Cistanche Deserticola Polysaccharide itattenwa l-osteoklastoġenesi u r-riassorbiment ta' l-għadam permezz ta' l-inibizzjoni tas-sinjalar RANKL u l-produzzjoni ta' speċi ta' ossiġenu reattiv

Kuntatt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dezhi Song et al

L-osteoporożi hija marda metabolika kkaratterizzata minn osteopenja u deterjorazzjoni mikrostrutturali tal-għadam. L-osteoklasti huma ċ-ċelloli primarji effetturi li jiddegradaw il-matriċi tal-għadam u l-funzjoni anormali tagħhom twassal għall-iżvilupp tal-osteoporożi. L-akkumulazzjoni ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS) matul il-metaboliżmu ċellulari tippromwovi l-proliferazzjoni u d-differenzjazzjoni tal-osteoklasti, għalhekk, għandhom rwol importanti fl-osteoporożi.Cistanchedeserticolapolisakkarid(CDP) jippossjedi attività antitumorali, anti-infjammatorja u antiossidanti. Madankollu, l-impatt tas-CDP fuq l-osteoklasti mhuwiex ċar. F'dan l-istudju, it-tbajja' tal-aċidu fosfatażi reżistenti għat-tartrat, l-immunofluworexxenza, ir-reazzjoni tal-katina tal-polimerażi tat-traskrizzjoni inversa, u l-analiżi tal-western blot ġew utilizzati biex juru li CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)osteoklastoġenesi inibita u assorbiment mill-ġdid ta 'hydroxyapatite. Barra minn hekk, CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)inibixxi wkoll l-espressjoni ta 'ġeni markaturi osteoclast inklużi Ctsk, Mmp9, u Acp5, u ma kellu l-ebda effett fuq l-attivatur tar-riċettur tal-espressjoni tal-fattur nukleari κB (RANK). Analiżi mekkanistiċi wrew li CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)iżid l-espressjoni ta 'enzimi antiossidanti biex ittaffi l-produzzjoni ta' ROS medjata minn RANKL fl-osteoklasti u jinibixxi l-fattur nukleari ta 'ċelluli T attivati ​​u attivazzjoni ta' protein kinase attivata minn mitoġenu. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li CDP jista 'jirrappreżenta mediċina kandidata għat-trattament tal-osteoporożi kkawżata minn attività eċċessiva tal-osteoklasti.

KELMI EWLENINassorbiment mill-ġdid tal-għadam,Cistanchedeserticolapolysaccharide, MAPK, osteoclast, speċi ta 'ossiġnu reattiv

bodybuilding cistanche

1|INTRODUZZJONI

Il-bilanċ bejn il-formazzjoni tal-għadam, medjat mill-osteoblasts, u r-risorbiment tal-għadam, medjat mill-osteoclasts, għandu rwol vitali fiż-żamma tal-omeostasi metabolika tal-għadam (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Meta l-assorbiment mill-ġdid tal-għadam jaqbeż il-formazzjoni tal-għadam, isseħħ l-osteoporożi, li hija kkaratterizzata minn tnaqqis fil-massa tal-għadam u ħsara mikrostrutturali tal-għadam (Ikeda, 2008). L-osteoporożi hija marda komuni f'individwi anzjani u nisa wara l-menopawża u l-patoġenesi tagħha ma ġietx spjegata għal kollox (Cooper & Melton, 1992). Id-defiċjenza tal-estroġenu hija kawża primarja tal-osteoporożi (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). Barra minn hekk, speċi reattivi tal-ossiġnu (ROS) jistgħu jiġu indotti minn attivatur tar-riċettur tal-ligand tal-fattur nukleari κB (RANKL) u huma assoċjati mal-formazzjoni tal-osteoklasti (Yip et al., 2005), u għalhekk jistgħu jikkontribwixxu għall-iżvilupp tal-osteoporożi (Manolagas, 2010). Xi studji sabu li n-nuqqas ta' Nrf2-antiossidant iżid il-livelli ta' ROS u jippromwovi d-differenzazzjoni osteoclast indotta minn RANKL (Hyeon, Lee, Yang, & Jeong, 2013). Għalhekk, it-tnaqqis tal-produzzjoni ta 'ROS waqt id-divrenzjar ta' l-osteoklasti għandu jiġi evalwat bħala strateġija terapewtika għat-trattament ta 'l-osteoporożi.

