Effetti ta ' Cistanche Fuq newroni dopaminerġiċi Apoptożi Indotti min- newrotossina 1- methyl- 4 - Phenylpyridinium (MPP)

Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Tian Jiyu, Chen Jianzong

(Mediċina Tradizzjonali Ċiniża u Ċentru ta 'Riċerka Tal-Medica Ċiniż tal-Isptar Xijing, FMMU, Xi'an 710032)

Astratti

Oġġettivi: Biex tinvestiga l-effetti ta'Cistanche fuq iċ-ċellula tal-apoptożi tan-newroni dopaminerġiċi tal-kultura primarja kkawżata minn 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+).Metodu: Biex tipprepara s-serum tal-fenek magħmul minnCistanchejuża l-metodu ta' farmakoloġija fis-serum. Imbagħad assaġġ l-effetti ta ' Cistanche fuq iċ-ċellula ta ' l- apoptożi ta ' newroni DA minnMPP+mudelli indotti bl-użu ta' morfoloġika, ċitometrija tal-fluss, tbajja' TUNEL.Riżultat: Trattament ta '200μmol/ LMPP+għal 24 siegħa jew aktar indotti apoptożi fin-newroni DA. WaraMPP+ikkurat, il- proporzjon ta ' apoptożi tal- grupp li fih dożaġġ ekwivalenti tas- serum ta ' Cistanche huwa ta ' 6.MPP+ittrattat waħdu huwa 30.2%. In-numru ta' ċelloli tal-apoptożi tal-grupp B u C huwa inqas mill-grupp E b'mod sinifikanti (P<0.05).>Konklużjoni: Is-serum li jkun fihCistanchenewroni tal-apoptożi protetta DA indotti minnMPP+.

Kliem ewlieni：Cistanche;1-metil-4-phenylpyridinium(MPP+); newroni dopaminerġiċi; apoptożi

Fil-preżent, it-terapija ewlenija għalIl-marda ta' Parkinsonhija t- terapija ta ' sostituzzjoni ta ' preparazzjonijiet komposti ta ' levodopa (L- dopa), li ma jistgħux jikkontrollaw l- iżvilupp tal- marda. Hekk kif il-marda timxi 'l quddiem, id-dożaġġ jiżdied, u ġeneralment, fi żmien 3 sa 5 snin, l-effett kurattiv jonqos, is-sintomi tal-mutur ivarjaw, u jidhru diskinesija kkaġunati mill-mediċina. Studji reċenti sabu li L- dopa għandu l- effett li jinduċi apoptożi fuq newroni kkoltivati in vitro[1, 2], u mbagħad ġie propost li l- effett newrotossiku ta ' dopamine endoġenu jwassal għat- telf ta ' newroni dopaminerġiċi f'Il-marda ta' Parkinson. Waħda mir-raġunijiet [3]. Fil-prattika klinika fit-tul, użajna l-mediċina Ċiniża għal-it-tined tal-fwied u tal-kliewiflimkien ma ' preparazzjonijiet ta ' levodopa għall- kura tal- PD u kisbu riżultati tajbin [4- 6]. Dan l-esperiment esplora l-effett protettiv tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża fuq l-apoptożi tan-newroni dopaminerġiċi u l-mekkaniżmu tiegħu mil-livelli molekulari u ċellulari.

1. Materjali u metodi

1.1 Materjali

midjum tad-DMEM,1-metil-4-phenylpyridini um, MPP+, serum bovin tal-fetu mixtri mill-kumpanija Gibco.Cytarabine, poly-l-lysine, PLLinxtraw mingħand Sigma Company. Pjanċa tal-kultura ta '24 bir, 25cm2

Fliexken tal-kultura tal-plastikinxtraw mingħand NUNC Company.Il-mediċina Ċiniżakonna użati ġie mixtri minn Xi'an Decoction Piece Factory. L-annimali li użajna huma pprovduti miċ-ċentru tal-annimali tal-iskola.https://www.xjcistanche.com/products

