Bijomonitoraġġ tal-Mikotossini fil-Plażma ta' Pazjenti bil-marda ta' Alzheimer u ParkinsonⅡ

2. Riżultati u Diskussjoni

2.1. Analiżi LC-MS/MS

Minħabba l-karatteristiċi fiżikokimiċi differenti tagħhom, il-mikotossini ġew maqsuma għas-separazzjoni kromatografika f'żewġ gruppi (ara t-taqsima tal-materjal u l-metodi). Il-figuri li ġejjin (Figuri 1–4) juru kromatogrammi estratti sovrapposti ta’ mikotossini f’kalibraturi u kampjun tal-plażma (kodifikat bħala kampjuni 1–4), qabel u wara t-trattament enżimatiku. Kif jidher, l-OTA tidher f'kampjuni qabel u wara t-trattament enżimatiku (Figura 1; Figura 3); billi STER jidher biss wara trattament enżimatiku (Figura 3). L-ebda waħda mill-mikotossini l-oħra analizzati ma nstabet fil-kampjuni tal-plażma.

Kull waħda mill-kurvi ta' kalibrazzjoni użati fil-kwantifikazzjoni tal-mikotossini ssodisfat il-kriterji definiti qabel matul il-validazzjoni tal-metodu. Eżempji tal-kurvi tal-kalibrazzjoni miksuba għal kull mikotossina huma ppreżentati fit-Tabelli S1 u S2. L-identità tal-komposti ġiet ivvalutata wkoll: transizzjonijiet ta’ kwalifika (q) u kwantifikazzjoni (Q) għal kull mikotossina misjuba ġew osservati f’kull wieħed mill-individwi u kampjuni pożittivi, u l-iżball relattiv miksub (RE) bejn il-valuri tal-proporzjon q/Q għal kull mikotossina fil-kalibraturi u fil-kampjuni kienet inqas minn 20 fil-mija [32]. Barra minn hekk, il-ħinijiet ta 'żamma ma kinux differenti fil-kampjuni u l-kalibraturi b'aktar minn 2.5 fil-mija [33] (1.3 fil-mija għal OTA qabel u 1.6 fil-mija wara t-trattament enżimatiku; 0.3 fil-mija għal OTB, u 1.8 fil-mija għal STER).

2.2. Kampjuni tal-Plażma

Total ta’ 93 suġġett, inklużi 25 kontroll b’saħħtu (CNT) u 68 pazjent ġew reklutati mis-servizz newroloġiku fl-Isptar San Pedro f’La Rioja (Spanja). Donaturi ta 'kontroll kienu kumpanji mhux relatati tal-pazjenti bl-ebda mard newroloġiku apparenti jew iddijanjostikat. Il-pazjenti kienu maqsuma skond il-patoloġiji: 44 pazjent b'PD u 24 b'AD.

Ikklikkja għall-kapsuli cistanche tubulosa għall-marda ta 'Alzheimer u l-marda ta' Parkinson

Id-dijanjosi u l-progressjoni tal-marda tal-pazjenti rreklutati twettqu minn newroloġi esperti skont l-iskala Hoehn u Yahr (HY) għal PD (Tabella S3) u l-Iskala Globali ta 'Deterjorament (GDS) għal AD (Tabella S4). Il-pazjenti AD kollha diġà wrew sinjali kliniċi ta 'tnaqqis konjittiv ħafif jew dimenzja (minn 3 sa 7, skala GDS). Il-pazjenti PD ġew suddiviżi f'żewġ gruppi peress li l-progressjoni tal-marda kienet differenti fost pazjenti b'individwi li ma wrew l-ebda riflessi posturali indeboliti (1 u 2, skala HY) u oħrajn li diġà juru riflessi posturali indeboliti (minn 2.5 sa 3, skala HY).

Madankollu, minħabba n-numru baxx ta 'kampjuni, l-analiżi statistika tal-pazjenti PD twettqet bħala grupp wieħed. In-numru ta' suġġetti rreġistrati għal kull grupp u sottogrupp huwa rrappurtat, flimkien mas-sess, il-firxa tal-età, u l-progressjoni tal-marda, fit-Tabella 1. Informazzjoni individwali kompleta dwar is-suġġetti reklutati għall-istudju hija mogħtija fil-materjali supplimentari (Tabelli S5 u S6).

