1. Introduzzjoni

L-identifikazzjoni tal-ingredjenti tal-ikel bi proprjetajiet immunomodulatorji flimkien mal-miri molekulari rispettivi tagħhom ġibdet interess akbar f'dawn l-aħħar snin. Minħabba d-diversità għolja tal-ligand tagħhom, is-superfamilja potenzjali tar-riċettur temporanju tal-kanali tal-joni (kanali TRP) tirrappreżenta klassi interessanti ħafna ta 'strutturi ta' mira potenzjali.

Is-superfamilja tal-kanali TRP tal-mammiferi tinkludi sitt familji ta' proteini relatati, jiġifieri l-ankyrin (TRPA), il-kanoniku (TRPC), il-melastatin (TRPM), il-mucolipin (TRPML), il-polycystin (TRPP), u l-familja vanilloid (TRPV), li kollha tipikament jaqsmu sitt segmenti transmembrana li jinġabru bħala tetramers biex jiffurmaw porcations selettivi b'katonizzazzjoni varjabbli. Il-kanal TRPV1 jista 'jkun, bil-bosta, l-aktar membru investigat b'mod intensiv tas-superfamilja TRP. TRPV1 kien inizjalment identifikat bħala r-riċettur għall-kapsajċina, il-komponent pikkanti tal-bżar taċ-chili.[2] Aktar tard, ukoll l-ingredjenti punġenti mill-ġinġer, il-gingerols, intwerew li jattivaw TRPV1.[3]

Ir-rwol bijoloġiku ta 'TRPV1 f'tipi ta' ċelluli mhux newronali għadu taħt investigazzjoni estensiva, iżda r-riżultati disponibbli jimplikaw funzjonijiet ferm lil hinn mill-perċezzjoni sensorja u termali. Pereżempju, intervent ta '12-il ġimgħa b'doża ta' kuljum ta '0.15 mg tal-agonist TRPV1 nonivamide, analogu strutturali tal-kapsajċina, ipprevjeni żieda fil-massa tax-xaħam tal-ġisem ikkawżata mid-dieta, u żied il-livelli ta' serotonin fil-plażma f'suġġetti b'saħħithom b'piż żejjed.[4]

Fl-adipocytes 3T3-L1 l-attivazzjoni ta' TRPV1 permezz ta' nonivamide naqqset l-akkumulazzjoni tal-lipidi waqt id-divrenzjar u l-maturazzjoni billi trażżan l-espressjoni ta' PPAR𝛾.[5] Fil-makrofaġi, capsaicin u nonivamide attenwaw rilaxx indott minn LPS ta 'ċitokini pro-infjammatorji bħal IL6, CXCL8, u TNF-alfa, b'mod dipendenti fuq TRPV1.[6] Madankollu, il-funzjonijiet partikolari ta 'TRPV1 fil-lewkoċiti tad-demm tal-bniedem jibqgħu vagi. Fiċ-ċelloli NK tal-bniedem, 10 u 50 μM kapsajċina indoxxew żieda fil-konċentrazzjonijiet intraċellulari ta' Ca2+, li jindika kanal TRPV1 funzjonali.[7]

Madankollu, funzjonijiet effettur taċ-ċelluli NK imxarrba bħal degranulazzjoni ċitotossika u sekrezzjoni ta 'ċitokini, indotti minn trattament minn qabel taċ-ċelloli b'kapsajċina għal siegħa f'firxa ta' konċentrazzjoni ta '10-100 μM, kienu fil-biċċa l-kbira TRPV1 indipendenti.[7] Fiċ-ċelluli T, TRPV1 ġie dokumentat li huwa involut fil-proċessi ta 'sinjalazzjoni tar-riċettur taċ-ċelluli T, proliferazzjoni u differenzjazzjoni taċ-ċelluli T, kif ukoll produzzjoni ta' ċitokini.[8] Xogħol preċedenti mill-grupp tagħna wera wkoll espressjoni funzjonali ta 'TRPV1 fiċ-ċelloli T primarji umani.[9] Barra minn hekk, analiżi tar-rispons tad-doża f'konċentrazzjonijiet li jvarjaw minn 0.03 sa 300 μmol L-1 urew li [6]-gingerol jinibixxi t-tnixxija taċ-ċitokini minn lewkoċiti umani primarji b'valur IC50 ta '82.2 μmol L-1.