L-osteoklasti huma derivati ​​minn nisel ematopojetiku tal-monoċiti jew tal-makrofagi u huma l-uniċi ċelloli multinukleati li jwettqu assorbiment mill-ġdid tal-għadam (Teitelbaum, 2000). Għalhekk, ir-riċerka li tinvolvi l-formazzjoni tal-osteoklasti hija ta’ sinifikat kbir fl-iżvilupp ta’ trattamenti effettivi għall-mard tal-metaboliżmu tal-għadam (Lorenzo, 2017). Fattur li jistimula l-kolonji tal-makrofagi (M-CSF) u RANKL, prodotti minn osteoblasti u ċelluli T attivati, huma ċitokini importanti li jirregolaw l-osteoklastoġenesi (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL jinduċi l-espressjoni ta 'fattur nukleari ta' ċelluli T attivati ​​(NFATc1), li huwa fattur ta 'traskrizzjoni kritiku attiv matul il-formazzjoni tal-osteoklasti (Ishida et al., 2002). NFATc1 attivat jippromwovi l-espressjoni ta 'ġeni markaturi tal-osteoclast bħal tartrate-resistant acid phosphatase (TRAcP) u cathepsin K (CTSK) li jirregolaw l-osteoclastogenesis u l-funzjoni tal-osteoclast (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008).

Cistanchedeserticolapolisakkarid(CDP) huwa iżolat miż-zkuk imlaħħam ta 'Cistancheu jippossjedi regolazzjoni immuni, antitumorali, antiaging, u effetti farmakoloġiċi oħra (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)kellu effett inibitorju fuq il-produzzjoni ta 'nitric oxide (NO) indotta minn lipopolysaccharide fiċ-ċelloli mikrogliali tal-ġrieden (ċelluli BV-2; Nan et al., 2013). Barra minn hekk, estratt b'ħafna feniletanojdi (ECD) ta'Cistanchetejbet il-kapaċità tal-għawm tal-ġrieden billi tnaqqas il-ħsara fil-muskoli, ittardja l-akkumulazzjoni tal-aċidu lattiku, u tejbet il-ħażna tal-enerġija (Cai et al., 2010). Madankollu, l-effetti ta' CDP fuq il-funzjoni u l-attività ta' l-osteoklasti għadhom mhux magħrufa.

F'dan l-istudju, aħna wrejna li CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)jinibixxi d-differenzjazzjoni tal-osteoclast indotta minn RANKL u l-assorbiment mill-ġdid tal-għadam. Il-mekkaniżmu sottostanti kien dak is-CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)isaħħaħ l-espressjoni ta 'enzimi antiossidanti biex attenwaw il-produzzjoni ta' ROS, u mbagħad trażżan kaskati ta 'sinjalazzjoni ta' NFAT attivat minn RANKL u protein kinase attivat minn mitoġenu (MAPK). Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)jista' jintuża biex jikkura l-osteoporożi kkawżata minn riassorbiment eċċessiv ta' l-għadam osteoklastiku.

maca ginseng cistanche

2|MATERJALI U METODI

2.1|Materjali

CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)(purità> 98 fil-mija) inxtrat minn Solarbio (Beijing, iċ-Ċina) u ppreparat f'konċentrazzjoni ta 'ħażna ta' 1 mM f'salina buffered bil-fosfat (PBS). L-antikorpi huma speċifiċi għal c‐Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, fosforilati (p)‐ERK, p‐p38, p‐JNK, u ‐actin inkisbu minn Santa Cruz Biotechnology (San Jose, CA). Antikorpi għal V-ATPase d2 ġew prodotti kif deskritt qabel (H. Feng et al., 2009). Is-3‐(4,5‐dimethylthiazol‐2‐yl)‐5‐(3‐carboxymethoxyphenyl)‐2‐(4‐sulfophenyl)‐2H‐tetrazolium (MTS) u s-sistema ta’ analiżi tal-luċiferażi nkisbu minn Promega (Sydney, l-Awstralja) . M-CSF rikombinanti nxtara minn R&D Systems (Minneapolis, MN). Proteina GST-rRANKL rikombinanti ġiet espressa u purifikata kif deskritt qabel (Xu et al., 2000).

2.2|Kultura taċ-ċelluli

Ċelloli RAW264.7 (ċelluli makrofaġi tal-ġrieden) inkisbu minn American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) u kkultivati ​​f'mezz essenzjali minimu ‐modifikat (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Awstralja) supplimentat b'10 fil-mija serum bovin tal-fetu, 2 mM ta’ L‐glutamine, 100 U/ml ta’ peniċillina, u 100 ug/ml ta’ streptomycin (medju komplet). Monoċiti derivati ​​mill-mudullun (BMMs) ġew iżolati minn ġrieden C57BL/6J ta’ 6 ġimgħat, li ġew ewtanizzati skont proċeduri approvati mill-Kumitat tal-Etika tal-Annimali tal-Università ta’ Western Australia (RA/3/100/1244). L-għadam twil ġie mqassam mingħajr tessuti rotob u l-mudullun kien imlaħlaħ mill-wirk u t-tibja, li mbagħad ġie kkultivat f'medju sħiħ fil-preżenza ta 'M-CSF (50 ng/ml).

