Cistanche Deserticola Polysaccharides Itejbu Tixjiħ intestinali Billi jinibixxu l-Attivazzjoni tal-Inflammasome NLRP3

 

 

It-tixjiħ iwassal għat-tnaqqis gradwali ta 'funzjonijiet fiżjoloġiċi multipli u jżid ir-riskju ta' mard relatat mal-età [1]. Studji wrew li t-tixjiħ għandu impatt sinifikanti fuq l-istruttura u l-funzjoni intestinali [2]. Bħala l-organu ewlieni għad-diġestjoni, il-metaboliżmu u d-difiża immuni, it-tixjiħ tal-imsaren jista 'jikkawża assorbiment ħażin ta' nutrijenti, disturbi metaboliċi, u funzjoni immuni indebolita [3-4], u b'hekk tiżdied is-suxxettibilità għal mard gastrointestinali [5]. L-infjammazzjoni kronika hija karatteristika tat-tixjiħ intestinali, iżda l-mekkaniżmi molekulari tagħha għadhom mhumiex ċari għal kollox. Bħalissa, l-aġenti kontra t-tixjiħ jinkludu prinċipalment beta-nicotinamide mononucleotide (NMN), rapamycin, dasatinib flimkien ma 'quercetin, u oħrajn [3]. Fost dawn, NMN huwa prekursur ewlieni tal-koenzima essenzjali NAD +, u studji multipli kkonfermaw li jdewwem b'mod sinifikanti t-tixjiħ intestinali fil-ġrieden b'età naturali; huwa rikonoxxut ħafna fil-qasam bħala intervent effettiv [4-5]. Għalhekk, l-esplorazzjoni ta 'mekkaniżmi rilevanti u strateġiji ta' intervent hija ta 'sinifikat kbir.

Likur Orali Cistanche Għall-Mard Relatat mat-Tixjiħ

Ikkuntattja issa ssir taf lill-bdiewa cistanche fiċ-Ċina

Servizz ta 'Appoġġ Ta' Wecistanche-L-akbar esportatur ta' cistanche fiċ-Ċina:
Email:wallence.suen@wecistanche.com

 

 

 

 

L-infjammasoma 3 (NLRP3) li fih id-dominju tal-pyrin tal-familja tar-riċettur bħal dominju tal-oligomerizzazzjoni li torbot in-nukleotidi huwa regolatur ewlieni tal-immunità intrinsika u għandu rwol importanti f'mard relatat mat-tixjiħ. L-attivazzjoni tagħha teħtieġ żewġ sinjali. L-ewwel sinjal: mudelli molekulari assoċjati mal-patoġenu (PAMPs) u mudelli molekulari assoċjati mal-ħsara (DAMPs) jinduċu l-espressjoni ta 'NLRP3 u l-prekursur ta' interleukin-1 (pro-IL-1). It-tieni sinjal (bħal efflux tal-potassju u ħsara mitokondrijali) iqanqal assemblaġġ inflammasome, jattiva caspase-1, u jaqsam pro-IL-1 u pro-IL-18 biex jiġġenera IL-1 u IL-18 maturi, u b'hekk iwassal l-infjammazzjoni [6]. Matul ix-xjuħija, l-omeostażi intestinali hija mfixkla, li twassal għar-rilaxx ta 'fatturi pro-infjammatorji bħal lipopolysaccharide (LPS), li jattiva b'mod persistenti l-inflammasome NLRP3, li jifforma infjammazzjoni kronika ta' grad baxx. Dan ikompli jaggrava l-ħsara fil-barriera intestinali u d-disbijożi, ibiddel l-espressjoni ta 'proteini ta' junction stretta, iżid il-permeabilità intestinali, u jaċċellera t-tixjiħ intestinali [7-10].