Madankollu, il-kwantifikazzjoni ta '[6]-gingerol f'kampjuni tal-plażma ta' suġġetti b'saħħithom żvelat konċentrazzjoni massima medja fil-plażma ta '42.0 ± 16.3 nmol L-1 biss wara t-teħid ta' 1 L ta 'tè tal-ġinġer. Peress li dawn il-konċentrazzjonijiet [6]- gingerol ma kellhom l-ebda impatt sinifikanti fuq is-sekrezzjoni taċ-ċitokini fi studji preċedenti,[9] mhuwiex ċar, jekk konċentrazzjoni rilevanti tad-dieta ta '50 nmol L-1, li tintlaħaq fil-plażma tad-demm wara l-konsum ta' 1 L ta 'tè tal-ġinġer, hijiex biżżejjed biex timmodula r-risponsi immuni ċellulari f'lewkoċiti primarji umani oħra.

Għan-newtrofili umani, l-għarfien dwar ir-rwol funzjonali ta 'TRPV1 huwa limitat. Filwaqt li Köse u Nazıroglu˘ [10] wrew flussi ta' Ca2+- fin-newtrofili b'reazzjoni għal 10 μM kapsajċina li jonqsu mill-antagonist ta' TRPV1 capsazepine, riżultati oħra ma wrewx li l-kapsajċina jinduċi influss ta' Ca{2+ meta ttestjat f'medda ta' konċentrazzjoni ta' 1-10 μM, minkejja TRPV10 μM, minkejja li l-kapsajċina tista' tinduna espressjoni.[11]

In-newtrofili huma l-aktar lewkoċiti abbundanti fid-demm uman, li jammontaw għal 60-70 % taċ-ċelluli bojod tad-demm kollha li jiċċirkolaw. Huma l-ewwel ċelluli immuni li jiġu reklutati fis-siti ta 'infezzjoni; għalhekk ħafna drabi jissejħu l-ewwel linja ta' difiża.[12] Ir-reklutaġġ tan-newtrofili jiġi attivat minn, fost oħrajn, il-peptide batterjali jew derivat mill-mitokondrija N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLF) jew kimokini bħal CXCL8 (IL-8).[13]

Mekkaniżmi ta' difiża tan-newtrofili jinkludu fagoċitosi,[14] rilaxx ta' enżimi anti-mikrobiċi permezz ta' degranulazzjoni,[15] ġenerazzjoni ta' speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS),[16] u l-formazzjoni ta' nases extraċellulari newtrofili.[17] Minbarra dawn il-mekkaniżmi ta' difiża diretta, in-newtrofili jikkontribwixxu aktar għal risponsi immuni sussegwenti permezz tar-rilaxx ta' diversi ċitokini u kimokini.[18] Ukoll, in-newtrofili jistgħu jgħaddu minn proċess ta' priming li jippermettilhom li jirrispondu b'mod aktar qawwi għall-attivazzjoni sħiħa sussegwenti.[16b]

F'dawn l-aħħar snin, kibret l-evidenza li l-ingredjenti mill-ikel u/jew mill-pjanti mediċinali jistgħu jimmodifikaw waħda jew aktar mir-risponsi ta 'difiża msemmija tan-newtrofili umani. Dawn il-modifiki jinkludu żieda fl-attività fagoċitotika[19] u ġenerazzjoni ta' ROS,[20] kimotassi miżjuda lejn fMLF,[21] u formazzjoni ta' nases extraċellulari newtrofili.[20] Madankollu, il-kompost(i) attiv(i) ma ġewx identifikati. Kostitwenti minn Ferula akitschkensis (𝛽-pinene, sabinene, 𝛾-terpinene, geranylacetone, u isobornylacetate) iddesensibilizzaw in-newtrofili għal influss ta' Ca2+ ikkaġunat minn fMLF- u CXCL8 u inibixxew kimotassi indotta minn fMLF, fejn l-effett geranytone indott minn geranytone kien indott minn CXCL821.

Ibbażat fuq id-dejta disponibbli, ipotizzajna li l-attivazzjoni indotta minn ligand ta 'TRPV1 minn [6]-gingerol tista' taffettwa l-funzjonijiet ġenerali tan-newtrofili, jew direttament jew permezz tat-titjib tar-risponsi tagħhom għal stimuli attivanti. Fl-ambitu ta 'din l-ipoteżi, aħna immiraw b'mod partikolari biex niċċaraw, jekk konċentrazzjoni verifikata nutrizzjonalment rilevanti hijiex biżżejjed biex timmodula r-risponsi immuni ċellulari fin-newtrofili primarji umani bħala parti mill-popolazzjoni tal-lewkoċiti. '

Barra minn hekk, fittxejna li nqabblu l-livelli tal-espressjoni tal-RNA tal-membri kollha tas-superfamilja tat-TRP tal-mammiferi f'ħamsa mit-tipi ta 'ċelluli l-aktar prominenti fid-demm uman sabiex niksbu ħarsa ġenerali kwalitattiva u kwantitattivament komprensiva tal-espressjoni tal-kanal TRP fil-lewkoċiti umani.