2.3|Assaġġ tal-osteoklastoġenesi

BMMs ġew ibbanjati fi pjanċi ta’ kultura ta’ 96-bir f’densità ta’ 6 × 103 ċelluli għal kull bir u ttrattati b’medja kompluta li fiha M-CSF (50 ng/ml) u GST-rRANKL (100 ng/ml), fil-preżenza jew assenza ta' konċentrazzjonijiet li jvarjaw ta' CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>tliet nuklei) ġew identifikati bħala osteoklasti.

2.4|Assays taċ-ċitotossiċità

Il-BMMs ġew miżrugħa fi pjanċi ta '96-bir f'6 × 103 ċelluli għal kull bir u tħallew matul il-lejl biex jaderixxu. L-għada, iċ-ċelloli ġew inkubati b'konċentrazzjonijiet varji ta 'CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid). Wara 48 siegħa oħra, is-soluzzjoni MTS (20 µl/bir) ġiet miżjuda u inkubata maċ-ċelloli għal 2 sigħat. L-assorbanza f'490 nm ġiet iddeterminata b'qarrej tal-mikroplate (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2.5|Tbajja immunofluworexxenti

BMMs ġew miżrugħa f'densità ta '6 × 103 ċelluli għal kull bir fil-preżenza ta' M-CSF (50 ng / ml) matul il-lejl. Iċ-ċelloli mbagħad ġew stimulati b'M-CSF u GST-rRANKL (100 ng/ml) sakemm iffurmaw osteoklasti maturi. L-osteoklasti mbagħad ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)għal 48 siegħa qabel ma jiġi ffissat b'4 fil-mija paraformaldehyde, permeabilizing bi 0.1 fil-mija Triton X‐100-PBS, u jimblokka bi 3 fil-mija albumina tas-serum bovin f'PBS. Ċelloli ppreparati ġew inkubati b'phalloidin konjugat b'rhodamine għal 45 minuta fid-dlam biex tebgħa għal F-actin. Iċ-ċelloli mbagħad ġew maħsula b'PBS, nuklei kontrotebba b'4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), u mmuntati b'coverslips għal mikroskopija konfokali.

esperjenza cistanche

2.6|Assaġġ ta' assorbiment mill-ġdid ta' Hydroxyapatite

Biex titkejjel l-attività ta' l-osteoklasti, il-BMMs (1 × 105 ċelluli kull bir) ikkultivati ​​fuq pjanċi miksija bil-kollaġen b'sitt-bir (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) ġew stimulati b'GST-rRANKL (100 ng/ml) u M-CSF (50 ng/ ml) sakemm ġew iġġenerati osteoklasti maturi (Zhou et al., 2016). Iċ-ċelloli mbagħad inqalgħu bil-mod mill-pjanċa bl-użu ta 'soluzzjoni ta' dissoċjazzjoni taċ-ċelluli (Sigma-Aldrich) u numri ugwali ta 'osteoclasts maturi ġew miżrugħa fuq bjar individwali fi pjanċi 96-well miksija b'hydroxyapatite (Corning Osteoassay, Corning, NY). Osteoklasti maturi ġew inkubati f'mezz li fih GST-rRANKL u M-CSF bi jew mingħajr CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)fil-konċentrazzjonijiet indikati. Wara 48 siegħa, nofs il-bjar kienu mtebbgħin b'mod immunoistokimiku għall-attività TRAcP, kif deskritt hawn fuq, biex jiġi vvalutat in-numru ta 'ċelluli multinukleati għal kull bir. Il-bjar li kien fadal ġew ibbliċjati għal 10 minuti biex jitneħħew iċ-ċelloli u jippermettu l-kejl taż-żoni risorbiti. Żoni risorbiti ġew fotografati taħt mikroskopija tad-dawl standard u s-softwer Image J (Istituti Nazzjonali tas-Saħħa, Bethesda, MD) intuża biex jikkwantifika l-erja perċentwali tal-wiċċ hydroxyapatite resorbed mill-osteoclasts.

