Karatterizzazzjoni Tal-Potenzjal ta' Inibizzjoni ta' Enżimi CYP3A4 Ta' Flavonojdi Magħżula Parti 2

Jekk jogħġbok ikkuntattjaoscar.xiao@wecistanche.comgħal aktar informazzjoni

2.3. Assaġġ ta' Inibizzjoni Psewdo-Irriversibbli

Fl-assaġġ ta 'inibizzjoni psewdo-irreversibbli, kampjuni ġew inkubati bi flavonoids u ttrattati b'ossidant, u wara ġew soġġetti għal dijaliżi. Fil-każ ta' inibizzjoni psewdo-irreversibbli, l-attività ta' l-enżima għandha tiġi rkuprata. Fl-inkubazzjonijiet bil-flavonoids ittestjati kollha, kien hemm inibizzjoni sinifikanti tal-attività tal-enzima wara dijalisi bi u mingħajr trattament b'ossidant (Figura 4). Fil-każijiet kollha, id-differenza fl-attività tal-enżimi residwi bejn il-kampjun tal-flavonojdi u l-kampjun tal-hexacyanoferrate tal-potassju kienet statistikament insinifikanti (p<>

Bħal fl-esperimenti preċedenti, l-ogħla tnaqqis fl-attività tal-enżimi kien osservat meta chrysin intuża bħala inibitur. L-attività residwa ta 'l-enzima wara l-inkubazzjoni u d-dijalisi bi chrysin kienet 0.57 fil-mija, u wara l-inkubazzjoni u d-dijalisi bi trattament minn qabel b'hexacyanoferrate tal-potassju, kienet 1.31 fil-mija (Figura 4).

Cistanche jista 'jtejjeb l-immunità

Fil-każ ta 'inibizzjoni diretta (riversibbli), dan it-tip ta' esperiment juri rkupru ta 'attività ta' enzima wara d-dijalisi. Fil-każ ta' inibizzjoni psewdo-irreversibbli, l-attività ta' l-enżima tiġi rkuprata wara trattament b'ossidant u dijaliżi. Billi dawn ma kinux il-każ ma' ebda wieħed mill-flavonoids analizzati, jista' jiġi konkluż li l-flavonoids kollha juru inibizzjoni irriversibbli taċ-ċitokrom P450 3A4.

3. Diskussjoni

Intwera li xi flavonoids jistgħu jinibixxu l-attività tal-enzimi ċitokrom P450. Saric-Mustapic et al. [28] u Kondza et al. [29] wera li acacetin, apigenin, chrysin, u pinocembrin jinibixxu l-enzima CYP3A4 fl-assaġġ bit-testosterone bħala sottostrat markatur. Peress li l-enzima CYP3A4 tippossjedi sit attiv kbir li jista' jakkomoda substrati b'mod differenti, huwa rakkomandat li jsiru testijiet ta' attività b'substrat markatur ieħor bħal nifedipine u midazolam [30]. Konsegwentement, użajna l-ossidazzjoni ta 'nifedipine bħala r-reazzjoni markatur tal-attività CYP3A4 u ddeterminajna l-parametri kinetiċi ta' inattivazzjoni. Il-valuri tal-effikaċja tal-inibizzjoni miksuba bl-użu ta 'nifedipine bħala sottostrat markatur huma tal-istess ordni ta' kobor meta mqabbla mal-assaġġ tat-testosterone għal apigenin, acacetin, u pinocembrin. Chrysin biss wera valur erba' darbiet ogħla fit-testosterone [29] meta mqabbel mal-assaġġ ta' nifedipine, jiġifieri, 0.108 min-1 uM-1 vs 0.029 min-IμM-1. Ix-xebh osservati fil-kinetika ta 'inattivazzjoni huma skond id-dejta tal-letteratura li tikkonferma li nifedipine u testosterone għandhom siti ta' rbit differenti li jikkoinċidu [31]. Cytochrome P4503A4 għandu wieħed mill-akbar siti attivi u jista 'jakkomoda s-sottostrat u l-inibitur fl-istess ħin, b'wieħed jinfluwenza l-irbit tal-ieħor, li jista' jispjega d-differenzi osservati bejn nifedipine u testijiet ta 'testosterone.