2. Riżultati

2.1. Abbundanza u Livelli Relattivi ta' Traskrizzjoni ta' Kanali TRP f'Lewkoċiti Umani

Sabiex tiġi evalwata l-espressjoni tal-RNA tal-kanal TRP fil-lewkoċiti tad-demm, ħamsa mit-tipi ta 'ċelluli lewkoċiti l-aktar prominenti ġew iżolati mid-demm ta' donaturi b'saħħithom u l-espressjoni tal-RNA tal-kanali TRP ġiet analizzata permezz ta 'RT-PCR kwantitattiv (Figura 1).

Traskrizzjonijiet speċifiċi tat-TRPV kif ukoll tal-familja TRPM ġew skoperti bi frekwenzi għoljin ta '75-100% fit-tipi kollha ta' ċelluli analizzati. Il-frekwenza ġenerali medja meta wieħed iqis it-tipi kollha taċ-ċelluli kienet 96% għall-familja TRPV u 98% għall-familja TRPM. Traskrizzjonijiet speċifiċi għal TRPC kienu ħafna inqas abbundanti, li jvarjaw minn 0% f'monoċiti, ċelluli NK, ċelluli T u ċelluli B għal 100% f'ċelluli NK, u ċelluli T bi frekwenza medja ġenerali ta '53% biss (Figura 1A). It-traskrizzjoni speċifika għal TRPC5 ġiet skoperta biss fin-newtrofili, bi frekwenza ta' 70%.

Ukoll, it-traskrizzjoni speċifika għal TRPA1 ġeneralment żvelat abbundanza pjuttost baxxa fit-tipi ta 'ċelluli analizzati bi frekwenza ta' 100% fin-newtrofili, 25% f'monoċiti, 80% fiċ-ċelloli NK, 100% fiċ-ċelloli T, u 60% fiċ-ċelloli B. Bl-istess mod, it-traskrizzjoni speċifika għal TRPML3 wriet frekwenza baxxa fin-newtrofili (50%), monoċiti (25%), ċelluli NK (40%), u ċelluli B (20%), iżda frekwenza ta '100% fiċ-ċelluli T. It-traskrizzjoni speċifika għal TRPV1 ġiet skoperta fit-tipi kollha ta 'ċelluli, li turi frekwenza ta' 100% fil-monoċiti, ċelluli NK, u ċelluli T, u frekwenza ta '90% fin-newtrofili u 80% fiċ-ċelluli B.

Rigward l-espressjoni relattiva ta 'RNA, meta mqabbla mal-frekwenzi rispettivi, il-kanali TRP żvelaw mudell ta' espressjoni aktar speċifiku għat-tip taċ-ċellula, kif evidenti bi tqabbil tal-valuri Δct rispettivi fit-tipi differenti ta 'ċelluli analizzati (Figura 1B). Pereżempju, TRPP3 ġie skopert bi frekwenza ta '100% fit-tipi kollha ta' ċelluli, iżda żvela b'mod ċar l-ogħla livell ta 'espressjoni fil-monoċiti.

B'kuntrast, il-kanal TRPV2 ġie skopert fit-tipi kollha ta 'ċelluli investigati, b'livell ta' espressjoni ta 'RNA komparabbilment għoli kif ukoll frekwenza għolja. Bl-istess mod, il-livelli ta 'traskrizzjoni ta' TRPV1 kienu simili fit-tipi kollha ta 'ċelluli eżaminati (Figura 1B).

2.2. TRPV1 Espressjoni tal-wiċċ fuq Newtrofili

L-għarfien attwali dwar il-funzjoni ta 'TRPV1 fin-newtrofili tal-bniedem għadu mhux ċar. Biex tesplora aktar ir-rwoli ta 'TRPV1 fin-newtrofili umani, imbagħad investigajna jekk il-kanal TRPV1 huwiex espress fuq il-wiċċ ta' newtrofili umani primarji bl-użu taċ-ċitometrija tal-fluss taċ-ċelluli ħajjin (Figura 2).