2.7|Assays ta' reporter ta' Luciferase

Biex tiġi investigata l-attivazzjoni tat-traskrizzjoni NFATc1, iċ-ċelloli RAW264.7 ġew trasfettati b'mod stabbli b'kostruttur ta' reporter luciferase li jirrispondu għal NFATc1 (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Ċelloli trasfettati ġew ikkultivati ​​fi pjanċi ta’ 48 bir f’densità ta’ 1.5 × 105 ċelluli għal kull bir u ttrattati minn qabel b’diversi konċentrazzjonijiet ta’ CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)għal 1 siegħa. Wara t-trattament minn qabel, iċ-ċelloli ġew stimulati b'GST-rRANKL (100 ng/ml) għal 24 siegħa, u l-attività tal-luċiferażi ġiet imkejla bl-użu tas-sistema ta 'assaġġ ta' reporter luciferase skont il-protokoll tal-manifattur (Promega).

2.8|Analiżi kwantitattiva tar-reazzjoni tal-katina tal-polimerażi tat-traskrizzjoni inversa (RT-PCR).

L-RNA totali ġie iżolat miċ-ċelloli bl-użu tar-reaġent Trizol skont il-protokoll tal-manifattur (Thermo Fisher Scientific). Id-DNA komplementari ġie sintetizzat bl-użu ta 'reverse transcriptase tal-virus tal-lewkimja murina Moloney b'1 ug ta' mudell RNA u primers oligo-dT. L-amplifikazzjoni tar-reazzjoni tal-katina tal-polimerażi ta’ sekwenzi speċifiċi twettqet bl-użu tal-programm li ġej: 94 grad għal 5 min, segwit minn 30 ċiklu ta’ 94 grad għal 40 s, 60 grad għal 40 s, u 72 grad għal 40 s, u pass ta’ estensjoni finali ta’ 5 min f'72 grad. L-informazzjoni dettaljata ta 'primers speċifiċi hija murija fit-Tabella 1. Il-livelli relattivi ta' RNA ta 'messaġġier ġew ikkalkulati permezz ta' normalizzazzjoni għall-espressjoni tal-ġene ta 'housekeeping Hmbs.

2.9|Analiżi Western blot

Il-BMMs ġew ikkultivati ​​f'medju sħiħ b'M-CSF fi pjanċi ta 'sitt reċipjenti u stimulati b'GST-rRANKL (100 ng / ml) għall-ħinijiet iddikjarati. Iċ-ċelloli ġew lysed f'radjuimmunoprecipitation lysis buffer u l-proteini ġew solvuti permezz ta 'elettroforesi tal-ġel tas-sodju dodecyl sulfate-polyacrylamide u trasferiti għal membrani tal-poly(vinylidene fluoride) (GE Healthcare, Silverwater, Awstralja). Il-membrani ġew imblukkati f'5 fil-mija ħalib xkumat għal siegħa u mbagħad ittestjati b'diversi antikorpi primarji speċifiċi bi tħawwad ġentili matul il-lejl f'4 gradi. Il-membrani ġew maħsula u sussegwentement inkubati b'antikorpi sekondarji konjugati bil-perossidasi tar-ravanell. Ir-reattività tal-antikorpi mbagħad ġiet skoperta b'reaġent kimiluminixxenti mtejjeb (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) u viżwalizzat b'Image‐quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2.10|Sejbien ta' ROS intraċellulari

Livelli ta 'ROS intraċellulari ġew skoperti bl-użu ta' 2',7'-dichlorofluorescein diacetate ċellulari ROS detection assay kit (Abcam, Melbourne, Awstralja). BMMs (5 × 103 ċelluli kull bir) ġew ikkultivati ​​fi pjanċi 96-well u ttrattati b'RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml), u CDP għal 72 siegħa. Il-livelli ta 'ROS intraċellulari ġew imkejla bl-użu ta' 2',7'-dichlorofluorescein diacetate, li jossidizza f'DCF fluworexxenti fil-preżenza ta 'ROS. Iċ-ċelloli ġew maħsula fil-buffer ta' Hank u inkubati fid-dlam għal 30 min b'10 µM ta' DCFH-DA. Immaġini nkisbu bl-użu ta 'mikroskopija konfokali.

