Astratt

L-invenzjoni preżenti tiżvela aEstratt ta' Cistanche għat-titjib tad-densità minerali tal-għadam (BMD). Fl-estratt, il-kontenut totali ta' echinacoside u acteoside (verbascoside)huwa>25% wt. L-estratt huwa ppreparat billi twettaqestrazzjoni bl-ilma distillattatrab mhux raffinat ta'Cistanche tubulosa, segwit minnfiltrazzjoni, ċentrifugazzjonital-filtrat,konċentrazzjoni, estrazzjoni likwidu-likwidu, konċentrazzjoni bit-tneħħija tal-impurità, dilwizzjoni, wara t-trattament, u mbagħadkonċentrazzjoni finali u tnixxifbiex tikseb l-estratt Cistanche.

 

 

Proċess ta 'Estratt ta' Cistanche

Fl-estratt Cistanche għat-titjib tad-densità minerali tal-għadam skond l-invenzjoni, ilkontenut totali ta 'echinacoside u acteosidehuwa25-30% wt(esklużi 25 wt%), u l-estratt huwa wkoll għani flaċidu shikimickif ukollkomponenti tat-tip phenylpropionic-acidukomponenti tat-tip alkalojdi, li jippermettilha lijeżerċita b'mod stabbli effett li jtejjeb id-densità tal-għadam.

 

Talbiet

1. Metodu ta 'preparazzjoni

Metodu għall-preparazzjoni ta' estratt ta' Cistanche għat-titjib tad-densità minerali tal-għadam, ikkaratterizzat li jinkludi l-passi li ġejjin:

tgħaffiġCistanche tubulosabiex tikseb trab mhux raffinat taCistanche tubulosa;

żżid ilma distillat mat-trab mhux raffinat taCistanche tubulosagħall-estrazzjoni, l-iffiltrar, iċ-ċentrifugazzjoni tal-filtrat, u l-konċentrazzjoni biex tinkiseb soluzzjoni konċentrata taCistanche tubulosa;

estrazzjoni tas-soluzzjoni konċentrata taCistanche tubulosa, tikkonċentra l-fażi ta 'estrazzjoni t'isfel biex tneħħi l-impuritajiet, u tħallat biex tikseb soluzzjoni ta' tagħbija;

wara t-trattament tas-soluzzjoni tat-tagħbija, segwit minn konċentrazzjoni u tnixxif biex jinkiseb l-estratt ta 'Cistanche.

2. Proporzjon ta 'Materjal għall-Ilma

Il-metodu skond Talba 1, fejn il-proporzjon tal-massa għall-volum tat-trab mhux raffinat ta'Cistanche tubulosagħall-ilma distillat huwa1 : (15–25).

3. Temperatura ta 'estrazzjoni

Il-metodu skont it-talba 1, fejn it-temperatura tal-estrazzjoni tal-ilma distillat hija60-100 grad.

4. Proporzjon Waqt Estrazzjoni Likwida-Likwida

Il-metodu skond Talba 1, fejn waqt l-estrazzjoni tas-soluzzjoni kkonċentrata, il-proporzjon tal-volum tas-soluzzjoni kkonċentrata ta'Cistanche tubulosagħall-estrazzjoni solvent huwa1 : (1–5).

5. Estrazzjoni Solvent

Il-metodu skont it-talba 4, fejn is-solvent tal-estrazzjoni jinkludi mill-inqas wieħed minnetere tal-pitrolju, aċetat etiliku, n-hexane, jew cyclohexane.

6. Proċess ta 'wara t-Trattament

Il-metodu skond Talba 1, fejn it-trattament ta' wara tas-soluzzjoni tat-tagħbija jinkludi: tgħaddi s-soluzzjoni tat-tagħbija minn ġoreżina makroporuża, u mbagħad eluting sekwenzjali mailma distillatu ansoluzzjoni ta’ etanol.

7. Volumi ta 'Eluzzjoni

Il-metodu skond Talba 6, fejn il-proporzjon tal-volum ta 'ilma distillat għar-reżina makroporuża huwa(5–10) : 1, u l-proporzjon tal-volum tas-soluzzjoni tal-etanol mar-reżina makroporuża hija(3–9) : 1.

8. L-Estratt

Estratt ta' Cistanche għat-titjib tad-densità minerali tal-għadam, ikkaratterizzat li huwa ppreparat skont kwalunkwe waħda mill-Pretensjonijiet 1–7.

9. Kontenut ta' Marker Attiv

L-estratt ta 'Cistanche skond it-talba 8, fejn il-kontenut totali ta' echinacoside u acteoside huwa25-30% wt, esklużi 25% wt.

10. Applikazzjoni

Użu ta' l-estratt ta' Cistanche skond kwalunkwe waħda mill-Pretensjonijiet 8–9 fil-preparazzjoni ta' prodott għat-titjib tad-densità minerali ta' l-għadam, fejn il-konċentrazzjoni ta' l-estratt ta' Cistanche fil-prodott hija12.5-25 ug/mL.

 

Qasam Tekniku

[0001] L-invenzjoni preżenti tirrigwarda l-qasam ta 'formulazzjonijiet mediċi, u speċifikament tirrigwarda aEstratt ta 'Cistanche għat-titjib tad-densità minerali tal-għadam, tagħhametodu ta’ preparazzjoni, uapplikazzjonijiet.