In-newtrofili iżolati kienu mtebbgħin għal CD15 bħala markatur tal-wiċċ għan-newtrofili (Figura 2A, B) u fl-istess ħin jew imtebbgħin b'antikorp imqajjem kontra epitope fl-ewwel linja extraċellulari tal-proteina TRPV1 (Figura 2B) jew il-kontroll tal-isotip rispettiv, dan tal-aħħar iservi bħala surrogat għall-kejl tal-irbit mhux speċifiku (Figura 2A). Fi ħdan il-popolazzjoni CD15+, ġiet analizzata l-intensità tal-fluworexxenza għal FITC. It-tbajja tan-newtrofili bl-antikorp TRPV1 wasslet għal sinjal ta 'fluworexxenza li jingħaraf b'mod ċar meta mqabbel mal-kontroll tal-isotip, u b'hekk tikkonferma l-espressjoni tal-wiċċ ta' TRPV1 fin-newtrofili umani primarji (Figura 2C). L-analiżi ta 'newtrofili minn erba' donaturi individwali żvelat espressjoni tal-wiċċ komparabbli ta 'TRPV1 (Figura 2D).

2.3. [6]-Żieda Indotta fil-Ġingerol fil-Ca Intraċellulari2+

Peress li l-attivazzjoni ta' TRPV1 indotta minn ligand se tirriżulta f'influss ta' Ca2+, [23] konċentrazzjonijiet intraċellulari ta' Ca2+ ta' newtrofili ġew determinati permezz taż-żebgħa sensittiva għal Ca{2+-Fura-2. Ibbażat fuq is-sejbiet preċedenti tagħna,[9] intgħażlu konċentrazzjoni ta '50 nM tal-ligand TRPV1 magħruf [6]-gingerol u ħin ta' inkubazzjoni ta '2 sigħat. L-analiżi wrew li l-inkubazzjoni ta 'newtrofili b'50 nM [6]-gingerol irriżulta f'żieda fil-konċentrazzjonijiet intraċellulari ta' Ca2+ li kienu bħala medja 18.4% ± 1.0% tal-valur massimu, kif determinat bl-applikazzjoni ta '1 μM ta' ionophore ionomycin. Iż-żieda indotta minn DMSO kienet f'4.7% ± 1.2% (Figura 3).

2.4. Impatt ta' [6]-Gingerol fuq l-Espressjoni TRPV1

Sussegwentement, immirajna li nanalizzaw l-impatt tal-istimulazzjoni ta 'TRPV1 minn [6]-gingerol fuq l-espressjoni ta' TRPV1 fil-livell ta 'traskrizzjoni permezz ta' q-RTPCR kif ukoll fil-livell tal-proteina tal-wiċċ permezz ta 'tbajja' taċ-ċelluli ħajjin. Għal dan il-għan, in-newtrofili umani ġew inkubati b'50 nM [6]-gingerol għal 2 sigħat u l-livelli ta' espressjoni rispettivi kkwantifikati.

Din l-inkubazzjoni ta '2 sigħat la kellha impatt la traskrizzjoni TRPV1 u lanqas livelli ta' proteina (Figura 4), u lanqas ma nbidlit, ħlief għal IL6, IL17A, IL24, C5, u GDF5, l-espressjoni RNA ta 'ġeni komuni ta' ċitokini u chemokine investigata (Figura S1, Tabella S2, Informazzjoni ta 'Appoġġ).

2.5. Impatt ta '[6]-Gingerol fuq l-Espressjoni ta' Markers tal-wiċċ ta 'Newtrophil

1. Introduzzjoni

L-identifikazzjoni tal-ingredjenti tal-ikel bi proprjetajiet immunomodulatorji flimkien mal-miri molekulari rispettivi tagħhom ġibdet interess akbar f'dawn l-aħħar snin. Minħabba d-diversità għolja tal-ligand tagħhom, is-superfamilja potenzjali tar-riċettur temporanju tal-kanali tal-joni (kanali TRP) tirrappreżenta klassi interessanti ħafna ta 'strutturi ta' mira potenzjali.

Is-superfamilja tal-kanali TRP tal-mammiferi tinkludi sitt familji ta' proteini relatati, jiġifieri l-ankyrin (TRPA), il-kanoniku (TRPC), il-melastatin (TRPM), il-mucolipin (TRPML), il-polycystin (TRPP), u l-familja vanilloid (TRPV), li kollha tipikament jaqsmu sitt segmenti transmembrana li jinġabru bħala tetramers biex jiffurmaw porcations selettivi b'katonizzazzjoni varjabbli. Il-kanal TRPV1 jista 'jkun, bil-bosta, l-aktar membru investigat b'mod intensiv tas-superfamilja TRP. TRPV1 kien inizjalment identifikat bħala r-riċettur għall-kapsajċina, il-komponent pikkanti tal-bżar taċ-chili.[2] Aktar tard, ukoll l-ingredjenti punġenti mill-ġinġer, il-gingerols, intwerew li jattivaw TRPV1.[3]

