Chrysogenamide A minn fungus endofitiku assoċjat ma' Cistanche Deserticola u l-effett newroprotettiv tiegħu fuq iċ-ċelloli SH-SY5Y

Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Introduzzjoni

Cistanche deserticola(YC Ma) hija pjanta parassitika indiġena fil-majjistral taċ-Ċina. Iz-zokk ta 'dan l-impjant huwa mediċina tradizzjonali Ċiniża importanti u huwa użat għat-trattament ta' defiċjenza tal-kliewi u newrasthenia ("The Chinese Medicine Dictionary", 1977). Phenylthanoid glycosides minnCistanchedeserticolaġew irrappurtati li għandhom attivitajiet fil-prevenzjoni u t-trattament tal-mard tan-nervituri kranjali u t-tneħħija tar-radikali ħielsa [1, 2]. Ibbażat fuq il-fatt li l-fungi endofitiċi jistgħu jipproduċu komponenti mediċinali ġodda u l-istess/simili bħal dawk mill-pjanti ospitanti, it-tfittxija għal komposti attivi ġodda minn fungi endofitiċi ta 'pjanti mediċinali importanti turi l-valur għall-iżvilupp ta' riżorsi mediċinali ġodda. Fil-kors tat-tfittxija tagħna għal komposti newroprotettivi ġodda minn fungi endofitiċi minnCistanchedeserticolamiġbura mill-Inner Mongolia fil-majjistral taċ-Ċina, tliet razez attivi ġew skrinjati bl-użu ta 'ċelloli SH-SY5Y. Fosthom, il-brodu tal-kultura tal-fungus Nru 005, awtentikat bħala Penicillium chrysogenum, wera effett sinifikanti ta 'protezzjoni tan-newroċiti kontra l-mewt taċ-ċelluli indotta mill-istress ossidattiv fiċ-ċelloli SH-SY5Y. Studji dwar il-kostitwenti attivi ta 'din ir-razza wasslu għall-iżolament ta' chrysogenamide A (1) (Fig. 1) permezz ta 'proċedura ta' iżolament iggwidata minn bioassay. Barra minn hekk, erba' komposti magħrufa ġew iżolati u identifikati bħala circumdat f'G (2) [3], 2-[({2-hydroxypropionyl) amino] benzamide (3) [4], 2- ,3-dihydrosorbicillin (4) [5] u (9Z,12Z)-2,3-dihydroxypropyl octadeca-9,12-dienoate (5) [6] , b'paragun tad-dejta spettroskopika tagħhom mad-dejta tal-letteratura. Hawnhekk, nirrapportaw dwar l-iżolament, l-identifikazzjoni u l-effett newroprotettiv ta 'chrysogenamide A.

Cistanche deserticola

Materjali u metodi

Materjal Fungali Kampjun ta' Penicillium chrysogenum Nru 005 kien iżolat mill-għerq ta' C. deserticola miġbur mill-Inner Mongolia fil-majjistral taċ-Ċina. Fuq l-agar tad-destrożju tal-patata d-dehra makroskopika kienet ta 'kolonji mifruxa, lixxi, bellusin, blu-aħdar kultant miżgħuda b'hyphae ħfief; il-wiċċ tal-kolonji spiss wera qtar numerużi isfar ċar; isfar b'lura. Twettqet tfittxija GenBank bis-sekwenza tal-ġeni tad-DNA ribosomali 18S ta 'Nru 005 (1676 nukleotidi; numru ta' adeżjoni Gen-Bank EU203859). Ir-riżultati jindikaw speċi ta’ Penicillium chrysogenum bħala l-eqreb tqabbil. Fuq il-bażi tad-dehra makroskopika tagħha u s-sekwenza tal-ġeni 18S rDNA, Nru.005 hija razza ta 'Penicillium chrysogenum.

