Kontroll Sintonizzabbli medjat minn CRISPRi tal-Livell tal-Espressjoni tal-Ġene b'RNA ta' gwida Uniku Mfassal f'Escherichia Coli

ASTRATT

Precise control of gene expression is essential for flux redistribution in metabolic pathways. Although the CRISPR interference (CRISPRi) system can effectively repress gene expression at the transcriptional level, it has still been difficult to precisely control the level without loss of specificity or an increase in cell toxicity. In this study, we developed a tunable CRISPRi system that performs transcriptional regulation at various levels. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) library targeting repeat, tetraloop, and anti-repeat regions to modulate the binding affinity against dCas9. Each screened sgRNA could regulate the gene expression at a certain level between fully repressing and nonrepressing states (>45-darbiet). Dawn l-sgRNAs ippermettew ukoll regolazzjoni modulari b'diversi sekwenzi tad-DNA fil-mira. Aħna applikajna din is-sistema biex niddistribwixxu mill-ġdid il-fluss metaboliku biex nipproduċu derivattivi tal-violacein fi proporzjon prevedibbli u ottimizzaw il-produzzjoni tal-lycopene. Din is-sistema tgħin biex tħaffef il-proċessi ta 'ottimizzazzjoni tal-fluss fl-inġinerija metabolika u l-bijoloġija sintetika.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Ikklikkja hawn biex tara l-prodotti Cistanche Enhance Immunity

【Staqsi għal aktar】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

INTRODUZZJONI

Is-sistema ta’ tip II Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-assoċjata (Cas) hija sistema ta’ qsim tad-DNA ggwidata mill-RNA magħmula minn CRISPR RNA (crRNA), CRISPR RNA trans-activating (tracrRNA) u proteina Cas9 (1) ,2). Cas9 minn Streptococcus pyogenes intuża ħafna fl-inġinerija tal-ġenoma minħabba l-proprjetajiet karatterizzati tajjeb tiegħu (3,4). Il-kumpless tal-proteina spCas9, tracrRNA, u crRNA jorbot u jaqsam il-protospacer tad-DNA fil-mira kumplimentari għas-sekwenza spacer ta' 20 nukleotide (nt) tal-crRNA fil-preżenza ta' 5'-NGG-3' protospacer adjacent motif (PAM) ) sekwenza (5,6). Biex tissimplifika s-sistema, jista 'jintuża RNA ta' gwida unika chimeric (sgRNA) fejn crRNA u tracrRNA huma magħquda minn linker artifiċjali msejjaħ tetraloop (5). Jippermetti li jiġu sostitwiti żewġ RNAs separati b'molekula waħda ta 'RNA, li tagħmel is-sistema aktar maniġġabbli. Waħda mis-sistemi bbażati fuq CRISPR, l-interferenza CRISPR (CRISPRi), tutilizza Cas9 katalitikament inattiv (dCas9) billi tissostitwixxi ċerti aċidi amminiċi minn kull dominju endonukleażi (7). Din il-modifika tagħmel kumpless ta 'ribonucleoprotein (RNP) li jista' jidderieġi u jorbot mad-DNA fil-mira u jinterferixxi mal-RNA polymerase (RNAP) biex jinibixxi l-bidu jew it-titwil tat-traskrizzjoni (7). B'kuntrast ma' knockout mis-sistema CRISPR/Cas9, CRISPR jippermetti t-tnaqqis riversibbli tal-ġeni billi jesprimi dCas9 jew sgRNA taħt promotur inducibbli, li jippermetti aktar flessibilità fir-regolamentazzjoni tal-ġeni (7). Is-sistema CRISPRi effettivament isikket il-ġeni fil-mira għal mijiet ta' darbiet (7,8). Ir-ripressjoni tal-ġeni speċifika għall-mira tippermetti fenotipi ta' produzzjoni għolja bl-użu ta' ġabra ta' sgRNA madwar il-ġenoma (9) jew tidderieġi mill-ġdid il-fluss tal-karbonju f'batterji maħduma lejn il-kimika fil-mira (10-12). Barra minn hekk, CRISPRi multiplex intwera f'diversi hosts bl-użu ta 'varjetà ta' metodi biex jesprimu b'mod stabbli sgRNAs multipli, inklużi arrays ta 'crRNA twal, integrazzjoni ta' swiċċ tas-sieq, u arrays sgRNA extralong mhux ripetittivi (13-16). Dawn it-tekniki ta 'inibizzjoni ta' ġeni multipli simultanjament ġew utilizzati biex iwettqu kompiti aktar kumplessi, bħat-tnaqqis ta 'intermedji tossiċi jew l-imblukkar ta' mogħdijiet li jikkompetu fil-fermentazzjoni batterjali (13,16-19). Madankollu, ripressjoni sħiħa mhix dejjem mixtieqa għall-inġinerija metabolika. Il-livelli ta 'espressjoni tal-ġeni għandhom jiġu kkontrollati b'mod preċiż biex tinkiseb l-attività ottimali ta' l-enzimi bejn il-mogħdijiet ta 'tkabbir u produzzjoni, jibbilanċjaw f'konċentrazzjonijiet ta' prekursuri intraċellulari u jevitaw l-akkumulazzjoni ta 'intermedji tossiċi (20-22). Ġew żviluppati diversi tekniki biex titfassal l-effiċjenza tar-ripressjoni ta' CRISPRi. Ġew manipulati diversi fatturi, bħall-ammont ta 'sgRNA u proteina dCas9 jew l-għażla ta' sgRNA. Il-kontroll ta' l-espressjoni ta' dCas9 jew l-espressjoni ta' dCas9 u sgRNA bl-użu ta' promotur induċibbli rregolat l-espressjoni tal-ġene fil-mira b'aktar minn 30- darbiet jew 300- darbiet, rispettivament (23,24). Madankollu, ġie osservat li l-modulazzjoni tal-konċentrazzjoni dCas9 tista 'twassal għal effiċjenzi ta' ripressjoni inkonsistenti fuq protospacers differenti (23). In-numru limitat ta' promoturi inducibbli disponibbli jagħmel ukoll sfidi ta' disinn minkejja ħafna sforzi (25). Strateġija oħra hija l-inserzjoni ta’ aptamer RNA speċifiku għal ligand fl-sgRNA, fejn molekula żgħira konnessa tista’ tesponi l-ispazjatur, u b’hekk tippermetti kontroll dipendenti fuq id-doża ta’ CRISPRi (26). L-sgRNA speċifiku għal ligand huwa ta 'għajnuna jekk ikun disponibbli par ligand u aptamer adattat. Id-distanza mis-sit tal-bidu tat-traskrizzjoni u l-orjentazzjoni tal-irbit tad-dCas9 jaffettwaw ukoll l-effiċjenza ta 'CRISPRi (7). L-aġġustament tad-distanza bejn is-sit tal-irbit tas-sgRNA u s-sit tal-bidu tat-traskrizzjoni jista 'jottimizza l-mogħdija fl-inġinerija metabolika (17,27,28). L-effiċjenza ta 'ibridizzazzjoni bejn is-sekwenzi spacer u protospacer tbiddel ukoll l-effiċjenza tal-irbit tal-kumpless RNP (29-31). Għalhekk, ġew introdotti diskrepanzi iddisinjati barra mir-reġjun taż-żerriegħa biex ibiddlu l-enerġija ħielsa biex jiddiversifikaw l-effiċjenza CRISPRi (31,32). Madankollu, it-tfassil tal-sgRNA huwa meħtieġ għal kull sekwenza fil-mira ġdida, u l-kisba ta 'differenza sinifikanti fl-enerġija ħielsa permezz ta' nuqqas ta 'qbil biss tista' tkun ta 'sfida. Barra minn hekk, hemm possibbiltà ta' rabta akbar barra l-mira (33). Madankollu, xorta hija limitata biex tirreprimi b'mod preċiż espressjonijiet tal-ġeni multipli b'mod modulari irrispettivament mis-sekwenza fil-mira. F'dan l-istudju, żviluppajna sistema CRISPRi sintonizzabbli li tirregola l-espressjoni tal-ġeni bi preċiżjoni għolja u prevedibbiltà. Permezz ta' għażla iterattiva taċ-ċelloli bbażata fuq il-fluworexxenza tal-librerija sgRNA li timmira lejn it-tetraloop u r-reġjun tal-ġenb tagħha, ksibna effiċjenzi ta' ripressjoni tat-traskrizzjoni sa 45-darbiet anki meta d-DNA fil-mira tinbidel. Din is-sistema tippermetti r-ridistribuzzjoni prevedibbli tal-fluss metaboliku mingħajr ma timmanipula l-ġenoma ospitanti jew il-mogħdijiet sintetiċi, li tipprovdi għodda promettenti għall-ottimizzazzjoni tal-mogħdijiet metaboliċi.