Ir-rwol bijoloġiku ta 'TRPV1 f'tipi ta' ċelluli mhux newronali għadu taħt investigazzjoni estensiva, iżda r-riżultati disponibbli jimplikaw funzjonijiet ferm lil hinn mill-perċezzjoni sensorja u termali. Pereżempju, intervent ta '12-il ġimgħa b'doża ta' kuljum ta '0.15 mg tal-agonist TRPV1 nonivamide, analogu strutturali tal-kapsajċina, ipprevjeni żieda fil-massa tax-xaħam tal-ġisem ikkawżata mid-dieta, u żied il-livelli ta' serotonin fil-plażma f'suġġetti b'saħħithom b'piż żejjed.[4]

Fl-adipocytes 3T3-L1 l-attivazzjoni ta' TRPV1 permezz ta' nonivamide naqqset l-akkumulazzjoni tal-lipidi waqt id-divrenzjar u l-maturazzjoni billi trażżan l-espressjoni ta' PPAR𝛾.[5] Fil-makrofaġi, capsaicin u nonivamide attenwaw rilaxx indott minn LPS ta 'ċitokini pro-infjammatorji bħal IL6, CXCL8, u TNF-alfa, b'mod dipendenti fuq TRPV1.[6] Madankollu, il-funzjonijiet partikolari ta 'TRPV1 fil-lewkoċiti tad-demm tal-bniedem jibqgħu vagi. Fiċ-ċelloli NK tal-bniedem, 10 u 50 μM kapsajċina indoxxew żieda fil-konċentrazzjonijiet intraċellulari ta' Ca2+, li jindika kanal TRPV1 funzjonali.[7]

Madankollu, funzjonijiet effettur taċ-ċelluli NK imxarrba bħal degranulazzjoni ċitotossika u sekrezzjoni ta 'ċitokini, indotti minn trattament minn qabel taċ-ċelloli b'kapsajċina għal siegħa f'firxa ta' konċentrazzjoni ta '10-100 μM, kienu fil-biċċa l-kbira TRPV1 indipendenti.[7] Fiċ-ċelluli T, TRPV1 ġie dokumentat li huwa involut fil-proċessi ta 'sinjalazzjoni tar-riċettur taċ-ċelluli T, proliferazzjoni u differenzjazzjoni taċ-ċelluli T, kif ukoll produzzjoni ta' ċitokini.[8] Xogħol preċedenti mill-grupp tagħna wera wkoll espressjoni funzjonali ta 'TRPV1 fiċ-ċelloli T primarji umani.[9] Barra minn hekk, analiżi tar-rispons tad-doża f'konċentrazzjonijiet li jvarjaw minn 0.03 sa 300 μmol L-1 urew li [6]-gingerol jinibixxi t-tnixxija taċ-ċitokini minn lewkoċiti umani primarji b'valur IC50 ta '82.2 μmol L-1.

Madankollu, il-kwantifikazzjoni ta '[6]-gingerol f'kampjuni tal-plażma ta' suġġetti b'saħħithom żvelat konċentrazzjoni massima medja fil-plażma ta '42.0 ± 16.3 nmol L-1 biss wara t-teħid ta' 1 L ta 'tè tal-ġinġer. Peress li dawn il-konċentrazzjonijiet [6]- gingerol ma kellhom l-ebda impatt sinifikanti fuq is-sekrezzjoni taċ-ċitokini fi studji preċedenti,[9] mhuwiex ċar, jekk konċentrazzjoni rilevanti tad-dieta ta '50 nmol L-1, li tintlaħaq fil-plażma tad-demm wara l-konsum ta' 1 L ta 'tè tal-ġinġer, hijiex biżżejjed biex timmodula r-risponsi immuni ċellulari f'lewkoċiti primarji umani oħra.

Għan-newtrofili umani, l-għarfien dwar ir-rwol funzjonali ta 'TRPV1 huwa limitat. Filwaqt li Köse u Nazıroglu˘ [10] wrew flussi ta' Ca2+- fin-newtrofili b'reazzjoni għal 10 μM kapsajċina li jonqsu mill-antagonist ta' TRPV1 capsazepine, riżultati oħra ma wrewx li l-kapsajċina jinduċi influss ta' Ca{2+ meta ttestjat f'medda ta' konċentrazzjoni ta' 1-10 μM, minkejja TRPV10 μM, minkejja li l-kapsajċina tista' tinduna espressjoni.[11]

In-newtrofili huma l-aktar lewkoċiti abbundanti fid-demm uman, li jammontaw għal 60-70 % taċ-ċelluli bojod tad-demm kollha li jiċċirkolaw. Huma l-ewwel ċelluli immuni li jiġu reklutati fis-siti ta 'infezzjoni; għalhekk ħafna drabi jissejħu l-ewwel linja ta' difiża.[12] Ir-reklutaġġ tan-newtrofili jiġi attivat minn, fost oħrajn, il-peptide batterjali jew derivat mill-mitokondrija N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLF) jew kimokini bħal CXCL8 (IL-8).[13]