2.3. Preżenza ta' Mikotossini

Mid-19-il mikotossina evalwati, fil-kampjuni nstabu biss OTA, OTB, u STER. L-OTA kienet preżenti qabel u wara t-trattament bit-taħlita ta' glucuronidase/arilsulfatase, filwaqt li l-OTB kienet tinkixef biss qabel u STER deher biss wara t-trattament enżimatiku. Ta’ min jinnota li minħabba l-volum limitat ta’ xi kampjuni, l-evalwazzjoni wara trattament enżimatiku kienet possibbli biss għal 74 mit-93 kampjun miġbura.

Ir-riżultati analitiċi miksuba għal OTA, OTB, u STER huma miġbura fil-qosor fit-Tabella 2. Minħabba l-konferma tal-kriterji ta’ identifikazzjoni (transizzjonijiet q u Q għandhom ikunu preżenti u mqabbla mal-kalibraturi RE għat-tnejn, il-proporzjon q/Q u l-ħin ta’ żamma, li għandhom tkun < 20 fil-mija jew 2.5 fil-mija, rispettivament), kampjuni b'valuri akbar minn jew ugwali għal LOD intużaw għall-analiżi tal-immaniġġjar tad-dejta. Għalhekk, il-kalkoli saru bl-adozzjoni ta' metodu ta' sostituzzjoni tal-limiti aktar baxxi [34].

Only OTA (77% of the samples) and OTB (13% of the samples) were detected (>LOD) fil-kampjuni pproċessati qabel it-trattament enżimatiku. Rigward il-preżenza tal-OTA, instabu kampjuni taħt il-LOD fil-gruppi kollha. Il-livell massimu ta' OTA (8.81 ng/mL) kien jikkorrispondi għal mara ta' 66 sena fil-grupp ta' kontroll. Rigward il-popolazzjoni ta 'kontroll, OTA u OTB kienu preżenti f'92 fil-mija u 24 fil-mija tal-kampjuni rispettivament.

Dawn ir-riżultati jaqblu ma’ studju riċenti li sar f’Navarra, reġjun ġar fi Spanja. F'dak l-istudju, OTA kienet preżenti f'97.3 fil-mija u OTB f'10 fil-mija tal-kampjuni (n=438) [35] imkejla bl-istess metodu bħal dak applikat fl-istudju attwali [36]. Fl-istudju preżenti, il-livelli medji ta' OTA (2.15 ng/mL) huma ftit inqas minn dawk imkejla f'Navarra (2.87 ng/mL). Il-livelli ta' OTA varjaw minn LOD għal 8.81 ng/mL, filwaqt li fil-kampjuni minn Navarra, il-konċentrazzjoni ta' OTA varjat bejn LOD u 19.9 ng/mL (b'kampjun jilħaq 45.7 ng/mL f'mara ta' 66-sena).

Rigward is-sess, u wkoll bi qbil mal-istudju Navarra [35], seta' jiġi osservat li l-valuri medji tal-OTA qabel it-trattament enżimatiku kellhom it-tendenza li jkunu ogħla fl-irġiel milli fin-nisa fil-gruppi kollha. Għalkemm il-perċentwal ta' kampjuni pożittivi għall-OTA jaqbel ma' studji preċedenti mwettqa fi Spanja, il-livelli medji u massimi ta' OTA fil-popolazzjoni CNT tal-istudju preżenti u l-istudju reċenti ta' Navarra [35] huma ogħla minn dawk ta' studji preċedenti minn Spanja .

Peress li din l-informazzjoni nkisbet qabel l-2011, id-dejta tagħna tappoġġja l-ħtieġa li jkomplu l-bijomonitoraġġ tal-livelli tal-mikotossini fil-popolazzjoni ġenerali. Kif osservat qabel [35], OTB kien preżenti fi ftit kampjuni u dejjem seħħet flimkien ma 'OTA (ħlief għal raġel CNT wieħed). B'mod sorprendenti, OTB ma nstabx fil-grupp AD. L-OTB huwa l-analogu deklorinat tal-OTA u ma ġiex imkejjel fl-istudji tal-bijomonitoraġġ tal-bniedem li saru s'issa.

