Klonazzjoni tal-Ġene, Identifikazzjoni Funzjonali, Analiżi Strutturali U Espressjoni tas-Sukrożju Synthase Minn Cistanche Tubulosa Ⅱ

Riżultati u analiżi

1 Minjieri u klonazzjoni ta 'ġeni ta' sucrose synthase f'Cistanche tubulosa

The amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 was used as a template[16], and sequence alignment was performed in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data, which were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>parti mill-ajru.

Għalhekk, il-valuri FPKM tal-livell ta 'espressjoni taż-żewġ ġeni ta' sucrose synthase kandidati miksuba fl-iskrining inizjali fid-dejta tat-traskriptome ta 'partijiet differenti ta' Cistanche tubulosa ġew normalizzati minn Z-Score u saret analiżi differenzjali (Figura 1A). Ir-riżultati wrew li l-ġene CtSus kellu l-ogħla livell ta 'espressjoni fil-haustorium, u l-livell ta' espressjoni fil-parti taħt l-art kien ogħla minn dak fil-parti ta 'l-ajru, li kien konsistenti mal-mudell ta' akkumulazzjoni ta 'komposti ta' glycoside f'partijiet differenti ta 'Cistanche tubulosa, filwaqt li l-livell ta' espressjoni tal-ġene CtSus1 fil-haustorium kien baxx. Għalhekk, abbażi tar-riżultati ta 'hawn fuq, il-ġene CtSus intgħażlet għal amplifikazzjoni ta' sekwenza sussegwenti, espressjoni eżoġena u identifikazzjoni funzjonali. Bl-użu ta 'cDNA ta' Cistanche tubulosa bħala mudell, inkiseb prodott ta 'faxxa waħda f'~2500 bp wara l-amplifikazzjoni tal-PCR (Figura 1B). Il-prodott PCR ġie rkuprat mill-ġel u ligated mal-vettur tal-klonazzjoni, u r-reġjun ta 'kodifikazzjoni ta' tul sħiħ tal-ġene fil-mira nkiseb permezz ta 'sekwenzjar. It-tul tas-sekwenza CtSus kien 2418 bp.

Figura 1 Esplorazzjoni tal-ġeni u klonazzjoni ta 'CtSus minn C. tubulosa u analiżi bijoinformatika tal-proteina kodifikata tagħha. A: Livelli ta 'espressjoni tal-ġeni CtSus u CtSus1 f'partijiet differenti ta' C. tubulosanormalizzati bħala Z-Scores ibbażati fuq il-valuri FPKM tagħhom; B: Amplifikazzjoni tal-ġeni ta 'CtSus; M: markatur tad-DNA;C: Dominju konservattiv tal-proteina CtSus imbassar minn SMART; D: Allinjament ta' sekwenza multipla ta' CtSus u sucrose synthases identifikati minn pjanti oħra inklużi Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum u Albuca bracteata. Id-dominju tas-sinteżi tas-sukrożju u d-dominju tat-trasferiment taz-zokkor huma rappreżentati minn kaxxi ħomor u blu, rispettivament; E: Analiżi filoġenetika ta 'CtSus u sucrosesynthases minn pjanti oħra; F: Analiżi SDS-PAGE tal-espressjoni eterologa ta' CtSus bl-użu ta' pCold™ I vector f'E. coli. Korsija 1: Marker tal-proteini; Korsija 2: Frazzjoni tas-supernatant; Korsija 3: Precipitatefraction. Il-vleġġa ħamra turi l-proteina CtSus. G: Kolonja PCR ta' klonu wieħed li fih iż-żewġ plasmidi rikombinanti. M: markatur tad-DNA; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

HETIAN DICHEN CISTANCHE JIKKULTIVA L-BAESES KOOPERA MAL-UNIVERSITÀ TA’ PEKING

Servizz ta 'Appoġġ Ta' Wecistanche-L-akbar esportatur ta' cistanche fiċ-Ċina:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