2.11|Analiżi statistiċi

Id-dejta kollha hija rappreżentattiva ta' mill-inqas tliet esperimenti mwettqa fi tliet kopji sakemm ma jkunx indikat mod ieħor. Id-dejta hija espressa bħala medja ± SD. Analiżi f'direzzjoni waħda tal-varjanza segwita minn testijiet post hoc ta' Student–Newman–Keuls intużaw biex jiddeterminaw is-sinifikat tad-differenzi bejn ir-riżultati, b'p < 0.05="" meqjusa="" bħala="">

3|RIŻULTATI

3.1|CDP jinibixxi l-osteoklastoġenesi indotta minn RANKL u l-fużjoni tal-osteoklasti

Biex tiddetermina jekk CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)jista 'jrażżan il-formazzjoni ta' osteoklasti indotta minn RANKL, l-ewwel għamilna assay ta 'osteoklastoġenesi bl-użu ta' BMMs tal-ġrieden (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). BMMs ġew ittrattati b'RANKL u M-CSF għal 5 ijiem b'konċentrazzjonijiet dejjem jiżdiedu ta' CDP. CDP naqqas in-numru ta 'ċelluli multinukleati pożittivi għal TRAcP meta l-konċentrazzjoni ta' CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)laħaq 5 µM jew ogħla (Figura 1a,b). Biex tevalwa CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)tossiċità u jikkonfermaw li dawn ir-riżultati ma kinux riflessjoni ta 'mewt taċ-ċelluli jew numru, wettaqna assaġġ MTS. BMMs ġew ittrattati b'RANKL u M-CSF għal 48 siegħa b'dożi varji ta' CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid). CDP ma kellu l-ebda effett fuq il-proliferazzjoni tal-BMM fil-konċentrazzjoni ta '15 µM jew inqas (Figura 1c).

Biex tittestja l-effetti tas-CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)fuq il-fużjoni ta' l-osteoklasti, l-osteoklasti ġew indotti bi trattament ta' RANKL u M-CSF, b'dożi differenti ta' CDP jew mingħajru(Cistanchedeserticolapolisakkarid). L-osteoklasti kienu mtebbgħin b'rhodamine‐phalloidin u DAPI biex jiġi vvalutat in-numru ta 'nuklei għal kull osteoklasti (Figura 2a). Kemm in-numru ta' osteoklasti kif ukoll in-numru medju ta' nuklei għal kull osteoklasti naqsu wara CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)trattament (5-10 µM; Figura 2b,c). Għalhekk, CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)kellu effetti inibitorji fuq l-osteoklastoġenesi indotta minn RANKL u l-fużjoni tal-osteoklasti b'mod dipendenti fuq id-doża.

3.2|CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)inaqqas l-attività ta' assorbiment mill-ġdid ta' hydroxyapatite osteoklastiku indotta minn RANKL

Twettaq analiżi ta' assorbiment mill-ġdid ta 'hydroxyapatite biex jinstab l-effett ta' CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)fuq il-funzjoni tal-osteoklasti (Figura 3a). Wara inkubazzjoni ta’ 24 siegħa, in-numru ta’ osteoklasti għal kull bir ma nbidilx filwaqt li ż-żona ta’ riassorbiment ta’ hydroxyapatite naqset b’mod sinifikanti bi trattament b’5 u 10 µM CDP meta mqabbla ma’ gruppi ta’ kontroll (Figura 3b,c). Dawn ir-riżultati juru li CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)għandu effetti inibitorji qawwija kemm fuq il-formazzjoni tal-osteoklasti kif ukoll fuq l-attività ta 'assorbiment mill-ġdid tal-osteoklasti mingħajr ebda effetti ċitotossiċi.

3.3|CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)jinibixxi l-espressjoni tal-ġene marker osteoclast

Biex tinvestiga aktar l-effetti inibitorji tas-CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)fuq l-osteoklastoġenesi u l-assorbiment mill-ġdid tal-għadam osteoklastiku, BMMs ġew ittrattati b’RANKL u M-CSF għal 5 ijiem b’konċentrazzjonijiet differenti ta’ CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid). Imbagħad saret RT-PCR biex tiskopri l-espressjoni tal-ġeni markaturi tal-osteoclast. L-espressjoni ta 'Nfatc1, fattur ta' traskrizzjoni kruċjali matul l-osteoklastoġenesi, ġiet inibita minn CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)b'mod dipendenti mid-doża (Figura 4a). Barra minn hekk, CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)(5 u 10 µM) irregolaw l-espressjoni ta 'ġeni relatati mar-riassorbiment tal-għadam, inklużi Mmp9, Ctsk, u Acp5 (Figura 4b–d).

