Kapitolu 2:Komposti li jimmiraw OSBPL7 Żieda ABCA1- Dipendenti tal-Kolesterol Efflux Preservazzjoni tal-Funzjoni tal-Kliewi f'Żewġ Mudelli ta' Mard tal-Kliewi

Għal aktar informazzjoni. kuntatttina.xiang@wecistanche.com

Diskussjoni

L-istudju preżenti jiddeskrivi l-identifikazzjoni ta' klassi ta' komposti permezz ta' skoperta ta' drogi fenotipiċi (PDD) li jirregolaw l-effluss tal-kolesterol dipendenti fuq ABCA1-. Id-dekonvoluzzjoni fil-mira wriet li l-OSBPL7 hija l-mira molekulari. F'mudelli ta 'annimali ta' mard tal-kliewi, dawn il-komposti naqqsu l-akkumulazzjoni tal-lipidi renali, evitaw it-telf ta 'podocyte, proteinurja normalizzata, u naqqsu t-tnaqqis tal-funzjoni renali.

Terapiji kurrenti għal kroniċimard tal-kliewihuma limitati għal ACEi, ARBs, u, aktar reċentement, sodium-glucose cotransporter-type 2 inibituri (SLGT2i). Minkejja l-effettività ta’ dawn l-aġenti biex idewmu l-progressjoni ta’ mard kroniku tal-kliewi, primarjament f’pazjenti b’mard proteinuriku tal-kliewi, il-ħtieġa medika mhux sodisfatta f’CKD tibqa’ immensa3,3940.Fi prova randomised ta’ 4300 pazjent, SGLT2i instab b’mod mhux mistenni li kien effikaċi irrispettivament. tal-preżenza tad-dijabete4, li jissuġġerixxi li huma involuti mekkaniżmi ta' rinoprotezzjoni minbarra dawk li jbaxxu l-glukożju. Fil-fatt, studju reċenti wera li SGLT2i jista 'jżid l-HDL fil-plażma u jista' jnaqqas l-akkumulazzjoni ta 'xaħam kardijaku42. Dan l-emerġenza reċenti ta 'SGLT2i jenfasizza l-benefiċċju li jiġu mmirati mekkaniżmi multipli ta' sewqan ta 'CKD biex jiġu żviluppati terapiji aktar effettivi.

Aħna, u oħrajn, iddeskrivejna l-akkumulazzjoni tal-kolesterol glomerulari fimard tal-kliewili jirriżultaw kemm minn oriġini metabolika kif ukoll mhux metabolika. L-akkumulazzjoni tal-lipidi glomerulari, flimkien ma' tnaqqis fl-effluss tal-kolesterol medjat minn ABAl, isseħħ f'DKD7-11, FSGS12-14, u AS13. Din id-dejta tissuġġerixxi li r-restawr tal-funzjoni ABCal jista’ jkun effettiv fit-trattament ta’ dawn it-tipi ta’ mard renali. Riċentement urejna li t-tnaqqis tal-kolesterol renali b'cyclodextrin, jew espressjoni żejda ġenetika ABCAL, tipproteġi minndisfunzjoni renalif'mudelli ta 'DKD9, FSGS13,14, u ASl3. Aħna wrejna wkoll li d-defiċjenza tal-ABAl speċifika għall-podoċiti tmur għall-agħar il-fenotip renali f'DKD7. Studji b'agonisti LXR, bħal T1317, ipprovdew ukoll appoġġ qawwi għal rwol ewlieni ta 'ABC Al, li baqa' mira terapewtika attraenti minkejja l-limitazzjoni ta 'dawn l-aġenti.

Fittixna aġenti permezz ta 'skoperta fenotipika tad-droga u ottimizzazzjoni ta' drugstore kandidat ta 'molekula żgħira. Aħna identifikajna serje ta' 5-arylnicotinamides, li bosta rappreżentanti tagħhom żiedu l-livelli tal-proteini ABCAl u l-effluss tal-kolesterol minn ċelloli mgħobbija bil-kolesterol. In-nuqqas ta 'attività tal-effluss fil-fibroblasti minn pazjent bil-marda ta' Tangier, u n-nuqqas ta 'żieda fl-mRNA ABCal, żvelaw mekkaniżmu ġdid ta' azzjoni.

L-isforzi ta' dekonvoluzzjoni fil-mira identifikaw l-OSBPL7 bħala mira ta' interess għoli. Is-sonda molekulari (³H-Cpd K) ingħaqdet b'mod effiċjenti OSBPL7 fiċ-ċelloli ħajjin u tista 'tkun ikkompeti b'mod effettiv ma' komposti mhux tikkettati. Aktar importanti minn hekk, urejna relazzjoni korrelattiva "attività-attività" għal sett akbar ta 'komposti bejn il-kapaċità tagħhom li jżidu l-effluss tal-kolesterol ABAl u l-kapaċità tagħhom li jikkompetu għall-irbit tas-sonda ma' OSBPL7. Analiżi mutazzjonali, flimkien ma 'studji ta' mudellar molekulari u docking, tindika interazzjoni diretta tal-komposti mal-but imbassar tal-irbit tal-isterol OSBPL7. Fl-aħħarnett, studji siRNA kkonfermaw l-involviment ta 'OSBPL7 fil-funzjoni ABC Al.