Jekk jogħġbok ikklikkja hawn biex tkun taf aktar

L-implikazzjonijiet kliniċi ta' inibituri riversibbli (jiġifieri, interazzjonijiet ikel-mediċina) jistgħu jiġu evitati jekk l-inibitur jitwaqqaf mit-trattament. Interazzjonijiet aktar importanti huma dawk li huma irriversibbli, filwaqt li sempliċement it-twaqqif tal-użu tal-inibitur ma jsolvix il-kwistjonijiet tal-interazzjoni. F'dan l-istudju, chrysin wera l-ogħla potenzjal ta 'inibizzjoni, bl-inqas IC50 u K; valuri. L-istudju ta' docking molekulari ta' flavonoids li jorbtu maċ-ċitokromu P450 3A4 wera affinità ta' rbit ogħla ta' chrysin billi jesponi ċ-ċirku B għall-ħadid fiċ-ċentru attiv ta' l-enzima [28]. Studju ta ' relazzjoni struttura-inibizzjoni wera liidrossilgruppi fiċ-ċirku A jikkontribwixxu għall-effett inibitorju probabbilment minħabba interazzjonijiet jone-jone, filwaqt li ċ-ċirku B jista 'jkun mhux sostitwit (pinocembrin, chrysin) jew monosostitut (acacetin, apigenin) għall-effett inibitorju li għandu jiġi osservat (Figura 1) [28]. Flavonoids mhux sostitwiti (pinocembrin, chrysin) huma aktar suxxettibbli għall-epossidazzjoni u l-ġenerazzjoni ta 'intermedji reattivi li jinattivaw CYP3A4. L-effett inibitorju aktar qawwi osservat bil-chrysin huwa probabbilment dovut għar-riġidità tal-istruttura u l-preżenza tar-rabta doppja C2=C3 meta mqabbla ma 'pinocembrin.

L-importanza ta' dawn il-kinetiċi ta' l-enżimi deskritti tista' tiġi osservata fil-kuntest ta' interazzjonijiet ikel-mediċina, fejn l-għoti ta' chrysin （20-100 μM） żiedet b'mod sinifikanti l-AUC u l-ogħla konċentrazzjoni fis-serum (Cmax) ta' nitrofurantoin fil-firien [32] .cistanche deserticola ma,Pereżempju, l-inibitur relattivament dgħajjef ibbażat fuq il-mekkaniżmu tal-enzima CYP3A4/5, erythromycin [33], ġie rrappurtat li jikkawża interazzjoni moderata ma 'cerivastatin f'voluntiera b'saħħithom (żieda ta' 21 fil-mija fl-AUC ta 'cerivastatin) [34]. Chrysin għandu wkoll potenzjal ta' inibizzjoni akbar minn mibefradil, mediċina kontra l-pressjoni għolja li ġiet irtirata minħabba interazzjonijiet sinifikanti ma' mediċini oħra. Ir-riżultati ta 'dan l-istudju jissuġġerixxu li chrysin jista' jkun inibitur qawwi u possibilment jinteraġixxi ma 'mediċini oħra użati,cistanche deserticolatibdel l-AUC u Cmax ta’ dawn il-mediċini. Chrysin hija abbundanti fil-propolis (28 g/L), u hija t-tielet flavonoid ewlieni fl-għasel 5.3 mg/kg [35]; għalhekk, dieta rikka f'dan l-ikel għandha l-potenzjal li jinteraġixxi ma' mediċini li huma sottostrati ta' CYP3A4.

Pinocembrin, inibitur irriversibbli ppruvat tal-enzima CYP3A4, wera l-inqas k; il-valur mg ta' 0.04 ± 0.01 min-1. L-effikaċja ta' inattivazzjoni tagħha kienet simili għal dik ta' acacetin u apigenin （0.01 min-1 μM-1）. Pinocembrin jinsab l-aktar f'ikel bħall-għasel u xorb (tè u inbid aħmar), li jippreżenta sors għani ta 'dan il-flavonojdi [29]. Skont dawn il-parametri kinetiċi, għandha tingħata attenzjoni fil-konsum ta’ dawn is-sorsi ta’ pinocembrin flimkien ma’ mediċini li jaġixxu bħala sottostrati ta’ CYP3A4.