Fermentazzjoni u Estrazzjoni

Il-fungu tkabbar f'kundizzjonijiet statiċi f'24 grad għal 3{{10}} ijiem fi flixkuns konikali ta' 35 1000-ml li kien fihom mezz likwidu (30{{2{{22} }}} ml/flixkun) magħmul minn glukożju (10 g/litru), maltożju (20 g/litru), mannitol (20 g/litru), monosodium glutamate (10 g/litru), KH2PO4 (0.5 g/litru), MgSO4·7H2O (0.3 g/litru), likur wieqaf tal-qamħ (1.0 g/litru) u estratt tal-ħmira (3.0 g/litru) u ilma baħar wara li aġġusta l-pH tiegħu għal 7.0. Il-brodu sħiħ iffermentat (10.5 litri) ġie estratt tliet darbiet b'EtOAc biex jagħti soln EtOAc, li kien ikkonċentrat taħt pressjoni mnaqqsa biex jagħti estratt mhux raffinat (9.5 g).

Purifikazzjoni

L-estratt mhux raffinat (9.5 g) ġie sseparat fi 15-il frazzjoni fuq kolonna tal-ġel tas-silika bl-użu ta 'eluzzjoni gradjent tal-pitrolju/Me2CO. Il-frazzjoni 2, eluwata bi 8: 2 etere tal-petroleum/Me2CO, ġiet rikristallizzata minn MeOH, u tat 3 bħala labar bla kulur (8.{{10}} mg). Il-frazzjoni 3 (19.{{30}} mg), elużi b'7: 3 ether tal-pitrolju/Me2CO, ġiet isseparata aktar b'kolonna ta' fażi inversa (RP18, 40 6{{38 }} mm, Merck;MeOH - H2O 3:2→4:1→MeOH) biex jaffordjaw fr. 3 7 (8.0 mg), li kien ippurifikat minn PHPLC estensiv (60 fil-mija MeOH li fih {{70}}.1 fil-mija TFA, 4.{{77} } ml/minuta) biex tagħti 4 (2.{{80}} mg). Il-frazzjoni 4 (26.0 mg), eluwata b'6: 4 petroleum ether/Me2CO, ġiet isseparata aktar b'kolonna b'fażi maqluba (RP18, 40 60 mm, Merck; MeOH - H2O 3:2→4:1→MeOH) biex taffordja fr. 4-3 (5.4 mg) u fr. 4-9 (7.6 mg). Imbagħad, il-fr. 4-3 ġie sseparat minn PHPLC estensiv [YMC-pack ODS (A), 10 250 mm, 5 mm, 4.0 ml/minuta] (60 fil-mija MeOH, 4.0 ml/minuta) biex jagħti 2 (1.0 mg), u il-fr. 4-9 ġie separat b'PHLC estensiv (80 fil-mija MeOH, 4.0 ml/minuta) biex jagħti 1 (4.0 mg) u 5 (2.6 mg). 1: miksub bħala solidu isfar ċar; [a]D 25 24.5 grad (c 0.155, MeOH); UV (MeOH) l max 208, 251 nm; CD (MeOH) (ara Fig. 4); IR (KBr) n max 3433, 3200, 3076, 2928, 2862, 1677, 1440, 1370, 1324, 1188, 1029 ċm 1; 1 H- u 13C-NMR (ara Tabella 1); HRESI-MS m/z 448.2951 [MH] (ikkalkolat għal C28H38N3O2, 448.2964)

DPPH Radical Scavenging Effect

Soln MeOH (160 ml) ta' konċentrazzjonijiet ta' kampjuni li jvarjaw (1.0 mg/ml 0.0001 mg/ml) ġie miżjud ma' 40 ml DPPH (1,1- diphenyl{{8 }}picrylhydrazyl; Sigma) MeOH soln (1.5 10 4 M). Wara li tħallat bil-mod u ħalliet għal 30 minuta f'temperatura tal-kamra, id-densità ottika ġiet imkejla f'520 nm bl-użu ta 'spettrofotometru. L-attività antiossidant ta 'kull kampjun kienet espressa f'termini ta' IC50 (mg/ml jew mM meħtieġa biex tinibixxi l-formazzjoni ta 'radikali DPPH b'50 fil-mija) u kkalkulata mill-kurva ta' inibizzjoni log-doża.