MATERJALI U METODI

Razez batterjali, plasmidi, u reaġenti

Razez u plasmidi Escherichia coli użati f'dan l-istudju huma elenkati fit-Tabella Supplimentari S1. Primers użati f'dan l-istudju huma elenkati fit-Tabella Supplimentari S2. Il-proċeduri ta' klonazzjoni huma deskritti fil-metodi supplimentari. Il-ġeni fil-mira u s-sekwenzi tad-DNA fil-mira tagħhom għas-sistema CRISPR huma murija fit-Tabella Supplimentari S3. Mach1-T1R intuża għall-klonazzjoni ġenerali. Il-librerija nbniet bl-użu ta' NEB 5-alpha Electrocompetent E. coli (NEB). Kulturi ta 'rutina għall-kostruzzjoni ta' plasmidi u razez saru f'37◦C f'brodu Luria-Bertani (LB) jew fuq pjanċa agar LB li fiha antibijotiċi xierqa (34 g/ml chloramphenicol, 50 g/ml spectinomicin). Il-PCR twettqet bl-użu Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB). Il-plażmidi u l-prodotti tal-PCR ġew ippurifikati bl-użu ta' GeneAll® Exprep™ Plasmid SV Kit u Gel SV Kit (GeneAll Biotechnology). Effiċjenza ta' ripressjoni ta' mutanti sgRNA Il-midja tal-kultura ta' matul il-lejl ġiet aggornata għal OD600 ta' 0.05 u inkubata sakemm laħqet valur bejn 0.6 u 0.8. Il-midja tal-kultura mbagħad ġiet dilwita għal OD600 ta '0.05 b'20 ng/ml ta' aTc u inkubata għal 4 sigħat. Il-fluworexxenza ta 'kolonja waħda ġiet imkejla f'575 nm/616 nm bl-użu ta' qarrej tal-mikroplate Hidex Sense (Hidex), u l-valur OD600 ġie ddeterminat bl-użu tal-ispettrofotometru Jenway 7300 (Jenway). Il-fluworexxenza relattiva ġiet ikkalkulata bħala l-unitajiet tal-fluworexxenza għal kull valur OD600, bil-valur għall-PC stabbilit bħala 100%.

Effetti Ta 'Cistanche tubulosa-kura stitikezza

screening tal-librerija sgRNA

Intuża l-istess metodu kulturali bħal dak deskritt hawn fuq. Il-midja tal-kultura ġiet dilwita għal [ċellula]<10−7 cells/ml in PBS buffer (pH 7.4). The fluorescence distribution was obtained from 100,000 cells from each sample using S3e Cell Sorter (Bio-Rad), and 5000 cells for each fluorescence range were sorted in each iteration. Cells were overnight cultured in fresh media for the next iteration. Samples were obtained after the final iteration and spread to the LB agar plate. Each colony was inoculated into 100 l of LB media and overnight cultured in 96-well microplate shaking at 900 rpm by Hidex Sense microplate reader (Hidex). Overnight culture media was refreshed by diluting 3 l culture media in 97 l fresh media and incubated for 2 h. Culture media was re-diluted by mixing 6 l culture media with 94 l fresh media, and aTc was added. The fluorescence of every single colony was obtained at 575 nm/616 nm by Hidex Sense microplate reader (Hidex) after 6 h of incubation. The OD600 value from the microplate reader was converted to the OD600 value from the spectrophotometer.

Estrazzjoni tal-RNA

L-RNA totali ġie estratt bl-użu ta 'RNeasy Mini Kit (Qiagen) biss meta miRNeasy Mini Kit (Qiagen) għall-kwantifikazzjoni ta' sgRNA, wara trattament b'Reaġent tal-Batterja RNAprotect (Qiagen) u ħażna f'-80◦C. Diġestjoni tad-DNA fuq il-kolonna bl-użu ta 'RNase-Free DNase Set (Qiagen) saret matul il-proċess ta' estrazzjoni. Il-kontaminazzjoni tad-DNA ġiet ivverifikata permezz tal-PCR mingħajr traskrizzjoni inversa. Il-konċentrazzjoni u l-purità ta 'kull kampjun ġew determinati bl-użu ta' NanoDrop One (Thermo Scientific), u l-kwalità ġiet evalwata bl-użu ta 'DNA 5K/RNA/CZE 24 LabChip (PerkinElmer) fuq LabChip GX Touch 24 (PerkinElmer).

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Analiżi RT-qPCR

Primers għal RT-qPCR jew inkisbu minn stokk tal-laboratorju jew iddisinjati bl-użu tal-għodda Primer3Plus (34) u elenkati fit-Tabella Supplimentari S4. Il-ġene CysG intuża bħala ġene ta' referenza (35) għall-esperimenti kollha RT-qPCR. Kurva standard ġiet iġġenerata billi 10-darbiet iddilwixxi mudell minn 107 kopji/ l għal 10−1 kopji/ l. Il-limitu ta 'kwantifikazzjoni ġie determinat billi twaħħlu n-numru tal-kopja u r-rata ta' amplifikazzjoni pożittiva għal funzjoni sigma u kkalkulat il-valur tan-numru tal-kopja pożittiv ta '95%. Il-medda dinamika lineari ġiet definita bħala l-inqas numru ta' kopji li fih il-varjazzjoni Cq ikkalkulata lura hija inqas minn 35%. Il-valuri Cq 'il fuq minn 30 jew dawk mhux amplifikati f'kontroll mhux mudell ġew validati. Id-dejta tal-kurva standard hija disponibbli fit-Tabella Supplimentari S5 u l-Figura Supplimentari S1. Total ta '2.5 ng ta' RNA totali intuża f'reazzjoni RT-qPCR ta '10 l ma' Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB). RT-PCR twettqet fi tliet kopji fuq StepOnePlus™ RealTime PCR System (Bijosistemi Applikati) bil-passi li ġejjin: (i) traskrizzjoni inversa f'55◦C għal 10 min, segwita minn denaturazzjoni f'95◦C għal 1 min; (ii) 40 ċiklu termali f'95◦C għal 10 s u 60◦C għal 1 min; (iii) analiżi tal-kurva tat-tidwib f'95◦C għal 15 s u 60◦C għal 1 min, segwita minn rampa minn 60◦C sa 95◦C b'rata ta '0.3◦C/min. Il-kwantifikazzjoni relattiva tal-RNA ġiet iddeterminata bl-użu tal-metodu delta-deltaCt (36) u analizzata bis-Software StepOnePlus™ (Applied Biosystems).

Sekwenzar tal-RNA (RNA-seq) u analiżi tad-dejta

1.5 in biological duplicate. Total RNA was extracted by the abovementioned method, and ribosomal RNA (rRNA) was depleted using Ribo-Zero plus rRNA Depletion Kit (Illumina). cDNA libraries were constructed using KAPA Stranded RNA-Seq Kits (Kapa Biosystems), with an additional size-selection step using AMPure XP (Beckman Coulter). Adapters and primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. The concentration was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Scientific), and the size distribution of the cDNA was measured using X-Mark LabChip (PerkinElmer) on the LabChip GX Touch 24 instrument. The average cDNA length ranged from 390 to 450 bps. RNA-Seq was performed as >19M reads of 41 bp paired-end using NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles) (Illumina) on NextSeq 550 (Illumina). Data analysis was performed using the reference genome of E. coli BL21(DE3) complete genome (Genbank CP001509.3) with FastQC (v0.11.9) (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) (37), Bowtie (v1.2.3) (38) with trim3 option value of 3, samtools (v1.10) (39), and cufflinks (v2.2.1) (40,41). All samples between replicates had R2 >{{0}}.92 ibbażat fuq FPKM (Frammenti Per Kilobase ta' traskrizzjonijiet għal kull Miljun qari mappjat). Ġeni espressi b'mod differenzjali nkisbu mil-limitu ta' 1.5 (ibbażat fuq log2-) u 0.01 (valur q).

Produzzjoni u teħid ta' kampjuni ta' proviolacein u prodeoxyviolacein

Għall-produzzjoni ta' violacein u prodeoxyviolacein, intużat il-kompożizzjoni medja li ġejja: 10.7 g/l K2HPO4, 5.2 g/l KH2PO4,1g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 1 g/l MgSO4, { {17}}.2 g/l estratt tal-ħmira, u 1{{20}} g/l glukożju. Medda ta' kultura matul il-lejl ġiet aggornata għal OD600 ta' 0.1 u kkultivata sakemm OD600 laħaq bejn 0.6 u 0.8. Il-midja tal-kultura mbagħad ġiet dilwita għal OD600 ta '0.1 u supplimentata b'500 ng/ml aTc, 0.05 mM IPTG, u 0.1 g/l L-tryptophan għal volum finali ta' 5 ml. Ittieħdu kampjuni ta '300 l ta' medja tal-kultura u ċċentrifugati fi 14 000 rpm għal 5 min biex tinkiseb pellet taċ-ċelluli għall-analiżi HPLC, u ttieħdu kampjuni ta '300 l ta' medja tal-kultura għall-estrazzjoni tal-RNA.

Analiżi HPLC

Għall-analiżi tal-mogħdija bijosintetika tal-violacein, il-pellet taċ-ċelluli ġie sospiż mill-ġdid f'metanol ta' {{0}}volum, ivvibrat għal 5 min, ċentrifugat, u ffiltrat minn 0.22-m filtru tan-najlon. L-analiżi HPLC segwiet il-metodu (42) b'Poroshell 120 EC-C18, 4.6 × 150 mm, 4 m kolonna (Agilent). Żewġ fażijiet mobbli, A b'0.1% aċidu formiku f'DDW u B b'0.1% aċidu formiku f'acetonitrile, intużaw b'rata ta 'fluss ta' 0.6 ml/min bil-profil gradjent li ġej: 95% A għal 1.5 min, ramping A minn 95 % sa 2% għal 4 min, żamma ta '2% A għal 2 min, ramping A minn 2% għal 95% għal 30 s, u żamma ta' 95% A għal 10 min. Il-kampjuni ġew skoperti bl-użu ta 'ditekter PDA, u ż-żona HPLC ġiet iddeterminata f'600 nm għal violacein u 610 nm għal prodeoxyviolacein.