Acacetin wera valur IC50 tliet darbiet ogħla minn chrysin u ħames darbiet ogħla K; valur, filwaqt li jinżammu valuri ta 'impatt simili bħal flavonoids oħra, li jindikaw effikaċja inibitorja aktar baxxa. Acacetin jista 'jinstab prinċipalment fi speċi ta' pjanti bħal Turnera diffusa, Robinia pseudoacacia, u Betula pendula [36], iżda ċertu ikel jippreżenta wkoll sors ta 'dan il-flavonoid. Pereżempju, il-meraq tal-kumquat huwa sors rikk ta’ acacetin, u l-acacetin jista’ jinstab f’konċentrazzjonijiet ta’ 0.1 mg/100 g ta’ meraq frisk [37]. Il-kompost ġenitur ta 'acacetin, apigenin wera l-ogħla valur IC50 u l-ogħla K; valur fost l-erba 'flavonoids ittestjati. Il-potenzjal inibitorju ta’ apigenin ġie kkonfermat in vivo meta t-trattament kombinat ta’ apigenin u paclitaxel wasslet għal żieda fil-bijodisponibilità orali ta’ paclitaxel, li kienet attribwita prinċipalment għal assorbiment imtejjeb fil-passaġġ gastrointestinali permezz tal-inibizzjoni tal-glikoproteina P u tnaqqis tal-ewwel pass. metaboliżmu ta' paclitaxel permezz tal-inibizzjoni tas-sottofamilja CYP3A fil-musrana ż-żgħira u/jew fil-fwied minn apigenin [38]. Apigenin huwa flavonoid dominanti fil-karfus, it-tursin u l-kamomilla. It-tursin imnixxef ġie rrappurtat li għandu l-kwantità massima ta’ apigenin, f’45035ug/g. Sorsi addizzjonali ta’ apigenin jinstabu f’ħxejjex aromatiċi bħall-fjura mnixxfa tal-chamomile, li fihom 3000 sa 5000 ug/g, u żrieragħ tal-karfus, li fihom 786.5 ug/g [39].

L-inibizzjoni riversibbli taċ-ċitokromi P450 3A4 hija relatata mal-ewwel pass taċ-ċiklu katalitiku taċ-ċitokromu P450 (Figura 5). Ħafna drabi, il-kompetizzjoni bejn is-sottostrat u l-inibitur fl-irbit mas-sit attiv (ħadid ferriku) hija osservata. F'dak il-każ, huwa rakkomandabbli li jsiru esperimenti ta 'rbit (titrazzjonijiet ta' enzimi) u li jiġi ttestjat b'aktar minn sottostrat wieħed, peress li CYP3A4 għandu sit attiv kbir li jista 'jakkomoda aktar minn molekula waħda ta' substrat/inibitur [26,30. F'dan l-istudju, użajna nifedipine bħala sottostrat, u r-riżultati ta 'effiċjenza ta' inibizzjoni kienu ta 'kobor komparabbli mal-assaġġi rrappurtati qabel imwettqa b'testosterone bħala sottostrat markatur (Tabella 1).

Figura 5. Iċ-ċiklu katalitiku taċ-ċitokromju P450 jikkonsisti f'disa' passi. L-ewwel pass jirrappreżenta l-irbit tas-sottostrat u l-punt ta 'interazzjoni ma' inibituri riversibbli. Fit-tieni pass, il-ħadid heme jitnaqqas għal forma tal-ħadid li lilha jorbtu inibituri psewdo-irreversibbli.effetti cistancheJekk tiġi osservata inibizzjoni irriversibbli, ġeneralment tkun relatata mal-forma radikali tas-sottostrat (iffurmat fil-pass 7) u/jew prodott (iffurmat fil-pass 8). Speċijiet ta 'ossiġnu reattivi ffurmati f'ċitokromu għalxejn P450cycle (passi 3a u 5a) jistgħu jikkawżaw qerda ta' enzimi, li jistgħu jiġu evitati biż-żieda ta 'SODand CAT. Id-deskrizzjoni tal-passi mhux relatati mal-inibizzjoni titħalla barra. Ippreparat skont ir-referenza [26].