L-OTB jista' jkun preżenti f'kampjuni umani peress li huwa magħruf li huwa preżenti f'xi matriċi tal-ikel, bħall-inbid [37], iżda jista' jkun ukoll metabolit uman tal-OTA [38]. Sfortunatament, fl-istudju preżenti, huwa impossibbli li ssir diskriminazzjoni bejn is-sorsi possibbli ta 'OTB jew li tkun taf jekk in-nuqqas ta' OTB fil-grupp AD tistax tkun dovuta għal mudell differenti ta 'konsum tal-ikel tal-pazjenti jew għal metaboliżmu differenti minħabba l- marda, jew jekk ikun minħabba n-numru baxx ta’ kampjuni analizzati. L-analiżi tad-dejta wara t-trattament enżimatiku wriet li l-OTA kienet għadha skoperta (89 fil-mija tal-kampjuni).

Barra minn hekk, kif osservat qabel fid-donaturi b'saħħithom ta 'Navarra [35], STER deher fil-maġġoranza tal-kampjuni (88 fil-mija), filwaqt li l-OTB ma kienx skopert aktar. Meta tqabbel il-preżenza ta 'OTA qabel u wara t-trattament enżimatiku, il-perċentwali ta' kampjuni pożittivi qabel it-trattament enżimatiku f'CNT kien ogħla milli f'pazjenti; billi, wara trattament enżimatiku, il-preżenza ta 'OTA naqset għal CNT filwaqt li żdiedet fil-pazjenti AD u PD. Xi awturi jappoġġjaw l-ipoteżi li l-konjugati OTA jistgħu jiġu ffurmati matul il-metaboliżmu uman [39-41].

However, more data are needed to understand and monitor the human metabolism of OTA. In this study, and again in line with the study conducted in Navarra, STER only appeared after treating the samples with β-glucuronidase/arylsulfatase and this mycotoxin was found positive (>LOD) fi 88 fil-mija tal-kampjuni analizzati. Din id-dejta tappoġġja l-ipoteżi li STER-glucuronides huma ffurmati matul il-metaboliżmu uman [35,42].

2.4. Analiżi Statistika

Skont ir-riżultati analitiċi, il-kalkoli statistiċi saru biss għal OTA u STER. OTB ma kienx inkluż fl-analiżi statistika minħabba li 12-il kampjun biss (13 fil-mija) kienu Akbar minn jew ugwali għal LOD. L-ipoteżi tad-distribuzzjoni tan-normalità (test Shapiro-Wilk) ġiet rifjutata, għalhekk testijiet mhux parametriċi, li ma jimplikaw l-ebda suppożizzjoni ta 'distribuzzjoni, intużaw għat-trattament statistiku. STER ġie skopert biss wara trattament enżimatiku, għalhekk, l-analiżi statistika għal STER saret fuq l-74 riżultat disponibbli miksuba wara diġestjoni enżimatika. Min-naħa l-oħra, għall-OTA kienu disponibbli żewġ settijiet ta 'dejta ta' riżultati, dak miksub dejta tal-ipproċessar qabel it-trattament enżimatiku u dak miksub wara trattament enżimatiku (jiġifieri, OTA qabel, u wara).

Minħabba n-nuqqas ta' kompletezza tal-OTA wara s-sett tad-dejta (74 rekord), ġie deċiż li jsiru kalkoli statistiċi b'kont meħud tal-OTA biss qabel is-sett tad-dejta (93 rekord). Biex tiġi kkonfermata d-deċiżjoni li tiġi eskluża l-OTA wara s-sett tad-dejta, sar test ta 'ranks iffirmati ta' Wilcoxon paired-pairs biex jiġu esplorati differenzi possibbli bejn ir-riżultati paired tal-OTA qabel u wara s-settijiet tad-dejta.

It-test ma enfasizza l-ebda differenza sinifikanti meta applikat għall-valuri OTAbefore u OTAafter tal-grupp tal-popolazzjoni totali (n=74, z=-1.438, p-value=0.1503), li jikkonferma li s-sett tad-dejta OTAbefore komplut jaqbel mal-evalwazzjonijiet statistiċi. Kif issemma qabel, l-ebda studji preċedenti li jimmonitorjaw il-mikotossini f'kampjuni tal-plażma minn pazjenti PD jew AD ma huma disponibbli. Għalhekk, biex jinqabdu d-differenzi u l-assoċjazzjonijiet kollha possibbli ta 'livelli ta' konċentrazzjoni OTA u STER bejn gruppi u sottogruppi, it-test Wilcoxon rank-sum jew it-test Kruskal-Wallis għal tqabbil multi-varjabbli tmexxa.