Ikklikkja biex tkun taf cistanche minn fejn tixtri u għal xiex tintuża cistanche  

Aħna identifikajna wkoll is-CBIR bħala mira potenzjali. Diversi rapporti jissuġġerixxu rwol għas-sinjalar endocannabinoid fir-regolamentazzjoni tal-kolesterol ċellulari. Rimonabant intwera li jirregola b'mod modest ir-riċettur tal-kennies B1 (SR-B1) u ABCGl, iżda mhux ABC Al, konsistenti mad-dejta tagħna45. Il-kannabinojde sintetiku WIN55,212-2 intwera li jnaqqas l-espressjoni ta 'ABC Al filwaqt li jżid ir-riċettur tal-keniesja CD36 fil-makrofaġi RAW264.7 mgħobbija b'oxLDL46. Flimkien din id-dejta ma tappoġġax rwol qawwi għas-CBIR fir-regolamentazzjoni ta’ ABCA1. Fl-istudji tagħna, rimonabant u agonisti/antagonisti CBIR oħra inklużi AM251, WIN55-212-2, u arachidonic choloroethylamine (ACEA), kienu inattivi biex jinduċu ABCA1 effluss tal-kolesterol (Figuri 3a, 4a).

Il-proteini li jorbtu l-ossisterol tal-mammiferi (OSBPs) kienu oriġinarjament implikati fil-bijosintesi tal-kolesterol u l-isfingomielin47-49. Diversi studji rabtu OSBPs speċifiċi mar-regolazzjoni tal-istabbiltà tal-proteina ABC Al u l-effluss tal-kolesterol medjat minn ABAl50,51. L-ebda dejta qabel ir-rapport preżenti ma implikat OSBPL7 bħala regolatur ta' ABCA1. Id-dejta tagħna tissuġġerixxi li OSBPL7 jista 'jipprovdi funzjoni ta' trasferiment ta 'chaperone jew sottostrat li taffettwa ABC Al. Esperimenti preliminari ta 'ko-immunopreċipitazzjoni f'ċelloli trasfettati ma identifikawx interazzjoni diretta bejn iż-żewġ proteini. Madankollu, meta-analiżi ta 'studji ta' assoċjazzjoni mal-ġenoma kollu (GWAS) identifikat OSBPL7 fost 60 loci ġenetiku li jinfluwenzaw il-livelli tal-kolesterol fil-plażma fil-bnedmin.

L-interess fit-tul tagħna fir-rwol tal-ABC Al fil-mard tal-kliewi wassalna biex nevalwaw il-mudelli 5-arilnicotinimidi in vitro u in vivo tal-mard tal-kliewi. Sibna li l-OSBPL7 huwa espress fil-kliewi, inkluż fil-glomeruli u l-podoċiti, u li Cpd A u Cpd G jirregolaw l-effluss tal-kolesterol medjat minn apo Al minn podoċiti mgħobbija bil-kolesterol. Cpd A u Cpd G jippromwovu żieda ta 'ABAl fil-membrana tal-plażma mingħajr ma jaffettwaw l-espressjoni ta' mRNA. Dan il-mekkaniżmu jikkuntrasta ma 'agonisti LXR, li jirregolaw 'l fuq tal-mRNA ABAl li jwassal għal żieda fl-ABC Al kemm fil-plażma kif ukoll fil-membrani intraċellulari. Aħna evalwajna l-effikaċja terapewtika ta 'Cpd A u Cpd G in vivo f'mudell tal-ġurdien ta' FSGS (nefropatija indotta mill-ADR). Iż-żewġ aġenti nstabu li jnaqqsu l-kontenut tal-kolesterol renali, li jikkorrelataw ma 'proteinurja mnaqqsa, telf ta' piż, u bidliet patoloġiċi renali. Cpd G kien effettiv ħafna biex jipprevjeni t-telf tal-podoċiti kkaġunat mill-ADR u l-bidliet strutturali glomerulari. It-tnaqqis sinifikanti ta 'ABCAL fil-kliewi, akkumpanjat minn żieda filinfjammatorjiproteini, ġie evitat minn Cpd G, li jappoġġja rwol ewlieni għal ABCA1. Cpd G naqqas b'mod effettiv l-albuminurja, il-BUN, u l-livelli tal-kreatinina fis-serum fil-ġrieden AS. Aktar importanti minn hekk, Cpd G tawwal il-ħajja f'annimali Col4a3 anzjani b'insuffiċjenza renali avvanzata.

Din id-dejta tappoġġja l-potenzjal terapewtiku ta 'komposti li jimmiraw għall-ABCAL u jissuġġerixxu bil-qawwa li dan il-mod ta' azzjoni ġdid se joffri effikaċja addizzjonali, jew kumplimentari għal mediċini li jimmiraw lejn RAAS, SGLT2, NRF2, u sinteżi jew assorbiment tal-kolesterol. Notevolment, b'kuntrast mal-effett ta 'Cpd G, l-imblokk RAAS ma jtawwalx il-ħajja fi ġrieden Col4a3 anzjani, minkejja li huwa l-aktar terapija effettiva għal intervent bikri f'dan il-mudell53,54. L-attività antiproteinurika ta 'Cpd G kienet superjuri għall-effetti ta' ramipril li rrapportajna qabel f'mudell syngeneic ta 'AS38. Cpd G għalhekk jista' jimmira aħjar il-popolazzjoni ta' pazjenti b'AS u proteinurja meta mqabbel ma' bardoxolone, agonist ta' NRF-2 li ntwera li jżid il-GFR iżda ma kellu l-ebda effett fuq proteinurja, l-iktar tbassir qawwi ta' 10- sena riskju ESRD fil-popolazzjoni ġenerali55,56. Statins instabu li huma protettivi f'AS57 sperimentali, u huma rakkomandati fil-pazjenti kollha b'CKD biex inaqqsu r-riskju kardjovaskulari, iżda wrew li huma ineffettivi biex inaqqsu l-progressjoni tal-mard tal-kliewi 8. Fl-aħħar nett, reċentement irrappurtajna benefiċċju potenzjali ta' ezetimibe f'AS permezz ta' tnaqqis ta' aċidu xaħmi u assorbiment tat-trigliċeridi. Madankollu, ezetimibe ma affettwax il-kontenut tal-kolesterol fil-kliewi, u l-effikaċja tiegħu biex ittejjeb il-GFR u tnaqqas il-proteinurja kienet inferjuri għall-effetti li nirrapportaw hawn għal Cpd G