IKKLIKKJA GĦAL AKTAR DETTALJI

2 Analiżi bijoinformatika tal-ġene CtSus u l-proteina kodifikata tagħha

2.1 Analiżi tal-proprjetajiet fiżikokimiċi tas-CtSus u tbassir tal-istruttura tad-dominju transmembrana

Il-proprjetajiet fiżikokimiċi tal-proteina kodifikata CtSus ġew analizzati bl-użu tas-softwer onlajn ProtParam. Il-proteina fiha 805 aċidi amminiċi, b'formula molekulari ta' C4189H6548N1104O1187S28 u massa molekulari relattiva ta' 92266.44; il-punt isoelettriku teoretiku huwa 6.00; il-koeffiċjent ta 'instabilità II huwa 35.45, li hija proteina stabbli; l-idrofiliċità medja ġenerali (GRAVY) hija -0.187, li hija proteina idrofilika. MHMM 2.0 intuża biex ibassar id-dominju transmembrane ta 'sucrose synthase CtSus, u r-riżultati wrew li l-proteina kodifikata minn dan il-ġene m'għandha l-ebda dominju transmembrane.

HETIAN DICHEN CISTANCHE JIKKULTIVA L-BAESES KOOPERA MAL-UNIVERSITÀ TA’ PEKING

2.2 Tbassir ta 'struttura konservattiva CtSus u allinjament tas-sekwenza

Is-softwer onlajn SMART intuża biex ibassar id-dominji konservattivi tal-proteina CtSus (Figura 1C). Il-proteina fiha żewġ oqsma konservattivi. L-N-terminus (aċidi amminiċi 8 sa 553) huwa d-dominju tas-sukrożju synthase, li jista 'jikkatalizza r-reazzjoni riversibbli ta' UDP u sukrożju biex jiġġenera UDP-glukożju u D-fruttożju; il-terminal C (aċidi amminiċi 557 sa 739) jappartjeni għad-dominju glycosyltransferase (Figura 1D). Is-softwer DNAMAN intuża biex jallinja s-sekwenza tal-proteina CtSus mas-sekwenza tal-aċidu amminiku sucrose synthase fid-database NCBI (Tabella 2). Ir-riżultati wrew li s-sekwenza ta 'aċidu amminiku CtSus wriet xebh għoli mas-sekwenzi ta' sucrose synthase minn pjanti oħra. L-ogħla xebh bejn CtSus u s-sekwenza ta’ sucrose synthase minn ġulġlien (Sesamum indicum) kien 94.78%, u x-xebh mas-sekwenzi ta’ sucrose synthase minn pjanti oħra kien ukoll ogħla minn 65%, li jindika li s-sukrożju synthase minn pjanti għandu grad għoli ta’ sekwenza konservazzjoni.

Tabella 2 xebh ta' sekwenza ta' aċidi amminiċi bejn CtSus u sucrose synthases identifikati minn pjanta oħra

2.3 Analiżi filoġenetika

Is-siġra filoġenetika mibnija mis-softwer MEGA intużat biex tanalizza r-relazzjoni filoġenetika bejn is-sukrożju synthase CtSus minn Cistanche tubulosa u sucrose synthase minn pjanti oħra. Ir-riżultati huma murija fil-Figura 1E. Sucrose synthases minn pjanti juru friegħi evoluzzjonarji distinti fid-dikots (reġjuni I u II) u monokottiċi (reġjun III). CtSus huwa fil-fergħa dicot, u s-sekwenzi li huma relatati mill-qrib ma 'CtSus huma kollha minn pjanti Lamiaceae (Cistanche tubulosa hija pjanta Lamiaceae Orobanchaceae), filwaqt li l-fergħa l-oħra hija magħmula prinċipalment minn pjanti Solanales, li tindika aktar il-konservazzjoni u l-omoloġija għolja. ta 'ġeni sucrose synthase derivati ​​mill-pjanti fl-evoluzzjoni tal-pjanti fl-istess ordni. Fosthom, is-sukrożju synthase PrSus (AEN79500.1) minn Phelipanche ramosa tal-pjanta Orobanchaceae hija l-eqreb għal CtSus.