newroprotettiv ta' cistanche deserticola

Kultura taċ-Ċelloli u Trattament tad-Droga

Iċ-ċelloli tan-newroblastoma umana SH-SY5Y ġew ikkultivati ​​f'medja DMEM u miżmuma f'37 grad f'atmosfera umidifikata b'5.0 fil-mija CO2. Dawn is-sospensjonijiet taċ-ċelluli (180 ml) f'densità ta' 5*104 ċelluli ml-1 ġew ibbanjati fi 96- pjanċi ta' mikrotiteru tajjeb u inkubati għal 24 siegħa fil- kundizzjoni hawn fuq. Chrysogenamide Soluzzjoni A (2.0 ml f'DMSO) f'konċentrazzjonijiet differenti ġiet miżjuda ma 'kull bir ħlief il-gruppi ta' kontroll u mudell u inkubata aktar għal siegħa fl-istess kundizzjonijiet. H2O2 (Sigma Chemical Co., MO, USA) ġie miżjud biex jinduċi apoptożi fiċ-ċelloli SH-SY5Y f'konċentrazzjoni finali ta '200 mM għal 24 siegħa. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet iddeterminata bl-użu ta' analiżi MTT. MTT maħlul f'salina buffered bil-fosfat ġie miżjud fi tmiem l-inkubazzjoni għal konċentrazzjoni finali ta '5.0 mg/ml (PBS), u mbagħad inkubat f'37 grad għal 4 sigħat. Meta twarrab is-supernatant, il-prodott formazan riżultanti ġie maħlul.

Riżultati u diskussjoni

1 inkiseb bħala solidu isfar ċar. Il-formula molekulari ġiet iddeterminata bħala C28H37N3O2 minn HRÉSI-MS (osservata [MH] f'm/z 448.2951, imsejħa [MH] C28H38N3O2, 448.2964). L-ispettru IR issuġġerixxa l-preżenza ta' NH (3433 u 3200 cm 1 ) u grupp(i) karbonil (1677 cm-1 ). L-ispettru 1 H-NMR (Tabella 1) irreġistrat f'DMSO-d6 żvela tliet gruppi tal-metil (d H 0.62, 0.87, 0.98), u żewġ sinjali ta 'protoni skambjabbli (d H 10.36 u 8.29). Barra minn hekk, tliet sinjali aromatiċi akkoppjati orthos (d H 6.90 dd, J 7.3, 7.3 Hz, 6.94 d, J 7.3 Hz, u 7.18 J 7.3 Hz) indikaw ċirku tal-benżin trisostitut 1,2,3-. Il-protoni tal-metilin (d H 3.23) flimkien ma' proton olefiniku (d H 5.27), flimkien ma' żewġ metili viniliċi (d H 1.67 u 1.70), indikaw il-preżenza ta' grupp 3-metil-2-butenil f'1. Il-konnettività b'rabta waħda ta 'dawn il-protoni u 14-il protoni tal-methine u jew tal-metilen ieħor ġew stabbiliti permezz ta' esperiment HMQC. L-ispettri 13C-NMR u DEPT (Tabella 1), li żvelaw 28 sinjal, ikkonfermaw ukoll il-preżenza ta’ dawn iż-żewġ frammenti [ċirku tal-benżin trisostitut (dC 123.6 CH, 120.8 CH, 127.7 CH, 122.1 QC, u 140.4 QC) u {a] {79}}metil-2-butenil (dC 28 CH2, 121.9 CH, 132.3 QC, 25.5 CH3, u 17.7 CH3)]; barra minn hekk, żewġ carbonyls (dC 183.1 u 172.3), erba sp3 karbonji kwaternarji (dC 46.5, 58.7, 60.4, u 62.3), żewġ sp3 metines (dC 46.1 u 58.7), u sitt sp3 methylenes (dC 34., 34.. 35.2, 39.9 u 64.9) ġew osservati wkoll. Peress li 6 minn 12 insaturazzjonijiet ġew ikkunsidrati, 1 ġie dedott li fih sitt ċrieki. Evalwazzjoni ulterjuri ta' din id-dejta spettrali, flimkien mar-riżultati ta' 1 H-1 H COSY u HMBC, wriet li 1 huwa relatat mill-qrib mal-grupp marcfortine ta' metaboliti fungali [7]. L-interpretazzjoni tal-korrelazzjonijiet HMBC (Fig. 2) indikat il-preżenza ta' struttura parzjali A (korrelazzjonijiet HMBC 1-NH sa C-8 u C-9; H-6 sa C{{ 136}}; H-5 sa C{-7 u C{-9; H-26 sa C{-28 u C{-8 u H{{143 }} sa C-29 u C-30) u B (korrelazzjonijiet HMBC H-10 sa C-3, C{-22, C-21, C-11, C{-12; H-20 sa C-13, C{-18, C{-22, C-11 u { {157}}NH sa C-13, C{-10), u C, ċirku G b'sitt membri [8] b'karbonju methylated f'C-17 (korrelazzjonijiet HMBC H{{ 163}} sa C-17, C{-16). Il-konnettività tas-sottostruttura A sa B permezz C-3 kienet appoġġjata mill-korrelazzjonijiet HMBC ewlenin minn H-4 u 1-NH sa C-3; H-10 sa C-2 u C-9. Il-konnessjoni bejn l-istruttura B u C b'atomu ta' nitroġenu ġiet dedotta mill-korrelazzjonijiet ewlenin tal-HMBC minn H-12 għal C-17 u C-13 u tqabbel iċ-ċaqliq kimiċi korrispondenti tagħhom ta' C{{176 }} u C-17 (dC 64.9 u 58.7). L-analiżi ta 'hawn fuq indikat li 1 kellu struttura simili għal marcfortine A ħlief għad-differenzi tal-katina tal-ġenb fiċ-ċirku tal-benżin u l-metil f'C-17 taċ-ċirku G b'sitt membri. Allura l-istruttura grossa ta '1 ġiet assenjata kif muri fil-Fig

