Il-kurkumina ttaffi s-senescence taċ-Ċelloli Stem Mesenchymal tal-Mudullun tal-Klieni Waqt l-Espansjoni In Vitro

Jekk jogħġbok ikkuntattjaoscar.xiao@wecistanche.comgħal aktar informazzjoni

Astratt:Senescence fiċ-ċelloli staminali mesenkimali (MSCs) mhux biss ixekkel l-applikazzjoni ta 'MSCs fil-mediċina riġenerattiva iżda hija wkoll korrelata mill-qrib mat-tixjiħ bijoloġiku u l-iżvilupp ta' mard deġenerattiv. F'dan l-istudju, investigajna l-effetti kontra t-tixjiħ tal-curcumin (Cur) fuq MSCs (cBMSCs) derivati ​​mill-mudullun tal-klieb u spjegajna aktar il-mekkaniżmu potenzjali ta 'azzjoni bbażat fuq il-modulazzjoni tal-awtofaġija. cBMSCs ġew estiżi in vitro bi proċeduri standard biex jinbena mudell taċ-ċelluli ta 'senescence prematura.cistanche dożaġġ redditL-evidenza tagħna tindika li meta mqabbla mat-tielet passaġġ ta 'cBMSCs, ħafna fenotipi tipiċi assoċjati mas-senescence ġew osservati fis-sitt passaġġ ta' cBMSCs. It-trattament b'Cur jista' jtejjeb is-sopravivenza cBMSC u jtardja s-senescence cBMSC skont osservazzjonijiet li t-trattament Cur(1 uM) jista' jtejjeb l-effiċjenza tal-fibroblasts unit-forming colony (CFU-Fs) u jirregola l-espressjoni tal-mRNA ta' fatturi ta' traskrizzjoni pluripotenti (SOX{{5} } u Nanog), kif ukoll jinibixxi l-attivitajiet tal-beta-galactosidase (SA- -gal) assoċjati mas-senescence u l-espressjoni tal-mRNA tal-markaturi relatati mas-senescence (pl6 u p21) u molekuli pro-infjammatorji (fattur tan-nekrożi tat-tumur- (TNF-a)u interleukin-6(IL{-6)). Barra minn hekk, Cur（0.1 uM ~ 10μM） ġie osservat li jżid l-attività awtofaġika, kif identifikat permezz ta' regolazzjoni 'l fuq tal-proteina 1 katina ħafifa 3 (LC3) assoċjata mal-mikrotubuli, unc51-bħal kinażi li jattiva l-awtofaġija -1 (ULK1), ġene relatat mal-awtofaġija (Atg)7 u Atg12, u l-ġenerazzjoni tat-tip II tal-katina ħafifa 3(LC3-II), u b'hekk jiżdiedu l-vakuoli awtofaġiċi u l-organelli vesikulari aċidużi, kif kif ukoll tikkawża tnaqqis sinifikanti fil-livell tal-proteina p62. Barra minn hekk, l-attivatur autophagy rapamycin (RAP) u Cur instabu li jtejbu parzjalment il-karatteristiċi senescent ta 'cBMSCs, filwaqt li l-inibitur autophagy 3-methyladenine ({3-MA) intwera li jaggrava s-senescence cBMSCs u t-trattament ta' Cur kien kapaċi jirrestawraw l-awtofaġija mrażżna u jikkontrobattu 3-senescence cBMSC indotta mill-MA. Għalhekk, l-istudju tagħna jenfasizza r-rwol importanti tal-awtofaġija indotta minn Cur u l-effetti tagħha fuq it-titjib tas-senescence cBMSC u jipprovdi għarfien ġdid biex jittardja s-senescence u jtejjeb il-potenzjal terapewtiku tal-MSCs.

Jekk jogħġbok ikklikkja hawn biex tkun taf aktar

Kliem ewlieni:kurkumina;senescence; awtofaġija; ċelluli staminali mesenkimali derivati ​​mill-mudullun tal-klieb