Madankollu, kif urejna qabel [28,29] u kkonfermajna hawn fl-esperimenti mwettqa tagħna, il-flavonoids kollha studjati juru inibizzjoni irriversibbli. Irrispettivament mit-tip ta 'inibizzjoni irriversibbli (irbit psewdo-irreversibbli jew kovalenti ta' intermedju għal heme jew apoproteina), l-inibizzjoni tkun l-aktar prominenti jekk titwettaq preinkubazzjoni, qabel iż-żieda ta 'substrat ta' markatur [26]. Fi preinkubazzjoni, ċiklu katalitiku jiġi attivat biż-żieda tas-sistema li tiġġenera għall-produzzjoni tal-koenzima (NADPH), u huwa permess biżżejjed ħin biex tiġi osservata l-inattivazzjoni tal-enżima. Għalhekk, it-tipi irriversibbli kollha ta 'inibizzjoni jeħtieġu t-tnaqqis tal-enzima għall-forma tal-ħadid (Figura 5).

Billi ċ-ċitokromi P450 huma emoproteini, studjajna l-irbit ta' flavonoids mal-forma tal-ħadid tas-sit attiv u l-irbit ta' intermedju reattiv possibbli mal-eme [26]. Biex tiġi vvalutata l-formazzjoni possibbli tal-adduct heme, sar analiżi tal-emokromopiridina. Kollha ttestjatiflavonojdikonċentrazzjoni ta' heme mnaqqsa b'mod sinifikanti fiż-żewġ analiżi, b'aktar minn 50 fil-mija. Chrysin kien, għal darb'oħra, l-inibitur l-aktar qawwi, li qabbel il-valuri kinetiċi ta 'inibizzjoni osservati f'dan l-istudju. Il-konċentrazzjoni ta 'heme b'pinocembrin kienet ħames darbiet ogħla, u, b'apigenin, kienet kważi għaxar darbiet ogħla minn dik bi chrysin (25.3±0.4 u 45.1±1.7 fil-mija, rispettivament). Dan it-tnaqqis fil-konċentrazzjonijiet ta' heme jindika li l-inibizzjoni irriversibbli ta' CYP3A4 mill-flavonoids studjati tista' tiġi attribwita għall-irbit kovalenti ta' intermedju reattiv ma' l-eme. Għandu jiġi nnutat li l-hemes jistgħu jiġu meqruda minn speċi ta 'ossiġnu reattivi, li jbaxxu r-riżultati ta' l-assaġġ ta 'hemochromopyridine. Biex tiġi eliminata din il-possibbiltà, twettqu inkubazzjonijiet fil-preżenza ta 'SOD u CAT (Tabella 2), li tikkonferma l-konklużjoni msemmija hawn fuq.

L-ewwel pass fiċ-ċiklu katalitiku tal-enzima taċ-ċitokromu P450 huwa l-irbit ta 'sottostrat ma' jone ferriku. Jekk l-inibitur juri inibizzjoni kompetittiva għas-sottostrat, l-attività tal-enzima tista 'tiġi rkuprata permezz tad-dijalisi, peress li l-eliminazzjoni tal-inibitur tippermetti l-irkupru sħiħ tal-attività tal-enzima [26]. Madankollu, jekk l-inibitur jeħel mal-ħadid tal-ħadid, l-użu ta 'ossidant, bħal PCF, id-dijalisi preċedenti huwa meħtieġ sabiex tkun irkuprata l-attività ta' l-enżima. Jekk l-attività tal-enzima tiġi rkuprata, l-inibizzjoni hija kkaratterizzata bħala psewdo-irreversibbli [26]. Billi l-attività ta' l-enżima ma setgħetx tiġi rkuprata wara d-dijalisi bi jew mingħajr PCF, l-ebda wieħed mill-flavonojdi ttestjati (f'konċentrazzjoni ta' 25 uM) ma jaġixxi bħala inibituri riversibbli jew psewdo-irreversibbli ta' l-enzima CYP3A4. Dan jikkonferma wkoll li inibizzjoni irriversibbli permezz ta 'rbit kovalenti jew ma' heme jew apoproteina hija l-kawża probabbli ta 'inattivazzjoni ta' l-enżimi.