1. 2 Preparazzjoni u raggruppament sperimentali ta ' serum medikat

Cistanche huwa ppreparat bħala trab imnixxef bil-friża għall-preservazzjoni u dilwit b'ilma distillat meta jintuża. Is-serum tal-annimali tħejja mill-fenek abjad ta 'widna kbira ta' New ZealandSerum, li kollha kienu rġiel b'saħħithom, li jiżnu 2.5-3.0 kg. Id-doża ekwivalenti ta' annimali tiġi kkonvertita skont l-erja tas-superfiċje tal-ġisem u maqsuma b'mod każwali f'serum tal-grupp ta' kontroll vojt; 1/2 doża ekwivalenti fis-serum tal-grupp (doża ta' gavage ta' materja mediċinali prima Cistanche 0.8g/kg); grupp ta' doża ekwivalentiSerum(Id-doża ta' gavage hija materjal mediċinali oriġinali ta' Cistanche cistanche 1.6g/kg); 2 darbiet id- doża ekwivalenti ta 'Serum(id-doża ta' gavage hija materjal mediċinali oriġinali ta' Cistanche 3.2g/kg). Gavage darbtejn kuljum għal total ta' 3 ijiem, siegħa wara l-aħħar gavage, trab tad-demm karotid, matul il-lejl f'4°C, ċentrifugazzjoni f'2500 r/min għal 25 minuta, separazzjoni bir-reqqa tas-serum, inattivazzjoni f'56°C għal 30 minuta, u ġbid minn 0.22μm membrana tal-filtru Iffiltra l-batterji u aħżen f'temperatura ta' -20°C. Taħt l-istess kondizzjonijiet, serum vojt ta' kontroll tal-fenek ġie ppreparat b'gavage b'volum ugwali ta' salina normali. L-esperiment kien maqsum f'5 gruppi. Il-Grupp A kien fenek vojtSerumil-grupp ta' kontroll tal-kultura; Il-Grupp B kienkultura tas-serum + MPPil-grupp ta' kura li fih darbtejn id-doża ekwivalenti; Il-Grupp C kienkultura tas-serum + MPPil-grupp ta' kura li fih doża ekwivalenti; Il- Grupp D kien grupp ta ' kontroll tal- kultura tas- serum li fih doża ekwivalenti ta ' 1/ 2 ta ' kultura tas- serum + grupp ta ' trattament MPP; Il-grupp E huwa kultura vojta tas-serum tal-fenek + grupp ta 'trattament MPP.

Benefiċċju cistanche

1.3 Kultivazzjoni ta 'newroni dopaminerġiċi midbrain

Tliet firien SD ta ' 14- il jum ta ' tqala ntgħażlu u nqatlu b' injezzjoni diretta ta ' emboliżmu ta ' l- arja fil- qalb; il-firien embrijoniċi ttieħdu taħt kundizzjonijiet asettiċi u tqiegħdu f'dixx petri mimli b'soluzzjoni silġ D-Hanks. It-tessut tal-moħħ tal-far tal-fetu ġie dissegwat u separat taħt stereomikroskopju. Il-metodu ta' referenza [7] tjieb ftit. Il-meninġi u t-tessut vaskulari tqaċċtu, u t-tessuti fiż-żoni A8, A9, u A10 tal-midbrain ventrali ġew separati. Żid 1mL ta '0.125% pankreatiċi u poġġiha f'inkubatur ta' 37 °C għal madwar 20 minuta, żid ammont xieraq ta 'mezz ta' kultura li fih 10% serum bovin tal-fetu biex ittemm id-diġestjoni, u uża l-aspirazzjoni

Għaddi b'pipetta t-tubu f'sospensjoni uniformi taċ-ċelloli, iċċentrifuga f'1500r/min għal 5 minuti f'temperatura ambjentali, neħħi b'attenzjoni s-supernatant, ippipetta 15-il darba b'pipetta b'għonq irqiq, u ħalliha toqgħod għal 5 minuti. Fil-pjanċa tal-kultura ta '24 bir ta' lysine, żid il-mezz ta 'kultura ma' kull bir biex taġġusta d-densità taċ-ċellula għal 2×105 ċelloli / mL, żid il-mezz tal-kultura għal 0.5mL għal kull bir, u żid cytarabine wara 3 ijiem ta 'kultura (il-konċentrazzjoni finali hija 10μmol / L), tinibixxi t-tkabbir ta' mhux newroni.