Cistanche deserticola, ħxejjex aromatiċi mediċinali tradizzjonali Ċiniża u omologa għall-ikel magħrufa bħala l-"ġinseng tad-deżert," tonifies yang tal-kliewi, ssostni l-essenza u d-demm, u xarrab l-imsaren biex ittaffi l-istitikezza. Il-polisakkaridi attivi tiegħu juru proprjetajiet anti-aging, antiossidanti u protettivi għall-imsaren [11-12]. F'termini ta 'protezzjoni intestinali, Cistanche deserticola polysaccharides (CDPs) jistgħu jimmodulaw il-bilanċ tal-mikrobijota tal-musrana billi jinibixxu l-attivazzjoni tar-riċettur Toll-like 4 (TLR4) / fattur nukleari-kappa B (NF-κB), u b'hekk inaqqsu l-livelli ta' LPS u jsewwu l-funzjoni tal-barriera intestinali [13-14]. Is-CDPs jistgħu wkoll itejbu l-funzjoni mitokondrijali permezz tal-attivazzjoni tal-mogħdija tal-proteina kinase attivata bl-AMP (AMPK)/sirtuin 1 (SIRT1), idewmu s-senescence ċellulari, jirregolaw il-metaboliżmu tal-lipidi, u jtaffu l-ħsara lipotossika fiċ-ċelloli epiteljali intestinali [15].

Għalkemm intwerew l-effetti protettivi intestinali tas-CDPs, għadu mhux ċar jekk itejbux it-tixjiħ intestinali billi jrażżnu l-passaġġ inflammasome NLRP3. Dan l-istudju għandu l-għan li jinvestiga l-mekkaniżmu li bih is-CDPs jinibixxu l-attivazzjoni tal-inflammasome NLRP3ittejjeb it-tixjiħ intestinali.

Materjali

 

1.1 Annimali esperimentali

Ħamsin ġrieden maskili C57BL/6J b'saħħithom (10 fl-età ta '2 xhur; 40 f'età ta' 20 xahar) inxtraw minn Beijing Speifu Biotechnology Co., Ltd Liċenzja tal-produzzjoni: SYXK (Beijing) 2023-0011. L-annimali kienu miżmuma f'ambjent ta 'barriera fil-Faċilità Sperimentali tal-Annimali tal-Isptar Provinċjali ta' Hebei tal-Mediċina Tradizzjonali Ċiniża taħt il-kundizzjonijiet li ġejjin: temperatura 22 ± 2 gradi, umdità relattiva 50% ± 10%, u ċiklu ta 'dawl ta' 12-il siegħa/12-il siegħa skur. Il-ġrieden kollha ġew akklimatizzati għal ġimgħa. Dan l-istudju ġie approvat mill-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Isptar Provinċjali ta 'Hebei tal-Mediċina Tradizzjonali Ċiniża (IACUC-HPHCM-2025001).

 

1.2 Strumenti u reaġenti

 

Krijostat (Thermo Fisher; CryoStar NX50)

Mikroskopju konfokali tal-iskannjar bil-lejżer (Nikon; AX)

Sistema PCR f'ħin reali (Thermo Fisher; 7500)

Reader tal-pjanċa multimode (Tecan; Spark)

Beta-nicotinamide mononucleotide (Bontac, iċ-Ċina; Cat. BT05N120A005)

Kit tat-tbajja' ta' SA- -gal (Solarbio, Beijing; Cat. 250003003)

Mouse LPS ELISA kit (CUSABIO/Huamei, Wuhan; Cat. CSB-E13066m)

Kit RNA TransZol Up Plus (TransGen Biotech, Beijing; Cat. ER501-01-V2)

Taħlita tal-qPCR MonAmp ChemoHS (Monad; Cat. MQ00501S)

Antikorp poliklonali Lgr5 (Wuhan Sanying; Cat. 30007-1-AP)

ZO-1 antikorp monoklonali, antikorp monoklonali NLRP3, antikorp monoklonali Caspase-1, antikorp monoklonali ASC, antikorp monoklonali GAPDH, antikorp monoklonali Ki67 (Abcam; Cats. ab307799, ab263899, ab179515, ab30924498, ab30924498, ab30924497),

Metodi

 

2.1 Preparazzjoni tal-polisakkaridi Cistanche deserticola

Materjal ta 'Cistanche (50 g) ġie estratt darbtejn b'decoction b'volumi ta' ilma 8 darbiet, siegħa kull darba. Il-filtrati ġew magħquda u mkessħa għat-temperatura tal-kamra. Etanol anidruż ġie miżjud ma 'konċentrazzjoni finali ta' 80% għall-preċipitazzjoni. Wara ċ-ċentrifugazzjoni, is-supernatant ġie mormi. Il-preċipitat ġie maħlul fl-ilma, iddiżalizzat, imbagħad lajofilizzat biex jinkiseb il-kampjun.