Produzzjoni u teħid ta' kampjuni tal-lycopene

Għall-produzzjoni tal-lycopene, intużat il-kompożizzjoni medja li ġejja: 13.56 g/l Na2HPO4,6g/l KH2PO4,2g NH4Cl, 1 g NaCl, 2 ml ta' 1 M MgSO4, 0.1 ml ta' 1 M CaCl2 u 4 g/l ta’ glukożju (22). Intużaw 27 g/ml chloramphenicol u 50 g/ml spectinomicin. Midja tal-kultura matul il-lejl ġiet aggornata għal OD600 ta' 0.1 għal volum finali ta' 5 ml. Meta l-OD600 laħaq bejn 0.5 u 0.6, aTc ġie miżjud mal-konċentrazzjoni finali ta '500 ng/ml, u meta l-OD600 laħaq bejn 0.9 u 1, IPTG ġie miżjud mal-konċentrazzjoni finali ta' 0.02 mM. Il-lycopene ġie estratt bl-użu tal-aċetun, kif deskritt fir-referenza (22). Il-konċentrazzjoni ta 'lycopene inkisbet mill-assorbenza f'475 nm bl-użu ta' spettrofotometru Jenway 7300 bl-użu ta 'kurva standard. Ittieħdu kampjuni ta '300 l ta' medja tal-kultura għall-estrazzjoni tal-RNA.

benefiċċji cistanche għall-irġiel isaħħu s-sistema immuni

RIŻULTATI U DISKUSSJONI

L-effetti tal-mutazzjonijiet fl-sgRNA fuq l-effiċjenza tar-ripressjoni tas-sistema CRISPR

Is-sistema CRISPRi tista 'trażżan l-espressjoni tal-ġeni meta l-kumpless ternarju dCas9–sgRNA–DNA jorbot flimkien b'mod qawwi. Aħna ipoteżijna li l-effiċjenza ta 'ripressjoni tas-sistema CRISPRi tista' tinbidel għal ċertu livell billi timmodula l-formazzjoni tal-kumpless RNP. Biex tikkwantifika l-effiċjenza ta 'ripressjoni tas-sistema CRISPR, iddisinjajna sistema ta' rappurtar tal-fluworexxenza bbażata fuq iċ-ċirkwit ġenetiku fejn dCas9 minn S. pyogenes huwa indott minn anhydrotetracycline (aTc), u kemm il-ġene reporter (mCherry) kif ukoll il-varjanti sgRNA huma espressi b'mod kostituttiv (Figura 1A). Ladarba l-aTc jiġi miżjud fil-medju, il-kumpless ternarju dCas9–sgRNA–DNA jimblokka t-traskrizzjoni tal-ġene reporter, u l-livell ta’ fluworexxenza jindika b’mod invers l-effiċjenza ta’ ripressjoni tas-sistema CRISPR. L-sgRNA fih 96 nukleotide (nts) b'kollox. Ir-reġjun spacer (l-ewwel 20 nts) jeħel mas-sekwenza tad-DNA fil-mira, u s-76 nts l-oħra jikkontribwixxu għall-formazzjoni kumplessa u l-istabbiltà. Peress li n-nuqqas ta 'tqabbil fir-reġjun tal-ispazjar jista' jitilfu l-ispeċifiċità u jżidu l-effetti off-mira fis-sistema bbażata fuq CRISPR (33,43), it-tul massimu tal-sgRNA li jista 'jiġi mfassal huwa 76 nts. F'dan il-każ, għandu jinkiseb daqs ta' librerija ta' 476 (madwar 1045), iżda huwa kbir wisq biex jinbena. Għalhekk, huwa meħtieġ li d-daqs tal-librerija jitnaqqas billi jiġu ddeterminati pożizzjonijiet speċifiċi fuq l-sgRNA. L-ewwel investigajna kif mutazzjonijiet fl-sgRNA f'kull reġjun jaffettwaw ir-ripressjoni fis-sistema CRISPR. Studju preċedenti rrapporta li mutazzjonijiet fl-istm–loop 1 (sg mut01 u sg mut02) wasslu għal tnaqqis sinifikanti fl-attività tan-nukleażi ta’ Cas9, filwaqt li mutazzjonijiet fl-istm–loop 2 (sg mut03) jew stem–loop 3 (sg). mut04) mhux affettwat l-attività tagħha (44). A sgRNA rikostruwit (sg mut05) li fihom mutazzjonijiet fir-reġjun zokk-loop 1 u r-repeti, tetraloop, anti-repeat, u zokk-loop 2 reġjuni wkoll naqas l-attività nukleażi (44). Madankollu, fis-sistema CRISPRi, il-ħames varjanti sgRNA kollha kellhom ftit effett fuq l-effiċjenza tar-ripressjoni meta mqabbla mal-sgRNA tat-tip selvaġġ (sg WT), b'kull varjant juri livell ta 'fluworexxenza ta' 2-4% meta mqabbel mal-kontroll pożittiv mingħajr reġjun spacer ( sg PC) (Figura 1B). Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-formazzjoni tal-kumpless dCas9–sgRNA hija inqas sensittiva għall-modifika tas-sekwenza fir-reġjun stem-loop 1 fis-sistema CRISPRi, b'kuntrast mas-sistema CRISPR/Cas9. Aħna ipoteżijna li t-tneħħija ta 'reġjuni relatati mal-istabbiltà tal-kumpless tista' tkun punt tat-tluq biex tikkontrolla aktar l-espressjoni fuq livelli multipli. Għal dan il-għan, bnejna sgRNA maqtugħ (sg trcSL1) nieqes mill-linker, stem-loop 2 u stem-loop 3. Dan l-sgRNA maqtugħ għandu numru minimu ta 'komponenti u ntwera li jnaqqas b'mod sinifikanti l-attività tan-nukleażi fil-CRISPR/ Sistema Cas9 (5,44). Meta ttestjat fis-sistema CRISPRi, dan il-mutant difettuż wera livell ta 'fluworexxenza ta' 8% meta mqabbel ma 'sg PC, li jissuġġerixxi li xorta seta' jorbot ma' dCas9 u jrażżan il-ġene ta 'interess f'ċertu livell anke bi stabbiltà kumplessa ternarja mnaqqsa (Figura 1B). L-analiżi strutturali tal-kumpless RNP tissuġġerixxi li r-reġjuni linker, stem-loop 2, u stem-loop 3 tal-sgRNA huma responsabbli għall-istabbilizzazzjoni tal-kumpless permezz tal-interazzjonijiet tagħhom mad-dominju tan-nukleażi ta 'dCas9, li jwassal għal tnaqqis sinifikanti fl-indel. effiċjenza fis-sistema CRISPR/Cas9 (44). B'kuntrast, ir-repetizzjoni: reġjun kontra r-repetizzjoni u stem-loop 1 tas-sgRNA prinċipalment jinteraġixxu mad-dominju ta 'rikonoxximent u d-dominju ta' interazzjoni PAM ta 'dCas9 u ma jaffettwawx b'mod sinifikanti l-effiċjenza indel fis-sistema CRISPR/Cas9 (44). Dan ir-riżultat jappoġġa l-osservazzjoni li sg trcSL1 wera tnaqqis sinifikanti fl-attività tan-nukleażi fis-sistema CRISPR/Cas9 filwaqt li affettwa biss ftit l-affinità tal-irbit fis-sistema CRISPRi.

Figura 1. Kostruzzjoni tas-sistema u l-effett fuq l-effiċjenza tar-ripressjoni minn mutazzjoni sgRNA. (A) Żewġ plażmidi sistema għall-kwantifikazzjoni ta 'l-effiċjenza ta' ripressjoni. Plasmid wieħed b'oriġini p15A fih il-ġene dCas9 taħt promotur li jista' jinduċi aTc u l-ġene mCherry taħt promotur kostituttiv. Il-plasmid l-ieħor b'oriġini cloDF13 fih sgRNA tat-tip selvaġġ jew mutant taħt promotur kostituttiv. (B) Fluworexxenza relattiva ta 'kull mutant sgRNA (sg mut01 ~ sg mut05 u sg trcSL1) u sg WT meta mqabbla ma' sg PC. +1 sa + 20 huma s-sekwenza spacer li torbot mal-ġene mCherry. sg PC: sgRNA mingħajr spacer bħala kontroll pożittiv, sg WT: sgRNA tat-tip selvaġġ. Il-vireg tal-iżball jindikaw devjazzjoni standard (n=3). Il-valuri P ġew determinati permezz tat-test t mhux imqabbad. ns: mhux sinifikanti, **P< 0.01

Varjazzjoni tal-effiċjenza tal-formazzjoni kumplessa għal kontroll ta 'espressjoni ta' livelli multipli