3.4|CDP irażżan l-attività NFATc1 u l-espressjoni tal-proteini downstream

Biex teżamina l-effett tas-CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)fuq l-attività NFATc1 indotta minn RANKL, sar assaġġ ta' reporter luciferase. Trattament b'CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid), f'konċentrazzjonijiet ta '5 µM u ogħla, inibit b'mod sinifikanti l-attività NFATc1 indotta minn RANKL (Figura 5a). Barra minn hekk, l-analiżi tal-western blot wriet li CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)soppressa b'mod sinifikanti l-espressjoni tal-proteina ta 'NFATc1 u c-Fos f'BMMs ittrattati b'RANKL u M-CSF għal 3 u 5 ijiem (Figura 5b). Barra minn hekk, l-espressjoni ta 'proteini relatati mal-funzjoni tal-osteoclast, bħal V-ATPase-d2 u CTSK, kienet irregolata fil-preżenza ta' CDP.(Cistanchedeserticolapolisakkarid)meta mqabbla ma' gruppi ta' kontroll. Madankollu, CDP ma kellu l-ebda effett fuq l-espressjoni RANK (Figura 5b).

3.5|CDP jippromwovi l-espressjoni ta 'enzimi antiossidanti biex ineħħi l-produzzjoni ta' ROS waqt l-osteoklastoġenesi indotta minn RANKL

Biex jiġi esplorat il-mekkaniżmu sottostanti tal-inibizzjoni tal-osteoklastoġenesi li tiddependi fuq CDP, il-BMMs ġew ittrattati b'RANKL (100 ng/ml) u M-CSF (50 ng/ml) flimkien ma' PBS jew CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)għal 72 siegħa. Aħna eżaminajna l-effett ta 'CDP fuq il-produzzjoni intraċellulari ta' ROS stimulata minn RANKL. Il-livelli ta 'ROS intraċellulari żdiedu bit-trattament RANKL, li kien attenwat minn CDP (5 u 10 µM; Figura 6a). Kemm in-numru ta 'ċelluli pożittivi ROS kif ukoll l-intensità tat-tbajja' ROS tnaqqsu permezz ta' trattament CDP b'mod dipendenti fuq id-doża (Figura 6b, c). Analiżi Western blot wriet li CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)ippromwova l-espressjoni ta 'thioredoxin (TRX1) u glutathione reductase (GSR) filwaqt li irażżan l-espressjoni ta' nitric oxide synthase inducible (NOS2) f'BMMs li ġew ittrattati b'RANKL u M-CSF għal 3 ijiem (Figura 6d).

Biex tesplora aktar jekk CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)soppressa d-divrenzjar tal-osteoklasti billi naqqas il-produzzjoni ta 'ROS, aħna mbagħad ittrattati BMMs b'perossidu (10 µM) biex nimitaw l-istatus għoli ta' ROS fiċ-ċelloli. BMMs ġew indotti minn RANKL u M-CSF għal 3 ijiem u r-riżultati tal-analiżi tal-western blot u RT-PCR urew li l-perossidu ippromwova l-espressjoni ta 'NFATc1 u c-Fos meta mqabbel mal-gruppi ta' kontroll. B'mod konsistenti mar-riżultati fil-Figura 5, l-espressjoni ta 'NFATc1 u c-Fos ġiet imrażżna minn CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)filwaqt li l-perossidu salva l-effett inibitorju ta 'CDP (Figura 6e, f). Din id-dejta indikat li CDP irażżan l-espressjoni ta 'NFATc1 u c-Fos billi neħħi l-produzzjoni ta' ROS.

3.6|CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)trażżan il-mogħdijiet MAPK waqt l-osteoklastoġenesi indotta minn RANKL

Sussegwentement, investigajna l-effett tas-CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)trattament fuq espressjoni TRAF6 medjata minn RANKL u attivazzjoni tal-mogħdija MAPK. Wara l-inkubazzjoni f'medja ħielsa mis-serum għal 2 sigħat, il-BMMs ġew stimulati b'RANKL, bi jew mingħajr CDP, għal 60 min. Stimulazzjoni b'CDP (10 µM) ma kellha l-ebda effett fuq l-espressjoni ta 'TRAF6 u fosforilazzjoni attenwata ta' JNK2 u ERK1/2 f'10 u 20 min (Figura 7). Barra minn hekk, il-fosforilazzjoni ta 'p38 kienet inibita b'mod sinifikanti minn CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)trattament ta '60 min meta mqabbel ma' gruppi ta 'kontroll (Figura 7). Din id-dejta tiżvela li CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)irażżan il-mogħdijiet tas-sinjalar MAPK indotti minn RANKL, konsistenti mal-effett inibitorju tiegħu fuq il-formazzjoni u l-attività tal-osteoklasti.