3 Espressjoni eżoġena u analiżi tal-attività tas-CtSus

3.1 Espressjoni eżoġena tal-ġene CtSus

Il-plażmidi pET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus u pCold™ I-CtSus verifikati permezz tas-sekwenzjar ġew trasferiti fl-espressjoni kompetenti E. coli Transetta (DE3), u l-kloni pożittivi ġew skrinjati permezz tal-kolonja PCR għall-verifika tas-sekwenzjar. Ir-razez ta 'espressjoni rikombinanti miksuba ġew indotti minn temperatura baxxa IPTG għall-espressjoni tal-proteini, u l-batterji nġabru permezz ta' ċentrifugazzjoni. Il-liżi buffer ġiet miżjuda biex tkisser il-batterja biex tikseb is-supernatant u l-preċipitat, u SDS-PAGE saret għall-iskoperta. Ir-riżultati wrew li meta pET-28a u pET{-24b intużaw bħala vettori tal-espressjoni, CtSus ma kienx espress f'E. coli, filwaqt li meta pCold™ I intuża bħala l-vettur tal-espressjoni, CtSus ċar. medda ta 'proteina rikombinanti ġiet skoperta fir-reġjun ~ 100 kDa, li kien konsistenti mal-massa molekulari relattiva teoretikament mbassra tagħha ta' 92.2 kDa (Figura 1F).

HETIAN DICHEN CISTANCHE JIKKULTIVA L-BAESES KOOPERA MAL-UNIVERSITÀ TA’ PEKING

3.2 Trasformazzjoni taċ-ċellula sħiħa

Sabiex tiġi vverifikata b'mod preliminari l-funzjoni katalitika ta 'CtSus, inbniet razza ta' ko-espressjoni ta 'CtSus u l-ġene glycosyltransferase UGT71BD1. UGT71BD1 ġie kklonat u identifikat minn Cistanche tubulosa u huwa UDP-glucosyltransferase li jista 'jaċċetta b'mod wiesa' komposti aromatiċi bħal phenylethanoid glycosides, tipi differenti ta' flavonoids, stilbene u coumarin bħala riċetturi u jikkatalizza r-reazzjoni ta 'glucosylation tas-sottostrat phenolic hydroxyl grupp bl-użu ta' UDP hydroxyl. bħala d-donatur taz-zokkor[18]. L-introduzzjoni ta 'CtSus tista' teoretikament tipprovdi aktar biżżejjed donatur ta 'glycosyl UDP-glucose għar-reazzjoni ta' glucosylation katalizzata minn UGT71BD1, u b'hekk tippromwovi l-ekwilibriju tar-reazzjoni biex timxi lejn il-formazzjoni ta 'prodotti ta' glycosylation, u b'hekk tiżdied ir-rendiment ta 'prodotti ta' glycosylation. Il-plażmid pCold™ I-CtSus u l-plażmid tal-pET-28a-UGT71BD1 ġew trasformati fl-istess ħin fl-espressjoni kompetenti E. coli Transetta (DE3). Kloni waħdieni li fihom iż-żewġ plasmidi rikombinanti ġew skrinjati minn PCR tal-kolonja, u razez ta 'espressjoni rikombinanti pożittivi nkisbu permezz ta' verifika tas-sekwenzjar (Figura 1G). Il-ko-espressjoni tal-ġene doppja ġiet indotta in vitro, u r-razza tal-espressjoni tal-ġene waħda pET-28aUGT71BD1 intużat bħala l-grupp ta' kontroll. L-attività ta 'CtSus fil-katalizzar tal-ġenerazzjoni ta' donatur tal-UDP-glukożju ġiet verifikata b'mod preliminari permezz ta 'trasformazzjoni taċ-ċellula sħiħa. Ir-riżultati ta 'HPLC u spettrometrija tal-massa b'riżoluzzjoni għolja wrew li meta twettqet reazzjoni ta' trasformazzjoni taċ-ċellula sħiħa b'aesculetin 1 u resveratrol 2 bħala sottostrati, il-ġenerazzjoni ta 'prodotti ovvji ta' glycosylation ġiet skoperta wara 24 siegħa ta 'trasformazzjoni, kif muri fil-Figura 2.