1.4 Tebgħa immunoċitokimiċi ta' tyrosine hydroxylase (TH)

Bl- użu tal- metodu SABC, id- dilwent ta ' l- antikorp fih albumina tas- serum bovin 1g / 100mL (Boster Company, Wuhan), 0. Il-kultura ntemmet fis-7 jum, maħsula bid-D-PBS għal 5min 3 darbiet, 4% paraformidid ippreparat frisk kien iffissat f'temperatura tal-kamra għal 30min u maħsul bid-D-PBS għal 5min 3 darbiet; b'1:1:8 perossidu tal-idroġenu, metanol u soluzzjoni PBS Inkuba għal 30 minuta f'temperatura ambjentali, laħlaħ b'D-PBS għal 5 minuti, żid 5% serum tal-mogħoż li jimblokka għal 30 minuta f'temperatura ambjentali, laħlaħ b'D-PBS għal 5 minuti, u żid antikorp TH tal-mogħoż kontra l-ġrieden dilwit b'dilwent ta' antikorpi (dilwizzjoni ta' 1:1000, Calbiochem), matul il-lejl f'4°C, laħlaħ b'D-PBS għal 3 minuti 3 darbiet, żid igG bijotinilat kontra l-firien dilwit b'dilwent ta' antikorpi (dilwit 1:200, Sigma USA), jaġixxi f'temperatura ambjentali għal 4 sigħat, laħlaħ b'D-PBS għal 3 minuti 3 darbiet, Żid il-kumpless HRP dilwit b'dilwent ta' antikorpi għal 2h f'temperatura ambjentali, u laħlaħ b'D-PBS għal 3min 3 darbiet. Laħlaħ id-dilwent tad-DAB għal 3 minuti, żid ir-reaġent kromoġeniku DAB lest biex tużah (Wuhan Boster Company) fiċ-ċelloli, u osserva l-kulur taħt mikroskopju maqlub.https://www.xjcistanche.com/

1.5 Trattament tal-mediċini

L-osservazzjonijiet morfoloġiċi tan-newroni kkoltivati twettqu taħt mikroskopju ta 'kuntrast ta' fażi kuljum u l-bidliet ġew irreġistrati b'ritratti. Wara l-kultura għal 12-il siegħa, iċ-ċelloli ġew osservati taħt mikroskopju maqlub u l-mediċini ġew miżjuda eżatt qabel il-konfluwenza. Il-kontenut tas-serum ta 'kull grupp kien 10%. Wara l-kultura għal 3 ijiem, MPP+ ġie miżjud mal-konċentrazzjoni finali ta' 200 μmol/L. Wara inkubazzjoni f'inkubatur ta' 37 °C, 5% tas-CO2 għal 24 siegħa, wettaq diversi spezzjonijiet.

Cistanche

1.6 Skoperta taċ-ċitometrija tal-fluss

It- trattament tad- droga kien l- istess bħal qabel. Wara li kull grupp ġie ttrattat, iċ-ċelloli aderenti tal-PC12 ġew diġeriti b'0.125% trypsin, u ċ-ċelloli ttieħdu madwar 1×106 PBS. Iċ-ċelloli nħaslu darbtejn, u 490 μL ta' buffer li jorbot ġie miżjud, u ċ-ċelloli kienu mħallta sewwa, u ġie miżjud 5 μL annexin V. FITC u 10μL ta' PI maħlul fis-sospensjoni taċ-ċellula, ħawwad bil-mod, poġġi t-tubu tat-test f'temperatura ta' 4 °C, inkuba għal 10 min fid-dlam, u ttestja fuq iċ-ċitometru tal-fluss COULTER EPICS (Beckman Coulter, l-Istati Uniti).