Fil-qosor, ir-rapport preżenti jiddeskrivi l-identifikazzjoni permezz ta 'skoperta ta' droga fenotipika ta 'molekuli żgħar li jixbħu mediċina ta' l-ewwel fil-klassi li jinduċu l-effluss tal-kolesterol medjat minn ABAl. Il-bijoloġija kimika identifikat l-OSBPL7 bħala l-mira molekulari u wriet li l-molekuli jinteraġixxu b'mod intima fid-dominju mbassar ta' rbit ta' oxysterol. Sa fejn nafu aħna, dan huwa wieħed mill-ftit eżempji biss ta’ komposti li jixbħu mediċini li inizjalment ġew skoperti minn approċċi fenotipiċi, li l-mira tagħhom sussegwentement ġiet identifikata b’suċċess44. Il-komposti G u A kienu effikaċi ħafna biex itejbu l-funzjoni renali f'mudelli tal-ġrieden li jirriflettu żewġ etjoloġiji differenti ta' mard renali progressiv. Jidher li huma sikuri u tollerati tajjeb, kif rifless mill-abbiltà tagħhom li jnaqqsu l-livelli ta 'AST fil-ġrieden ikkontestati mill-ADR u, b'mod aktar konvinċenti, li jtawlu l-ħajja tal-ġrieden Col4A3 KO. Dawn il-komposti jistgħu joffru terapija ġdida potenzjali għall-mard tal-kliewi billi jimmiraw il-metaboliżmu tal-kolesterol ċellulari permezz ta 'mod ġdid ta' azzjoni. Dawn l-aġenti, flimkien ma 'mediċini attwali li jimmiraw il-pressjoni tad-demm jew il-kontroll tal-glukożju, jistgħu jindirizzaw il-ħtieġa sinifikanti mhux sodisfatta fis-CKD.

Metodi

Komposti. Il-komposti użati f'dan l-istudju huma miġbura fil-qosor fit-Tabella Supplimentari 5 u ġew sintetizzati f'F.Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, l-Isvizzera sakemm ma jkunx indikat mod ieħor. Għal esperimenti in vitro, komposti lajofilizzati ġew rikostitwiti f'DMSO (Sigma) u l-alikwoti ġew maħżuna fi -20 grad. Għal esperimenti in vivo, komposti lajofilizzati ġew sospiżi mill-ġdid f'vetturi li kien fihom 1.25 fil-mija hydroxypropyl methylcellulose,0.10 fil-mija melħ tas-sodju docusate,0.18 fil-mija propylparaben sodium, u 0.02 fil-mija aċidu ċitriku monoidrat, f'pH 6. Sospensjoni ta 'partiċelli fini kienet iġġenerata minn tliet ivvibrazzjonijiet tal-polz qosra mwettqa fuq is-silġ.

Proċeduri tal-kimika sintetika u data analitika. Jekk jogħġbok irreferi għall-fajl tad-Data Supplimentari 1.

Bijoloġija kimika/screening tal-mira kandidat Fil-qosor, plasmid li jesprimi mira kandidat ta' interess imdewweb b'tikketta FLAG ġie trasfettat fiċ-ċelloli HEK293. Wara 24 siegħa, il-kompost tritiated K f'konċentrazzjoni li kapaċi tinduċi effluss tal-kolesterol medjat minn ABCA (1.0 μM) ġie miżjud għal 3 sigħat, imbagħad iċ-ċelloli ħajjin ġew esposti għad-dawl UV (K{{{ 7}} nm) biex issir mistoqsija in situ ta' kompost/target cross-linking potenzjali. Ġew ippreparati lisati taċ-ċelluli, il-proteina espressa mbagħad ġiet immunoprecipitata b'mod selettiv bl-użu ta' antikorp anti-FLAG akkoppjat ma' żibeġ ta' sepharose, proteini marbuta ġew isseparati b'SDS-PAGE, u żewġ blots identiċi ġew ippreparati u sondati permezz ta' western blot u b'awtoradjografija biex tindividwa l-espressjoni tal-proteini. u l-preżenza jew in-nuqqas ta 'crosslinking kompost, rispettivament. Il-flow chart ta 'dan l-iskrin hija illustrata fil-Fig. 2. Figura 2d turi l-abbiltà ta' Cpd A u Cpd G li jċaqalqu Cpd K tritiated minn OSBPL7 espress żżejjed u immuno-preċipitat. Il-Figura 3b turi l-użu ta 'dan l-assaġġ biex tiskopri l-irbit ta' Cpd K tritiated ma' varjanti espressi żżejjed u immunoprecipitati ta 'OSBPL7 li fihom mutazzjonijiet puntwali fil-but imbassar ta' rbit ta 'ossisterol ta' OSBPL7. Il-vantaġġi ta 'dan il-metodu huma i. l-użu tat-trasfezzjoni tal-plasmid iwassal għal espressjoni għolja ta' kull kandidat li jnaqqas il-probabbiltà li tintilef mira awtentika għal dawk li jistgħu jiġu espressi f'livelli endoġeni baxxi, iii. l-interazzjoni tas-sonda kimika mal-mira tagħha sseħħ f'kuntest bijoloġiku rilevanti (ċelluli ħajjin) f'konċentrazzjoni farmakoloġikament attiva, u iii. l-immunopreċipitazzjoni tippermetti li l-proteina espressa ta 'interess tiġi purifikata minn proteini fl-isfond, u ttejjeb sostanzjalment il-proporzjon tas-sinjal/ħoss.