L-isterjokimika relattiva ta '1 ġiet spjegata fuq il-bażi tad-dejta NOESY (Fig. 3). Studji preċedenti wrew li l-2-komposti tat-tip alkaloid oxindole adottaw konformazzjoni li fiha ċ-ċirku ċentrali b'ħames membri huwa ortogonali mal-pjan tas-subunità oxindole [9].

Korrelazzjonijiet NOESY bejn H{{0}} u H-10a, H-25, u bejn 19-NH u H{-10a indikaw li t-tnejn kienu fuq il-wiċċ taċ-ċirku cyclopentanon li jorjentahom lejn H-4, li jiffissa l-isterjokimika relattiva f'C-3 kif muri. L-interazzjonijiet NOESY bejn H-21, H-12a, H-10b, H{-23, u H{-24 poġġew is-sostituenti korrispondenti flimkien fuq il-wiċċ ta’ quddiem ta’ iċ-ċirku taċ-ċiklopentanon. L-isterjokimika relattiva proposta għal 1 hija taqbel mal-karatteristiċi rilevanti tal-isterjokimika relattiva ta 'marfortine A [7]. L-effett tal-Qoton f'200-250 nm jirriżulta minn tranżizzjoni np* tar-rabtiet tal-amide tad-diketopiperazine, li hija dijanjostika għall-qalba tad-diketopiperazine bicyclo-[2.2.2] diazaoctane [10, 11]. L-ispettru CD ta '1 (Fig. 4) ikkorrelata ma' reġjuni rilevanti ta 'dak ta' -brevianamide A [11]. Allura l-isterjokimika assoluta ta '1 għandha tkun 3S, 11S, 13S, 17S, 21R u ngħatat l-isem ta' chrysogenamide A. Evalwazzjoni preliminari tal-effett protettiv ta 'chrysogenamide A fuq in-newroċiti ġiet evalwata bl-użu ta' mewt taċ-ċelluli indotta minn stress ossidattiv f'SH-SY5Y ċelluli b'assaġġ MTT. L-attività ta 'scavenging radikali ħielsa ta' chrysogenamide A ġiet eżaminata l-ewwel bl-użu ta 'DPPH bħala donatur ta' radikali ħielsa. B'kuntrast mal-vitamina Ċ (IC50: 29.0 mM), chrysogenamide A ma wera l-ebda ħila (IC50 akbar minn jew ugwali għal 100 mM) li jneħħi DPPH radikali ħielsa f'konċentrazzjoni sa 100 mM. Sadanittant, ittestjajna jekk iċ-ċelluli chrysogenamide A ipproteġix kontra l-mewt taċ-ċelluli kkaġunata mill-istress ossidattiv fin-newroblastoma umana SH-SY5Y