Tetraloop huwa linker artifiċjali li jgħaqqad crRNA u tracrRNA fis-sistema CRISPR-Cas9 (5). L-istruttura tal-kristall tal-kumpless ternarju, magħmul minn dCas9, crRNA, u tracrRNA, wriet li t-tetraloop u r-reġjuni 5 u 3 tiegħu li jġorru ftit għandhom kuntatt mad-dCas9 (44). Fl-istess ħin, irrepeti: ir-reġjuni anti-repeat u stem-loop 1 huma kritiċi għall-kumpless funzjonali (44). Peress li ma jinteraġixxix direttament ma 'dCas9, it-tetraloop, u r-reġjuni ħdejn tiegħu ġew esplorati bħala siti potenzjali għall-inġinerija ta' sgRNA b'komponenti addizzjonali, bħall-inkorporazzjoni ta 'sekwenzi aptamer biex jirreklutaw proteini addizzjonali għall-sgRNA (45,46). Huwa plawsibbli li mutazzjonijiet f'dan ir-reġjun jistgħu jiddiversifikaw l-affinità ta' rbit bejn sgRNA u dCas9 mingħajr ma jfixklu għal kollox il-kumpless. A 12- librerija b'mod każwali mer (4 nt tar-reġjun tetraloop u 4 nt ta '5 u 3 reġjuni ħdejn, rispettivament) inbniet bl-użu ta' sg trcSL1 bħala mudell biex tkompli tnaqqas l-effiċjenza tal-formazzjoni kumplessa bejn sgRNA u dCas9 (Figura 2A ). Aħna applikajna strateġija ta' għażla f'żewġ stadji biex niksbu diversi mutanti sgRNA li jkopru l-effiċjenza tar-ripressjoni bejn sg WT (stat li jirrażżan bis-sħiħ) u sg PC (stat li ma jirreprimix). Qassamna l-librerija oriġinali f'libreriji iżgħar b'firxiet ta 'intensità ta' fluworexxenza differenti, u mbagħad identifikajna individwalment il-fluworexxenza ta 'kull varjant ta' sgRNA mil-librerija iżgħar. Id-distribuzzjoni tal-fluworexxenza tal-librerija oriġinali miksuba permezz taċ-ċitometrija tal-fluss kienet kważi identika għal dik ta 'sg PC (Figura 2B). Madankollu, wara tliet passi konsekuttivi ta 'għażla, kull librerija (għolja, nofs, u baxxa) kellha 63%, 24%, u 14% livelli medjan ta' fluworexxenza meta mqabbla ma 'sg PC, rispettivament (Figura 2B). Tnejn u tmenin kolonja ġew iżolati minn dawn il-libreriji iżgħar, b'livelli ta 'fluworexxenza li jvarjaw minn 8% sa 104% (Figura 2C). Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li tetraloop mutating u r-reġjun tal-ġenb tiegħu ta 'l-sgRNA jistgħu jimmodulaw l-affinità ta' rbit bejn dCas9 u sgRNA għal diversi effiċjenzi ta 'ripressjoni. Analiżi PCR kwantitattiva ta’ traskrizzjoni inversa (RT-qPCR) ta’ 10 mutanti sgRNA (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10, Tabella Supplimentari S6) b’diversi sinjali ta’ fluworexxenza bejn sg WT u sg PC fost 82 kolonja sgRNA wriet li l-livelli ta’ fluworexxenza żdiedu b’mod lineari tat-traskrizzjoni mCherry. , li jindika li s-sistema CRISPRi tagħna tikkontrolla l-espressjoni tal-ġeni fil-livell traskrizzjoni (Figura Supplimentari S2). Is-sistema CRISPRi tunable tagħna tutilizza sgRNAs inġinerija, li jistgħu jiksbu kontroll tar-ripressjoni sa 45-darbiet, li jippermetti rfinar tal-effiċjenza tar-ripressjoni mingħajr ma jbiddlu l-ammonti ta 'dCas9 jew sgRNA. Vantaġġ notevoli tas-sistema tagħna huwa li tista 'tirfina l-effiċjenza tar-ripressjoni permezz ta' varjanti speċifiċi ta 'sgRNA mingħajr il-potenzjal għal konsegwenzi mhux intenzjonati, minkejja li hija meħtieġa klonazzjoni addizzjonali. Barra minn hekk, il-kurva tat-tkabbir tissuġġerixxi li s-sistema tagħna ma timponix piż ċellulari sinifikanti (Figura Supplimentari S3). Barra minn hekk, RNA-Seq fuq tliet varjanti sg trcSL1 b'livelli varji ta 'effiċjenza ta' ripressjoni wera li l-espressjoni ta '51 sa 83 ġeni nbidlet, b'kuntrast mal-ġeni 262 mibdula fl-sg WT (Figura Supplimentari S4). Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-varjanti sg trcSL1 kellhom effetti mhux fil-mira saħansitra aktar baxxi mis-sistema CRISPRi konvenzjonali. Huwa partikolarment rilevanti f'applikazzjonijiet ta 'inġinerija metabolika, fejn l-ottimizzazzjoni tal-mogħdijiet metaboliċi ħafna drabi tinvolvi l-manipulazzjoni ta' ġeni multipli. Il-ħila li tirfina l-espressjoni tal-ġeni mingħajr ma tikkawża effetti sekondarji negattivi tista 'tħaffef b'mod sinifikanti l-proċess ta' ottimizzazzjoni u ttejjeb l-effiċjenza u l-produttività ġenerali tas-sistema.

Figura 2. Struttura tal-librerija sgRNA u screening tal-librerija. (A) scaffold sgRNA użat f'dan l-istudju. 12-mer li fih it-tetraloop u s-sekwenza ta' ħdejn tagħha tiġi mutata b'mod każwali minn sg trcSL1 biex tinkiseb librerija sgRNA. (B) Distribuzzjoni tal-fluworexxenza miksuba miċ-ċitometrija tal-fluss qabel (xellug) u wara (lemin) issortjar. Kull distribuzzjoni fiha 100,000 ċellula. (C) Fluworexxenza ta 'kolonji singoli miksuba minn (B). Il-vireg tal-iżball jindikaw devjazzjoni standard (n=2).

Effetti tal-kwantità ta 'dCas9 u sgRNA fuq l-effiċjenza tar-ripressjoni

Peress li l-modulazzjoni tal-ammont jew ta 'dCas9 jew sgRNA tista' tbiddel l-effiċjenza tar-ripressjoni tas-sistema CRISPRi (23,24), huwa essenzjali li jiġi eżaminat l-impatt tal-kwantità ta 'dCas9 u sgRNA fuq l-effiċjenza tar-ripressjoni. Aħna ttestjajna l-prestazzjoni tas-sistema tagħna taħt kundizzjonijiet differenti billi nbiddlu l-ammonti ta 'dCas9 u sgRNA bl-użu ta' għaxar mutanti sgRNA (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10). Tliet konċentrazzjonijiet differenti (20, 100, u 500 ng/ml) tal-induttur intużaw għall-espressjoni dCas9. Meta mqabbel mal-livell ta' mRNA dCas9 meta ntuża 20 ng/ml ta' induttur, żdied aktar b'{15}}darbiet (100 ng/ml) u 22-darbiet (500 ng/ml) (Figura Supplimentari S5A ). Hemm tħassib dwar l-espressjoni żejda tad-dCas9 peress li livell għoli ta 'dCas9 jista' jkun tossiku għaċ-ċelloli (47,48) jew xi kultant le (49). Madankollu, ir-rata tat-tkabbir tnaqqset b'inqas minn 10% meta ntuża sa 500 ng/ml ta 'aTc, skont il-kurvi tat-tkabbir f'diversi konċentrazzjonijiet ta' induttur (Figura Supplimentari S6). Dan jissuġġerixxi li l-ammont ta 'dCas9 ma kellux effett tossiku fuq E. coli taħt il-kundizzjonijiet ittestjati. L-effiċjenza tar-ripressjoni nbidlet marġinalment meta l-ammont differenti ta 'dCas9 ġie espress (Figura 3A). Kien konsistenti ma' studju preċedenti li s-sistema CRISPRi laħqet effiċjenza massima ta' ripressjoni f'[aTc]< 5 ng/ml when the same replication origin and promoter were used for the expression of CRISPRi components (24). We set the inducer concentration to 500 ng/ml to sufficiently supply dCas9 for further applications such as multiple gene regulation. The property that our system is less sensitive to the amount of dCas9 has advantages over the strategy of adjusting inducer concentration, as the dose-dependent induction of dCas9 might be varied due to the promoters, plasmid copy numbers, or host strains (50–53). Additionally, using CRISPR-based systems allows for the simultaneous targeting of multiple genes for editing or repression, making it an effective tool for multiplexing gene regulation (54). Our tunable CRISPRi system allows for the precise modulation of repression efficiency through sgRNA variants. With this approach, it would be possible to target multiple genes with varying levels of repression simultaneously. The previous study reported that stronger promoters for sgRNA expression lead to higher repression efficiency (24). To investigate the effect of the amount of sgRNA on repression efficiency in our system, two different promoters having different strengths were used (BBa J23100; J23100 and BBa K2753055; UPJ23119). Promoter UPJ23119 contains a UP element that interacts with E. coli RNA polymerase and expresses 16-fold more transcript than J23100 (55). However, the exact fold change may vary depending on the plasmids, genes, and host strains used. Our results showed that UPJ23119 doubled sgRNA expression in our system and had higher repression efficiency (Figure 3B and Supplementary Figure S5B). These results suggest that adjusting the amount of sgRNA can further expand the dynamic range of multi-level expression and provide precise modulation of repression efficiency.

Figura 3. Karatterizzazzjoni u l-modularità tas-sistema CRISPRi tunable. (A) Fluworexxenza relattiva taħt konċentrazzjonijiet differenti ta 'aTc (20, 100, u 500 ng/ml). (B) Fluworexxenza relattiva taħt promoturi differenti (J23100 u UPJ23119). (C) Fluworexxenza relattiva taħt protospacers differenti. L-assi x jindika l-fluworexxenza relattiva ta' mCherry, u l-assi y jindika l-fluworexxenza relattiva ta' lacI33-mCherry (aħmar) u araC33-mCherry (blu). 33 bp ta' sekwenzi addizzjonali minn lacI u araC ġew miżjuda mat-tarf 5- ta' mCherry (56). (D) Enerġija ħielsa ta' 12-mer u l-fluworexxenza relattiva. Linji b'daxx jindikaw intervall ta 'tbassir ta' 95% u linji solidi jindikaw linja ta 'rigressjoni. Il-valur dG ta' sg trcSL1c2 ma setax jinkiseb bl-użu ta' mFold u għalhekk jiġi eskluż mill-analiżi. (A–D) Il-vireg tal-iżball kollha jindikaw devjazzjoni standard (n=3).