Mekkaniżmi ta' difiża tan-newtrofili jinkludu fagoċitosi,[14] rilaxx ta' enżimi anti-mikrobiċi permezz ta' degranulazzjoni,[15] ġenerazzjoni ta' speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS),[16] u l-formazzjoni ta' nases extraċellulari newtrofili.[17] Minbarra dawn il-mekkaniżmi ta' difiża diretta, in-newtrofili jikkontribwixxu aktar għal risponsi immuni sussegwenti permezz tar-rilaxx ta' diversi ċitokini u kimokini.[18] Ukoll, in-newtrofili jistgħu jgħaddu minn proċess ta' priming li jippermettilhom li jirrispondu b'mod aktar qawwi għall-attivazzjoni sħiħa sussegwenti.[16b]

F'dawn l-aħħar snin, kibret l-evidenza li l-ingredjenti mill-ikel u/jew mill-pjanti mediċinali jistgħu jimmodifikaw waħda jew aktar mir-risponsi ta 'difiża msemmija tan-newtrofili umani. Dawn il-modifiki jinkludu żieda fl-attività fagoċitotika[19] u ġenerazzjoni ta' ROS,[20] kimotassi miżjuda lejn fMLF,[21] u formazzjoni ta' nases extraċellulari newtrofili.[20] Madankollu, il-kompost(i) attiv(i) ma ġewx identifikati. Kostitwenti minn Ferula akitschkensis (𝛽-pinene, sabinene, 𝛾-terpinene, geranylacetone, u isobornylacetate) iddesensibilizzaw in-newtrofili għal influss ta' Ca2+ ikkaġunat minn fMLF- u CXCL8 u inibixxew kimotassi indotta minn fMLF, fejn l-effett geranytone indott minn geranytone kien indott minn CXCL821.

Ibbażat fuq id-dejta disponibbli, ipotizzajna li l-attivazzjoni indotta minn ligand ta 'TRPV1 minn [6]-gingerol tista' taffettwa l-funzjonijiet ġenerali tan-newtrofili, jew direttament jew permezz tat-titjib tar-risponsi tagħhom għal stimuli attivanti. Fl-ambitu ta 'din l-ipoteżi, aħna immiraw b'mod partikolari biex niċċaraw, jekk konċentrazzjoni verifikata nutrizzjonalment rilevanti hijiex biżżejjed biex timmodula r-risponsi immuni ċellulari fin-newtrofili primarji umani bħala parti mill-popolazzjoni tal-lewkoċiti. '

Barra minn hekk, fittxejna li nqabblu l-livelli tal-espressjoni tal-RNA tal-membri kollha tas-superfamilja tat-TRP tal-mammiferi f'ħamsa mit-tipi ta 'ċelluli l-aktar prominenti fid-demm uman sabiex niksbu ħarsa ġenerali kwalitattiva u kwantitattivament komprensiva tal-espressjoni tal-kanal TRP fil-lewkoċiti umani.

2. Riżultati

2.1. Abbundanza u Livelli Relattivi ta' Traskrizzjoni ta' Kanali TRP f'Lewkoċiti Umani

Sabiex tiġi evalwata l-espressjoni tal-RNA tal-kanal TRP fil-lewkoċiti tad-demm, ħamsa mit-tipi ta 'ċelluli lewkoċiti l-aktar prominenti ġew iżolati mid-demm ta' donaturi b'saħħithom u l-espressjoni tal-RNA tal-kanali TRP ġiet analizzata permezz ta 'RT-PCR kwantitattiv (Figura 1).

Traskrizzjonijiet speċifiċi tat-TRPV kif ukoll tal-familja TRPM ġew skoperti bi frekwenzi għoljin ta '75-100% fit-tipi kollha ta' ċelluli analizzati. Il-frekwenza ġenerali medja meta wieħed iqis it-tipi kollha taċ-ċelluli kienet 96% għall-familja TRPV u 98% għall-familja TRPM. Traskrizzjonijiet speċifiċi għal TRPC kienu ħafna inqas abbundanti, li jvarjaw minn 0% f'monoċiti, ċelluli NK, ċelluli T u ċelluli B għal 100% f'ċelluli NK, u ċelluli T bi frekwenza medja ġenerali ta '53% biss (Figura 1A). It-traskrizzjoni speċifika għal TRPC5 ġiet skoperta biss fin-newtrofili, bi frekwenza ta' 70%.