ċelloli. L-istress ossidattiv mill-perossidu tal-idroġenu rriżulta fi tnaqqis fil-vijabbiltà taċ-ċelluli bi 43 fil-mija meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll. Chrysogenamide A inibit il-mewt taċ-ċelluli indotta mill-perossidu tal-idroġenu billi ttejjeb il-vijabbiltà taċ-ċelloli b'59.6 fil-mija f'konċentrazzjoni ta' 1*10-4 mM. Din id-dejta ssuġġeriet li chrysogen amide A wriet effett ta 'protezzjoni tan-newroċiti kontra l-mewt taċ-ċelluli indotta mill-istress ossidattiv, mhux permezz tal-attività antiossidant tagħha. L-alkalojdi Indole li għandhom sistema ta' ċirku diazaoctane bicyclo [2.2.2] mhux tas-soltu ġew iżolati minn ġeneri differenti ta' fungi bħal Aspergillus [12, 9, 13], Penicillium [14 16], u Malbranchea [17]. 1 kien membru ġdid ta 'dan il-grupp ta' komposti, kellu skeletru mistenni li jkun intermedju fil-bijosintesi ta 'l-admins citrin A u B rrappurtati bħala klassi ġdida ta' alkalojdi pentacyclic spiroin dolinone fl-2005 [18]. Mil-lat strutturali, huwa importanti li jiġi rrilevat li 1 hija struttura unika b'metilazzjoni f'pożizzjoni C-17 u frazzjoni 2- oxindole li tippossjedi unità isoprene f'C-7. Xi wħud minn dawn l-alkalojdi indol iżolati sal-lum juru attività antiparassitika qawwija [19], inibizzjoni taċ-ċelluli tat-tumur umani [13], u ċitotossiċità [10]. Sa fejn nafu tagħna, huwa l-ewwel rapport ta 'newroprotezzjoni minn dan it-tip ta' alkalojdi.

RikonoxximentDan ix-xogħol kien appoġġjat finanzjarjament mill-Fond Nazzjonali Ċiniż tax-Xjenza Naturali (Nru 30472136).

newroprotettiv ta' cistanche deserticola: kontra l-marda ta' Alzheimer

Cistanche deserticola għandha ħafna effetti, ikklikkja hawn biex tkun taf aktar

Referenzi

1. Li LL, Wang XW, Wang XF. Perossidazzjoni antilipidi u azzjoni kontra r-radjazzjoni tal-glikosidi fiherba Cistanches. China J Chin Mater Med 22: 364–367 (1997)

2. Xie JH, Wu CF. Effett ta 'estratt etanoliku ta'Cistanche deserticolafuq il-kontenut ta’ newrotrasmettituri monoamini fil-moħħ tal-firien. Chin Trad Herb Drugs 24: 417–419 (1993)

3. Dai JR, Carte BK, Sidebottom PJ, Yew ALS, Ng SB, Huang Y, Butler MS. Circumdatin G, alkalojd ġdid mill-fungus Aspergillus ochraceus. J Nat Prod 64: 125–126 84 Fig. 2 Korrelazzjonijiet ewlenin HMBC u 1 H-1 H COSY ta’ 1. Fig. 3 NOESYs ta’ 1. Fig. 4 Ispettru CD ta’ 1. (2001)

4. Kettering M, Sterner O, Anke T. Antibijotiċi fil-komunikazzjoni kimika tal-fungi. Zeitschrift fuer Naturforschung, C: Journal of Biosciences 59: 816–823 (2004)

5. Trifonov LS, Bieri JH, Prewo R, Dreiding AS, Hoesch L, Rast DM. L-iżolament u l-eluċidazzjoni tal-istruttura ta 'tliet metaboliti minn Verticillium intertextum: sorbicillin, dihydrosorbicillin u bisvertinoquinol. Tetrahedron 39: 4243–4256 (1983)