4|DISKUSSJONI

Cistanche, magħruf bħala "ġinseng tad-deżert," reċentement ġibed ħafna attenzjoni għall-abbiltà tiegħu li jimmodula l-immunità u jaġixxi b'mod protettiv matul ix-xjuħija u stress ossidattiv (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). Glikożidi sostitwiti minn Phenylpropanoid, il-komponenti attivi ewlenin ta 'Cistanche, intwerew li jinibixxu NO attività fil-makrofaġi (Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017). Barra minn hekk, aCistancheestratt naqqas l-istress ossidattiv f'mijokardju riperfuż wara iskemija u kellu rwol sinifikanti fl-inibizzjoni ta 'mogħdijiet apoptotiċi li jwasslu għal kardjoprotezzjoni (Yu, Li, & Cao, 2016). Bħala komponent importanti ta 'Cistanche, CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)għandu varjetà ta 'funzjonijiet farmakoloġiċi. L-istudju attwali tagħna sab li s-CDP irażżan id-divrenzjar u l-attivazzjoni tal-osteoclast attivati ​​minn RANKL billi attenwaw il-produzzjoni ta 'ROS kif ukoll l-attivazzjoni ta' NFAT u MAPK.

Bħala fosfatażi aċiduża, TRAcP jeżisti f'varjetà ta 'ċelluli u huwa abbundanti fl-osteoklasti u makrofaġi alveolari (Snipes, Lam, Dodd, Gray, & Cohen, 1986). TRAcP hija enzima karatteristika tal-osteoklasti u l-espressjoni tagħha hija relatata mill-qrib mal-funzjoni tal-osteoklasti, meqjusa bħala indikatur tal-attività tal-osteoklasti u r-riassorbiment tal-għadam (Minkin, 1982). Fl-istudju tagħna, CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)inibixxi n-numru ta’ ċelloli pożittivi għal TRAcP, li jindika li l-osteoklastoġenesi indotta minn RANKL kienet imblukkata minn CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid). Id-degradazzjoni tal-matriċi tal-għadam mill-osteoklasti tiddependi fuq cathepsin K (CTSK) u MMPs (Gruber, 2015). Hawnhekk, CDP irregola b'mod sinifikanti l-espressjoni ta 'ġeni funzjonali tal-osteoclast bħal Mmp9, Ctsk, u Acp5.

Id-divrenzjar u l-funzjoni tal-osteoklasti huma rregolati minn mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni multipli (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). Wara li jorbot ma' RANK, RANKL jirrekluta l-proteina tal-adapter TRAF6 biex jattiva l-espressjoni ta' NFATc1, li hija fattur importanti ta' traskrizzjoni għall-formazzjoni tal-osteoklasti, li taffettwa l-espressjoni tal-ġene speċifika għall-osteoklasti, inklużi TRAcP u CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). F'dan l-istudju, sibna li CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)ma kellu l-ebda effett fuq l-espressjoni ta' RANK u TRAF6 fl-osteoklasti. Madankollu, CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)inibit l-attivazzjoni NFATc1 indotta minn RANKL waqt l-osteoklastoġenesi tal-BMMs. Barra minn hekk, intwera li ROS, prodott mill-mitokondrija fil-proċess ta 'twassil ta' elettroni, ippromwova l-proliferazzjoni u d-divrenzjar ta 'osteoclasts u d-degradazzjoni regolata tal-matriċi tal-għadam (Ha et al., 2004). Studju reċenti sab li RANKL indotta l-importazzjoni nukleari Bach1 u attenwat il-produzzjoni ta 'enżimi antiossidanti medjata minn Nrf2, u b'hekk żied l-espressjoni intraċellulari ta' ROS u l-osteoklastoġenesi fil-ġrieden (Kanzaki et al., 2017). Barra minn hekk, żieda fil-ġenerazzjoni ta 'ROS intraċellulari permezz ta' homocysteine ​​tejbet il-formazzjoni u l-attività ta 'osteoclast (Koh et al., 2006). L-istudju tagħna sab li CDP naqqas l-akkumulazzjoni ta 'ROS fl-osteoclasts billi jinibixxi l-espressjoni ta' NOS2 u jippromwovi l-espressjoni ta 'enzimi antiossidanti, bħal TRX1 u glutathione reductase. Meta kkurajna BMMs bil-perossidu biex intejbu l-akkumulazzjoni ta 'ROS intraċellulari, ir-riżultati li ROS miżjuda setgħu jtejbu l-espressjoni ta' NFATc1 wrew li ROS kien upstream ta 'NFATc1. Sibna wkoll li l-perossidu salva l-effett inibitorju ta 'CDP fuq l-espressjoni NFATc1. Għalhekk, id-dejta tagħna tissuġġerixxi li CDP irażżan l-akkumulazzjoni ta 'ROS biex jinibixxi l-espressjoni NFATc1, imbagħad biex trażżan il-formazzjoni u l-funzjoni tal-osteoclast.