Barra minn hekk, id-differenzi possibbli b'sinifikat statistiku ġew esplorati billi qasmu gruppi skont is-sess, u l-mard (pazjenti b'PD u AD), b'kunsiderazzjoni wkoll tal-istadju tal-marda (skala HY jew GDS). Sommarju tad-differenzi kollha, li kienu statistikament sinifikanti (p-valur < 0.050) meta tqabbel id-distribuzzjonijiet OTA jew STER fost il-gruppi, bejn CNT u grupp ta’ pazjenti (bħala grupp sħiħ u bħala grupp PD u AD), bejn sessi u fost gruppi f'kull sess u varjabbli tas-sess, huma murija fit-Tabella 3.

Id-differenzi bejn il-livelli tad-distribuzzjoni tal-OTA nstabu li kienu statistikament sinifikanti meta tqabbel il-grupp CNT, PD, u AD, iżda din id-differenza (p-valur=0.0447) hija ggwidata mill-paragun PD/AD (p- valur=0.0114), billi PD il-grupp ta 'pazjenti kkaratterizzat minn valuri ogħla. Meta kkunsidra l-istadju tal-marda, meta tqabbel id-distribuzzjonijiet tas-sottogrupp PD 1 u PD subgrupp 2, ma ġiet osservata l-ebda differenza, li tindika li fil-grupp PD, l-istadju tal-marda ma jinfluwenzax differenza fid-distribuzzjoni. Fil-paragun bejn is-sessi, il-livelli tal-OTA tal-irġiel u tan-nisa mqabbla taw differenzi statistiċi jew fis-suġġetti kollha jew fil-grupp tal-pazjenti (PD flimkien mal-AD), bl-irġiel dejjem juru livelli ogħla min-nisa.

Għalhekk, id-distribuzzjonijiet tal-OTA mhumiex differenti meta jqabblu CNT u gruppi ta 'pazjenti iżda jidher li s-sess jista' jaġixxi bħala mutur għad-differenzi fid-distribuzzjonijiet fil-livell tal-OTA aktar mill-marda tad-dijanjosi. Barra minn hekk, fl-ittestjar tad-differenzi tad-distribuzzjonijiet tal-OTA għall-irġiel u n-nisa separatament, fost il-gruppi (CNT, PD, AD) it-test ma wera l-ebda differenza.

L-analiżi statistika fuq il-livelli ta' STER bejn is-CNT u l-grupp ta' pazjenti wriet distribuzzjonijiet statistikament differenti (p-value <0.0001), bil-valuri CNT ikunu aktar baxxi. Il-grupp CNT/PD/AD wera distribuzzjonijiet statistikament differenti (p-valur=0.0001) u d-differenza kienet ikkonfermata wkoll meta tqabbel CNT/PD u CNT/AD (p-valur < 0.0001 fiż-żewġ każijiet), b' valur medjan aktar baxx fil-grupp AD.

Għalhekk, fil-livelli STER id-distribuzzjoni tal-grupp CNT kienet dejjem differenti fil-paraguni mal-pazjenti u l-gruppi tal-mard. Filwaqt li tqabbel id-distribuzzjonijiet tas-sessi, bejn l-irġiel u n-nisa, ġiet enfasizzata kwalunkwe differenza statistika, il-livelli ta’ STER fi gruppi individwali ta’ irġiel u nisa kienu differenti fil-paraguni kollha (CNT/PD/AD, CNT/grupp ta’ pazjenti, CNT/PD, CNT/AD), u l-irġiel u n-nisa fil-grupp CNT kienu dejjem aktar baxxi milli fi gruppi ta 'pazjenti.

Dan jissuġġerixxi li d-dijanjosi tal-marda tista' tinfluwenza d-distribuzzjonijiet tal-livell STER. Id-differenzi bejn il-livelli ta’ konċentrazzjoni ta’ OTA u STER ġew investigati wkoll billi tqabbel id-distribuzzjonijiet taż-żewġ gruppi ta’ pazjenti (PD u AD) f’kull sess (fl-irġiel u n-nisa) u tqabbel l-iskala tal-mard, GDS fil-grupp ta’ pazjenti AD, u l-iskala HY f’ il-grupp ta 'pazjenti AD, u l-ebda differenza statistika mqajma. La d-distribuzzjoni OTA u lanqas STER ma wrew xi differenza meta tqabbel ukoll l-iskala HY bħala l-varjabbli binarja HY_d=0 (PD Sub-grupp 1, skala HY fil-medda 1–2) u HY{{6 }}d=1 (PD Sottogrupp 2, skala HY fil-medda 2.5–3).