Kultura taċ-ċelluli. Linji taċ-ċelluli nxtraw minn ATCC u subkultivati ​​għal mhux aktar minn passaġġ 15, ħlief għall-podoċiti umani, li kienu oriġinarjament minn Dr Jochen Reiser. Podoċiti umani immortalizzati kondizzjonali ġew ikkultivati ​​taħt kundizzjonijiet permissivi fi 33 grad, f'medja RPMI (Corning) li kien fih 10 fil-mija FBS (GIBCO), 1 fil-mija penicillin/streptomycin,0.01. mg/ml insulina umana rikombinanti, 0.0055 mg/ml transferrin uman (sostanzjalment ħieles mill-ħadid), u 0.005 ug/ml selenit tas-sodju (ITS, Corning). Biex jinduċu d-divrenzjar, il-podoċiti ġew ikkultivati ​​f'37 grad għal 14-il jum f'medja RPMI li fiha 10 fil-mija FBS (GIBCO) u 1 fil-mija penicillin/streptomycin. Podocytes differenzjati kienu starved f'RPMI -0.2 fil-mija FBS għal 18h u mbagħad ittrattati b'1 uM, 5 uM, u 10 μM ta 'komposti ppreparati friski f'DMSO għal 18 h f'37 grad kif indikat.

Efflux tal-kolesterol fil-makrofaġi u l-fibroblasti. Il-kapaċità tal-komposti li jinduċu l-effluss tal-kolesterol medjat minn ABAl ġiet determinata f'kulturi replikati ta 'ċelluli THP1 jew fibroblasts f'mikroplates 96-well. Iċ-ċelloli ġew ibbanjati f'densità ta' 150,000 ċelluli/bir. Il-monoċiti THP1 ġew differenzjati għal makrofaġi biż-żieda ta 'PMA (100 nM) għal 72 siegħa f'medja RPMI li fiha 10 fil-mija serum bovin tal-fetu u 3 pl ta' 2-mercaptoethanol. Iċ-ċelloli ġew maħsula darba b'RPMI-1640 u mbagħad mgħobbija b'50 ug/ml acetylated LDL, u 10μCi/ml 【'H】-kolesterol f'RPMI-1640 medju li kien fih 2 fil-mija FCS, għal 48h f'37 grad . Wara t-tagħbija, iċ-ċelluli ġew maħsula darba b'RPMI-1640 u inkubati b'komposti tat-test għal 24 siegħa addizzjonali f'medja RPMI-1640 li fiha l mg/ml albumina tas-serum bovina ħielsa mill-aċidu xaħmi (BSA). Iċ-ċelloli mbagħad inħaslu darba, u l-effluss tal-kolesterol ġie indott biż-żieda ta’ 10 ug/ml ta’ apoAI uman jew 30 ug/ml ta’ HDL2, HDL3, jew LDL f’RPMI-1640 li kien fih I mg/ml BSA għal addizzjonali 6h. Ir-radjuattività fis-supernatanti tal-kultura ġiet iddeterminata bl-għadd ta' tpetpet. L-effluss tal-kolesterol kien espress bħala valur relattiv vs kontrolli inkubati fin-nuqqas ta 'aċċettaturi tal-kolesterol. Il-kurvi tar-rispons tad-doża ġew ikkalkulati bl-użu ta' XLfit3 (ID Business Solutions Ltd. UK).

Efflux tal-kolesterol fil-podoċiti. Il-podoċiti umani differenzjati għal 13-il jum ġew ittikkettati għal 24 siegħa f'37 grad f'medja RPMI li fiha 2 fil-mija FBS u [PH]-kolesterol (1 uCi/ml, American Radiolabeled Chemicals). Iċ-ċelloli mbagħad ġew maħsula 3 darbiet b'PBS u inkubati b'RPMI supplimentat b'0.2 fil-mija bla xaħam-BSA (Sigma) bi jew mingħajr komposti għal 18- siegħa f'37 grad. Il-komposti ntużaw fil-konċentrazzjonijiet li ġejjin∶ Cpd C（1 μM), Cpd A （1 μM, 5 uM), u Cpd G（l uM, 5 uM,10 μM）. Wara l-inkubazzjoni 18-h, apoAI umana (Calbiochem) ġiet miżjuda mal-midja, (2{0 ug/mL konċentrazzjoni finali) u ċ-ċelloli ġew inkubati għal 18-il siegħa oħra f'37 grad. Alikwoti ta' medju miġbura qabel (T =0h) u wara (T{=18h) iż-żieda ta' apoAI ġew ċentrifugati fi 12,00xg għal 5 min u r-radjuattività fis-supernatant kien magħdud bi tpetpet likwida. Iċ-ċelloli mbagħad ġew maħsula b'PBS, lysed 0.1 fil-mija SDS, 0.1M NaOH u r-radjuattività fil-lysates ġiet ikkwantifikata bi tpetpet likwida. L-effluss tal-kolesterol medjat minn apo Al, espress bħala perċentwali, ġie kkalkulat bħala l-ammont ta’ tikketta rilaxxata fil-mezz wara li żżid apo Al (id-differenza fir-radjuattività fil-mezz qabel u wara li żżid ApoA1) diviż bl-ammont ta’ tikketta totali f’kull bir (radjuattività rilaxxata lill-midja flimkien mar-radjuattività fiċ-ċelloli lisizzati).