Sfond

[0002] Cistanche tirreferi għaż-zokk imnixxef imlaħħam bil-weraq tal-iskala tal-pjanti OrobanchaceaeCistanche deserticola YC MajewCistanche tubulosa (Schenk) Wight. Cistanche għandha attivitajiet multipli bħalregolamentazzjoni immuni, anti-infjammatorji, kontra l-għeja, antiossidant, newroprotettiv, uappoġġ tas-sistema riproduttiva.

Phenylethanoid glycosides (PhGs)-bilechinacosideuacteoside (verbascoside)li huma l-PhGs ewlenin f'Cistanche-huma kostitwenti importanti.Echinacosideġie muri li għandu effett fuqittejjeb id-densità minerali tal-għadam. Madankollu, sibna li l-effett li jtejjeb id-densità tal-għadam tal-estratti ta 'Cistanche huwamhux biss korrelatati mal-kontenut ta 'echinacoside. Sempliċement tikkontrolla l-kontenut ta 'echinacosidema jistax jiżgurali l-estratt seb'mod stabblijeżerċita effett li jtejjeb id-densità tal-għadam. Għalhekk, huwa kruċjali li jiġi żviluppat estratt ta 'Cistanche u metodu ta' preparazzjoni li jista 'b'mod stabblijagħti l-effett mixtieq ta 'sostenn tad-densità tal-għadam.

[0003] Applikazzjoni tal-privattiva tal-invenzjoni ĊiniżaCN102441040Atiżvela metodu ta 'preparazzjoni għall-glikożidi feniletanojdi totali minn Cistanche permezz ta' polverizzazzjoni, estrazzjoni, adsorbiment ta 'reżina makroporuża, elużjoni, konċentrazzjoni, eċċ. Taħt kundizzjonijiet aċidużi dgħajfa (pH 2-4), l-istabbiltà tal-glikożidi feniletanojdi ta' Cistanche hija mtejba b'mod sinifikanti, u l-proporzjon totali li jirriżulta li jaġixxu proporzjonali ecoside acoside > 90%. Madankollu, ma jivverifikax jekk il-prodott jistaxb'mod stabbliittejjeb id-densità minerali tal-għadam.

Applikazzjoni ta 'privattiva ta' invenzjoni ĊiniżaCN105111255Atiżvela metodu għall-estrazzjoni u s-separazzjoni ta 'echinacoside u acteoside minn Cistanche, bl-użu ta' 75% etanol bħala s-solvent tal-estrazzjoni, AB-8 reżina makroporuża bħala l-materjal tal-ippakkjar, u 55% eluzzjoni ta 'etanol, li jagħti estratt ta' Cistanche b'echinacoside > 25%, acteoside > 10% > 80% PhGs. Madankollu, xorta jista' ma jiggarantixxix astabblieffett li jtejjeb id-densità tal-għadam.

 

Sommarju ta' l-Invenzjoni

[0004] Biex tiżviluppa estratt ta 'Cistanche u metodu ta' preparazzjoni li jista 'b'mod stabblijappoġġja densità minerali tal-għadam mtejba, l-invenzjoni tipprovdi:

L-Ewwel Aspett: Metodu ta' Preparazzjoni

Metodu ta' preparazzjoni għal estratt ta' Cistanche għat-titjib tad-densità minerali tal-għadam, li jinkludi:

tgħaffiġCistanche tubulosabiex tikseb trab mhux raffinat;

estrazzjoni tat-trab mhux raffinat b'ilma distillat, iffiltrar, ċentrifugazzjoni, u konċentrazzjoni biex tinkiseb soluzzjoni kkonċentrata;

twettiq ta' estrazzjoni; tikkonċentra l-fażi t'isfel biex tneħħi l-impuritajiet; dilwizzjoni biex tinkiseb soluzzjoni tat-tagħbija;

wara t-trattament tas-soluzzjoni tat-tagħbija, tikkonċentra, u tnixxif biex tikseb l-estratt ta 'Cistanche.

[0005] F'inkarnazzjoni waħda, it-trab mhux raffinat jiġi mgħoddi minn a40-maljigħarbiel.

[0006] F'inkarnazzjoni waħda, il-proporzjon tal-massa għall-volum ta' trab mhux raffinat għal ilma distillat huwa1 : (15–25).

[0007] F'inkarnazzjoni waħda, il-proporzjon tal-massa għall-volum huwa1 : 20.

[0008] F'inkarnazzjoni waħda, it-temperatura ta 'estrazzjoni hija60-100 grad.

[0009] F'inkarnazzjoni waħda, it-temperatura ta 'estrazzjoni hija80 grad.

[0010] F'inkarnazzjoni waħda, titwettaq l-estrazzjoni1-2 darbiet, 1 siegħa kull darba.

[0011] F'inkarnazzjoni waħda, il-filtrazzjoni titwettaq permezz ta'80-maljifiltru.

[0012] F'inkarnazzjoni waħda, il-veloċità taċ-ċentrifugazzjoni hija3000–4000 r/minu l-ħin hu3–9 min.

[0013] F'inkarnazzjoni waħda, il-veloċità taċ-ċentrifugazzjoni hija3500 r/minu l-ħin hu5 min.

[0014] F'inkarnazzjoni waħda, wara ċ-ċentrifugazzjoni, il-filtrat huwa kkonċentrat fi70 gradbiex18%–28%tal-volum inizjali.

[0015] F'inkarnazzjoni waħda, waqt l-estrazzjoni tas-soluzzjoni kkonċentrata, il-proporzjon tal-volum tas-soluzzjoni kkonċentrata mas-solvent tal-estrazzjoni huwa1 : (1–5).