Ukoll, it-traskrizzjoni speċifika għal TRPA1 ġeneralment żvelat abbundanza pjuttost baxxa fit-tipi ta 'ċelluli analizzati bi frekwenza ta' 100% fin-newtrofili, 25% f'monoċiti, 80% fiċ-ċelloli NK, 100% fiċ-ċelloli T, u 60% fiċ-ċelloli B. Bl-istess mod, it-traskrizzjoni speċifika għal TRPML3 wriet frekwenza baxxa fin-newtrofili (50%), monoċiti (25%), ċelluli NK (40%), u ċelluli B (20%), iżda frekwenza ta '100% fiċ-ċelluli T. It-traskrizzjoni speċifika għal TRPV1 ġiet skoperta fit-tipi kollha ta 'ċelluli, li turi frekwenza ta' 100% fil-monoċiti, ċelluli NK, u ċelluli T, u frekwenza ta '90% fin-newtrofili u 80% fiċ-ċelluli B.

Rigward l-espressjoni relattiva ta 'RNA, meta mqabbla mal-frekwenzi rispettivi, il-kanali TRP żvelaw mudell ta' espressjoni aktar speċifiku għat-tip taċ-ċellula, kif evidenti bi tqabbil tal-valuri Δct rispettivi fit-tipi differenti ta 'ċelluli analizzati (Figura 1B). Pereżempju, TRPP3 ġie skopert bi frekwenza ta '100% fit-tipi kollha ta' ċelluli, iżda żvela b'mod ċar l-ogħla livell ta 'espressjoni fil-monoċiti.

B'kuntrast, il-kanal TRPV2 ġie skopert fit-tipi kollha ta 'ċelluli investigati, b'livell ta' espressjoni ta 'RNA komparabbilment għoli kif ukoll frekwenza għolja. Bl-istess mod, il-livelli ta 'traskrizzjoni ta' TRPV1 kienu simili fit-tipi kollha ta 'ċelluli eżaminati (Figura 1B).

2.2. TRPV1 Espressjoni tal-wiċċ fuq Newtrofili

L-għarfien attwali dwar il-funzjoni ta 'TRPV1 fin-newtrofili tal-bniedem għadu mhux ċar. Biex tesplora aktar ir-rwoli ta 'TRPV1 fin-newtrofili umani, imbagħad investigajna jekk il-kanal TRPV1 huwiex espress fuq il-wiċċ ta' newtrofili umani primarji bl-użu taċ-ċitometrija tal-fluss taċ-ċelluli ħajjin (Figura 2).

In-newtrofili iżolati kienu mtebbgħin għal CD15 bħala markatur tal-wiċċ għan-newtrofili (Figura 2A, B) u fl-istess ħin jew imtebbgħin b'antikorp imqajjem kontra epitope fl-ewwel linja extraċellulari tal-proteina TRPV1 (Figura 2B) jew il-kontroll tal-isotip rispettiv, dan tal-aħħar iservi bħala surrogat għall-kejl tal-irbit mhux speċifiku (Figura 2A). Fi ħdan il-popolazzjoni CD15+, ġiet analizzata l-intensità tal-fluworexxenza għal FITC. It-tbajja tan-newtrofili bl-antikorp TRPV1 wasslet għal sinjal ta 'fluworexxenza li jingħaraf b'mod ċar meta mqabbel mal-kontroll tal-isotip, u b'hekk tikkonferma l-espressjoni tal-wiċċ ta' TRPV1 fin-newtrofili umani primarji (Figura 2C). L-analiżi ta 'newtrofili minn erba' donaturi individwali żvelat espressjoni tal-wiċċ komparabbli ta 'TRPV1 (Figura 2D).

2.3. [6]-Żieda Indotta fil-Ġingerol fil-Ca Intraċellulari2+

Peress li l-attivazzjoni ta' TRPV1 indotta minn ligand se tirriżulta f'influss ta' Ca2+, [23] konċentrazzjonijiet intraċellulari ta' Ca2+ ta' newtrofili ġew determinati permezz taż-żebgħa sensittiva għal Ca{2+-Fura-2. Ibbażat fuq is-sejbiet preċedenti tagħna,[9] intgħażlu konċentrazzjoni ta '50 nM tal-ligand TRPV1 magħruf [6]-gingerol u ħin ta' inkubazzjoni ta '2 sigħat. L-analiżi wrew li l-inkubazzjoni ta 'newtrofili b'50 nM [6]-gingerol irriżulta f'żieda fil-konċentrazzjonijiet intraċellulari ta' Ca2+ li kienu bħala medja 18.4% ± 1.0% tal-valur massimu, kif determinat bl-applikazzjoni ta '1 μM ta' ionophore ionomycin. Iż-żieda indotta minn DMSO kienet f'4.7% ± 1.2% (Figura 3).