Għalhekk, meta tqabbel l-imġieba tad-distribuzzjoni OTA u STER, huwa indikat li d-differenzi fl-OTA huma ġewwa s-sess (b'M> W) u ġewwa l-gruppi tal-pazjenti (PD> AD), u ħarġet differenza statistika mmarkata fil-paraguni kollha. Fir-rigward tal-STER, id-differenzi fid-distribuzzjonijiet huma rreġistrati biex iqabblu CNT u l-grupp tal-pazjenti (grupp tal-pazjenti > CNT), u l-evalwazzjonijiet kollha dejjem ittestjaw differenza statistika. Min-naħa l-oħra, iż-żewġ mikotossini investigati ma enfasizzaw l-ebda differenza permezz ta' esplorazzjoni fi ħdan is-sottogruppi tal-pazjenti u/jew l-istadju tal-marda.

Sa fejn nafu tagħna, l-ebda studju ieħor ma huwa disponibbli biex iqabbel il-livelli ta 'mikotossini f'pazjenti b'mard newrodeġenerattiv. Madankollu, xi awturi ssuġġerew il-ħtieġa li jiġi evalwat aktar ir-rwol tal-mikotossini fid-deterjorazzjoni tal-manifestazzjonijiet kliniċi ta 'disturbi tal-ispettru tal-awtiżmu [43,44].

Tabilħaqq, l-awturi enfasizzaw differenzi statistikament sinifikanti meta jqabblu l-mikotossini (DON, DOM-1 fl-awrina u AFM1, OTA, u FB1 fil-plażma) bejn il-gruppi awtistiċi u ta' kontroll tat-tfal. Ir-riżultati tal-istudju preżenti huma wkoll konformi ma 'studju aktar reċenti mill-grupp tagħna [45], li fih l-inċidenza tal-OTA u l-konċentrazzjonijiet fil-plażma nstabu li kienu ogħla fi tfal tal-grupp ta' kontroll milli fi tfal bi spettru tal-awtiżmu jew disturbi tal-iperattività ta 'defiċit tal-attenzjoni.

Rigward l-influwenza tas-sess, u skont ir-riżultati minn dan l-istudju, fil-biċċa l-kbira tal-istudji ppubblikati, il-livelli tal-irġiel tal-OTA fil-plażma kienu ogħla milli fin-nisa [46]; għalkemm Warensjö et al. (2020) fl-adolexxenti Svediżi [47], u Coronel et al. (2011) [48] ma sabx differenzi fil-livelli tal-plażma tal-OTA bejn l-irġiel u n-nisa. Fl-aħħarnett, biex tiġi vvalutata r-relazzjoni bejn il-livelli ta 'OTA u STER fil-plażma u l-varjabbli ta' l-età, ġie kkalkulat il-koeffiċjent ta 'korrelazzjoni tar-rank ta' Spearman (rho).

Ir-rho kollu b'sinifikat statistiku (valuri p <0.050) huwa miġbur fil-qosor fit-Tabella 4. Ġeneralment, instabu korrelazzjonijiet negattivi u pożittivi dgħajfa: OTA u STER jikkorrelataw b'mod dgħajjef mal-età. B'mod partikolari, il-livelli ta 'OTA jonqsu bl-età (korrelazzjonijiet negattivi, rho < 0), u l-valur rho jiżdied meta jintgħażel il-grupp PD jew il-grupp tal-irġiel; barra minn hekk, il-valur rho huwa saħansitra ogħla meta jintgħażlu l-valuri tal-irġiel fil-grupp PD. Bil-maqlub, il-korrelazzjonijiet STER huma pożittivi u huma statistikament sinifikanti meta jintgħażel il-grupp tan-nisa.