[0016] F'inkorporazzjoni waħda, il-proporzjon huwa1 : 3.

[0017] F'inkorporazzjoni waħda, is-solvent tal-estrazzjoni jinkludi mill-inqas wieħed minnetere tal-pitrolju, aċetat etiliku, n-hexane, jew cyclohexane.

[0018] F'inkarnazzjoni waħda, l-estrazzjoni titwettaq b'mod sekwenzjali bl-użuetere tal-pitroljusegwit minnaċetat etiliku.

[0019] F'inkarnazzjoni waħda, "konċentrazzjoni bit-tneħħija tal-impurità" tfisser li tikkonċentra l-fażi ta' estrazzjoni t'isfel għal pejst, tinħall fi300 mL ta' 50% wt ta' etanol akwejubiex tneħħi l-impuritajiet, u taġġusta għal1.0-1.5 g ħaxix mhux raffinat għal kull mLbħala s-soluzzjoni tat-tagħbija.

[0020] F'inkarnazzjoni waħda, il-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tat-tagħbija hija1.0–1.5 g ħaxix mhux raffinat/mL ilma.

[0021] F'inkorporazzjoni waħda, it-trattament ta 'wara jinkludi t-tgħaddi tas-soluzzjoni tat-tagħbijareżina makroporuża, u mbagħad eluting sekwenzjali mailma distillatu ansoluzzjoni ta’ etanol.

[0022] F'inkarnazzjoni waħda, ir-rata tal-fluss tat-tagħbija permezz tar-reżina makroporuża hija1–5 mL/min.

[0023] F'inkarnazzjoni waħda, ir-reżina hijaAB-8 reżina makroporużab'volum tar-reżina ta'0.93 L.

[0024] F'inkarnazzjoni waħda, il-proporzjon tal-volum ta 'ilma distillat għal reżina huwa(5–10) : 1, u l-proporzjon tal-volum ta 'soluzzjoni ta' etanol għar-reżina huwa(3–9) : 1.

[0025] F'inkarnazzjoni waħda, il-proporzjon tal-volum ta 'ilma distillat għal reżina huwa7 : 1, u l-proporzjon ta 'soluzzjoni ta' etanol għar-reżina hija6 : 1.

[0026] F'inkarnazzjoni waħda, is-soluzzjoni tal-etanol hija80% (w/w) etanol milwiema.

It-Tieni Aspett: L-Estratt

[0027] L-invenzjoni tipprovdi wkoll estratt ta 'Cistanche ippreparat bil-metodu ta' hawn fuq.

[0028] F'inkarnazzjoni waħda, il-kontenut totali ta 'echinacoside u acteoside huwa25-30% wt, esklużi 25 wt%.

It-Tielet Aspett: Użu

[0029] L-invenzjoni tipprovdi wkoll l-użu tal-estratt ta' Cistanche fil-preparazzjoni ta' prodotti għat-titjib tad-densità minerali tal-għadam, fejn il-konċentrazzjoni tal-estratt fil-prodott hija12.5-25 ug/mL.

 

Vantaġġi / Effetti Benefiċi

[0030] Meta mqabbla ma 'l-art preċedenti, l-invenzjoni għandha l-effetti ta' benefiċċju li ġejjin:

L-estratt Cistanche fih25-30% wtechinacoside totali u acteoside, u hija rikka flaċidu shikimic, komponenti tat-tip phenylpropionic-acid, alkalojdi, uaċidi grassi, li jippermettilha lib'mod stabblijappoġġjaw it-titjib tad-densità minerali tal-għadam.

Fi ħdan il-12.5-25 ug/mLfirxa ta 'konċentrazzjoni, l-estratt jippromwovi proliferazzjoni ta'MC3T3-E1ċelluli b'effetti proliferattivi eċċellenti.

L-estratt juri l-istess tendenza relatata mad-doża fil-promozzjoni tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli uAttività ALP, u jista 'jippromwovi b'mod stabbli l-proliferazzjoni u d-divrenzjar. Fil-promozzjoni tal-mineralizzazzjoni tal-osteoblast, turi effett aħjar mill-kontroll pożittiv17 -estradjol.

L-estratt jistimula fatturi ta 'traskrizzjoni speċifiċi għall-osteoblastRunx2uOsx, isaħħaħ id-divrenzjar tal-osteoblast, u jippromwovi l-espressjoni ta 'markaturi osteoġeniċiOPNuOCN, u b'hekk tippromwovi l-formazzjoni tal-għadam. Żid ukollBmp2 mRNAespressjoni biex ittejjeb id-divrenzjar tal-osteoblast u l-formazzjoni tal-għadam ġdid billi jattiva l-Mogħdija BMP/Smad; barra minn hekk, billi tirregolaLrp5 mRNA, Lrp6 mRNA, uWnt3 mRNA, jattivasinjalazzjoni Wnt/ -catenin, taffettwa l-espressjoni tal-fattur ta 'traskrizzjoni downstream, u tippromwovi d-divrenzjar tal-osteoblast u l-formazzjoni tal-għadam.

Il-metodu ta 'preparazzjoni jagħti estratt li fih phenylethanoid glycosides (echinacoside u acteoside), aċidu shikimic u aċidi phenylpropionic, alkalojdi, u aċidi grassi. Dawn il-komponenti flimkien jippermettu li l-estratt juri dipendenza konsistenti mid-doża fil-proliferazzjoni, id-divrenzjar u l-mineralizzazzjoni, li jippermettu effetti stabbli li jsostnu d-densità tal-għadam.