2.4. Impatt ta' [6]-Gingerol fuq l-Espressjoni TRPV1

Sussegwentement, immirajna li nanalizzaw l-impatt tal-istimulazzjoni ta 'TRPV1 minn [6]-gingerol fuq l-espressjoni ta' TRPV1 fil-livell ta 'traskrizzjoni permezz ta' q-RTPCR kif ukoll fil-livell tal-proteina tal-wiċċ permezz ta 'tbajja' taċ-ċelluli ħajjin. Għal dan il-għan, in-newtrofili umani ġew inkubati b'50 nM [6]-gingerol għal 2 sigħat u l-livelli ta' espressjoni rispettivi kkwantifikati.

Din l-inkubazzjoni ta '2 sigħat la kellha impatt la traskrizzjoni TRPV1 u lanqas livelli ta' proteina (Figura 4), u lanqas ma nbidlit, ħlief għal IL6, IL17A, IL24, C5, u GDF5, l-espressjoni RNA ta 'ġeni komuni ta' ċitokini u chemokine investigata (Figura S1, Tabella S2, Informazzjoni ta 'Appoġġ).

2.5. Impatt ta '[6]-Gingerol fuq l-Espressjoni ta' Markers tal-wiċċ ta 'Newtrophil

Aqta' l-Pilloli Jinkui Shenqi f'biċċiet, iżen b'mod preċiż bejn wieħed u ieħor 2.0 g tal-kampjun u ttrasferih f'kunjett koniku b'tapp. Żid 25 mL ta '70% metanol, iżen il-massa totali, u wettaq estrazzjoni ultrasonika (300 W, 40 kHz) għal 35 minuta. Wara li tkessaħ għat-temperatura tal-kamra, imla l-piż mitluf b'70% metanol u ħawwad sew. Iffiltra s-soluzzjoni minn membrana mikroporuża ta’ 0.45 μm biex tikseb is-soluzzjoni tat-test.

 

Sar skannjar ta 'wavelength sħiħ (190-400 nm) biex jintgħażel il-wavelength ta' skoperta. Għalkemm morroniside u loganin għandhom assorbiment massimu f'230-240 nm, dan il-wavelength ibati minn storbju għoli ta 'linja bażi. Il-wavelength ta '254 nm jiżgura rispons stabbli u interferenza baxxa fl-isfond. Paeonol, aċidu ċinnamiku, acteoside u 7-hydroxycoumarin kollha jipproduċu assorbiment ultravjola stabbli f'254 nm. Għalhekk, 254 nm intgħażlet bħala l-wavelength ta 'skoperta unifikata għal analiżi sinkronika b'ħafna komponenti.

 

Fost il-materja prima veġetali naturali kollha,Cistanche tubulosa (Cistanche ħaj fid-deżert)jispikka bħala l-ħaxix mal-l-ogħla kontenut ta’ acteosideglobalment. Bħala glycoside phenylethanoid qalba, acteoside huwa magħruf għall-anti-infjammazzjoni, antiossidant, newroprotezzjoni u regolazzjoni immuni. Il-fabbrika tagħna tispeċjalizza f'estratt ta 'Cistanche tubulosa ta' purità għolja, li fih livelli ferm ogħla ta 'acteoside u ingredjenti attivi oħra minn materjali veġetali komuni, li jagħmilha materja prima ideali għall-iżvilupp ta' supplimenti tad-dieta premium, ikel funzjonali, xorb erbali u prodotti għall-kura tal-ġilda għas-swieq Ewropej u Amerikani.

 

 

Acteoside, il-komponent tal-firma tal-estratt tagħna ta 'Cistanche tubulosa, jagħti benefiċċji ewlenin multipli li jaqblu mad-domandi tas-saħħa tal-konsumaturi Ewropej u Amerikani: anti-infjammazzjoni, titjib immuni, kontra l-ipoksja, tneħħija ta' radikali ħielsa, tiswija tad-DNA u protezzjoni tal-fwied. Magħquda ma 'echinacoside (antiossidant, newroprotezzjoni, protezzjoni kardjovaskulari) u polisakkaridi (regolamentazzjoni immuni), l-estratt tagħna jintegra l-effikaċijiet mainstream kollha ta' ingredjenti veġetali premium imsemmija hawn fuq, inklużianti-infjammatorji, antibatteriċi, antiossidanti, regolazzjoni immuni u protezzjoni kardjovaskulari.