studji siRNA. Għaqdiet ta' siRNA speċifiċi għal OSBPL7 uman, CBIR uman, u kontroll negattiv ta' siRNA mhux fil-mira huma miġbura fil-qosor fit-Tabella Supplimentari 6. Il-monoċiti THPI ġew miżrugħa f'densità ta' 80,000 ċelluli/bir fi {{4} }pjanċi sew u differenzjati bil-PMA kif deskritt hawn fuq. Wara 72 siegħa, il-mezz ġie sostitwit b'50 ul ta' medium frisk għal kull bir. Iċ-ċelloli mbagħad ġew trasfettati bl-użu ta' reaġent Viromer Blue (Origene) skont id-direzzjonijiet tal-manifattur. Fil-qosor, 10 ul ta 'siRNA (5 μM) tħalltu ma' 90 ul ta 'Viromer Blue (dilwit 1 fil-mija v/v fil-buffer fornut). Wara 15-il minuta inkubazzjoni, kumplessi ta 'reaġent ta' trasfezzjoni siRNA ġew dilwiti f'1: 6.5 f'medja friska u miżjuda ma 'volum ta' 50 ul għal kull bir. Wara 24h, iċ-ċelloli mbagħad ġew mgħobbija bil-kolesterol permezz ta 'inkubazzjoni b'LDL aċetilat (25 ug/ml) f'medja RPMI, 1 fil-mija FBS, 100 nM PMA, 2 μCi H-kolesterol għal 24h. Sett ta 'bjar li fihom ċelluli trasfettati twarrab biex tivverifika l-effiċjenza tat-trasfezzjoni permezz ta' RT-PCR. Il-makrofagi mgħobbija bil-kolesterol imbagħad ġew inkubati fil-preżenza ta 'Cpd G 5 uM, jew vettura (0.1 fil-mija DMSO) f'medja RPMI li Phenol Red, 0.2 fil-mija BSA) għal 24 siegħa addizzjonali. L-effluss tal-kolesterol imbagħad ġie mkejjel kif deskritt hawn fuq.

RT-PCR. L-RNA ġie iżolat bl-użu tal-kit RNEasy Plus Mini (Qiagen). Traskrizzjoni inversa twettqet bl-użu ta 'qScript cDNA SuperMix(Quantabio) skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. PCR kwantitattiv f'ħin reali twettqet bl-użu ta 'TaqMan Fast Universal PCR Master Mix u analiżi tal-espressjoni tal-ġeni Taqman (Tabella Supplimentari 7).

Western blot. Lysates jew frazzjonijiet taċ-ċelluli ġew inkubati f'Laemmli buffer f'55 grad għal 10 min taħt kundizzjonijiet ta 'tnaqqis. Total ta '30 ug ta' proteina minn lysates taċ-ċelluli jew terz tal-volum miġbur fi preparazzjonijiet ta 'frazzjonijiet taċ-ċelluli ġew separati minn SDS-PAGE f'4-20 ġels gradjent fil-mija (Biorad) u proteini mbagħad ġew trasferiti għal membrani PVDF. Wara l-imblukkar b'5 fil-mija TBS-ħalib, il-membrani ġew ittestjati b'antikorpi primarji matul il-lejl f'4 gradi. Intużaw l-antikorpi primarji li ġejjin: ġrieden anti-ABCA1(Abcam; 1:1000), antikorp tal-fenek anti-GAPDH (Milli-pore;1:10,000), ġrieden anti-actin( CP01,Millipore 10,000),anti-MEK, anti-ERp72, anti-V5 u anti-Na plus /K plus ATPase (Cell Signaling; kollha 1:100), u fenek anti-OSBPL7 (Sigma ; 1:1000). Wara l-ħasil, il-membrani ġew inkubati b'antikorpi IgG-HRP kontra l-fenek jew kontra l-ġurdien (Promega,1:10,00). Sinjali ġew skoperti wara l-inkubazzjoni b'substrat Westernbright ECL HRP (Advansta) u s-sinjali tal-luminixxenza nqabdu b'workstation Azure C600 Gel Imaging (Azure Biosystems Inc, USA) jew films tar-raġġi X.

Il-frazzjonament taċ-ċelluli. Podoċiti differenzjati ġew ittrattati b'komposti Cpd C (l μM), Cpd A (5 μM), jew Cpd G (10 μM) għal 18-il siegħa, maħsula, u mbagħad maħsuda f'PBS kiesaħ bis-silġ. Iċ-ċelloli ġew ċentrifugati f'1000xg għal 5 min, is-supernatant tneħħa bir-reqqa, u l-pellet reġa' ġie sospiż f'buffer ipotoniku (15 mM KCl, 1.5 mM MgClz, 10mM HEPES, u I mM DTT) supplimentat bi protease. cocktail inibitur (Roche). Iċ-ċelloli ġew imfixkla b'douncer tal-ħġieġ, u sukrożju ġie miżjud biex tinkiseb konċentrazzjoni finali ta '227mM. Lisati taċ-ċelluli ġew ċentrifugati f'1000xg għal 30 min f'4 gradi. Is-supernatant imbagħad ġie trasferit għal tubu ġdid u ċentrifugat f'10,000 × g għal 15-il minuta f'4 gradi. Il-pellet, li kien fih il-frazzjoni mikrosomali, inġabret u s-supernatant ġie trasferit għal tubu ġdid u ċentrifugat f'100,000 × g għal siegħa f'4 gradi. Inġabret il-frazzjoni tal-membrana tal-plażma bil-gerbub u s-supernatant, li kien fih il-frazzjoni ċitosolika mingħajr organelli, ġie kkonċentrat f'kolonni tal-filtri Vivaspin 500. Western blot twettqet bl-użu ta 'antikorpi għal ABAl u markaturi speċifiċi għal kull frazzjoni tal-membrana kif deskritt hawn fuq. Nat/K flimkien ma 'ATPase intuża biex jidentifika l-frazzjoni tal-membrana tal-plażma, ERp72 bħala markatur għall-frazzjoni arrikkita bil-mikrosomali, u MEK bħala l-kontroll għall-frazzjoni ċitosolika mhux membranuża.