Għandu jiġi nnutat li chrysin ikkawżat kważi tnaqqis sħiħ ta 'heme fl-inkubazzjoni: 97.1 fil-mija mingħajr u 94.5 fil-mija b'SOD u CAT (Tabella 2); filwaqt li r-riżultati ta 'attività ta' enzima residwa taħt kundizzjonijiet simili wrew it-tnaqqis ta 'attività ta' enzima b'madwar 99 fil-mija (Figura 4). L-assaġġ hemochromopyridine jirreġistra hemes mis-sorsi kollha fl-inkubazzjoni, jiġifieri, ċitokromu P450, kif ukoll ċitokromu b;. Ir-riżultati għall-chrysin jindikaw li intermedju reattiv iġġenerat miċ-ċitokromu P450 irreaġixxa ma 'eme miċ-ċitokromu P450 kif ukoll ma' ċitokromu b5.

Twettqet aktar analiżi LC-MS biex tiddetermina intermedji flavonoid reattivi possibbli jew f'forma ta 'heme adduct jew maqbuda bl-użu ta' glutathione bħala kennies radikali (dejta mhux murija). Madankollu, ma stajna niżolaw l-ebda wieħed mill-adducts imbassra probabbilment minħabba l-instabilità tal-intermedjarju tal-flavonoid reattiv u/jew l-adduct heme/glutathione. Ġiet osservata imġieba simili b'mibefradil, mediċina kontra l-pressjoni għolja, irtirat mis-suq minħabba interazzjonijiet mediċina/mediċina. Għalkemm mibefradil ikkawża t-tnaqqis tal-heme, ma ġiex stabbilit intermedju reattiv [40].

4. Materjali u Metodi

4.1.Materjali

Erba 'flavonoids (acacetin, apigenin, chrysin, u pinocembrin) intużaw f'dan l-istudju (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA). Iċ-ċitokromi rikombinanti P450 3A4 koespressi ma 'nicotinamide-adenine-dinucleotide phosphate (NADPH) reductase u cytochrome bs fl-awtosomi nxtraw minn Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA).

Ibbażat fuq l-assaġġ tal-monossidu tal-karbonju taċ-ċitokrom P450 [41], il-kontenut tal-enzima CYP3A4 iddikjarat mill-manifattur ġie kkonfermat li huwa 1 μuM. Glukożju-6-fosfat （G6P）, glukożju-6-fosfat dehydrogenase (G6PDH), u -nicotinamide-dinucleotide phosphate disodium salt (NADP plus ) inxtraw mingħand Sigma-Aldrich. Fosfat tal-potassju (pa) u dichloromethane (pa) inxtraw minn Kemika dd (Żagreb, il-Kroazja), aċidu formiku (85 fil-mija, pa) minn Semikem doo (Sarajevo, Bosnja, u Ħerzegovina), u metanol użat għal dissoluzzjoni tar-reaġent u kromatografija minn Merck KGaA(Darmstadt, il-Ġermanja). Ilma ultrapur intuża fit-taħlitiet ta 'inkubazzjoni u fil-kromatografija. Il-fosfat diidroġenu tal-potassju (Kemika dd) intuża biex jipprepara buffer tal-fosfat tal-potassju pH 7.85; Il-pH ġie aġġustat bl-użu ta' idrossidu tas-sodju mixtri minn Semikem doo Nifedipine (Sigma-Aldrich) u nifedipine ossidizzat (Direttorat Ewropew għall-Kwalità tal-Mediċini, Farmakopea, 10 edizzjoni, Strasburgu, Franza) intużaw fl-istudju tal-attività tal-enżimi residwi, kif ukoll fi kinetika ta' inattivazzjoni. Testosterone (Sigma-Aldrich) u 6 -hydroxytestosterone (Cayman Europe, Tallinn, Estonja) intużaw għal testijiet f'inibizzjoni psewdo-irreversibbli. Troleandomycin u diltiazem inkisbu mill-Aġenzija għall-Prodotti Mediċinali u l-Apparat Mediku (Żagreb, il-Kroazja). Pyridine(pa)(Semikem doo), hemin bovina (Sigma-Aldrich), u dimethylsulfoxide (Semikem doo) intużaw fl-assaġġ hemochromopyridine. Hexacyanoferrate tal-potassju (Siegfried AG, Zofingen, l-Isvizzera) intuża fl-istudju ta 'inibizzjoni riversibbli u psewdo-riversibbli. Superoxide dismutase (SOD) (Sigma-Aldrich), catalase (CAT) (Sigma-Aldrich), u aċidu idrokloriku (36 fil-mija, pa) (Semikem doo) intużaw fl-assaġġ tal-ispeċifiċità tal-irbit. Inkubazzjonijiet ta 'enżimi saru f'banju ta' l-ilma (Inkolab, Zagreb, il-Kroazja). L-analiżi tal-attività tal-enżima residwa u l-kinetika tal-inattivazzjoni tal-flavonojdi twettqu bl-użu ta 'kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja flimkien ma 'detezzjoni UV-Vis (HPLC UV-Vis, Agi-lent 1100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Il-kalkoli tal-attività residwa u l-parametri tal-kinetika tal-inibizzjoni saru bl-użu tal-programm R (The R Project for Statistical Computing, Vjenna, Awstrija) u Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA).