1.7 Tikkettar fit-tarf in situ (TUNEL) biex tinstab l-apoptożi taċ-ċelloli

It-tikkettar tat-tarf in situ tad-DNA ta 'newroni kkoltivati juża l-kit ta' skoperta ta 'apoptożi ta' Boster (MK1022), u l-passi huma kif ġej: Ħu ċ-ċelloli newroni dopaminerġiċi ta 'kull grupp wara trattament MPP + (il-pjastra qabel ma l-kultura primarja tkun ikkultivata minn qabel bi trattament ta' polimeru Lysine), iffissat b'40g / L paraformaldehyde għal 1h, frisk 3% aċidu aċetiku (pH2.5) f'temperatura tal-kamra għal 10min, innewtralizza l-fosfatażi alkalina, żid 0.1mol/L TBS (pH7.5 ) 1:200 diġestjoni K proteinaża dilwita frisk f'temperatura ta' 37°C għal 20s, żid 1μL ta' TdT u DIG-d-UTP ma' kull slide u 18μL ta' soluzzjoni buffer għal 2h f'temperatura ta' 37°C; żid 50μL ta' soluzzjoni ta' imblukkar ma' kull slide, f'temperatura tal-kamra għal 30min; Żid 50μL ta' antikorp bijotinilat anti-digoxigenin dilwit b'soluzzjoni li timblokka; irreaġixxi għal 30min f'kaxxa mxarrba f'temperatura ta' 37°C; żid 50μL ta' SABC-AP dilwit b'0.1mol/L TBS ma' kull slide; BCIP / NBT (0.1mol ta 'pH9.5 / L TBS dilwit 1:20) ġie miżjud mal-kampjun biex jiżviluppa l-kulur għal 30 minuta; fl-istess ħin, intuża kontroll alternattiv (buffer TdT minflok taħlita TdT/bijotin-dUTP) għall-fotomikrografija u l-mikroskopju tal-kuntrast tal-fażi maqluba (200×) Osserva ċ-ċelloli apoptotiċi. Għaddi ċelloli pożittivi taħt mikroskopju ta' kuntrast ta' fażi, għaddi 5 oqsma għal kull bir f'kull grupp, għal total ta' 6 bjar.

2. Riżultati sperimentali

2.1 Osservazzjoni morfoloġika ta 'newroni kkoltivati

Osservat mill-mikroskopju tal-kuntrast tal-fażi OlympusIX70: 5h wara l-inokulazzjoni, ħafna miċ-ċelloli jaderixxu mal-ħajt, iċ-ċelloli huma mxerrda, il-ġisem taċ-ċellula huwa tond, in-nukleu huwa inviżibbli, u l-indiċi rifrattiv huwa b'saħħtu. Wara l-kultura għal 24 siegħa, il-protuberanzi taċ-ċelloli kibru u gradwalment tawwalija. Fi 48 siegħa, ħafna miċ-ċelloli ħarġu bi sporġenzi filamentużi ramifikati. Il-morfoloġija taċ-ċelloli kienet diversa, li kienet bipolari, tripolari, u multipolari, u gradwalment iffurmat netwerk skars. Il-ġisem taċ-ċellula tkabbar, tond, u ellittiku. Wara korriment tal-MPP+, iċ-ċelloli l-ewwel intefgħu, l-indiċi rifrattiv żdied, iċ-ċelloli kienu fi stat deġenerattiv, u ċ-ċelloli fl-aħħar naqsu u waqgħu. Dożi differenti ta ' serum kompost li fih il- mediċina Ċiniża għandhom effetti protettivi fuq korriment fl- MPP +. Wara li l-kultura kienet imtebba 'b'ċelloli immuni TH, deher li ċ-ċelloli pożittivi għat-TH kienu kannella b'outgrowth neurite. Wara li żżid id- doża ekwivalenti tas- serum tradizzjonali tal- mediċina Ċiniża, il- proporzjon ta ' TH- positivenewronijista 'jilħaq 55% ~ 60%.