 

Deskrizzjoni Qasira tat-Tpinġijiet

[0035] Fig. 1: Effett tal-estratt (Eżempju 1) fuq il-proliferazzjoni taċ-ċelluli MC3T3-E1
Fig. 2: Effett tal-estratt (Eżempju 2) fuq il-proliferazzjoni taċ-ċelluli MC3T3-E1
Fig. 3: Effett tal-estratt (Eżempju 3) fuq il-proliferazzjoni taċ-ċelluli MC3T3-E1
Fig. 4: Effett tal-estratt (Eżempju 1) fuq l-attività ALP
Fig. 5: Effett tal-estratt (Eżempju 2) fuq l-attività ALP
Fig. 6: Effett tal-estratt (Eżempju 3) fuq l-attività ALP
Fig. 7: Ritratti tat-tbajja 'Aħmar ta' Alizarin tal-mineralizzazzjoni tal-osteoblast (Eżempju 2)
Fig. 8: Riżultati kwantitattivi tal-mineralizzazzjoni tal-osteoblast (Eżempju 2)
Fig. 9–12: Effetti tal-Eżempju 2 fuq l-espressjoni tal-mRNA Runx2, Osx, Opn, Ocn
Fig. 13: Effett tal-Eżempju 2 fuq l-espressjoni tal-mRNA Bmp2 (BMP/Smad)
Fig. 14–16: Effetti tal-Eżempju 2 fuq l-espressjoni tal-mRNA Lrp5, Wnt3 , Lrp6 (Wnt/ -catenin)
Fig. 17–18: Effetti tal-Eżempju 2 fuq l-espressjoni tal-proteini Osx u RUNX2

 

Deskrizzjoni Dettaljata / Inkarnazzjonijiet

Eżempju 1

[0036] Metodu ta' preparazzjoni jinkludi:

tgħaffiġCistanche tubulosa, tgħaddi minn għarbiel 40-malji biex tikseb200 gtrab mhux raffinat;

estrazzjoni bililma distillat f'5× massa(kif deskritt), estrazzjoni fi75 gradgħal2 darbiet, 1 siegħa kull wieħed, tikkonċentra fuq70 gradgħal proporzjon ta' konċentrazzjoni ta'1 : 2.2biex tikseb soluzzjoni konċentrata;

iż-żieda ta’ etanol assolut mas-soluzzjoni kkonċentrata għal preċipitazzjoni gradata ta’ etanol b’konċentrazzjonijiet finali tal-massa ta’ etanol ta’20%, 40%, 60%, 80%, tippreċipita fi5 gradi għal 24 siegħa, jiġbru s-supernatant wara80% wtpreċipitazzjoni ta' l-etanol;

tikkonċentra u tnixxif fuq70 gradbiex tikseb l-estratt ta 'Cistanche, b'rendiment ta'20.75%.

Eżempju 2

[0037] Metodu ta' preparazzjoni jinkludi:

tgħaffiġCistanche tubulosabiex tikseb240 gtrab mhux raffinat;

estrazzjoni b'ilma distillat, iffiltrar, ċentrifugazzjoni, u konċentrazzjoni biex tinkiseb soluzzjoni konċentrata;

estrazzjoni tas-soluzzjoni konċentrata; tikkonċentra l-fażi t'isfel biex tneħħi l-impuritajiet; dilwizzjoni biex tinkiseb soluzzjoni tat-tagħbija;

wara t-trattament tas-soluzzjoni tat-tagħbija; tikkonċentra u tnixxif fuq70 gradbiex tikseb l-estratt, b'rendiment ta '19.69%.

[0038] It-trab mhux raffinat jgħaddi minn għarbiel ta' 40 malja.
[0039] Il-proporzjon tal-massa għall-volum tat-trab mhux raffinat għall-ilma distillat huwa1 : 20.
[0040] It-temperatura tal-estrazzjoni hija80 grad.
[0041] L-estrazzjoni titwettaq1-2 darbiet, 1 siegħa kull wieħed.
[0042] Il-filtrazzjoni hija permezz ta' an80-maljifiltru.
[0043] Iċ-ċentrifugazzjoni hija3500 r/min għal 5 min.
[0044] Konċentrazzjoni wara ċ-ċentrifugazzjoni: ikkonċentra fi70 gradbiex20%tal-volum inizjali.
[0045] Matul l-estrazzjoni, il-proporzjon tal-volum tas-soluzzjoni kkonċentrata mas-solvent huwa1 : 3.
[0046] L-estrazzjoni titwettaq b'mod sekwenzjali bietere tal-pitroljuuaċetat etiliku.
[0047] Il-fażi t'isfel hija kkonċentrata f'pejst u maħlula fiha300 mL ta' 50% wt ta' etanol akwejubiex tneħħi l-impuritajiet.
[0048] Konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tat-tagħbija:1.0 g ħaxix mhux raffinat/mL ilma.
[0049] Wara t-trattament: għaddi minn reżina makroporuża, elużi b'ilma distillat imbagħad soluzzjoni ta 'etanol.
[0050] Rata tal-fluss permezz tar-reżina:3 mL/min.
[0051] Reżina:AB-8, volum tar-reżina0.93 L.
[0052] Proporzjon ta' volum ta' ilma distillat għal raża:7 : 1. Proporzjon ta' etanol-soluzzjoni għal-reżina:6 : 1.
[0053] Soluzzjoni ta' etanol:80% (w/w)etanol milwiema.