1. Introduzzjoni

It-tixjiħ u l-lonġevità dejjem kienu suġġetti seduttivi għall-organiżmi. Bħala tip ta 'ċelluli staminali adulti bil-kapaċità għal awto-tiġdid, immunosoppressjoni, differenzjazzjoni, u migrazzjoni, iċ-ċelloli staminali mesenkimali (MSCs) joqogħdu b'mod estensiv f'diversi tessuti u organi, bħall-mudullun, tessut xaħmi, fluwidu amnjotiku, plaċenta, umbilikali. korda, u muskolu [1,2], u għandhom rwol essenzjali fiż-żamma tal-omeostażi tat-tessuti matul il-ħajja ta 'organiżmu [3,4]. L-evidenza akkumulata wriet li t-tixjiħ bijoloġiku u l-iżvilupp ta 'ħafna mard deġenerattiv jistgħu jattribwixxu għas-senescenza tal-MSC [5,6]. Barra minn hekk, l-MSCs huma sorsi promettenti ta’ terapija riġenerattiva bbażata fuq iċ-ċelluli, iżda ġeneralment jeħtieġ li jiġu estiżi in vitro biex jinkiseb in-numru minimu ta’ trapjant ta’ MSCs (20-100 miljun) għat-trattamenti [7]. Madankollu, il-kultura in vitro mhix kapaċi tissimula kompletament il-mikroambjent in vivo tal-MSCs, u inevitabbilment iqanqal is-senescence ċellulari [8,9]Is-senescence fiċ-ċelloli mitotiċi sseħħ b'reazzjoni għal varjetà ta' stressors, bħal disfunzjoni tat-telomeri [10], DNA ħsara [11], stress ossidattiv [12], u attivazzjoni tal-onkoġeni [13], u fl-aħħar mill-aħħar twassal għat-terminazzjoni tad-diviżjoni taċ-ċelluli. Barra minn hekk, l-MSCs senescent juru effett negattiv fuq il-funzjonijiet bijoloġiċi, inklużi l-immunomodulazzjoni, id-divrenzjar u l-migrazzjoni [14]. Ħafna xogħol ipprova jistabbilixxi strateġiji effettivi biex jittardja s-senescence fl-MSCs. Riċentement, bosta prodotti derivati ​​mill-ħxejjex ġew ssuġġeriti biex jippromwovu s-saħħa u l-lonġevità tal-organiżmi u jistgħu jkunu għodod promettenti biex jittardjaw is-senescenza tal-MSC [15].

Cistanche jista 'anti-aging

Curcumin(Cur), polifenol idrofobiku estratt mit-turmeric tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża, ġibed attenzjoni kbira minħabba l-effetti anti-infjammatorji, antiossidanti, anti-apoptotiċi, kontra t-tumur u kontra t-tixjiħ tiegħu fiċ-ċelloli tat-tessuti u xi mudelli ta 'mard [{ {4}}]. Bosta studji wrew li Cur għandu benefiċċji relatati mas-saħħa f'mard relatat mal-età, inkluż mard osteoartikulari, newroloġiku, riproduttiv u kardjovaskulari [20-24]. It-tixjiħ huwa assoċjat ma 'bidliet muskoloskeletali u l-bidu u l-progressjoni ta' mard osteoartikulari. Instab intervent kroniku tad-dieta b'Cur li jtejjeb il-funzjoni tal-mutur tal-idejn u ċ-ċifri fix-xadini ta 'età medja u kellu effetti ta' benefiċċju fuq il-muskoli skeletriċi anzjani [25,26]. Dejta disponibbli minn Buhrmann u l-kollegi wriet li Cur jista 'jnaqqas l-osteoartrite derivata mill-ambjent billi jibbilanċja s-sopravivenza tal-kondroċiti u r-risponsi infjammatorji [27,28]. Barra minn hekk, Cur jeżerċita effetti newroprotettivi permezz tal-medjazzjoni tal-awtofaġija u l-infjammazzjoni u għalhekk jista 'jkun terapija effettiva għal pazjenti b'mard newrodeġenerattiv, bħall-marda ta' Alexander, il-marda ta 'Alzheimer u l-marda ta' Parkinson [29,30].