Modularità tas-sistema CRISPRi tunable

L-approċċ tagħna li juża varjanti speċifiċi ta 'sgRNA biex jinżamm ċertu livell ta' espressjoni għal DNA fil-mira għandu l-potenzjal li jintuża bħala sistema modulari. Biex nuru l-fattibilità tas-sistema CRISPRi sintonizzabbli għall-mira ta’ protospacers differenti, bnejna żewġ ġeni ta’ fużjoni (lacI{{0}}mCherry u araC33-mCherry) billi żidna 33 bps ta’ sekwenzi minn lacI u araC sal-5 -tarf ta’ mCherry (56). Il-ġenoma ta' E. coli BL21(DE3) (GenBank: CP001509.3) fih żewġ kopji tas-sekwenza protospacer għal lacI33- mCherry u kopja waħda għal araC{33-mCherry. Madankollu, dawn is-sekwenzi kromosomali m'għandhomx sekwenzi PAM u, għalhekk, ma jistgħux jiġu mmirati mill-kumpless dCas9-sgRNA (43). Meta s-siRNAs kienu ddisinjati biex jimmiraw kull protospacer, l-effiċjenza tar-ripressjoni nżammet b'mod konsistenti għall-protospacers kollha minn lacI33, araC33, u mCherry (Figura 3C). Dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li s-sistema CRISPRi tunable tagħna tista 'tirregola b'mod effettiv l-espressjoni tal-ġeni f'ċertu livell irrispettivament mis-sekwenza tal-protospacer. Spjegazzjoni potenzjali waħda għar-relazzjoni osservata bejn il-formazzjoni tal-kumpless RNP u l-effiċjenza tar-ripressjoni hija l-bidla fl-enerġija ħielsa meta l-kumpless jiġi ffurmat. Il-linker tetraloop artifiċjali u r-reġjun tal-ġenb tiegħu fihom żewġ pari bażi A: U u G: C Watson-Crick u par bażi A: G mhux Watson-Crick (44). Peress li l-irbit ta 'crRNA u tracrRNA huma kruċjali għall-formazzjoni kumplessa, mutazzjonijiet li jimmiraw lejn tetraloop jaffettwaw l-affinità ta' rbit bejn dCas9 u sgRNA. Din l-affinità tista 'tiġi kkalkulata mid-differenza ta' enerġija ħielsa bejn l-istati kkonfinati u mhux konfinati. Madankollu, il-komputazzjoni tal-enerġija ħielsa tal-istati konfinati hija ta' sfida (57). Aħna suppost li l-istruttura ġenerali u l-istabbiltà tal-istat konfinat ma jinbidlux peress li sgRNAs magħżula mil-librerija ma jfixklux għal kollox il-funzjoni tiegħu. Barra minn hekk, it-tetraloop u r-reġjun tal-ġenb tiegħu għandhom ftit kuntatt mad-dCas9 (44). Għalhekk, l-affinità li torbot bejn dCas9 u sgRNA tkun affettwata prinċipalment mill-istabbiltà tal-istruttura sekondarja tat-tetraloop u s-sekwenza tal-ġenb tagħha. Ibbażat fuq din l-idea, ikkalkulajna l-enerġija ħielsa tat-tetraloop u s-sekwenzi tal-ġenb tagħha bl-użu tal-moffa (58). Id-differenza fl-enerġija ħielsa tat-tiwi minħabba l-mutazzjonijiet hija definita bħala d-differenza bejn l-enerġija ħielsa tas-sekwenzi mutati u tat-tip selvaġġ. Jista' jiġi kkalkulat direttament mill-enerġija ħielsa tat-tiwi ta' mutanti peress li l-enerġija tat-tiwi tas-sekwenza tat-tip selvaġġ hija kostanti għal –4.3 kcal/mol. Hekk kif l-enerġija ħielsa tat-tiwi żdiedet, is-sinjal tal-fluworexxenza żdied (Figura 3D). L-effiċjenza tar-ripressjoni kienet l-ogħla meta l-enerġija li tiwi tar-reġjun li fih it-tetraloop kienet qrib jew inqas minn 0 kcal/mol u naqset b'mod lineari hekk kif l-enerġija li tiwi qabżet iż-0 kcal/mol. Din l-osservazzjoni tissuġġerixxi li l-effiċjenza tal-formazzjoni kumplessa bejn dCas9 u sgRNA hija determinata mill-istruttura sekondarja tar-reġjun tetraloop, li tgħin tispjega l-modularità tas-sistema tagħna. L-effiċjenza ta' ripressjoni ta' 85 sgRNA addizzjonali b'sekwenzi ta' 12-mer differenti mil-librerija ġiet imkejla biex tiġi vvalidata aktar din ir-relazzjoni. Wera wkoll il-korrelazzjoni osservata minn varjanti sg trcSL1 (Figura 3D u Tabella Supplimentari S7), li tissuġġerixxi li t-tetraloop linker għandu rwol kruċjali fil-formazzjoni tal-kumpless RNP u li mutazzjonijiet f'dan ir-reġjun jistgħu jkollhom impatt fuq l-effiċjenza tas-sistema CRISPR. Barra minn hekk, din ir-relazzjoni turi l-possibbiltà ta 'disinn ibbażat fuq il-kompjuter ta' varjanti sgRNA b'effiċjenza ta 'ripressjoni mixtieqa.

L-applikazzjoni ta' sistema CRISPRi sintonizzabbli għar-ridistribuzzjoni tal-fluss fil-mogħdija bijosintetika ta' violacein f'E. coli

Redistributing the metabolic flux is an important process in metabolic engineering to maximize the yield of target products (59,60). Because our system could precisely control gene expression by targeting any protospacer, we chose the violacein biosynthetic pathway as a model system for pathway redistribution. Violacein is an indole derivative compound that exhibits a deep purple color, originally produced by Chromobacterium violaceum (Figure 4A) (61). This compound is synthesized from L-tryptophan by five enzymes encoded by vioA, vioB, vioE, vioD, and vioC (62). Along with violacein (V), other indole derivatives such as proviolacein (PV), deoxyviolacein (DV), and prodeoxyviolacein (PDV) with different colors can also be produced (Figure 4A) (62). The production of violacein and deoxy violacein is an enzymatic process mediated by vioC, while the production of PV and PDV is a non-enzymatic process. We expressed the violacein biosynthetic pathway under the IPTG inducible promoter (63), and different trcSL1 variants were designed to target vioD to redirect the flux. It could effectively modulate the expression of vioD at the transcriptional level (Figure 4B). vioC was repressed by sg WT and showed high variation (Supplementary Figure S7), but the absolute copy number was kept at low levels (>100-darbiet) meta mqabbla ma' ġeni oħra meta kkalkulati mill-kurvi standard. B'kuntrast, l-espressjoni ta 'enzimi oħra mhux regolati fil-mogħdija tal-violacein (vioA, vioB, u vioE) baqgħet ma nbidlitx. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li s-sistema tagħna tista 'timmira u timmodula speċifikament l-espressjoni ta' ġeni individwali mingħajr ma taffettwa ġeni oħra fil-mogħdija. Kwantifikazzjoni diretta ta 'PV u PDV ma kinitx possibbli minħabba n-nuqqas ta' standards disponibbli kummerċjalment għall-analiżi HPLC. Għalhekk aħna kejlu t-titri f'unitajiet arbitrarji bl-użu taż-żona tal-quċċata tal-HPLC. It-titru tal-prodott laħaq massimu fi 8 sigħat wara l-induzzjoni u mbagħad naqas gradwalment (Figura Supplimentari S8), possibbilment minħabba l-konverżjoni tal-prodott għal prodotti sekondarji oħra, bħal chromoviridans, b'mekkaniżmu mhux magħruf (42,64). Il-qċaċet minuri osservati fuq l-ispettru HPLC indikaw il-preżenza ta 'prodotti sekondarji minuri addizzjonali. Riċerka preċedenti wriet li l-logaritmu tat-titru ta 'kull prodott f'unitajiet arbitrarji jista' jiġi mbassar permezz ta 'kombinazzjonijiet lineari tal-qawwa promotur ta' kull ġene involut fil-mogħdija bijosintetika tal-violacein (42). Dan il-mudell ta 'rigressjoni log-lineari kien validu wkoll fis-sistema tagħna, u t-traskrizzjonijiet tal-vioD miżjuda kienu assoċjati ma' żieda fil-produzzjoni PV (Figura 4B). Huwa magħruf li l-inġinerija tal-promotur jew 5 -UTR ta 'kull ġene involut fil-mogħdija bijosintetika ta' violacein ippermettiet ir-ridistribuzzjoni tal-fluss u l-ottimizzazzjoni tal-mogħdija (65,66). Is-sistema tagħna tista 'taħdem bħala metodu alternattiv li juri l-kontroll tat-traskrizzjoni mingħajr ma timmanipula promoturi involuti fil-mogħdija bl-użu ta' sgRNAs sintetiċi, li huma qosra u jistgħu jiġu mmuntati b'metodi ta 'pass wieħed. L-iskrinjar permezz tas-sistema CRISPRi sintonizzabbli jagħmilha possibbli li l-mogħdija tintbagħat mill-ġdid b'fluss prevedibbli qabel ma timmanipula direttament razez ospitanti jew cassettes tal-ġeni, potenzjalment jaċċelleraw il-proċess.