ERK, JNK, u p38 jappartjenu għall-familja MAPK, li hija wkoll involuta fir-regolamentazzjoni tad-divrenzjar tal-osteoklasti (Seger & Krebs, 1995). RANKL jattiva l-mogħdija MAPK billi żżid il-fosforilazzjoni ta 'ERK, JNK, u p38 (Mizukami et al., 2002). Aħna wrejna li CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)irażżan il-fosforilazzjoni medjata minn RANKL ta 'proteini ewlenin fil-mogħdija MAPK, u b'hekk ikkontribwixxa għall-effett inibitorju ta' CDP fuq l-espressjoni ta 'ġeni markaturi osteoclast. Sa fejn nafu, dan huwa l-ewwel studju li juri l-effetti inibitorji tas-CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)fuq il-produzzjoni ROS, NFAT, u attivazzjoni MAPK, li jirrappreżentaw mekkaniżmi ġodda ta 'azzjoni ta' CDP in vitro.

Fil-qosor, aħna wrejna li CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)jnaqqas l-osteoclastogenesis u l-assorbiment mill-ġdid ta 'hydroxyapatite, u l-espressjoni ta' ġeni markaturi osteoclast inklużi Ctsk, Mmp9, u Acp5. CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)kien kapaċi jrażżan il-produzzjoni ROS medjata minn RANKL, kif ukoll l-attivazzjoni NFAT u MAPK (Figura 8). B'mod kollettiv, ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu li CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)jista 'jirrappreżenta mediċina kandidata għat-trattament ta' kundizzjonijiet relatati mal-osteoklasti akkumpanjati minn produzzjoni żejda ta 'ROS.

FIGURA 8 Dijagramma skematika tas-CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)funzjoni fid-divrenzjar tal-osteoklasti. CDP(Cistanchedeserticolapolisakkarid)irażżan il-produzzjoni ta 'ROS indotta minn RANKL, kif ukoll l-attivazzjoni ta' NFATc1 u MAPK, u għalhekk jinibixxi l-osteoklastoġenesi. CDP,Cistanchedeserticolapolisakkarid; MAPK, protein kinase attivat minn mitoġenu; NFATc1, fattur nukleari taċ-ċellula T attivata; RANKL, attivatur tar-riċettur tal-ligand tal-fattur nukleari κB; ROS, speċi ta' ossiġnu reattiv [Il-figura tal-kulur tista' tara fuq wileyonlinelibrary.com]

RIKONOXXIMENTI

Dan l-istudju kien appoġġjat mill-Fondazzjoni tax-Xjenza tan-Natura taċ-Ċina (81572164), il-Programm Nazzjonali ta 'Riċerka u Żvilupp tat-Teknoloġija Ewlenin taċ-Ċina (2017YFC1103300), il-Fondazzjoni tax-Xjenza Naturali tal-Provinċja ta' Guangxi (2016GXNSFAA380295), u l-Proġett ta 'Riċerka tax-Xjenza u Teknoloġija tal-Università ta' Guangxi Provinċja (KY2015YB054). Huwa wkoll appoġġjat parzjalment minn Proġett ta' Pjan ta' Żvilupp tat-Teknoloġija u Riċerka Xjentifika ta' Guangxi (GKG13349003, 1598013‐15), Fond tal-Infrastruttura tar-Riċerka Medika u tas-Saħħa tal-Awstralja tal-Punent, Fondazzjoni Artrite Awstralja, Premjijiet ta' Kollaborazzjoni tar-Riċerka tal-Università tal-Awstralja tal-Punent (UWA), u l- Kunsill Awstraljan tas-Saħħa u tar-Riċerka Medika (NHMRC, Nri 1107828 u 1027932).

KONFLITTI TA' INTERESS

L-awturi jiddikjaraw li m'hemm l-ebda kunflitt ta' interess

Minn: 'Cistanchedeserticolapolisakkaridjnaqqas l-osteoklastoġenesi u r-risorbiment tal-għadam permezz tal-inibizzjoni tas-sinjalar RANKL u l-produzzjoni tal-ispeċi tal-ossiġnu reattiva minn Dezhi Song et al.

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674–9684