Tabilħaqq, il-fatt li Cur jippossjedi attività plejotropika jista 'jiġi attribwit għall-effetti ta' attivazzjoni u protezzjoni tagħhom fuq MSCs [31,32]. Diversi studji kkonfermaw li Cur hija involuta fir-regolazzjoni tal-kapaċitajiet immunomodulatorji; il-potenzjal differenzjali ta 'MSCs għal nisel taċ-ċelluli differenti (newroċiti, kondroċiti, adipoċiti, u osteoblast), u f'mekkaniżmi ta' sinjalazzjoni multipli huwa involut f'dan il-proċess [2831,33-35]. Barra minn hekk, Cur huwa wkoll meqjus bħala antiossidant tajjeb li bih ittejjeb il-ħajja taċ-ċelloli staminali mesenkimali (ADSCs) derivati ​​mit-tessut xaħmi tal-firien minħabba ż-żieda fl-espressjoni tal-ġene telomerase reverse transcriptase (TERT) [36]. Studju reċenti wera li l-inibizzjoni ta 'p65 minn Cur tista' tipprevjeni s-senescence ċellulari u l-attivazzjoni infjammatorja f'MSCs derivati ​​mill-kurdun taż-żokra tal-bniedem [37].benefiċċji ta 'estratt ta' cistancheOvvjament, aktar attenzjoni ġiet iffukata fuq l-effetti kontra t-tixjiħ ta 'Cur f'MSCs minħabba l-potenzjal terapewtiku enormi tagħhom, iżda l-mekkaniżmi sottostanti dan l-effett għadhom mhux ċari. Xi evidenza minn studji in vitro kkonfermat li l-effetti ta 'benefiċċju eżerċitati minn Cur għandhom jiġu attribwiti għall-modulazzjoni tiegħu ta' awtofaġija [29,38-41]. Han u l-kollegi wrew li Cur jista 'jipproteġi ċ-ċelloli endoteljali tal-vina umbilikali tal-bniedem (HUVECs) minn ħsara ossidattiva indotta minn H2O2-u li l-effetti pożittivi jseħħu bit-titjib tal-awtofaġija permezz ta' phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt/ mira mammiferi ta' inibizzjoni ta' rapamycin (mTOR) [40]. Studju ieħor wera li Cur huwa kapaċi jippromwovi s-sopravivenza taċ-ċelluli billi jinibixxi l-apoptosi indotta minn ipoksja/riossiġenazzjoni (H/R) u awtofaġija eċċessiva fost kardjomijoċiti [41]. Għalhekk, jekk Cur iwettaqx bħala regolatur pożittiv jew negattiv tal-awtofaġija jiddependi fuq l-istimolu li jipproduċi stress u l-issettjar ċellulari, u huma meħtieġa aktar dettalji biex jiddeterminaw jekk il-modulazzjoni tal-awtofaġija minn Cur hijiex strateġija effettiva biex tittardja s-senescence tal-MSC. Bħala prinċipju ta 'degradazzjoni u mogħdija ta' riċiklaġġ għal sustanzi intraċellulari, l-awtofaġija għandha rwol kruċjali fiż-żamma tal-omeostażi ċellulari u tiflaħ għall-pressjoni ambjentali u wriet il-potenzjal enormi biex tittardja s-senescence ċellulari u t-trattament ta 'mard relatat mal-età. Id-disfunzjoni tal-organelle u l-akkumulazzjoni tal-metabolit tossiku huma l-karatteristiċi ewlenin tal-MSCs senescent [42], u b'hekk jissuġġerixxu rabta potenzjali bejn l-awtofaġija u s-senescence. Ma u l-kollegi sabu li l-attività awtofaġika ta 'BMSCs età naqset meta mqabbla ma' BMSCs żgħar u li l-inibitur ta 'awtofaġija 3-methyladenine (3-MA) jista' jaċċellera s-senescence f'MSCs żgħar; b'kuntrast, sabu li l-attivatur autophagy rapamycin (RAP) jista 'jrestawra parzjalment il-proprjetajiet bijoloġiċi ta' BMSCs antiki[5]. Studju reċenti eżamina r-rwol ta 'awtofaġija modulata permezz tal-użu ta' RAP u 3-MA fis-senescenza tal-MSC indotta minn D-galactose (D-gal) u wera li RAP itaffu b'mod notevoli s-senescenza tal-MSC [43]. Interessanti, bosta studji wrew li żieda fl-awtofaġija hija osservata f'MSCs senescent u li l-awtofaġija hija indispensabbli għaż-żamma tal-proċessi ta 'senescence tal-MSC [44,45]. Għalhekk, jekk l-awtofaġija tistax titqies bħala regolatur pożittiv jew negattiv tas-senescence fl-MSCs jibqa' konfliġġenti u ambigwu. Konsegwentement, ikun interessanti li tiġi investigata r-relazzjoni bejn l-awtofaġija, is-senescence tal-MSC u l-Cur, li tista 'tipprovdi perspettiva usa' biex tittardja s-senescence u ttejjeb il-potenzjal terapewtiku tal-MSCs.