 

Ikklikkja biex tkun taf aktar dettalji dwar il-fabbrika cistanche

Eżempju 3

[0053] Metodu ta' preparazzjoni jinkludi:

tgħaffiġCistanche tubulosa, tgħaddi minn għarbiel 40-malji biex tikseb120 gtrab mhux raffinat;

estrazzjoni bil12× massata50% wt etanol akweju, estrazzjoni fi70 grad, 2 darbiet, 1 siegħa kull wieħed, tikkonċentra fuq70 gradgħal proporzjon ta'1 : 2.5biex tikseb soluzzjoni konċentrata;

żżid l-ilma biex taġġusta l-konċentrazzjoni għal0.2 g ħaxix mhux raffinat/mL ilma, ċentrifugazzjoni fi3500 r/min għal 5 min, billi tieħu s-supernatant bħala s-soluzzjoni tat-tagħbija;

li jgħaddi minn reżina makroporuża; elużjoni sekwenzjali b'ilma distillat u soluzzjoni ta' etanol; jiġbru l-eluzzjoni ta' l-etanol u jikkonċentra/tnixxif fi70 gradbiex tikseb l-estratt b'rendiment ta '24.30%.

[0054] Reżina:HPD750, volum tar-reżina0.93 L.
[0055] Proporzjon ta' ilma distillat għal raża:3 : 1. Proporzjon ta' etanol-soluzzjoni għal-reżina:4 : 1.
[0056] Soluzzjoni ta' etanol:30% (w/w)etanol milwiema.

 

Ittestjar tal-Prestazzjoni

1.1 Assaġġ tal-Proliferazzjoni taċ-Ċelloli

[0057] L-osteoblasts huma ċ-ċelloli funzjonali ewlenin responsabbli għall-formazzjoni tal-għadam, li jinvolvu proliferazzjoni ta 'pre-osteoblasts, produzzjoni ta' matriċi tal-għadam, u differenzjazzjoni finali. Il-MC3T3-E1linja taċ-ċelluli hija komunement użata biex tistudja l-attività osteoġenika. Id-divrenzjar tal-osteoblasti jinvolvi proliferazzjoni, differenzjazzjoni u mineralizzazzjoni manifestati bħala żieda fin-numru ta 'pre-osteoblasti, maturazzjoni f'osteoblasti, u formazzjoni ta' matriċi tal-għadam ġdida.

Fosfatażi alkalina (ALP)hija proteina relatata mal-fenotip ta 'l-osteoblast li tista' tinduna waqt il-proliferazzjoni taċ-ċelluli u l-maturazzjoni tal-matriċi u hija markatur bikri użat komunement tad-divrenzjar ta 'l-osteoblast.

Għalhekk, billi evalwaw il-proliferazzjoni MC3T3-E1 u l-attività ALP, tqabbel l-attività li tippromwovi l-osteoġenesi tal-estratti ppreparati fl-Eżempji 1-3.

Iċ-ċelloli MC3T3-E1 ġew imqajma u mgħoddija. Wara l-istabbilizzazzjoni, iċ-ċelloli ġew diġeriti, ċentrifugati, u miġbura. Id-densità taċ-ċelluli ġiet aġġustata sabiex kull 100 μL kien fih 5 × 1035 \\times 10 ^ 35 × 103 ċelluli u kienet miżrugħa fi pjanċa ta '96 bir. Wara l-kultura ta’ matul il-lejl, il-medium ġie mibdul b’midjum komplut li kien fih estratti ta’ Eżempju 1–3 f’konċentrazzjonijiet ta’6.25, 12.5, 25, u 50 ug/mL, jew li jkun fihom0.1 M estradiol(kontroll pożittiv), jew medju waħdu (kontroll vojt), u kkultivati ​​għal48 h. Taħt kundizzjonijiet protetti mid-dawl, ġiet miżjuda soluzzjoni stokk MTT (10%–20% tal-volum tal-bir), inkubata għal4 hf'inkubatur tas-CO₂, medju mneħħi, u200 μL DMSOmiżjud biex jinħall formazan. Il-valuri OD ġew imkejla fi490 nm.

Riżultati: Fig. 1 (Eżempju 1), Fig. 2 (Eżempju 2), Fig. 3 (Eżempju 3).

[0058] Rata ta' proliferazzjoni taċ-ċelloli (%)=OD(Eżempju 1–3)-OD(Blank)OD(Blank)×100%\\frac{OD(\\text{Eżempju 1–3}) - OD(\\text{Blank})}{OD(\\text{Blank})} \\times 100\\)OD(Blank)%(Blank) 1–3)−OD(Blank)​×100%

[0059] Kif muri fil-Fig. 1–3, il-kontroll pożittiv ippromwova l-proliferazzjoni MC3T3-E1. Eżempju 1 promossi l-proliferazzjoni f'6.25, 12.5, u 25 ug/mL; ir-rata ta 'proliferazzjoni f'12.5 ug/mL kienet 1.4× dik tal-kontroll pożittiv, iżda mingħajr differenza sinifikanti (P> 0.05). Eżempju 2 ippromwova proliferazzjoni f'6.25, 12.5, 25, u 50 ug/mL; f'12.5, 25, u 50 ug/mL l-effetti tiegħu kienu superjuri għall-kontroll pożittiv (P <0.01 jew P <0.001), b'rati ta 'proliferazzjoni 2.55×, 3.46×, u 2.59× tal-kontroll pożittiv. Eżempju 3 ippromwova proliferazzjoni f'6.25, 12.5, 25, u 50 ug/mL; f'12.5, 25, u 50 ug/mL kien superjuri għall-kontroll pożittiv (P <0.01 jew P <0.001), b'rati ta 'proliferazzjoni 1.40×, 1.76×, u 0.93× tal-kontroll pożittiv. Dan jindika li l-Eżempju 2 kellu l-aħjar effett fuq il-promozzjoni tal-proliferazzjoni MC3T3-E1.