ABC AT ko-immunopreċipitazzjoni. ABCA{{0}}Il-kostruzzjoni tal-bandiera ġiet ġentilment ipprovduta minn Dr.Michael Fitzgerald, l-Università ta' Harvard. OSBPL7-V5 construct (pcDNA3.1-V5-ORP7) inxtara mingħand Addgene. Vetturi tal-espressjoni tal-mammiferi PCMV6-AN-GFP u pCMV6-AC-3DDK, minn Origene, intużaw bħala kontrolli negattivi. Iċ-ċelloli HEK293 ġew ko-trasfettati b'mod temporanju b'waħda mill-kombinazzjonijiet ta' plasmidi li ġejjin:(1)ABCA1-Bandiera flimkien ma' OSBPL7-V5;(2)ABCA1-Bandiera flimkien ma' PCMV{{19 }}AN-GFP; jew(3) OSBPL7-V5＋pCMV6-AC-3DDK bl-użu ta' reaġent ta' trasfezzjoni Fugene 6 (Promega) billi ssegwi l-istruzzjonijiet tal-manifattur. 48h wara t-trasfezzjoni, iċ-ċelloli ġew lysed b'1 ml buffer immunopreċipitazzjoni (1 fil-mija Triton X-100,50 mM Tris-Cl pH 7.0,150mM NaCI) supplimentat b'cocktail inibitur tal-protease (Roche). Il-lysates ġew ikklerjati biċ-ċentrifugazzjoni u ammonti ugwali ta 'proteini totali minn kull supernatant ġew inkubati matul il-lejl f'4 gradi bi 30 ul ta' ġel ta 'Affinità kontra Bandiera M2 （Sigma Aldrich）. Iż-żibeġ ġew imqassma permezz ta 'ċentrifugazzjoni u maħsula 5 darbiet b'1 ml ta' buffer ta 'immunopreċipitazzjoni. Proteini immunoprecipitati ġew elużi billi inkubaw iż-żibeġ b'50 ul ta' 2x kampjun buffer għal 15-il minuta f'56 grad. Il-preżenza ta' ABC A1 u OSBPL7-V5 fil-lysates u l-eluates ġiet ivverifikata bil-western blot kif deskritt hawn fuq.

Studji fuq l-annimali. L-annimali kienu miżmuma fuq ċikli ta’ dawl/dlam ta’ 12-il siegħa/12-il siegħa u taħt temperatura kkontrollata (18-23 grad ) u umdità (40-60 fil-mija ) f’faċilità tal-annimali ħielsa mill-patoġeni tad-Diviżjoni tar-Riżorsi Veterinarji fl-Università ta’ Miami, Miller School of Medicine. Il-ġrieden ġew ipprovduti dieta standard ta '18 fil-mija ta' proteina għall-annimali gerriema u ilma ad libitum. Il-protokoll ta 'studju ġie approvat mill-Kumitat għall-Kura u l-Użu tal-Annimali (IACUC) tal-Università ta' Miami, li huwa akkreditat mill-Assoċjazzjoni għall-Valutazzjoni u l-Akkreditazzjoni tal-Laboratorju tal-Kura tal-Annimali Internazzjonali (AAALAC). Il-proċeduri kollha twettqu f'konformità mar-regolamenti etiċi federali u statali kollha, inklużi r-regolamenti tal-Att dwar il-Benessri tal-Annimali (AWA) issorveljati mid-Dipartiment tal-Agrikoltura tal-Istati Uniti (USDA) u l-Politika tas-Servizz tas-Saħħa Pubblika dwar il-Kura Umana u l-Użu tal-Annimali tal-Laboratorju (PHS). Politika) amministrata mill-Istituti Nazzjonali tas-Saħħa (NIH), Uffiċċju tal-Benessri tal-Annimali tal-Laboratorju (OLAW). Ġrieden Balb/c femminili nxtraw mill-Laboratorji Jackson għal studji ta 'nefropatija indotta minn Adriamycin. Fl-età ta' 8 ġimgħat, il-ġrieden irċevew doża waħda ta' Adriamycin (Sigma-Aldrich, 12mg/Kg) jew vettura (0.9 fil-mija NaCI) permezz ta' injezzjoni tal-vina tad-denb. Il-ġrieden ġew separati b'mod każwali f'sitt gruppi sperimentali u, li jibdew f'24 siegħa wara l-injezzjoni ta 'ADR, ittrattati jew b'vettura jew b'dożi differenti ta' komposti kuljum permezz ta 'gavage orali għal 28 jum. Intużaw id-dożi li ġejjin: Cpd C (agonist LXR) 10mg/Kg; Cpd A 30mg/Kg; Cpd G 100mg/Kg. L-annimali kollha ġew sagrifikati 28 jum wara l-injezzjoni ta' l-ADR. Ġrieden Col4a3 KO (Col4a3tmiDec razza 129X1/SvJ) inxtraw minn Jackson Labs. Il-ġrieden ġew separati b'mod każwali f'2 gruppi. Li jibdew minn 4 ġimgħat, il-ġrieden ġew iddożati permezz ta 'gavage orali darba kuljum b'vettura jew Cpd G (100 mg/Kg) għal 4 ġimgħat segwiti minn sagrifiċċju ta' 8 ġimgħat. It-tieni studju sar fil-ġrieden Col4a3 KO bi trattament mibdi fl-età ta '6 ġimgħat. Dan l-istudju sar sabiex jiġi evalwat jekk it-trattament Cpd G ta' ġrieden b'insuffiċjenza renali stabbilita jistax jittardja l-marda tal-kliewi fl-aħħar stadju u għalhekk itawwal is-sopravivenza. Għat-trattament b'ramipril, il-ġrieden Col4a3 KO bdew jirċievu ramipril fl-età ta' 4 ġimgħat. Ramipril ġie miżjud mal-ilma tax-xorb f’konċentrazzjoni li twassal għal doża ta’ 10 mg/Kg/jum 8.