6. Zhang GL, Xing QY, Zhang MZ. Glycolipids minn Mirabilis Himalaya. Phytochemistry 45: 1213–1215 (1997)

7. Polonsky J, Merrien MA, Prange T, Pascard C, Moreau S. Iżolament u struttura (analiżi tar-raġġi X) ta 'marfortine A, alkaloid ġdid minn Penicillium roqueforti. JCS Chem Comm 13: 601–602 (1980)

8. Lee BH, Kornis GI, Cialdella JI, Clothier MF, Marshall VP, Martin DG, McNally PL, Mizsak SA, Whaley HA, Wiley VH. Idrossilazzjoni mikrobijoloġika f'sitt atomi tal-karbonju individwali ta' marcfortine A. J Nat Prod 60: 1139–1142 (1997)

9. Whyte AC, Gloer JB, Wicklow DT, Dowd PF. Sclerotiamide: Membru ġdid tal-klassi paraherquamide b'attività qawwija kontra l-insetti mill-sclerotia ta 'Aspergillus sclerotiorum. J Nat Prod 59: 1093–1095 (1996)

10. Kato H, Yoshida T, Tokue T, Nojiri Y, Hirota H, Ohta T, Williams RM, Tsukamoto S. Notoamides AD: alkalojdi indol prenilati iżolati minn fungus derivat mill-baħar, Aspergillus sp. Angew Chem Int Ed 46: 2254–2256 (2007)

11. Williams RM, Kwast E, Coffman H, Glinka T. Bijoġenesi notevoli, enantio-diverġenti ta 'brevianamide A u B. J Am Chem Soc 111: 3064–3065 (1989)

12. Banks RM, Blanchflflower SE, Everett JR, Manger BR, Reading C. Metaboliti antihelmintiċi ġodda minn speċi Aspergillus: l-aspergillimidi. J Antibiot 50: 840–846 (1997)

13. Qian-Cutrone J, Haung S, Shu YZ, Vyas D, Fairchild C, Menendez A, Krampitz K, Dalterio R, Klohr SE, Gao Q. J Am Chem Soc 124: 14556–14557 (2002)

14. Wilson BJ, Yang DTC, Harris TM. Produzzjoni, iżolament, u studji preliminari ta' tossiċità ta' brevianamide A minn kulturi ta' Penicillium Viridicatum. Appl Microbiol 26: 633–635 (1973)

15. Birch AJ, Russell RA. Studji fir-rigward tal-bijosintesi XLIV. Iluċidazzjonijiet strutturali ta 'brevianamides B, C, D u F. Tetrahedron 28: 2999–3008 (1972)

16. Liesch JM, Wichmann CF. Aġenti antinematodali u antiparassitiċi ġodda minn Penicillium Charles. II. Determinazzjoni tal-istruttura tal-paraherquamides B, C, D, E, F, u G. J Antibiot 43: 1380–1386 (1990) 17. Martinez-Luis S, Rodriguez R, Acevedo L, Gonzalez MC, Lira-Rocha A, Mata R Malbrancheamide, inibitur ġdid tal-calmodulin mill-fungus Malbranchea aurantiaca. Tetrahedron 62: 1817–1822 (2006)

17. Mishima T, Tsuda M, Kasa Y, Ishiyama H, Fukushi E, Kawabata J, Watanabe M, Akao K, Kobayashi J. Stereokimika assoluta ta 'citrinadins A u B minn fungus derivat mill-baħar. J Org Chem 70: 9430–9435 (2005)

18. Lopez-Greta MP, Gonzalez MC, Ciavatta L, Ayala I, Moya P, Primo J. Attività insettiċida ta 'paraherquamides, paraherquamides, inklużi paraherquamide H u paraherquamide I, Żewġ Alkalojdi Ġodda Iżolati minn Penicillium cluniae. J Agric Food Chem 54: 2921–2925 (2006)

newroprotettiv ta' cistanche deserticola: kontra l-marda ta' Alzheimer u l-marda ta' Parkinson