1.2 Assaġġ tal-Attività ALP

[0060] L-attività ALP ġiet imkejla bl-użu ta' kit ta' analiżi ALP. Il-konċentrazzjoni tal-istokk ta 'p-nitrofenol kienet 10 mM, u l-konċentrazzjonijiet tal-kurva standard kienu 0, 0.02, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, 0.2, u 0.25 mM, ippreparati permezz ta' dilwizzjoni gradjent b'buffer ta 'skoperta.

Għal kull kampjun tajjeb fi pjanċa ta '96 bir, ġew miżjuda 49 μL buffer ta' detezzjoni, 1 μL proteina estratta miċ-ċelluli MC3T3-E1 ittrattati (minn sezzjoni 1.1), u 50 μL substrat kromoġeniku (miżjud l-aħħar). Ir-reazzjoni kompliet għal 30 minuta fl-inkubatur protett mid-dawl, mitmuma billi żżid 100 μL soluzzjoni ta' waqfien, u l-assorbiment imkejjel f'405 nm. L-attività ALP ġiet ikkalkulata mill-kurva standard.

Riżultati: Fig. 4 (Eżempju 1), Fig. 5 (Eżempju 2), Fig. 6 (Eżempju 3).

[0061] Attività ALP (U/L)=(konċentrazzjoni molari relattiva tal-proteina) × 1000 × 100 / 30
(1000 għal konverżjoni ta' unità molari; 100 għal volum totali ta' reazzjoni; 30 għal ħin ta' reazzjoni ta' 30 min)

ALP huwa markatur bikri tad-differenzazzjoni MC3T3-E1. Fig. 4–6 turi li l-kontroll pożittiv żied l-attività ALP. Eżempju 1 ma ppromwovix attività ALP. Eżempju 2 żied l-attività ALP f'12.5, 25, u 50 ug/mL; f'25 u 50 ug/mL differenzi vs vojt kienu sinifikanti (P ​​<0.01). Eżempju 3 żied l-attività ALP f'12.5 u 25 ug/mL (P <0.001), iżda b'konċentrazzjoni dejjem tiżdied, it-titjib naqas. Dan jindika li l-Eżempji 2 u 3 biss żiedu l-attività ALP u appoġġaw id-divrenzjar.

[0062] B'mod ġenerali, l-Eżempju 2 biss wera korrelazzjoni pożittiva għad-doża kemm fil-proliferazzjoni MC3T3-E1 kif ukoll fl-attività ALP f'12.5 u 25 ug/mL. Eżempju 3 wera korrelazzjoni doża-pożittiva għall-proliferazzjoni iżda korrelazzjoni doża-negattiva għall-ALP. B'mod komparattiv, l-Eżempju 2 huwa aktar adattat għat-titjib tad-densità minerali tal-għadam.

1.3 Mineralizzazzjoni (Tbajja Aħmar ta 'Alizarin) tal-Eżempju 2

[0063] Peress li l-Eżempju 2 wera l-aħjar attività u korrelazzjoni tad-doża meta mqabbla mal-Eżempji 1 u 3, saru esperimenti ta 'mineralizzazzjoni biex jiġi evalwat aktar l-effett tiegħu.

[0064] Iċ-ċelloli MC3T3-E1 ġew ittrattati wara 72 siegħa ta' kultura b'Eżempju 2 estratt f'12.5, 25, u 50 ug/mL, inkubati f'37 grad għal14 days(ibbażat fuq il-formazzjoni tan-noduli tal-kalċju), b'bidliet medji kull jumejn. Tbajja ta 'Alizarin Red twettqet: medju mneħħi, ċelluli ffissati b'10% formalin newtrali (300 μL/bir) għal 30 min, mlaħalħa, imtebba 'b'0.1% Alizarin Red (300 μL/bir) għal 30 min (temperatura tal-kamra, protetta mid-dawl), u maħsula sakemm ma baqa' ebda kulur aħmar. Ittieħdu stampi. Imbagħad ġiet miżjuda soluzzjoni ta '10% cetylpyridinium chloride (400 μL/bir) u tħawwad għal siegħa biex tħoll in-noduli kalċifikati. Is-soluzzjoni maħlula ġiet trasferita għal pjanċa ta’ 96 bir (100 μL/bir) u OD imkejjel f’562 nmbiex tikkalkula r-rata ta' mineralizzazzjoni. Ritratti: Fig. 7; riżultati kwantitattivi: Fig. 8.