Analiżi fenotipika tal-ġrieden. Inġabru kampjuni tal-awrina fuq il-post ta' kull ġimgħa. L-albumina urinarja ġiet imkejla b'ELISA (laboratorji Bethy!) u kreatinina b'assaġġ kolorimetriku (Stanbio). Albuminurja kienet espressa bħala l-proporzjon albumina/kreatinina. Il-ġrieden ġew anestetizzati b'Ketamine (90 mg/Kg)/Xylazine(10mg/Kg), id-demm inġabar f'tubi eparinizzati, u l-annimali mbagħad ġew imxerrda permezz tal-ventrikolu tax-xellug b'soluzzjoni ta '0.9 fil-mija ta' NaCl. Il-kortiċi tal-kliewi ġew imneħħija bir-reqqa u separati f'kampjuni li kienu jew iffriżati snap, inkorporati f'OCT, jew iffissati f'formalin ta '10 fil-mija għal valutazzjonijiet sussegwenti.

Determinazzjoni tad-depożizzjoni tal-lipidi fis-sezzjonijiet tal-kortiċi tal-kliewi. Kampjuni tal-kortiċi tal-kliewi inkorporati OCT ġew cryosectioned bi ħxuna ta '4 μm u mtebbgħin biż-Żejt. Soluzzjoni ħamra O-isopropanol (Electron Microscopy Science, PA) dilwita 6:4 fl-ilma u mbagħad counterstained b'Hematoxylin Harris Hg Free (VWR, PA). It-taqsimiet imbagħad ġew evalwati bl-użu ta 'mikroskopju tad-dawl (Olympus BX 41, Tokyo, Ġappun).

Determinazzjoni tal-kontenut tal-kolesterol u t-trigliċeridi. Kampjuni tal-kortiċi tal-kliewi ffriżati snap ġew omoġenizzati f'buffer tal-fosfat tal-potassju 2 mM, pH 7,(1{{1{0}} pul buffer/mg tissue) bl-użu ta' glass douncer fuq is-silġ. 100 ul ta 'l-omoġenat tħalltu sewwa ma' I ml ta 'hexane: isopropanol (3:2;vv) għal kull volum ta' omoġenat tat-tessuti Il-fażijiet akweju (pellet) u organiku (supernet) ġew separati permezz ta 'ċentrifugazzjoni fi 12,000× g għal min 5. Pellets (fażi akweja) ġew imnixxfa u rikostitwiti fi 8 M urea, 0.1 fil-mija SDS, 0.1 M NaOH, u l-proteini totali ġew ikkwantifikati bil-metodu BCA (Thermofisher).Il-fażi organika ġiet imnixxfa b'espożizzjoni għan-nitroġenu. Il-lipidi mbagħad ġew rikostitwiti f'100 ul isopropanol∶NP-40 (9:1;vv). Il-kontenut ta' trigliċeridi ġie ttestjat permezz ta' kit kolorimetriku skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur (Cayman Chemical USA). Il-kontenut totali ta' kolesterol u CE ġew ttestjati bl-użu metodu fluworometriku enżimatiku 59. Għall-kejl tal-kolesterol totali, estratti ġew dilwiti 1:100 f'assay buffer (100 mM fosfat tal-potassju e,50mM NAC,5mM aċidu koliku,0.1 fil-mija Triton X-10,pH 7.4)li fihom kolesterol oxidase (1 U/ml), kolesterol esterase (1 U/ml), horseradish peroxidase (1 U/ml), u Amplex Red（75 μM）. Ir-reazzjonijiet ġew inkubati f'37 grad għal 30 min fi pjanċa sewda opaka 96-(Greiner) u l-fluworexxenza ġiet imkejla f'qarrej tal-mikroplate (Spectramax i3X, Apparat Molekulari) f'eċitazzjoni ta '530 nm u 580 emissjonijiet.

Għad-determinazzjoni CE, 150 ul tal-assay buffer deskritt hawn fuq, supplimentat b'catalase tal-fwied bovin (45 U/ml) u kolesterol oxidase (1 U/ml), ġie miżjud ma' 25 ul ta' kampjun u inkubat matul il-lejl f'37 grad biex jonqos ħieles. kolesterol li jħalli biss esteri tal-kolesterol. Imbagħad, ġew miżjuda 75 ul ta 'reaġent ta' skoperta tal-ester tal-kolesterol (1 U/ml kolesterol oxidase, 4 U/ml esterase tal-kolesterol, 24 U/ml perossidasi tar-ravanell, 300 μM Amplex Red）. Ir-reazzjoni ġiet inkubata f'37 grad għal 30 min u is-sinjal tal-fluworexxenza tkejjel kif deskritt hawn fuq.L-istandards interni inkludew kampjuni li fihom 1 mM ta kolesterol u 5 uM ta kolesterol oleate sabiex jivverifikaw il-kompletezza tad-dekompożizzjoni enżimatika tal-kolesterol ħieles kif ukoll is-sensittività u l-ispeċifiċità tal-assaġġ.