Figura 2 Bijotrasformazzjoni taċ-ċelluli kollha tas-sottostrat 1 jew 2 minn razza rikombinanti li fiha UGT71BD1 jew razza rikombinanti li fiha UGT71BD1 akkoppjar ma' CtSus, rispettivament. A: HPLCchromatograms tal-bijotrasformazzjoni taċ-ċellula sħiħa tas-sottostrat 1. Il-wavelength ta 'skoperta kien 360nm; B: HRESI-MS u MS2spectra tal-prodott 1a; C: kromatogrammi HPLC tal-bijotrasformazzjoni taċ-ċelluli kollha tas-sottostrat 2; Il-wavelength ta 'skoperta kien 330 nm. D: Spettri HRESI-MS tal-prodotti 2a u 2b

Meta 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+, formula molekulari C9H6O4) intuża bħala sottostrat, il-quċċata kromatografika tal-prodott 1a (m/z 41.087 2 [M+H] +, formula molekulari mbassra C15H16O9) ġiet skoperta f'5.39 min, li kienet konsistenti mal-assorbiment UV tas-sottostrat u l-prodott ta 'kontroll. Fl-istess ħin, il-quċċata tal-framment ta' m/z 179.033 4 [M+H]+ ġiet skoperta fl-ispettru MS2 ta' 1a, li ġie prodott billi 1a tilef molekula ta' glukożju (162 Da), li jindika li 1a kien il-prodott tas-sottostrat 1 konness ma' molekula ta' glukożju. Ir-rata ta' konverżjoni ġiet ikkalkulata bl-integrazzjoni taż-żona tal-quċċata. Instab li r-rata ta 'konverżjoni ta' ċelloli sħaħ UGT71BD1 li jikkatalizzaw is-sottostrat 1 biex jiġġeneraw il-prodott glycosylated 1a kienet 71.87%, filwaqt li ż-żieda ta 'CtSus żiedet ir-rata ta' konverżjoni tar-reazzjoni għal 95.84%, li kienet 1.3 darbiet dik tal-grupp ta 'kontroll. Meta s-sottostrat kien kompost 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, formula molekulari C14H12O3), il-qċaċet kromatografiku tal-prodott 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, molekulari mbassar). formula C20H22O8) u 2b (m/z 575. 175 9 [M+Na]+, formula molekulari mbassra 26H32O13) ġew skoperti f'10.32 u 6.52 min, rispettivament, li kienu konsistenti mal-assorbiment UV karatteristiku tas-sottostrat u il-prodott ta' kontroll. Ġiet skoperta quċċata ta 'framment f'227.071 3 [MH]-, li kienet prodotta mit-telf ta' molekula waħda tal-glukożju (162 Da), li jindika li 2a kien il-prodott tas-sottostrat 2 konness ma 'molekula waħda tal-glukożju. Billi tqabbel mad-dejta fil-letteratura [18] u l-informazzjoni dwar it-tbassir tal-ispettrometrija tal-massa, ġie determinat li l-prodott 2b kien il-prodott tas-sottostrat 2 konness ma 'żewġ molekuli tal-glukożju. Ir-rata ta' konverżjoni ġiet ikkalkulata bl-użu taż-żona peak integrata. Instab li ż-żieda ta 'CtSus tista' żżid ir-rata ta 'konverżjoni tar-reazzjoni ta' glycosylation tas-sottostrat 2 minn 64.01% għal 78.51%, li fosthom ir-rendiment tal-prodott monosaccharide 2a żdied minn 45.09% għal 63.58%, u r-rendiment tal-prodott disaccharide 2b inbidel minn 18.92% għal 14.93%.