[0065] Rata ta' mineralizzazzjoni (%)=OD(Eżempju 2)-OD(Blank)OD(Blank)×100%\\frac{OD(\\text{Eżempju 2}) - OD(\\text{Blank})}{OD(\\text{Blank})} \\times 100\\%OD(Blank) 2)−OD(Blank)​×100%

[0066] Fig. 7 turi li n-numri tan-noduli tal-kalċju żdiedu b'mod sekwenzjali mal-konċentrazzjoni vs. Fig . 8 tindika li l-Eżempju 2 ippromwova mineralizzazzjoni b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni f'12.5, 25, u 50 ug/mL, bl-aktar effett qawwi f'50 ug/mL, b'mod sinifikanti aħjar mill-kontroll pożittiv (P < 0.001). Minħabba li n-noduli mineralizzati jirrappreżentaw l-istadju finali tad-divrenzjar tal-osteoblasti, dawn ir-riżultati jikkonfermaw aktar l-effett ta 'sostenn tad-densità tal-għadam tal-Eżempju 2 u juru l-attività stabbli tiegħu. Eżempju 2 kien superjuri għall-estradiol, li jindika valur potenzjali għall-prodotti tas-saħħa tal-għadam.

Espressjoni tal-Ġene u Mekkaniżmu tal-Pathway (Eżempju 2)

[0067] Eżempju 2 estratt (12.5, 25, 50 ug/mL) ġie applikat għal ċelluli MC3T3-E1 għal 3 ijiem. L-estrazzjoni tal-RNA, il-kwantifikazzjoni, it-traskrizzjoni inversa (sistema 20 μL; input RNA 800 ng), u qRT-PCR twettqu biex jikkwantifikaw livelli ta’ espressjoni relattivi ta’Runx2 mRNA, Osx mRNA, Opn mRNA, u Ocn mRNA. Riżultati: Fig. 9–12.

[0068] Runx2 u Osx huma regolaturi downstream ewlenin fis-sinjalar BMP, li jinduċu differenzjazzjoni tal-osteoblast. Runx2 huwa importanti fl-istadju bikri ta 'impenn, filwaqt li Osx jiffunzjona fid-divrenzjar terminali. OPN u OCN huma indikaturi importanti għall-attività tal-osteoblast u l-mineralizzazzjoni tat-tessuti. Fig. 9–12 turi li l-Eżempju 2 żied l-espressjoni relattiva ta 'dawn il-markaturi, li jappoġġja d-differenzjazzjoni mtejba tal-osteoblast u l-formazzjoni tal-għadam.

[0069] Eżempju 2 regolat 'il fuqBmp2 mRNA(Fig. 13), li tindika l-attivazzjoni tal-Mogħdija BMP/Smad, li jappoġġja d-divrenzjar ta 'l-osteoblast u l-formazzjoni ta' għadam ġdid.

[0071] Eżempju 2 żied l-espressjoni relattiva ta'Lrp5 mRNA, Lrp6 mRNA, u Wnt3 mRNA(Fig. 14–16), li jappoġġjaw l-attivazzjoni ta'sinjalazzjoni Wnt/ -catenin, li hija relatata mill-qrib mal-proliferazzjoni tal-osteoblasti, id-divrenzjar u l-formazzjoni tal-għadam.

Espressjoni ta' Proteina (Eżempju 2)

[0073] Analiżi Western blot wriet li l-Eżempju 2 żdiedOsxuRUNX2espressjoni tal-proteina (Fig. 17–18), li tindika regolamentazzjoni kemm fil-livelli ta' traskrizzjoni kif ukoll ta' translazzjoni biex tippromwovi d-differenzazzjoni tal-osteoblast.

[0075] Dawn it-testijiet tal-attività juru li l-Eżempju 2 ipprovda l-aħjar effett li jippromwovi l-proliferazzjoni u kien l-uniku wieħed b'korrelazzjoni ta' doża konsistenti kemm għall-proliferazzjoni kif ukoll għall-ALP. Eżempju 2 kien ukoll superjuri għall-estradiol fil-promozzjoni tal-proliferazzjoni u l-mineralizzazzjoni ta 'MC3T3-E1, b'effetti ta' differenzjazzjoni komparabbli, li jissuġġerixxu potenzjal ottimali ta 'sostenn tad-densità tal-għadam.

 

Ittestjar ta' Kompożizzjoni Kimika

6.1 Kontenut ta' Phenylethanoid Glycosides

[0076] B'referenza għall-metodu ta 'assaġġ "Cistanche" fil-Farmakopea Ċiniża, il-kontenut ta' echinacoside u acteoside fl-Eżempji 1–3 ġew imkejla (riżultati murija fit-Tabella 1). Ibbażat fuq echinacoside, acteoside, u PhGs totali, it-tendenza kienet konsistenti: Eżempju 3 > Eżempju 1 > Eżempju 2, u acteoside fl-Eżempju 3 kien 3.85 × u 4.27 × dak ta 'Eżempji 1 u 2, rispettivament. Il-kombinazzjoni tar-riżultati tal-attività u l-kontenut tindika li echinacoside u acteoside waħedhom ma jiddeterminawx direttament l-effetti osteoġeniċi.

 

Tabella 1. Kontenut ta 'Echinacoside u Acteoside fl-Estratti ta' Cistanche (%)

Kampjun (Eżempju)	Echinacoside (%)	Acteoside / Verbascoside (%)	Total (%)
Eżempju 1	28.68	1.63	30.31
Eżempju 2	26.27	1.47	27.74
Eżempju 3	30.39	6.27	36.66

 

6.2 Komponenti oħra (UPLC/Q-TOF/MS)

[0078] UPLC/Q-TOF/MS intużaw biex iqabblu l-komponenti kimiċi fost l-Eżempji 1–3. Il-valuri tar-rispons huma murija fit-Tabella 2.