Evalwazzjoni istoloġika. Sezzjonijiet tal-kortiċi tal-kliewi inkorporati fil-paraffin iffissati b'formalina ta '4 um ħxuna kienu mtebbgħin b'Aċidu Perjodiku-Schiff(PAS). Il-pjastri ġew analizzati minn patologu renali f'disinn double-blind. Sklerożi glomerulari, (globali u segmentali), ipertrofija tal-podoċiti, u iperplażja tal-podoċiti ġew espressi bħala l-perċentwal ta 'glomeruli misjuba b'dawn l-anormalitajiet. Mikroċisti tubulari u infjammazzjoni interstizjali ġew skurjati fuq skala 0-4 fejn 0=0 fil-mija ,05=1-10 fil-mija ,1=11-25 fil-mija ,2:26-50 fil-mija ,3:{{ 12}} fil-mija , u 4=aktar minn 75 fil-mija ħsara. L-espansjoni tal-mesanġjali ġiet ikkalkulata abbażi ta' analiżi semi-kwantitattiva (skala 0-5) jew fil-mija tal-glomeruli li juru espansjoni tal-mesanġjali (perċentwali).

Mikroskopija tal-immunofluworexxenza. Għall-iskoperta tal-espressjoni tal-ABC Al, sezzjonijiet tal-kortiċi tal-kliewi tal-paraffin 4 um ġew deparaffinizzati u idratati mill-ġdid. L-antiġeni ġew irkuprati billi jagħli għal 30 min f'citrat buffer pH 6.0(Target Retrieval Solution, Citrate pH 6, Sigma, USA). Is-sezzjonijiet ġew permeabilizzati għal 30 min b'0.1 fil-mija Triton X-100 f'TBS. Sezzjonijiet tat-tessuti ġew inkubati b'10 fil-mija serum tal-mogħoż (qattus #G9023, Millipore Sigma) u 1 fil-mija BSA (qattus # SP-5050-500, Vector, USA) f'TBS-T għal siegħa f'temperatura tal-kamra biex jimblokka kwalunkwe mhux speċifiku. vinkolanti. Il-kampjuni ġew imbagħad inkubati matul il-lejl f'4 gradi b'antikorpi Rat anti-ABCAL(Novus,1:200) u Rabbit anti-WI1 (Abcam,1:200) f'kamra umidifikata. Wara l-ħasil estensiv, il-kampjuni ġew imbagħad inkubati għal I h f'RT b'antikorpi sekondarji konjugati bil-fluorokrom (Invitrogen, 1:500). Medja ta' immuntar antifade li fiha DAPI (Vectashield Plus) ġiet miżjuda mas-sezzjonijiet qabel ma ġiet analizzata

L-immaġini ġew akkwistati bl-użu ta 'Mikroskopju Konfokali FluoView FV1000 (Olympus) b'lenti oġġettiva taż-żejt x63 fi pjani differenti bl-użu ta' mudell tas-serje Z b'daqs ta 'pass ta' 0.18 um. Waqt l-analiżi, pjani individwali ġew dekonvoluti u f'munzelli biex jipproduċu immaġni massima proġettata bl-użu ta 'flu view software verżjoni 4.3b (Olympus). Minimu ta '5 immaġini ġew maqbuda minn 5 oqsma differenti għal kull kampjun. Il-kwantifikazzjoni tal-intensità tal-fluworexxenza medja glomerulari ABAl (MFI) saret bl-użu tas-softwer Fiji—ImageJ.

Għall-iskoperta ta 'OSBPL7,4 um sezzjonijiet tal-kortiċi tal-kliewi ffriżati inkorporati f'OCT, ġew iffissati b'PFA-sukrożju (2 fil-mija, 4 fil-mija) f'PBS għal 20min f'RT u permeabilizzati b'0.3 fil-mija Triton-PBS għal 15-il minuta u mblukkat b'buffer imblukkar (5 fil-mija FBS f'PBS) għal 1h. Sezzjonijiet tat-tessut imbagħad ġew inkubati b'antikorpi tal-fenek anti-OSBPL7 (Sigma, 1:50) u Mogħoż anti-Synaptopodin (Santa Cruz, 1:800) f'kamra umidifikata matul il-lejl f'4 gradi. Wara l-ħasil estensiv, il-kampjuni ġew imbagħad inkubati b'antikorpi sekondarji konjugati bil-fluworokrom, u mgħottija b'mezzi ta 'immuntar kif deskritt hawn fuq. L-immaġini nqabdu bl-użu ta 'mikroskopju fluworexxenti Leica DMI 6000B.

Analiżi statistika. GraphPad Prism ver 6 jew 7 intuża biex twettaq l-analiżi statistiċi kollha. Il-gruppi tqabblu bl-użu ta' test t b'żewġ denbu jew ANOVA f'direzzjoni waħda segwita mit-test ta' Dunnett jew ta' Tukey. It-test F, Brown-Forsythe, jew Bartlett intuża biex jiddetermina varjanzi sinifikanti bejn il-gruppi, jekk P<0.05, then="" groups="" were="" compared="" using="" two-tailed="" mann-whitney,="" or="" kruskal-wallis="" followed="" by="" dunn's="" tests.="" the="" correlation="" between="" albuminuria="" and="" accumulation="" of="" cholesterol="" ester="" in="" kidney="" cortexes="" was="" assessed="" using="" the="" spearman="" coefficient="" test.="" p=""><0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" only="" data="" from="" independent="" experiments="" were="">

L-annimali kollha ġew assenjati b'mod każwali għal gruppi ta 'trattament.