3

HETIAN DICHEN CISTANCHE JIKKULTIVA L-BAESES KOOPERA MAL-UNIVERSITÀ TA’ PEKING

3.3 CtSus

Purifikazzjoni ta 'proteini rikombinanti u identifikazzjoni ta' attività katalitika ta 'enzima in vitro Ir-riżultati ta' l-esperiment ta 'konverżjoni taċ-ċelluli kollha ssuġġerew li CtSus għandu l-attività li jikkatalizza l-produzzjoni ta' donatur attiv ta 'glucose UDP-glucose. Sabiex tiġi vverifikata aktar l-attività katalitika permezz ta 'katalisi enżimatika in vitro, il-proteina tal-fużjoni tal-ġene CtSus fis-sistema ta' espressjoni pCold™ ġiet isseparata u purifikata permezz ta 'kromatografija ta' affinità. Ir-riżultati wrew li meta pCold™ I intuża bħala l-vettur tal-espressjoni, il-proteina rikombinanti ġiet espressa fi kwantitajiet kbar, iżda l-aktar fil-preċipitat. Meta pCold™ TF intuża bħala l-vettur tal-espressjoni, il-ġene CtSus ġie espress fi kwantitajiet kbar f'E. coli (Figura 3A). Il-proteina tal-fużjoni ġiet ippurifikata bil-kromatografija ta' affinità HisTrap FF għal reazzjoni enżimatika in vitro. Ir-riżultati huma murija fil-Figura 3B. Meta s-sukrożju u l-UDP intużaw bħala sottostrati, meta mqabbla mal-grupp ta 'kontroll negattiv, instab quċċata ta' prodott ġdid f'10.32 min. Il-ħin ta 'żamma tiegħu u l-assorbiment UV kienu konsistenti ma' UDP-glucose. Il-prodott ġie ppruvat li huwa UDP-glukożju meta mqabbel mal-istandard. Madankollu, peress li l-proteina tal-fużjoni espressa mill-vettur tal-espressjoni pCold™ TF fiha tikketta li tinħall ta 'fattur ta' trigger kbir (id-daqs tal-proteina tat-tikketta huwa 48 kDa), se jkollha impatt kbir fuq l-attività katalitika tal-proteina. Għalhekk, it-tikketta tal-proteina tal-fużjoni ġiet maqtugħa aktar mill-enzima Fattur Xa, u l-proteina CtSus mingħajr tikketti eżoġeni ġiet ippurifikata (Figura 3A). Il-proteina kienet soġġetta għal katalisi enżimatika in vitro, u r-riżultati wrew li r-rendiment ta 'UDP-glucose żdied minn 3.53% għal 10.66% (Figura 3B). Ir-riżultati ta 'hawn fuq ikkonfermaw l-attività ta' CtSus fil-katalizzar tal-produzzjoni ta 'UDP-glucose permezz ta' katalisi enżimatika in vitro, u wrew ukoll li l-preżenza ta 'tikketta ta' affinità kbira twassal għall-espressjoni solubbli ta 'CtSus, iżda se taffettwa wkoll b'mod sinifikanti l-in attività katalitika vitro tal-enzima.

Figura 3 Espressjoni eterologa u identifikazzjoni funzjonali ta 'CtSus. A: Analiżi SDS-PAGE tal-proteini CtSus. Korsija 1: Marker tal-proteini; Korsija 2: CtSus rikombinanti b'fattur ta' attivazzjoni; Korsija 3: Trigger13factor qsim tat-tikketta bl-użu ta' Factor Xa protease biex tagħti l-proteina CtSus ittikkettata bil-vleġġa ħamra. B: Assays enżimatiċi invitro li jużaw proteini tal-fużjoni u proteini CtSus mingħajr fattur li jqanqlu biex jikkatalizzaw is-sintesi ta 'UDP-glucose fil-preżenza ta' sukrożju u UDP, rispettivament, b'referenza standardUDP-glucose. Proteina mgħollija ntużat bħala grupp ta 'kontroll taħt l-istess kundizzjonijiet. It-tul ta 'mewġ ta' skoperta kien 260 nm