4.2.Metodi

4.2.1. Determinazzjoni tal-Kinetika tal-Enżimi u l-Attività Residwu

L-inkubazzjonijiet ta 'l-enzimi saru fi tliet kopji, b'taħwid mekkaniku f'banju ta' l-ilma f'37 grad. Alikwoti ta 'flavonoids b'konċentrazzjoni finali ta' 1 μM ġew maħlula fil-metanol, trasferiti għal tubi tal-ħġieġ, u evaporati għan-nixfa, ħlief f'kampjuni ta 'kontroll mingħajr l-inibitur (flavonoid). Wara l-evaporazzjoni tas-solvent, ġiet ippreparata taħlita ta' inkubazzjoni għal volum ta' 100 μL, li jikkonsisti minn 5pmol enzima CYP3A4, 50 mM buffer tal-fosfat tal-potassju (pH7.4) , u ilma ultrapur. Sistema li tiġġenera NADPH magħmula minn 0.1 M G6P:10 mg/mL NADP flimkien ma :1000 IU/mL G6PDH=50:25:1(v/v/v) ġiet ippreparata immedjatament qabel l-użu. Din is-sistema li tiġġenera fiha glucose-6-phosphate dehydrogenase li tirriġenera NADP f'NADPH, u żżomm il-konċentrazzjoni taċ-ċitokromju P450 coenzyme (NADPH) kostanti fl-inkubazzjoni. Iż-żieda tas-sistema li tiġġenera (15 fil-mija tal-volum fl-inkubazzjoni finali, v/v) bdiet ir-reazzjoni. Nifedipine intuża biex tiġi ttestjata l-attività tal-enżima residwa f'konċentrazzjoni finali ta '200 μM. Ir-reazzjoni twaqqfet bl-użu ta '1 mL ta' soluzzjoni ta '1 fil-mija kiesħa bis-silġ ta' aċidu formiku fid-dichloromethane. Il-kampjuni tħalltu, imbagħad ċentrifugati għal 10 min fuq 1900g (Rotofix32, Westfalia, il-Ġermanja). Wara ċ-ċentrifugazzjoni, ġew iffurmati żewġ saffi (ilma u saff organiku）.850 μL tas-saff organiku ġie trasferit għal kuvettes u evaporat. L-analyte imbagħad ġie maħlul fi 30 μL ta 'metanol. Kolonna Agilent Zorbax SB C18 (4.6 × 250 mm, 3 μm, Teknoloġiji Agilent, Santa Clara, CA, USA）kien użat biex janalizza l-kampjuni mill-HPLC.Il-fażi mobbli kienet magħmula minn metanol u ilma fi proporzjon ta '64:36. L-analiżi kienet iżokratika. Il-fluss kien issettjat għal 1.0 mL min-. Il-volum tal-injezzjoni kien issettjat għal 10 μL. Nifedipine intuża bħala sottostrat markatur. Ir-reazzjoni osservata kienet l-ossidazzjoni ta 'nifedipine. Il-kromatogrammi ġew irreġistrati f'254 nm. It-tul tal-analiżi kien issettjat għal 25 min. Iż-żamma il-ħin ta 'nifedipine huwa 7.1 min u dak ta' nifedipine ossidizzat huwa 10.8 min [42].Fiż-żewġ każijiet, l-ammont ta 'prodott miksub kien osservat bħala l-ammont ta' żona taħt il-kurva (AUC) relattiv għall-kampjun ta 'kontroll. Għall-flavonoids kollha , konċentrazzjoni inibitorja nofs massima (ICs0), kostanti ta ' inibizzjoni (K;), kostanti ta 'veloċità ta' inattivazzjoni (Kinect), u effikaċja ta 'inattivazzjoni (impatt /K;) ġew determinati. Troleandomycin intuża bħala kontroll pożittiv--inibitur irriversibbli ta 'ċitokromu P{450 3A4.25 uM konċentrazzjoni ta' troleandomycin naqqas l-attività tal-enzima għal 35±5 fil-mija.