L-applikazzjoni tas-sistema CRISPRi tunable għall-ibbilanċjar tal-fluss tal-karbonju f'E. coli li tipproduċi l-lycopene

Il-produzzjoni effiċjenti ta 'komposti ta' valur fl-inġinerija metabolika teħtieġ ibbilanċjar tal-fluss tal-karbonju. Il-mogħdija tal-metileritritol 4-fosfat (MEP) hija mogħdija metabolika li tuża prekursuri sempliċi bħal piruvat u glyceraldehyde 3-fosfat (GAP) biex tipproduċi blokki tal-bini isoprenoid, dimethylallyl pyrophosphate u isopentenyl pyrophosphate (67,68) . Dawn il-molekuli jissintetizzaw il-geranyl pyrophosphate, li huwa kkonvertit f'farnesyl pyrophosphate (FPP) (67,68). Lycopene, karotenojdi ta 'valur għoli bi proprjetajiet antiossidanti qawwija u applikazzjonijiet diversi f'diversi industriji (69), huwa sintetizzat minn FPP permezz ta' serje ta 'reazzjonijiet enżimatiċi minn crtE, crtB, u crtI (Figura 4C) (22,70). Il-prekursur GAP huwa essenzjali mhux biss għall-mogħdija tal-MEP iżda wkoll għall-mogħdija tal-glikolisi (22). Espressjoni mnaqqsa tal-ġene gapA, li tikkodifika l-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) fil-mogħdija tal-glycolysis, intweriet li ttejjeb il-produzzjoni tal-lycopene billi żżid il-grupp GAP (22). Għalhekk, immirajna gapA b'ħames varjanti, inklużi tliet varjanti sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, u sg trcSL1c6) li wrew diversi effiċjenza ta 'ripressjoni, sg PC, u sg WT. Madankollu, gapA huwa ġene essenzjali li ma jistax jiġi knocked down kompletament (71,72). Tentattivi biex tiġi mrażżna gapA b'CRISPRi konvenzjonali bl-użu ta' sg WT ma rnexxewx anke bit-tnixxija baxxa tad-dcas9 taħt il-promotur tet (73). Min-naħa l-oħra, ripressjoni fuq livelli multipli tal-espressjoni tal-ġene gapA bl-użu tas-sistema CRISPRi sintonizzabbli nkisbet mingħajr difett tat-tkabbir u rriżultat f'żieda ta' 2.7-darbiet b'sg trcSL1c6 fil-produzzjoni tal-lycopene meta mqabbla ma' razza li tesprimi bis-sħiħ il-ġene gapA wara 15-il siegħa ta 'kultivazzjoni (Figura 4D u Figura Supplimentari S9). Ġie rrappurtat li 10% biss tal-espressjoni naturali tal-ġene gapA twassal għal ġabra akbar ta 'GAP mingħajr bidla sinifikanti fil-metaboliti downstream fil-mogħdija tal-glikolisi, bħal 2-fosfogliċerat u 3- fosfogliċerat ( 22). B'mod kollettiv, dawn ir-riżultati juru li CRISPRi tunable jista 'jirapressa b'mod preċiż l-espressjoni tal-ġeni f'livelli multipli mingħajr inġinerija tal-kromożomi.

Figura 4. Applikazzjoni tas-sistema CRISPRi tunable għall-mogħdija bijosintetika tal-violacein. (A) mogħdija bijosintetika tal-Violacein u l-kostruzzjoni tal-plasmid. Ħames ġeni (vioA, vioB, vioC, vioD, u vioE) responsabbli għall-produzzjoni ta' violacein ġew ikklonati fi plasmid li jesprimi dCas9-. Erba 'prodotti ewlenin (violacein, proviolacein, deoxyviolacein, u prodeoxyviolacein) huma prodotti. sg WT għal vioC u ħames varjanti sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6, sg trcSL1c8 u sg trcSL1c9) għal vioD, li juru effiċjenzi ta 'repressjoni differenti, ġew ikklonati fil-plasmid l-ieħor. Trp: L-tryptophan, V: violacein, PV: proviolacein, PDV: prodeoxyviolacein, DV: deoxyviolacein, PDVA: aċidu protodeoxyviolaceinic, PVA: aċidu protoviolaceinic. (B) Relazzjoni bejn traskrizzjonijiet vioD, fluworexxenza mCherry, u titer ta 'PDV u PV. L-assi x jindika l-vioD RNA relattiv miksub minn RT-qPCR, l-assi y fuq ix-xellug jindika l-fluworexxenza relattiva mCherry mill-Figura 3, u l-assi y fuq il-lemin jindika l-proporzjon taż-żona HPLC. Kampjuni bl-ogħla valur tal-vioD RNA ġew issettjati għal 100% għan-normalizzazzjoni. (C) mogħdija bijosintetika tal-lycopene u l-kostruzzjoni tal-plasmid. Tliet ġeni (crtE, crtB, crtI) responsabbli għall-produzzjoni tal-lycopene ġew ikklonati fi plasmid li jesprimi dCas9-. gapA kien immirat b'varjanti sg trcSL1 (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6) u sg PC ġie kklonat fil-plasmid l-ieħor. Glc: Glukożju, GAP: glyceraldehyde 3-fosfat, 1,3-BPG: 1,{3-bisphosphoglycerate, DMAPP: dimethylallyl pyrophosphate, IPP: isopentenyl pyrophosphate, FPP: farnesyl pyrophosphate. (D) Relazzjoni bejn traskrizzjonijiet gapA, fluworexxenza mCherry, u produzzjoni ta 'lycopene. L-assi x jindika d-distakk relattiv RNA miksub minn RT-qPCR, l-assi y fuq ix-xellug jindika l-fluworexxenza relattiva mCherry mill-Figura 3, u l-assi y fuq il-lemin jindika t-titru tal-lycopene. (B, D) Il-vireg kollha ta 'żball jindikaw devjazzjoni standard (n=3).

KONKLUŻJONI

Iddisinjajna sistema CRISPRi sintonizzabbli li tista 'tikkontrolla b'mod preċiż l-espressjoni tal-ġeni fil-livell mixtieq. Billi jbiddel it-tetraloop u r-reġjun tal-ġenb tiegħu, sgRNAs sintetiċi li jimmiraw diversi sekwenzi ta 'protospacer jistgħu jirregolaw il-ġene f'ċertu livell. Aħna applikajna b'suċċess din is-sistema biex nidderieġu mill-ġdid il-fluss metaboliku ta 'interess fil-mogħdija bijosintetika tal-violacein biex nipproduċu derivattivi ta' indol fi proporzjon prevedibbli. Barra minn hekk, urejna li l-użu ta' CRISPRi tunable wassal għal żieda ta' 2.7-darbiet fil-produzzjoni tal-lycopene, u enfasizza l-versatilità tas-sistema tagħna għat-titjib tal-produzzjoni ta' komposti ta' valur oħra. Din is-sistema taċċellera l-proċessi ta' ottimizzazzjoni tal-fluss qabel ma timmanipula b'mod permanenti l-informazzjoni ġenetika tal-host, bħas-sostituzzjoni tal-promotur jew is-sekwenzi 5-UTR.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

REFERENZI

1. Sapranauskas,R., Gasiunas,G., Fremaux,C., Barrangou,R., Horvath,P. u Siksnys,V. (2011) Is-sistema Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas tipprovdi immunità f'Escherichia coli. Aċidi Nukleiċi Res., 39, 9275–9282.

2. Gasiunas,G., Barrangou,R., Horvath,P. u Siksnys,V. (2012) Il-kumpless tar-ribonucleoprotein Cas9-crRNA jimmedja qsim speċifiku tad-DNA għal immunità adattiva fil-batterja. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, E2579–E2586.

3. Cong, L., Ran,FA, Cox, D., Lin,S., Barretto, R., Habib,N., Hsu, PD, Wu,X., Jiang, W., Marraffini, LA et al. . (2013) Inġinerija tal-ġenoma multiplex bl-użu ta' sistemi CRISPR/Cas. Xjenza, 339, 819–823.

4. Ran, FA, Hsu,PD, Wright,J., Agarwala,V., Scott,DA u Zhang,F. (2013) Inġinerija tal-ġenoma bl-użu tas-sistema CRISPR-Cas9. Nat. Protoc., 8, 2281–2308.

5. Jinek,M., Chylinski,K., Fonfara,I., Hauer,M., Doudna,JA u Charpentier,E. (2012) Endonukleażi tad-DNA iggwidata minn RNA doppju programmabbli f'immunità batterika adattiva. Xjenza, 337, 816–821.

6. Anders,C., Niewoehner,O., Duerst,A. u Jinek,M. (2014) Bażi strutturali tar-rikonoxximent tad-DNA fil-mira dipendenti mill-PAM mill-endonuclease Cas9. Natura, 513, 569–573.

7. Qi,LS, Larson, MH, Gilbert,LA, Doudna,JA, Weissman,JS, Arkin,AP and Lim,WA (2013) Repurposing CRISPR bħala pjattaforma ggwidata mill-RNA għall-kontroll speċifiku għas-sekwenza tal-espressjoni tal-ġeni. Ċellula, 152, 1173–1183.

8. Larson,MH, Gilbert,LA, Wang,X., Lim,WA, Weissman,JS u Qi,LS (2013) Interferenza CRISPR (CRISPRi) għal kontroll speċifiku għas-sekwenza tal-espressjoni tal-ġeni. Nat. Protoc., 8, 2180–2196.

9. McGlincy,NJ, Meacham,ZA, Reynaud,KK, Muller,R., Baum,R. u Ingolia, NT (2021) Librerija ta' gwida ta' interferenza CRISPR fuq skala tal-ġenoma tippermetti profili fenotipiċi komprensivi fil-ħmira. BMC Genomics, 22, 205.

10. Yoon,J. u Woo,HM (2018) CRISPR inġinerija metabolika medjata mill-interferenza ta 'Corynebacterium glutamicum għall-produzzjoni ta' homo-butyrate. Bijoteknoloġija. Bioeng., 115, 2067–2074.

11. Cleto,S., Jensen,JV, Wendisch,VF u Lu,TK (2016) Corynebacterium glutamicum metabolic engineering with CRISPR interference (CRISPRi). ACS Synth. Biol., 5, 375–385.