2.2 Analiżi tar-riżultati tat-test taċ-ċitometrija tal-fluss (ara Figura 1)

Phosphatidylserine (PS) li jinsab ġewwa l-membrana taċ-ċelloli fl-istadju bikri tal-apoptożi jemigra lejn in-naħa ta'barra tal-membrana taċ-ċelloli. Il-proteina V li teħel mal-Phosphatidyl (l-Annessin V) hija proteina li teħel mal-fosfolipidi dipendenti fuq il-kalċju, li għandha affinità għolja għal PS. Għalhekk, l-Anness V jista' jintuża bħala sonda biex jiġi skopert PS espost fuq il-wiċċ tal-membrana taċ-ċellula. Fl-istess ħin, flimkien mal-metodu ta' esklużjoni PI għad-doppjutbajja'ta' ċelloli apoptotiċi, iċ-ċelloli apoptotiċi jistgħu jinstabu permezz taċ-ċitometrija tal-fluss. Fil-kwadrant t'isfel tal-lemin ta' Fig.1 (FITC+/PI-), jintwerew id-dettalji tal-apoptożi ta' kull grupp. Il-proporzjon ta 'ċelloli, ir-rata ta' apoptożi ta 'kull grupp kienet 4.1%, 5.8%, 6.3%, 28.6%, 30.2%.

2.3 Analiżi tar-riżultati tat-tbajja' TUNEL

Dawk b'partiċelli blu-vjola fin-nukleu huma ċelloli pożittivi, jiġifieri, ċelloli apoptotiċi. Il-proporzjon ta' ċelloli apoptotiċi f'kull grupp kien magħdud taħt mikroskopju tad-dawl. In-numru ta' ċelloli apoptotiċi għal kull kamp viżiv f'kull grupp kien: Grupp A 2.13±0.34; Grupp B 4.92±0.67; Grupp C 6.20±1.47; Grupp D 10.33±1.51; Grupp E 12.74±2.51. Waraanaliżi tat-test t,il-gruppi B u C tqabblu mal-grupp E (P<0.05). the="">Riżultatihuma bażikament konsistenti mal-riżultati taċ-ċitometrija tal-fluss.

3. Diskussjoni

Il-marda ta' Parkinsonjappartjeni għall-kategorija ta '"sindromu ta' rogħda" fil-mediċina Ċiniża. Il-mediċina tradizzjonali Ċiniża temmen li l-bidu tal-PD huwa l-aktar serje ta 'manifestazzjonijiet tat-tnaqqis gradwali tal-fwied u l-kliewi fl-anzjani u t-telf tan-nutriment tal-meridjan tal-mudullun tal-moħħ. It-trattament ewlieni huwa linutrittiv il-fwied u l-kliewi, ikkalma l-fwied u telimina r-riħ. Il-mediċina tradizzjonali Ċiniża jista 'jkollha l-iskop ta' "it-tnaqqis tat-tossiċità u ż-żieda fl-effikaċja« fit- trattament ta 'Parkinson's, iżda l-mekkaniżmu ta' azzjoni tiegħu mhuwiex ċar ħafna fil-preżent. Numru kbir ta 'biċċiet sperimentali ta' evidenza fil-mediċina moderna jindikaw li l-istress ossidattiv huwa wieħed mill-fatturi li jikkawżaw il-mewt taċ-ċelloli tan-nervituri PD [3]. Studji sabu li l-glikosidi totali tal-cistanche jistgħu effettivament ineħħu diversi radikali ħielsa mill-ossiġnu reattiv u jipproteġu d-DNA mill-ossidazzjoni kkawżata minn OH[8]. L-estratt ta' Cistanche tubuloside B jista' jnaqqas iċ-ċitotossiċità indotta minnMPP+,iddgħajjef l-akkumulazzjoni ta' speċi ta' ossiġnu reattiv fiċ-ċellula, u jkollhom effett antagonistiku fuq l-apoptożi u l-istress ossidattiv ikkawżat minnMPP+[9]. Il-mediċina tradizzjonali Ċiniża tista 'tattiva u ssaħħaħ il-passaġġ protettiv tas-sinjal tagħha stess, tirreżisti ħsara esterna, u tirrestawra l-bilanċ tagħha. Dan huwa wieħed mill-għanijiet tal-modernizzazzjoni tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża. Wara terapija ta 'sostituzzjoni ta' dopamine, in-nies issa ġeneralment japprezzaw terapija newroprotettiva, li tissejjaħ it-tieni rivoluzzjoni fit-trattament ta 'Il-marda ta' Parkinson. F' dan l- esperiment, iċ- ċelloli tan- nervituri dopaminerġiċi iżolati midbrain kienu kkoltivati b' mediċina Ċiniża li fiha s- serum, u nstab li Cistanche għandu ċertu effett newroprotettiv. F'dan l-esperiment, intużaw żewġ metodi ta ' skoperta ta ' ċitometrija tal- fluss u tebgħa TUNEL biex fl- istess ħin jinstab li s- serum tal- grupp ta ' doża ekwivalenti u l- darbtejn is- serum tal- grupp ta ' doża ekwivalenti tal- kultura tas- serum medikat B' Cistanche jistgħu jnaqqsu n- nerv ta ' dopamine ta ' midbrain ikkutivat primarju kkawżat minnMPP+In- numru ta ' ċelluli apoptotiċi għandu ċertu effett protettiv fuq iċ- ċelloli apoptotiċi. Il-mediċina tradizzjonali Ċiniża tista 'tipproteġi newroni dopaminerġiċi minn ħsara fl-istadju bikri, li hija miżura aktar importanti minn terapiji oħra. F'dan is-sens, it-trattament olistiku tal-mediċina Ċiniża huwa l-kura għall-kawża ewlenija, u jista 'jitqies bħala wieħed mit-trattamenti newroprotettivi li n-nies japprezzaw fil-preżent.