[0079] Minbarra echinacoside u acteoside, l-Eżempju 2 kien fih addizzjonaliaċidu shikimic u komponenti tat-tip phenylpropionic-acid, u wkollalkalojdi. Meta mqabbel mal-Eżempji 1 u 3, l-Eżempju 2 kellu 11-il komponent relatati mal-aċidu fenilpropioniku/shikimic bl-ogħla risponsi, inklużi:

Tabella 2. Valuri ta' Rispons UPLC/Q-TOF/MS ta' Komponenti Ewlenin fl-Estratti ta' Cistanche (Eżempji 1–3)

注:原表为"响应值(valur tar-rispons)";我保留为纯数值,不加单位(与图表一致).表内分为2组Aċidu Shikimic & derivattivi ta 'aċidu fenilpropioniku(莽草酸及苯丙酸类)与 Alkalojdi(生物碱).

A. Shikimic acid & phenylpropionic acid derivattivi

Kompost	Eżempju 1	Eżempju 2	Eżempju 3
Aċidu isodanfenoliku B (异丹酚酸B)	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
Aċidu p-Hydroxyphenylpropionic (对羟基苯丙酸)	2,897,237.374	6,144,507.902	1,139,582.918
Aċidu Shikimic (莽草酸)	6,539,932.014	8,883,034.928	7,442,038.152
(2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-carboxy-2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethoxy]carbonyl-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-hydroxy-2,3-dihydrobenzofuran-4-yl]prop-2-enoyl]oxy-3-dihydroxyphenyl]oxy-3-dihydroxyphenyl aċidu	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
Benzoylacetone (苯甲酰丙酮)	4,235,952.540	4,526,539.189	4,297,281.060
Epipinoresinol 4′-O- -D-glukoside (表丁香树脂酚 4′-O{- -D-葡萄糖苷)	2,758,386.748	4,338,477.068	1,182,637.856
Yangmei Changshan glycoside* (杨梅常山苷)	713,259.014	9,202,359.822	841,791.016
Jionoside A1 (焦地黄苯乙醇苷A1)	2,184,856.679	3,736,929.302	3,098,713.743
Aċidu 3,4-Dimethylbenzoic (3,4-2甲基苯甲酸)	585,269.7562	1,386,349.28	1,400,433.204
Robustaside D	1,693,753.421	3,272,248.064	4,236,657.164
7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroxytetrahydropyran-2-il]oxymethyl]tetrahydropyran-2-yl]oxychromen-2-one	4,489,728.765	1,167,879.841	824,633.4

 

---

B. Alkalojdi

Kompost	Eżempju 1	Eżempju 2	Eżempju 3
Verticine (野百合碱)	1,306,481.28	524,919.97	4,057,704.757
Dihydrocoptisine (氢化可他宁碱)	6,406,217.365	9,533,850.521	4,649,410.535
Thymine (胸腺嘧啶)	2,658,397.084	2,715,160.269	554,956.4602
Gelsemine (钩吻碱)	3,698,263.919	1,554,195.385	5,144,366.562
Yohimbine (育亨宾)	3,929,806.438	1,286,932.427	9,431,924.132

aċidu isodanfenoliku B,

aċidu p-hydroxyphenylpropionic,

(2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-carboxy-2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethoxy]carbonyl-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-hydroxy-2,3-dihydrobenzofuran-4-yl]prop-2-enoyl]oxy-3-dihydroxyphenyl]oxy-3-dihydroxyphenyl acid

benzoylacetone,

epipinoresinol 4′-O- -D-glukoside,

glycoside relatat mal-myricetin (kif elenkat),

jionoside A1,

aċidu 3,4-dimethylbenzoic,

robustaside D,

7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroxytetrahydropyran-2-il]oxymethyl]tetrahydropyran-2-yl]oxychromen-2-one.

Fiha wkoll 5 alkalojdi, inklużi:

vertiċina,

dihydrocoptisine (kif elenkat),

timina,

alkaloid relatat mal-ġelsemine (kif elenkat),

yohimbine.

[0080] Ibbażat fuq riżultati komparattivi ta 'proliferazzjoni/attività ALP, analiżi ta' phenylethanoid glycoside, u profiling kimiku, jista 'jiġi konkluż li phenylethanoid glycosides (echinacoside u acteoside), shikimic/phenylpropionic acids, alkalojdi, u terpenoids kompożizzjoni speċifika ta' l-estratt, li jikkostitwixxu l-eżempju konsistenti ta ' l-estratt tiddependi b'mod konġunt. (12.5-25 ug/mL) tul il-proliferazzjoni, id-divrenzjar u l-mineralizzazzjoni, li tippermetti effetti stabbli li jsostnu d-densità tal-għadam.

[0081] Tabella 2: valuri ta' rispons tal-komponenti.
[0082] L-invenzjoni, permezz tal-proċess tal-Eżempju 2, tipprovdi estratt ta 'Cistanche b'echinacoside totali + acteoside > 25% u aċidi u alkalojdi shikimic/phenylpropionic arrikkit, li jippermettu effetti stabbli ta' appoġġ tad-densità tal-għadam. Fi żmien 12.5-25 ug/mL, jippromwovi l-proliferazzjoni, id-divrenzjar u l-mineralizzazzjoni ta 'MC3T3-E1 b'mod li jsaħħaħ id-doża b'korrelazzjoni ta' doża konsistenti, li jappoġġja riżultati aħjar u aktar stabbli tas-saħħa tal-għadam u li jippermetti l-użu fi prodotti relatati mat-titjib tad-densità minerali tal-għadam.