F'dan l-istudju, l-iskop primarju tagħna kien li niċċaraw jekk it-trattament ta 'Cur jistax jittardja s-senescence MSC (cBMSC) derivat mill-mudullun tal-klieb u jekk il-mekkaniżmu sottostanti kienx korrelatat mal-modulazzjoni tal-awtofaġija. Għal dan il-għan, aħna evalwajna l-karatterizzazzjoni fenotipika, l-attività awtofaġika, u l-espressjoni tal-ġeni wara l-espożizzjoni għal Cur f'cBMSCs senescent, kif ukoll jekk ir-relazzjoni bejn l-awtofaġija u l-effetti tagħha fuq is-senescence cBMSCs hijiex determinata bl-użu ta' 3-MA u RAP .

2. Riżultati

2.1. Karatteristiċi ta' cBMSCs

Is-cBMSCs ġew estiżi in vitro bi proċeduri standard u ntwerew li jgħaddu b'mod stabbli fuq disa' ġenerazzjonijiet (dejta mhux murija). Is-cBMSCs wrew dehra li tiflaħ mal-plastik u tixbah lill-fibroblast matul il-proċess tal-kultura (Figura 1A). Il-kapaċità ta 'divrenzjar ta' cBMSCs ġiet ikkonfermata minn induzzjoni adipoġenika u osteoġenika (Figura 1B, C). L-immunofenotip ta 'cBMSCs ġie evalwat bl-użu taċ-ċitometrija tal-fluss. Ir-riżultati wrew li l-popolazzjoni taċ-ċelluli espressa b'mod pożittiv CD90, CD105, u ITGB1, u espressa b'mod negattiv CD31, CD34, u CD45, li tissuġġerixxi l-oriġini mesenkimali tagħhom aktar milli ematopojetika (Figura 1 u Tabella 1).

2.2.cBMSCs Uri Progressivament Karatteristiċi Senescent tul l-Espansjoni In Vitro

CBMSCs ta 'passaġġ bikri (P1 u P3) juru forma fusiform twila jew trijangolari u huma rranġati fi idromassaġġi wara t-tkabbir in vitro (Figura 2A). Sussegwentement, cBMSCs urew gradwalment fenotipi assoċjati mas-senescence tul il-kors ta 'kultivazzjoni fit-tul in vitro, ikkaratterizzati minn morfoloġija mkabbra u ċatta u tnaqqis fil-proliferazzjoni (Figura 2A, B). Barra minn hekk, ir-riżultati minn assaġġ ta’ fibroblast ta’ unità li jiffurmaw kolonji (CFU-F) wrew li kemm in-numru ta’ CFU-F kif ukoll id-daqs tal-kolonji naqsu b’mod sinifikanti tul passaġġi tal-kultura (Figura 2C), konsistenti mal-mRNA regolat ‘l isfel. espressjoni ta' fatturi ta' traskrizzjoni pluripotenti Nanog u SOX-2 fis-6 u d-9 passaġġ (Figura 2G).

-galactosidase assoċjata mas-senescence (SA- -gal) hija enzima lisosomali, li l-attività tagħha hija korrelata b'mod qawwi mas-senescence ċellulari [46]. Ir-riżultati tat-tbajja' SA- -gal indikaw li n-numru ta' ċelloli pożittivi SA{- -gal kiber minn 7.5± 2.4 fil-mija (P3) għal 65.0 ±5.0 fil-mija (P6) u 87.3± 3.3 fil-mija (P9), rispettivament(Figura 2D).cistanche genghis khanBarra minn hekk, ġew skoperti żidiet fl-espressjoni ta 'inibituri taċ-ċiklu taċ-ċelluli kinase (p21 u p16) u molekuli pro-infjammatorji (TNF- u IL-6), li jaġixxu bħala komponenti ta' fenotip sekretorju assoċjat mas-senescence (SASP). fis-6 u d-9 passaġġ (Figura 2E, F). Għalhekk, cBMSCs juru żieda dipendenti fuq il-passaġġ fil-fenotipi senescent u jieqfu l-proliferazzjoni fid-9 passaġġ.