 

2.2 Raggruppament u amministrazzjoni tal-annimali

Wara l-akklimazzjoni, erbgħin ġrieden C57BL / 6J ta '20 xahar ġew assenjati b'mod każwali għal: grupp ta' tixjiħ naturali, grupp CDP b'doża baxxa (2.5 g·kg-1), grupp CDP b'doża għolja (5.0 g·kg-1), u grupp NMN (200 mg·kg-1). Għaxar ġrieden SPF C57BL/6J addizzjonali ta' xahrejn servew bħala grupp ta' kontroll żgħażagħ. Id-dożi CDP baxxi u għoljin ingħataw permezz ta 'gavage orali f'2.5 g·kg-1 u 5.0 g·kg-1, rispettivament. Bl-użu ta' konverżjoni tal-erja tas-superfiċje tal-ġisem u fattur ta' konverżjoni minn bniedem għal ġurdien ta' 12 [16], dawn jikkorrispondu għal madwar 1 × u 2 × id-doża klinika ekwivalenti għall-adulti. Il-grupp NMN irċieva NMN 200 mg·kg-1 bil-gavage. Il-gruppi ta 'kontroll żgħażagħ u ta' tixjiħ naturali rċevew volumi ugwali ta 'salina fiżjoloġika (10 mL · kg-1). It-trattamenti ngħataw kontinwament għal xahrejn.

 

2.3 Preparazzjoni ta 'sezzjonijiet iffriżati

Il-ġrieden ġew anestetizzati permezz ta 'injezzjoni intraperitoneali ta' sodium pentobarbital (30 mg · kg-1) u ewtanizzati. L-addome nfetaħ malajr, il-mesenterju sseparat, u t-tessut ileali inġabar u sezzjoni f'5 μm għal sezzjonijiet iffriżati [17].

 

2.4 Assaġġ SA- -gal għall-attività intestinali -galactosidase

It-tbajja’ twettqet skont l-istruzzjonijiet tal-kit SA- -gal. Wara l-inkubazzjoni, is-soluzzjoni tat-tbajja tneħħiet u s-sezzjonijiet ġew maħsula bil-PBS. Immaġini nġabru permezz ta 'mikroskopju maqlub.

 

2.5 PCR f'ħin reali għal fenotip sekretorju assoċjat mas-senescence (SASP)

L-RNA totali mit-tessut ileali ġie estratt bl-użu tal-kit TransZol Up Plus. It-traskrizzjoni inversa saret bis-sistema GoScript taħt il-kundizzjonijiet li ġejjin: 42 grad għal 15 min, 70 grad għal 15 min, 4 grad għal 10 min. PCR f'ħin reali twettqet bl-użu ta 'MonAmp ChemoHS qPCR Mix biċ-ċikliżmu li ġej: 95 grad 10 min; imbagħad 40 ċiklu ta '95 grad 15 s, 60 grad 1 min. Kurva tad-dewweb: 95 grad 15 s, 60 grad 15 s, 95 grad 15 s. GAPDH serva bħala r-referenza interna, u l-kwantifikazzjoni relattiva użat il-metodu 2^-ΔΔCt. Primers inxtraw mingħand Promega. Is-sekwenzi tal-primer huma murija fit-Tabella 1.

 

2.6 Tbajja ta' immunofluworexxenza għall-espressjoni ta' ZO-1

It-tessut ileali ġie ffissat f'4% paraformaldehyde u paraffin-sectioned f'5 μm. Is-sezzjonijiet ġew permeabilizzati b'0.3% Triton X-100 għal 15-il minuta u mblukkati b'10% serum tal-mogħoż għal siegħa f'temperatura tal-kamra. Antikorp primarju kontra ZO-1 (1:200) ġie applikat matul il-lejl f'4 gradi. Wara l-ħasil tal-PBS, antikorp sekondarju konjugat Cy3 (1:500) ġie inkubat għal siegħa f'temperatura tal-kamra fid-dlam. In-nuklei ġew counterstained b'DAPI għal 5 min. Slajds ġew immuntati b'mezz antifade u immaġini b'mikroskopija konfokali. L-intensità tal-fluworexxenza ġiet kwantifikata bl-użu ta 'softwer Image-Pro.