Referenzi

1. Ziv I, Zilkha-Falb R, Offen D, et al. Levodopa tinduċi apoptożi f' ċelluli newronali kkulturati - aċċeleratur possibbli ta ' deġenerazzjoni nigrostriatal fil- marda ta ' Parkinson? Mov Disord, 1997, 12(1):17

2. Jenner PG, Brin MF. Levodopa newrotossiċità: studji sperimentali kontra r- rilevanza klinika. Newroloġija,1998,50(6 Suppl 6): S39

3. Maruyama W, Naoi M. Mewt taċ-ċellula fil-marda ta 'Parkinson. J Neurol, 2002,249 (Suppl 2): II6

4. Chen Jianzong, Jiang Wen, Shi Jian, et al. Osservazzjoni klinika dwar it- trattament tal- marda ta ' Parkinson bil- funzjoni tal- fwied u tal- kliewi: rapport ta ' 60 każ. Ġurnal tal-Università Chengdu tal-Mediċina Tradizzjonali Ċiniża, 1999, 22(3): 14

5. Chen Jianzong, Chen Xiaoli, Li Junchang, eċċ. Osservazzjoni Klinika fuq 40 Każ tal-Marda ta ' Parkinson Ikkurat bil- Metodu ta ' Nourishing Tal- Fwied u tal- Kliewi. Riċerka fil-Mediċina Ċiniża, 1998, 14(3): 10

6. Chen Jianzong, Jiang Wen, Wu Baron, et al. Pingchan Nru 1 likwidu orali fit-trattament ta '40 każ tal-marda ta' Parkinson. Ġurnal tal-Kulleġġ Anhui tal-Mediċina Tradizzjonali Ċiniża, 1999, 18(2): 9

7. Shimoda K, Sauve Y, Marini A, et al. Rendiment perċentwali għoli ta' ċelloli tyrosine hydroxylase-pożittivi mill-kultura taċ-ċelloli mesenċefaliċi tal-far E14. Res tal-Moħħ,1992,586 (2):319

8. Wang Xiaowen, Jiang Xiaoyan, Wu Liya Yiming, et al. Tkaxkir in vitro ta' radikali ħielsa u effetti protettivi fuq il-ħsara kkawżata mid-DNA ta' OH·ikkawżata mill-glikosidi totali tal-cistanche. Ġurnal Farmaċewtiku Ċiniż, 2001, 36(1): 29

9. Sheng G, Pu X, Lei L,et al. Tubuloside B minn Cistanche salsa Salvataġġi ċ-ċelloli newronali PC12 minn apoptożi kkawżata minn joni 1-Methyl-4-phenylpyridinium ion u ossidattiva. Stress.Planta Med,2002,68 (11):966