4.2.2. Assaġġ Emokromopiridina

L-assaġġ tal-emokromopiridina ntuża biex jevalwa l-qerda tal-eme possibbli mill-forma intermedja reattiva fiċ-ċiklu taċ-ċitokromu P450 u sar skont il-metodu deskritt minn Flink u Watson [43] u Paul et al.[44], b' xi modifiki. Ġiet stabbilita kurva ta' kalibrazzjoni bl-użu ta' emin maħlul f'dimethylsulfoxide(0.6 sa 0.1 μM）. Spettri ġew irreġistrati f'wavelength ta' 500 sa 600 nm. Taħlitiet ta' inkubazzjoni ma' Inibituri 25 uM (flavonojdi) ġew ippreparati għal volum ta '200 μL. Ir-reazzjoni nbdiet biż-żieda ta' sistema li tiġġenera NADPH (għall-kompożizzjoni, ara Taqsima 4.2.1), u l-inkubazzjonijiet damu għal 30 min. Ir-reazzjoni twaqqfet wara nofs siegħa biż-żieda ta' piridina (konċentrazzjoni finali 0.83 M) u idrossidu tas-sodju (konċentrazzjoni finali 0.06 M). Il-kampjuni ġew irreġistrati fuq spettrofotometru (UV-1280, Shimadzu Corporation, Kyoto, Ġappun) fi żmien minuta minn iż-żieda ta 'soluzzjoni alkalina, minħabba l-instabilità ta' pyridine hemochromogen taħt kundizzjonijiet bażiċi [44].Konċentrazzjoni ta 'Heme fil-kampjuni ġiet ikkalkulata abbażi tal-kurva ta' kalibrazzjoni ppreparata. Dan l-assaġġ sar fi tliet kopji. L-inkubazzjonijiet ġew ripetuti bl-użu ta 'catalase u superoxide dismutase (5 IU kull wieħed) fil- taħlita ta 'inkubazzjoni biex tipprevjeni l-ġenerazzjoni ta' perossidu ta 'l-idroġenu permezz taċ-ċiklu katalitiku għalxejn.