2.7 Immunoistokimika għall-espressjoni ta' Ki67 u Lgr5

Is-sezzjonijiet ileali ġew inkubati b'antikorpi primarji Ki67 (1:1000) u Lgr5 (1:200) matul il-lejl f'4 gradi wara l-protokoll tal-kit IHC, imbagħad b'antikorpi sekondarji korrispondenti. DAB intuża għall-iżvilupp kromoġeniku. Ir-riżultati ġew osservati bil-mikroskopija tad-dawl. Id-densità ottika medja ġiet ikkwantifikata bl-użu ta 'softwer Image-Pro.

 

2.8 ELISA għal-livelli ta' LPS

Standards u kampjuni (100 μL kull bir) ġew miżjuda mal-pjanċa u inkubati f'temperatura tal-kamra għal 1.5 sigħat. Soluzzjoni ta' streptavidin konjugat ma' HRP (100 μL kull bir) imbagħad ġiet miżjuda u inkubata għal 30 min. Is-sottostrat ġie miżjud taħt kundizzjonijiet protetti mid-dawl u rreaġixxa għal 30 min. Ir-reazzjoni ġiet mitmuma b'soluzzjoni ta 'waqfien, u l-assorbiment tkejjel f'450 nm.

 

2.9 Western blot għal NLRP3, Caspase-1, u ASC

Madwar 30 mg ta 'tessut ileali kien mitħun f'nitroġenu likwidu. Ġie miżjud RIPA lysis buffer li fih inibituri tal-protease/phosphatase; lisati ġew inkubati fuq is-silġ għal 30 min u ċentrifugati fi 12,000 × g, 4 gradi għal 15-il minuta biex jiġbru supernatanti. Il-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet iddeterminata b'assaġġ BCA u aġġustata għal 2 ug/μL. Ammonti ugwali ta 'proteina (20-40 ug) ġew separati minn SDS-PAGE u trasferiti għal membrani PVDF. Il-membrani ġew imblukkati b'5% ħalib mingħajr xaħam għal siegħa f'temperatura tal-kamra, inkubati b'antikorpi primarji (NLRP{16}:1000, Caspase-1 1:500, ASC 1:1000) matul il-lejl f'4 gradi, imbagħad b'antikorpi sekondarji konjugati bl-HRP f'temperatura tal-kamra (1:100) għal h. Wara l-ħasliet TBST, ġew żviluppati sinjali. L-intensitajiet tal-banda ġew normalizzati għal GAPDH.

 

2.10 Analiżi statistika

Id-dejta hija espressa bħala medja ± devjazzjoni standard. L-analiżi statistika u l-grafika twettqu bl-użu ta 'SPSS 26.0 u GraphPad Prism 8.0.2, rispettivament. ANOVA f'direzzjoni waħda ntużat biex jiġu vvalutati d-differenzi fost il-gruppi, segwit mit-test post hoc ta 'Tukey. Is-sinifikat statistiku ġie stabbilit għal P <0.05.

 

Noti prattiċi għall-qarrejja interessati fil-motilità tal-musrana u l-iżvilupp tas-supplimenti

 

Fokus funzjonali ta 'Cistanche deserticola: Użat tradizzjonalment biex xarrab l-imsaren u ttaffi l-istitikezza; dejta moderna tappoġġja appoġġ tal-barriera, modulazzjoni tal-infjammazzjoni (TLR4/NF-κB), u funzjoni mitokondrijali permezz tal-AMPK/SIRT1.

Mekkaniżmu potenzjali tal-imsaren kontra t-tixjiħ esplorat hawn: Soppressjoni tal-attivazzjoni tal-inflammasome NLRP3; tnaqqis ta 'infjammazzjoni ta' grad baxx mmexxija minn LPS; preservazzjoni ta' junctions stretti (eż., ZO-1); manutenzjoni ta 'markers ta' proliferazzjoni/stemness epiteljali (Ki67, Lgr5).

Dożi orali sperimentali tipiċi fil-ġrieden: 2.5-5.0 g·kg-1 CDPs għal 2 xhur; NMN 200 mg·kg−1 bħala kontroll pożittiv.

Attenzjoni traslazzjonali: Dożi tal-ġrieden mhumiex rakkomandazzjonijiet diretti umani. L-istudju juża skalar tal-erja tal-wiċċ tal-ġisem; Formulazzjoni u sigurtà ekwivalenti għall-bniedem, ittestjar tal-identità, u manifattura GMP huma meħtieġa qabel l-iżvilupp tal-prodott.