12. Zhang,GQ, Ren,XN, Liang,XH, Wang,YQ, Feng,DX, Zhang,YJ, Xian,M. u Zou,HB (2021) Titjib tal-produzzjoni mikrobjali ta 'aċidi amminiċi: minn approċċi konvenzjonali għal tendenzi reċenti. Bijoteknoloġija. Bioproc. E, 26, 708–727.

13. Kim,SK, Seong,W., Han,GH, Lee,DH u Lee,SG (2017) Repressjoni multiplex iggwidata mill-interferenza CRISPR tal-ġeni tal-mogħdija li jikkompetu endoġeni għar-ridirezzjoni tal-fluss metaboliku f'Escherichia coli. Mikrob. Cell Fact., 16, 188.

14. Ellis,NA, Kim,B., Tung,J. u Machner, MP (2021) Għodda ta' interferenza CRISPR multiplex għall-interrogazzjoni tal-ġeni tal-virulenza f'Legionella pneumophila. Komun. Biol., 4, 157.

15. Siu,KH u Chen,W. (2019) gRNA riboregolat għall-funzjoni CRISPR-Cas9 programmabbli. Nat. Chem. Biol., 15, 217–220.

16. Reis,AC, Halper,SM, Vezeau,GE, Cetnar,DP, Hossain,A., Clauer,PR u Salis,HM (2019) Ripressjoni simultanja ta 'ġeni batterjali multipli bl-użu ta' arrays sgRNA extra-twil mhux ripetittivi. Nat. Biotechnol., 37, 1294–1301.

17. Tian,T., Kang,JW, Kang,A. u Lee,TS (2019) Ridirezzjoni tal-fluss metaboliku permezz ta' ripressjoni medjata minn CRISPRi multiplex kombinatorja għall-produzzjoni ta' isopentenol f'Escherichia coli. ACS Synth. Biol., 8, 391–402.

18. Gauttam,R., Seibold,GM, Mueller,P., Weil,T., Weiss,T., Handrick,R. u Eikmanns, BJ (2019) Sistema ta 'interferenza CRISPR sempliċi li tista' tinduċi doppja għal immirar ta 'ġeni multipli f'Corynebacterium glutamicum. Plasmid, 103, 25–35.

19. Yao,L., Cengic,I., Anfelt,J. u Hudson,EP (2016) Multiple gene repression in cyanobacteria billi tuża CRISPRi. Acs Synth. Biol., 5, 207–212.

20. Lim,HG, Noh,MH, Jeong,JH, Park,S. u Jung,GY (2016) Ibbilanċjar mill-ġdid ottimali tal-mogħdija tal-produzzjoni tal-aċidu 3-hydroxypropionic mill-gliċerol f'Escherichia coli. ACS Synth. Biol., 5, 1247–1255.

21. Yang,Y., Lin,Y., Li,L., Linhardt,RJ u Yan,Y. (2015) Ir-regolazzjoni tal-metaboliżmu malonyl-CoA permezz ta 'RNAs antisens sintetiċi għal bijosintesi mtejba ta' prodotti naturali. Metab. Inġ., 29, 217–226.

22. Jung,J., Lim,JH, Kim,SY, Im,DK, Seok,JY, Lee,SV, Oh,MK and Jung,GY (2016) Ibbilanċjar preċiż tal-prekursuri għall-produzzjoni ta’ isoprenoids b’kontroll fin tal-espressjoni ta’ gapA f’ Escherichia coli. Metab. Inġ., 38, 401–408.

23. Li,XT, Jun,Y., Erickstad,MJ, Brown,SD, Parks,A., Court,DL u Jun,S. (2016) tCRISPRi: kontroll tunable u riversibbli, f'pass wieħed tal-espressjoni tal-ġeni. Sci. Rep., 6, 39076.

24. Fontana,J., Dong,C., Ham,JY, Zalatan,JG and Carothers,JM (2018) Espressjoni regolata ta' melodiji sgRNAs CRISPRi f'E. coli. Bijoteknoloġija. J., 13, e1800069.

25. Kim,NM, Sinnott,RW u Sandoval,NR (2020) Biosensors ibbażati fuq fattur ta 'traskrizzjoni u sistemi inducibbli f'batterji mhux mudell: progress attwali u direzzjonijiet futuri. Curr. Opinja. Biotechnol., 64, 39–46.

26. Kundert,K., Lucas,JE, Watters,KE, Fellmann,C., Ng,AH, Heineike,BM, Fitzsimmons,CM, Oakes,BL, Qu,J., Prasad,N. et al. (2019) Jikkontrolla CRISPR-Cas9 bi sgRNAs attivati ​​bil-ligand u diżattivati ​​mil-ligand. Nat. Komun, 10, 2127.

27. Ferreira,R., Skrekas,C., Hedin,A., Sanchez,BJ, Siewers,V., Nielsen,J. u David, F. (2019) Irfinar bl-għajnuna tal-mudell tal-metaboliżmu ċentrali tal-karbonju fil-ħmira permezz ta' regolamentazzjoni bbażata fuq id-dCas9-. ACS Synth. Biol., 8, 2457–2463.

28. Su,T., Guo,Q., Zheng,Y., Liang,Q., Wang,Q. u Qi, Q. (2019) Irfinar ta' hemB bl-użu ta' CRISPRi biex tiżdied il-produzzjoni ta' 5-aminolevulinic acid f'Escherichia coli. Quddiem. Microbiol., 10, 1731.

29. Zheng,T., Hou,Y., Zhang,P., Zhang,Z., Xu,Y., Zhang,L., Niu,L., Yang,Y., Liang,D., Yi,F . et al. (2017) L-ispeċifiċità tal-RNA ta 'gwida waħda tiżvela sekwenza ċentrali sensittiva ta' nuqqas ta 'qbil. Sci. Rep., 7, 40638.

30. Jiang,W., Bikard,D., Cox,D., Zhang,F. u Marraffini,LA (2013) Editjar iggwidat mill-RNA tal-ġenomi batterjali bl-użu ta’ sistemi CRISPR-Cas. Nat. Bijoteknoloġija,

31, 233–239. 31. van Gestel,J., Hawkins,JS, Todor,H. u Gross,CA (2021) Pipeline komputazzjoni għat-tfassil ta’ RNAs gwida għal nuqqas ta’ qbil-CRISPRi. STAR Protoc, 2, 100521.

32. Hawkins,JS, Silvis,MR, Koo,BM, Peters,JM, Osadnik,H., Jost,M., Hearne,CC, Weissman,JS, Todor,H. u Gross, CA (2020) Mismatch-CRISPRi jiżvela r-relazzjonijiet espressjoni-fitness ko-varjabbli ta 'ġeni essenzjali f'Escherichia coli u Bacillus subtilis. Cell Syst., 11, 523–535.

33. Fortin,J.-P., Tan,J., Gascoigne,KE, Haverty,PM, Forrest,WF, Costa,MR u Martin,SE (2019) L-immirar ta’ ġeni multipli u t-tolleranza ta’ nuqqas ta’ tqabbil jistgħu jfixklu l-analiżi tal-ġenoma- skrins CRISPR miġbura wiesgħa. Ġenoma Biol., 20, 21.

34. Rozen,S. u Skaletsky, H. (2000) Primer3 dwar il-WWW għall-utenti ġenerali u għall-programmaturi bijoloġisti. Metodi Mol. Biol., 132, 365–386.

35. Zhou,K., Zhou,L., Lim,Q., Zou,R., Stephanopoulos,G. u Too,HP (2011) Ġeni ta 'referenza ġodda għall-kwantifikazzjoni tar-risponsi traskrizzjonijiet ta' Escherichia coli għal espressjoni żejda ta 'proteina permezz ta' PCR kwantitattiv. BMC Mol. Biol., 12, 18.

36. Livak,KJ u Schmittgen,TD (2001) Analiżi tad-dejta tal-espressjoni tal-ġeni relattiva bl-użu ta' PCR kwantitattiv f'ħin reali u l-Metodu 2(-Delta Delta C(T)). Metodi, 25, 402–408.

37. Andrews,S. (2010) FastQC: Għodda ta' Kontroll tal-Kwalità għal Data ta' Sekwenza ta' Produttività Għolja. v0.11.9 ed.

38. Langmead,B., Trapnell,C., Pop,M. u Salzberg,SL (2009) Allinjament ultraveloċi u effiċjenti fil-memorja ta' sekwenzi qosra tad-DNA mal-ġenoma tal-bniedem. Ġenoma Biol., 10, R25.

39. Danecek,P., Bonfield,JK, Liddle,J., Marshall,J., Ohan,V., Pollard,MO, Whitwham,A., Keane,T., McCarthy,SA, Davies,RM et al. (2021) Tnax-il sena ta 'SAMtools u BCFtools. Gigascience, 10, giab008.

40. Trapnell,C., Williams,BA, Pertea,G., Mortazavi,A., Kwan,G., van Baren,MJ, Salzberg,SL, Wold,BJ u Pachter,L. (2010) L-assemblaġġ u l-kwantifikazzjoni tat-traskrizzjoni mill-RNA-Seq jiżvelaw traskrizzjonijiet mhux annotati u swiċċjar tal-isoforma waqt id-divrenzjar taċ-ċelluli. Nat. Biotechnol., 28, 511–515.

41. Trapnell,C., Hendrickson,DG, Sauvageau,M., Goff,L., Rinn,JL u Pachter,L. (2013) Analiżi differenzjali tar-regolamentazzjoni tal-ġeni f'riżoluzzjoni tat-traskrizzjoni b'RNA-seq. Nat. Biotechnol., 31, 46–53.