Biex jirrappreżentaw il-korrelazzjonijiet osservati, il-plots dispersivi OTA/irġiel fil-grupp tal-pazjent PD u STER/nisa fis-suġġetti kollha huma rrappurtati fil-Figura 5. Huma juru t-tixrid b'żewġ varjabbli plot għat-tossini u l-età, u l-linja mwaħħla tgħin biex tiġi viżwalizzata il-korrelazzjoni.

Il-mekkaniżmu ta 'Cistanche's jikkura l-marda ta' Parkinson u l-marda ta 'Alzheimer

Cistanche hija ħaxixa tradizzjonali Ċiniża li ilha tintuża għal ħafna snin għall-benefiċċji potenzjali għas-saħħa tagħha. Fi studji riċenti, instab li Cistanche jista 'jkollu effetti newroprotettivi u jista' jkun effettiv fit-trattament tal-marda ta 'Alzheimer (AD) u l-marda ta' Parkinson (PD).

Il-mekkaniżmu ta 'Cistanche fit-trattament ta' AD u PD b'mod effettiv huwa attribwit lill-komponenti attivi tiegħu, bħal echinacoside, acteoside u cistanosides. Dawn il-komposti huma maħsuba li għandhom proprjetajiet anti-ossidanti u anti-infjammatorji li jistgħu jnaqqsu l-istress ossidattiv u l-infjammazzjoni fil-moħħ, li huma assoċjati mal-iżvilupp u l-progressjoni ta 'mard newrodeġenerattiv.

Cistanche jista 'wkoll jippromwovi t-tkabbir taċ-ċelloli tan-nervituri u jtejjeb il-funzjoni konjittiva billi jżid il-livelli ta' fattur newrotrofiku derivat mill-moħħ (BDNF), proteina li għandha rwol kruċjali fit-tkabbir u l-manutenzjoni tan-newroni. Barra minn hekk, Cistanche intwera li jnaqqas il-plakki -amyloid, li huma karatteristiċi distintivi tal-marda ta 'Alzheimer, u jnaqqas l-akkumulazzjoni ta' -synuclein fil-moħħ, li hija assoċjata mal-marda ta 'Parkinson.

B'mod ġenerali, il-benefiċċji terapewtiċi potenzjali ta 'Cistanche fit-trattament ta' AD u PD huma promettenti, iżda huma meħtieġa aktar studji biex jiċċaraw il-mekkaniżmi eżatti ta 'azzjoni tiegħu u jikkonfermaw l-effikaċja u s-sigurtà tiegħu f'ambjenti kliniċi.

ser jitkompla aktar il-quddiem...

Beatriz Arce-López 1 , Lydia Alvarez-Erviti 2 , Barbara De Santis 3 , María Izco 2 , Silvia López-Calvo 4 , Maria Eugenia Marzo-Sola 4 , Francesca Debegnach 3 , Elena Lizarraga 1 , Adela López de Cerain 5,6 , Elena González-Peñas 1,† u Ariane Vettorazzi 5,6,* ,†

1 Dipartiment tat-Teknoloġija u l-Kimika Farmaċewtika, Grupp ta' Riċerka MITOX, Skola tal-Farmaċija u Nutrizzjoni, Universidad de Navarra, 31008 Pamplona, ​​Spanja; barce@alumni.unav.es (BA-L.); elizarraga@unav.es (EL); mgpenas@unav.es (EG-P.)

2 Laboratorju ta' Newrobijoloġija Molekulari, Ċentru għar-Riċerka Bijomedika ta' La Rioja (CIBIR), Piqueras 98, 3rd Floor, 26006 Logroño, Spanja; laerviti@riojasalud.es (LA-E.); mizco@riojasalud.es (MI)

3 Laboratorju Nazzjonali ta' Referenza għal Mikotossini u Tossini tal-Pjanti, Istituto Superiore di Sanità, 00161 Roma, l-Italja; barbara.desantis@iss.it (BDS); francesca.debegnach@iss.it (FD)

4 Servicio de Neurología, Hospital San Pedro, Piqueras 98, 26006 Logroño, Spanja; slcalvo@riojasalud.es (SL-C.); memarzo@riojasalud.es (MEM-S.)

5 Department of Pharmacology and Toxicology, Research Group MITOX, School of Pharmacy and Nutrition, Universidad de Navarra, 31008 Pamplona, Spain; acerain@unav.es 6 IdiSNA, Navarra Institute for Health Research, 31008 Pamplona, Spain