2.3. Cur Ittaffi l-Istat Senescent ta 'cBMSCs

Is-6th passaġġ cBMSCs ġew inkubati fl-assenza jew il-preżenza ta 'Cur f'dożi ta' 0.1,0.5,1,5, jew 10μmol/mL (μM) għal 12h, 24h, 48h, u 72h, u l-vijabbiltà ċellulari tagħhom ġiet ivvalutata bl-użu ta' CCK-8. Ir-riżultati wrew li Cur (0.1-10 uM) ma jinduċix effett tossiku f'cBMSCs u għandu effetti palpabbli fuq iż-żieda tal-vijabbiltà ta 'cBMSCs wara 24 siegħa ta' trattament (Figura 3A). Biex tevalwa l-effett ta 'Cur fuq is-senescence ċellulari, cBMSCs ġew esposti għal konċentrazzjonijiet differenti ta' Cur (0.1,1, u 10 uM) għal 24 siegħa. Ir-riżultat wera li n-numri ta 'ċelluli pożittivi SA - -gal naqsu b'mod sinifikanti f'cBMSCs wara t-trattament b'Cur (1 μM u 10uM) meta mqabbla mal-grupp ta' kontroll (Figura 3B). Assays CFU-F kienu ntużaw biex jevalwaw l-effetti ta 'Cur fuq l-effiċjenza ta' awto-tiġdid ta 'cBMSCs (P6). Id-doża ta '1 uM ta' Cur instabet li hija l-aktar konċentrazzjoni effettiva għat-titjib tal-effiċjenza tal-CFU-F ta 'cBMSCs. Madankollu, id-doża ta '10 μM Cur kellha effetti avversi fuq l-effiċjenza ta' awto-tiġdid ta 'cBMSCs (Figura 3C), Barra minn hekk, l-effett li jtaffu s-senescence ta' Cur kien osservat f'doża ta '1 μM, manifestat mill-downregulation ta' p16, IL-6, u TNF- u regolazzjoni 'l fuq tal-espressjoni ta' Nanog u SOX-2 (Figura 3D-F).estensjoni tal-ħajja ta' cistancheMeħuda flimkien, dawn ir-riżultati jindikaw li Cur f'doża ta '1 uM jista' effettivament jeżerċita effetti ċitoprotettivi fuq cBMSCs senescent.

2.4. Cur Treatment Attività Awtofaġika Mtejba f'cBMSCs

L-attivazzjoni funzjonali tal-lysosomal għandha rwol kritiku fil-kors tal-awtofaġija, u disturbi tal-aċidifikazzjoni lisosomali huma avversi għall-funzjoni tad-degradazzjoni lisosomali [38]. Għalhekk, l-attività awtofaġika ġiet misjuba għall-ewwel darba bit-tbajja 'LysoTracker, li tista' tissorvelja l-aċidifikazzjoni lisosomali. Ir-riżultat indika li l-prekondizzjonament b'Cur b'mod dipendenti fuq id-doża saħħaħ l-intensità tal-fluworexxenza ħamra f'cBMSCs, li ssuġġeriet li l-aċidifikazzjoni tal-lysosome kienet żdiedet (Figura 4D).

Biex nevalwaw aktar l-effetti ta’ Cur fuq l-awtofaġija ta’ cBMSCs, għamilna użu mill-markaturi awtofagożomi tal-proteina assoċjata mal-mikrotubuli 1A/1Belight chain 3 (LC3) u p62/SQSTM1, li huma markaturi ċentrali għall-evalwazzjoni tal-fluss awtofaġiku[47,48]. ]. Iż-żieda fl-attività awtofaġika ġiet osservata f'cBMSCs wara espożizzjoni għal Cur, kif muri minn żieda dipendenti fuq id-doża fil-konverżjoni ta' LC{{10}}I għal LC3-II, flimkien mal-p62 li jaċċellera degradazzjoni (Figura 4A). Barra minn hekk, l-espressjoni mRNA ta 'ATG7, ATG12.LC3. u ULK1 ġew upregulated wara trattament Cur (Figura 4B). L-ultrastruttura ta 'cBMSCs ġiet eżaminata bl-użu ta' mikroskopija elettronika ta 'trażmissjoni. Imbagħad osservajna żieda fil-formazzjoni ta 'awtofagosomi u awtoliżosomi f'cBMSCs wara trattament b'Cur f'dożi ta' 0.1, 1, u 10 μM għal 24 siegħa (Figura 4C).cistanche nzIt-tbajja 'l-immunofluworexxenza wriet ukoll li n-numru ta' tikek fluworexxenti punteġġjati karatteristiċi ta 'LC3 żdied b'mod sinifikanti bit-trattament ta' Cur (Figura 4E). Dawn ir-riżultati indikaw li Cur jista 'jippromwovi l-aċidifikazzjoni lisosomali u l-attivazzjoni tal-awtofaġija b'mod dipendenti mid-doża.

Dan l-artikolu huwa estratt minn Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11356. https://doi.org/10.3390/ijms222111356 https://www.mdpi.com/journal/ijms