42. Lee,ME, Aswani,A., Han,AS, Tomlin,CJ u Dueber,JE (2013) Ottimizzazzjoni fil-livell ta 'espressjoni ta' mogħdija b'ħafna enzimi fin-nuqqas ta 'assaġġ ta' rendiment għoli. Aċidi Nukleiċi Res., 41, 10668–10678.

43. Hsu,PD, Scott,DA, Weinstein,JA, Ran,FA, Konermann,S., Agarwala,V., Li,Y., Fine,EJ, Wu,X., Shalem,O. et al. (2013) DNA li jimmira l-ispeċifiċità tan-nucleases Cas9 iggwidati mill-RNA. Nat. Biotechnol., 31, 827–832.

44. Nishimasu,H., Ran,F., Hsu,P., Konermann,S., Shehata,S., Dohmae,N., Ishitani,R., Zhang,F. u Nureki,O. (2014) Struttura tal-kristall ta 'Cas9 f'kumpless ma' Gwida RNA u DNA fil-mira. Cell, 156, 935–949.

45. Fu,Y., Rocha,PP, Luo,VM, Raviram,R., Deng,Y., Mazzoni,EO and Skok,JA (2016) CRISPR-dCas9 and sgRNA scaffolds enable dual-colour live imaging ta’ sekwenzi bis-satellita u loci individwali arrikkit ripetutament. Nat. Komun., 7, 11707.

46. ​​Khosravi,S., Schindele,P., Gladilin,E., Dunemann,F., Rutten,T., Puchta,H. u Houben, A. (2020) Applikazzjoni ta 'Aptamers Ittejjeb l-Immaġini Ħaj Ibbażat fuq CRISPR tat-Telomeri tal-Pjanti. Quddiem. Plant Sci., 11, 1254.

47. Nielsen,AA u Voigt,CA (2014) Ċirkwiti ġenetiċi CRISPR/Cas b'ħafna dħul li jgħaqqdu netwerks regolatorji ospitanti. Mol. Syst. Biol., 10, 763.

48. Lee,YJ, Hoynes-O'Connor,A., Leong,MC and Moon,TS (2016) Kontroll programmabbli tal-espressjoni tal-ġeni batterjali bil-44, 2462–2473.

49. Vigouroux,A., Oldewurtel,E., Cui,L., Bikard,D. u van Teeffelen,S. (2018) L-irfinar tal-kapaċità ta 'dCas9 li jimblokka t-traskrizzjoni jippermetti knockdown robust u bla storbju ta' ġeni batterjali. Mol. Syst. Biol., 14, e7899.

50. Zhang,Y., Shang,X., Lai,S., Zhang,G., Liang,Y. u Wen,T. (2012) Żvilupp u applikazzjoni ta 'sistema ta' espressjoni li tista 'tiġi indotta mill-arabinose billi tiffaċilita l-assorbiment ta' induttur f'Corynebacterium glutamicum. Appl. Environ. Microbiol., 78, 5831–5838.

51. Thompson,MG, Sedaghatian,N., Barajas,JF, Wehrs,M., Bailey,CB, Kaplan,N., Hillson,NJ, Mukhopadhyay,A. u Keasling,JD (2018) Iżolament u karatterizzazzjoni ta’ mutazzjonijiet ġodda fl-oriġini pSC101 li jżidu n-numru ta’ kopji. Sci Rep-UK, 8, 1590. 52. Fricke,PM, Link,T., Gatgens,J., Sonntag,C., Otto,M., Bott,M. u Polen,T. (2020) Plasmid ta 'espressjoni li jista' jinduċi L-arabinożju sintonizzabbli għall-batterju ta 'l-aċidu aċetiku Gluconobacter oxydans. Appl. Microbiol. Biotechnol., 104, 9267–9282.

53. Nguyen,TT, Nguyen,NH, Kim,Y., Kim,JR u Park,S. (2021) Karatterizzazzjoni in vivo tas-sistema promotur inducibbli ta '3-hydroxypropionic dehydrogenase fi Pseudomonas denitrificans. Biotechnol Bioproc E, 26, 612–620.

54. McCarty,NS, Graham,AE, Studena,L. u Ledesma-Amaro,R. (2020) Teknoloġiji CRISPR multiplexed għall-editjar tal-ġeni u r-regolamentazzjoni tat-traskrizzjoni. Nat. Komun, 11, 1281.

55. Yan,Q. u Fong,SS (2017) Studju ta 'effetti ta' rbit traskrizzjoni in vitro u storbju bl-użu ta 'promoturi kostituttivi flimkien ma' sekwenzi ta 'elementi UP f'Escherichia coli. J. Biol. Inġ., 11, 33.

56. Seo,SW, ​​Yang,JS, Kim,I., Yang,J., Min,BE, Kim,S. u Jung,GY (2013) Disinn prevedittiv tar-reġjun tal-bidu tat-traduzzjoni tal-mRNA biex jikkontrolla l-effiċjenza tat-traduzzjoni prokarjotika. Metab. Inġ., 15, 67–74. 57. Kappel,K., Jarmoskaite,I., Vaidyanathan,PP, Greenleaf,WJ, Herschlag,D. u Das,R. (2019) Testijiet għomja ta 'previżjoni ta' affinità li torbot RNA-proteina. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116, 8336–8341.

58. Zuker,M. (2003) Mfold web server għal aċidu nuklejku tiwi u tbassir ibridizzazzjoni. Aċidi Nukleiċi Res., 31, 3406–3415.

59. Xiong,B., Zhu,Y., Tian,D., Jiang,S., Fan,X., Ma,Q., Wu,H. u Xie,X. (2021) Ridistribuzzjoni tal-fluss tal-metaboliżmu ċentrali tal-karbonju għal produzzjoni effiċjenti ta 'l-tryptophan f'Escherichia coli. Bijoteknoloġija. Bioeng., 118, 1393–1404.

60. Yao,R., Li,J., Feng,L., Zhang,X. u Hu,H. (2019) (13)C inġinerija metabolika ggwidata mill-analiżi tal-fluss metaboliku ta 'Escherichia coli għal produzzjoni mtejba ta' acetol mill-gliċerol. Bijoteknoloġija. Bijofjuwils, 12, 29.

61. Duran,N. u Menck, CF (2001) Chromobacterium violaceum: reviżjoni tal-perspettivi farmakoloġiċi u industiral. Krit. Dun Microbiol., 27, 201–222.

62. Balibar, CJ u Walsh, CT (2006) Biosintesi in vitro ta' violacein minn L-tryptophan mill-enzimi VioA-E minn Chromobacterium violaceum. Bijokimika, 45, 15444–15457.

63. Gwon,DA, Seok,JY, Jung,GY u Lee,JW (2021) Evoluzzjoni tal-laboratorju adattivi assistita minn bijosensuri għall-produzzjoni tal-vjolaċeina. Int. J. Mol. Sci., 22, 6594.

64. Sanchez,C., Brana,AF, Mendez,C. u Salas, JA (2006) Rivalutazzjoni tal-mogħdija bijosintetika tal-violacein u r-relazzjoni tagħha mal-bijosintesi tal-indolokarbazole. Chem. Bio. Chem., 7, 1231–1240.

65. Jones,JA, Vernacchio,VR, Lachance,DM, Lebovich,M., Fu,L., Shirke,AN, Schultz,VL, Cress,B., Linhardt,RJ u Koffas,MA (2015) ePathOptimize: a approċċ kombinatorju għall-ibbilanċjar traskrizzjoni tal-mogħdijiet metaboliċi. Sci. Rep., 5, 11301.

66. Zhang,Y., Chen,H., Zhang,Y., Yin,H., Zhou,C. u Wang,Y. (2021) Inġinerija RBS diretta tar-raggruppament tal-ġeni bijosintetiċi għall-produttività effiċjenti tal-vjolaċeini f'E. coli. Mikrob. Cell Fact., 20, 38.

67. Hunter, WN (2007) Il-mogħdija mhux tal-mevalonat tal-bijosintesi tal-prekursuri tal-isoprenoid. J. Biol. Chem., 282, 21573–21577.

68. Rohmer,M. (1999) L-iskoperta ta 'mogħdija indipendenti mill-mevalonat għall-bijosintesi ta' isoprenoid f'batterji, alka u pjanti ogħla. Nat. Prod. Rep., 16, 565–574.

69. Muller,L., Caris-Veyrat,C., Lowe,G. u Bohm,V. (2016) Lycopene u r-rwol antiossidant tiegħu fil-prevenzjoni ta 'mard kardjovaskulari - reviżjoni kritika. Krit. Dun Ikel Sci. Nutr., 56, 1868–1879.

70. Miura,Y., Kondo,K., Saito,T., Shimada,H., Fraser,PD u Misawa,N. (1998) Produzzjoni tal-karotenojdi lycopene, beta-carotene, u astaxanthin fil-ħmira tal-ikel Candida utilis. Appl. Environ. Microbiol., 64, 1226–1229.

71. Goodall,ECA, Robinson,A., Johnston,IG, Jabbari,S., Turner,KA, Cunningham,AF, Lund,PA, Cole,JA u Henderson,IR (2018) The essential genome of Escherichia coli K{ {2}}. Mbio, 9, e02096-17.

72. Baba,T., Ara,T., Hasegawa,M., Takai,Y., Okumura,Y., Baba,M., Datsenko,KA, Tomita,M., Wanner,BL u Mori,H. (2006) Kostruzzjoni ta 'Escherichia coli K-12 in-frame, mutanti knockout ta' ġene wieħed: il-ġbir Keio. Mol. Syst. Biol., 2, 2006.0008.

73. Bertram,R. u Hillen,W. (2008) L-applikazzjoni ta 'Tet repressor fir-regolamentazzjoni u l-espressjoni tal-ġeni prokarjotiċi. Mikrob. Biotechnol., 1, 2–16.