4.2.3. Assaġġ ta' Inibizzjoni Psewdo-Irriversibbli

L-għan ta' dan l-essay huwa li jittestja l-formazzjoni ta' kumplessi kovalenti b'ħadid ferruż (Fe-), billi jiġi evalwat l-irkupru tal-attività tal-enżimi wara d-dijaliżi biż-żieda ta' ossidant jew mingħajru. Twettqu tliet tipi ta 'esperimenti għal kull flavonoid: taħlita ta' inkubazzjoni mingħajr flavonoid (kontroll), taħlita ta 'inkubazzjoni bi flavonoid, u taħlita ta' inkubazzjoni bi flavonoid li magħha ġie miżjud l-ossidant wara l-inkubazzjoni. Kull inkubazzjoni bl-inibitur saret għal 30 min bl-użu tal-istess settings sperimentali kif deskritt hawn fuq (Taqsima 4.2.1). Wara l-inkubazzjoni, il-kampjuni ġew trasferiti għal skrataċ tad-dijalisi. Aa ossidant - soluzzjoni ta '20 mM ta' hexacyanoferrate tal-potassju ġiet miżjuda ma 'waħda mill-inkubazzjonijiet qabel id-dijalisi [45]. Il-cassettes(Slide-A-Lvzer Dialysis Cassettes, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ġew mgħaddsa f'50 mM soluzzjoni buffer tal-fosfat tal-potassju (pH7.4) għal 30 min (soluzzjoni tad-dijalisi ġiet skambjata tliet darbiet). Wara d-dijalisi, il-kampjuni ġew trasferiti mill-cassette lura għat-tubu tal-ħġieġ, u l-attività tal-enżima residwa ġiet evalwata bl-użu ta 'testosterone bħala sottostrat markatur (konċentrazzjoni finali 200 μM). Peress li s-sistema li tiġġenera NADPH kienet ukoll iddijalizzata, reġgħet ġiet miżjuda mal-inkubazzjonijiet biex jinbdew reazzjonijiet tal-enżimi. Il-kampjuni ġew inkubati għal 30 minuta bl-istess settings (deskritti taħt it-Taqsima 4.2.1). Ir-reazzjoni ġiet mitmuma biż-żieda ta 'soluzzjoni kiesħa bis-silġ ta' aċidu formiku fid-diklorometan. Il-kampjuni ġew analizzati bl-HPLC. Diltiazem, inibitur psewdo-irreversibbli magħruf taċ-ċitokromu P450 3A4, intuża bħala kontroll pożittiv biex jevalwa l-ossidazzjoni għal forma ferrika (ġie osservat rkupru sħiħ tal-attività tal-enżima).

4.2.4.Ipproċessar tar-Riżultati

Test t fuq naħa waħda għandu jintuża biex jivvaluta s-sinifikat statistiku tad-differenzi bejn il-kampjuni u l-kontrolli, ibbażat fuq kejl tal-attività residwa. Intużat ekwazzjoni mhux lineari biex jiġi kkalkulat il-valur IC50. L-ekwazzjoni Michaelis-Menten intużat biex tiddetermina l-kostanti ta 'inattivazzjoni u r-rata ta' inattivazzjoni tal-inibitur. L-ipproċessar tal-istatistika u t-tħejjijiet tal-grafika saru bl-użu tal-Programm R (Il-Proġett R għall-Kompjuter tal-Istatistika, Vjenna, l-Awstrija) u Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA).

5. Konklużjonijiet

Acacetin, apigenin, chrysin, u pinocembrin jinibixxu l-attività tal-enzima CYP3A4 in vitro. Chrysin huwa l-inibitur tal-enzimi l-aktar qawwi, bl-inqas IC50, K; Valuri Kinect u l-ogħla effikaċja ta 'inattivazzjoni. Il-flavonoids kollha naqqsu l-konċentrazzjoni tal-heme tal-enzima, u kkonfermaw li din hija inibizzjoni irriversibbli minn intermedju reattiv li ma jistax jiġi evitat biż-żieda ta 'SOD u CAT. L-ebda wieħed mill-flavonojdi ttestjati ma jaġixxi bħala inibituri riversibbli jew psewdo-irreversibbli tal-enzima CYP3A4 f'konċentrazzjoni ta' 25 μM, peress li l-attività tal-enzima ma setgħetx tiġi rkuprata bid-dijalisi biż-żieda ta' potassium hexacyanoferrate u mingħajrha. Peress li dawn il-flavonoids jistgħu jinstabu b'mod abbundanti f'diversi ikel bħal frott, ħxejjex, ħwawar, tejiet u inbid aħmar, hemm il-possibbiltà li jistgħu jinterferixxu ma 'diversi ksenobijotiċi li huma sottostrati ta' CYP3A4. Jinħtieġu aktar studji in vivo biex jiġu investigati kompletament il-possibilitajiet ta' tali interazzjonijiet bejn l-ikel u d-droga, kif ukoll il-kontribut possibbli ta' enzimi u trasportaturi oħra fl-interazzjonijiet.

Dan l-artikolu huwa estratt minn Molekuli 2021, 26, 3018