara l-ħasil bil-PBS.

4.12. Immunofluworexxenza

Is-cBMSCs (2 × 104 ċelluli/slide) ġew miżrugħa fuq slides u ffissati b'4 fil-mija paraformaldehyde għal 30 min. Wara ko-inkubazzjoni b'0.5 fil-mija Triton X-100 għal 5 min (Solarbio, Beijing, iċ-Ċina), is-sezzjonijiet ġew mgħaddsa fis-soluzzjoni tal-imblukkar għal 30 min. Il-likwidu magħluq tneħħa, u ċ-ċelloli ġew inkubati b'antikorpi anti-LC3B (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) matul il-lejl f'4 gradi, imbagħad inkubati b'antikorpi sekondarji konjugati bil-fluorokrom (Abcam, Cambridge, MA, USA) għal 50 min f'37 grad C. Fl-aħħarnett, iċ-ċelloli ġew counterstained b'DAPI (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) u mmonitorjati taħt mikroskopju konfokali.

4.13.Analiżi tal-Western Blotting

Il-kampjuni taċ-ċelluli ġew lisati bit-tessut u l-lisat taċ-ċelluli (Solarbio, Beijing, iċ-Ċina) li fihom inibitur tal-protease wara ħasil b'PBS kiesaħ bis-silġ. Il-lysates taċ-ċelluli li fihom 15-il ug ta 'proteina għal kull kampjun ġew mgħobbija f'ġels ta' sodium-dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PA) (Solarbio, Beijing, China) u separati b'elettroforeżi. Wara li ttrasferixxi l-proteini fuq il-membrana tal-polyvinylidene fluoride (PVDF), dan tal-aħħar ġie mblukkat b'mod mhux speċifiku b'5 fil-mija ħalib xott bla xaħam (Solarbio, Beijing, Ċina) għal siegħa f'temperatura tal-kamra. Il-membrani ġew inkubati matul il-lejl bl-antikorpi primarji anti-LC3B (1:2000, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-p62/SQSTM1 (1:4000, Novus Biologicals, Littleton, NH, USA). ), u anti- -actin (1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA) f'4 gradi , u l-blots ġew maħsula b'TBST(Solarbio, Beijing, China) qabel ma jiġu inkubati b'antikorp sekondarju (1 :2000, Abcam, Cambridge, MA, USA) f'37 grad għal siegħa. Sussegwentement, il-membrani ġew żviluppati b'espożizzjoni għal reaġenti kimiluminixxenti (Millipore, Billerica, MA, USA) u viżwalizzati b'ChemiDocTM Imaging Systems (Tanon-5200, Shanghai, iċ-Ċina). Id-densità tal-medda ġiet ikkwantifikata bl-użu ta 'softwer Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) għal kull grupp u normalizzata b'-actin.

4.14. Mikroskopija Elettronika ta' Trażmissjoni (TEM)

Il-pellet taċ-ċelluli ġie diġerit u miġbur f'tubu ċentrifugu ta '1.5mL, imbagħad iffissat b'2.5 fil-mija glutaraldehyde (Solarbio, Beijing, China) għal 2 sigħat f'temperatura ambjentali. Il-kampjuni ġew imwaħħla wara b'1 fil-mija tetrossidu tal-osmju għal siegħa wara l-ħasil bil-PBS, imbagħad żidna d-deidrazzjoni b'mod gradwali f'soluzzjonijiet ta 'aċetun u inkorporawhom f'812 reżina epoxy (Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd., Bejing, iċ-Ċina). Sussegwentement, inkisbu sezzjonijiet ta '50 nm mill-ultra-microtome (EM UC7, Leica Microsystems Co., Ltd., Heidelberg, il-Ġermanja). Is-sezzjonijiet kienu mtebbgħin b'uranyl acetate (Zhongjingkevi, Bejing, iċ-Ċina) għal 10-15 min u ċomb citrate (Zhongjingkei, Beijing, China) għal 2 min. Il-kampjuni kollha dehru fuq TEM (EM-1400PLUS, JEOL, Akishima, Tokyo, Ġappun).

4.15. Analiżi Statistika

Ir-riżultati nkisbu minn tliet esperimenti indipendenti u d-dejta kollha ntweriet bħala mezzi ± devjazzjonijiet standard (SD). Il-valuri statistiċi ġew analizzati bl-użu tal-IBM SPSs Statistics 25 u illustrati bl-użu ta' GraphPad Prism 9.0(GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Differenzi statistikament sinifikanti ġew determinati bl-użu mwettqa bl-użu ta 'analiżi one-way tal-varjanza (ANOVA) u t-test ta' Student. valuri p<0.05 were="" considered="" to="" be="" significant="">

5. Konklużjonijiet

Is-sejbiet tagħna jitfgħu dawl fuq ir-relazzjoni bejn Cur, cBMSC senescence, u awtofaġija. Id-dejta mill-istudju tagħna tissuġġerixxi li Cur jista 'jtaffi l-istat ta' senescence ta 'cBMSCs filwaqt li jattiva l-awtofaġija u jippromwovi l-aċidifikazzjoni lisosomali. Barra minn hekk, aktar evidenza wriet li l-awtofaġija indotta minn Cur hija mekkaniżmu potenzjali għat-titjib tas-senescence cBMSC. Cur jista 'jkun attivatur promettenti u konservatur għat-titjib tal-funzjoni tal-MSCs. Fl-opinjoni tagħna, l-effetti pożittivi ta 'Cur fuq it-tixjiħ ma jistgħux jiġu traskurati. Studji futuri għandhom jiffokaw fuq l-effett tar-regolamentazzjoni ta 'Cur fuq id-destin tal-MSC biex itejbu l-potenzjal terapewtiku tal-MSCs f'diversi mard, bħal ħsara fit-tessuti u mard deġenerattiv u infjammatorju.

Dan l-artikolu huwa estratt minn Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms