Ibbażat fuq il-Farmakoloġija tan-Netwerk u Esperimenti fuq l-Annimali Biex Tesplora L-Effett tal-Glycoside Phenylethanoid Ta Cistanche Tubulosa Fuq l-Effett tan-Nefropatija Dijabetika

Astratt: Għan Biex tesplora l-effett taCistanchephenylethanol glycosides(CPhGs) fuqmard tal-kliewi dijabetiku(DKD) ibbażat fuq farmakoloġija tan-netwerk u esperimenti fuq l-annimali. Metodi Il-metodu UHPLC-QE-MS intuża biex janalizza l-komponenti kimiċi tas-CPhGs. Intużaw databases TCMSP u Swiss Target Prediction biex jiġu skrinjati l-komponenti ewlenin. Intużaw databases OMIM u GeneCards biex jinkisbu miri relatati mad-DKD. Wara li nkisbu miri komuni, il-websajt STRING intużat biex jinbena netwerk ta 'interazzjoni tal-proteini. Id-database DAVID intużat għall-analiżi tal-mogħdija GO, KEGG u s-softwer Cytoscape intuża biex jinbena n-netwerk "CPhGs core component-target-pathway". Għaxar firien ġew magħżula b'mod każwali bħala l-grupp normali, u l-firien li kien fadal ġew mitmugħa b'għalf b'ħafna zokkor u xaħam għoli u ngħataw injezzjoni intraperitoneali waħda ta 'STZ biex jistabbilixxu mudell DKD. Huma ġew maqsuma fi grupp mudell, grupp dapagliflozin (1 mg/kg), u CPhGs doża għolja u Medja u baxxa (500, 25{{40}}, 125 mg/kg), 10 annimal f'kull grupp, intervent tad-droga għal 6 ġimgħat, ġew osservati kundizzjonijiet ġenerali, ġie determinat il-piż tal-ġisem u ġie ttestjat il-glukożju fid-demm kull ġimgħa; L-awrina ta' 24 siegħa nġabret wara l-aħħar doża. Issib 24-siegħa proteina totali tal-awrina (24-UTP); iġbor id-demm mill-aorta addominali u ssagrifikah, separati serum, u skopri nitroġenu tal-urea (BUN), aċidu uriku (UA), kolesterol totali (TC), trigliċeridi (TG), u pressjoni tad-demm għolja. Lipoproteina ta' densità għolja (HDL) u livelli ta' lipoproteina ta' densità baxxa (LDL), tebgħa HE u tebgħa Masson intużaw biex josservaw bidliet patoloġiċi fit-tessut tal-kliewi, ELISA intużat biex jinstab IL-1 , IL{{17} fis-serum }, u livelli ta' TNF, u Western blot intużaw biex jinstabu tessut renali. JAK2, p-JAK2, STAT3, p STAT3, espressjoni tal-proteina SOCS3. Riżultati Total ta' 699 komponent ġew skoperti bit-teknoloġija UHPLC-QE-MS. Wara l-iskrinjar, inkisbu 16-il komponent ewlieni ta 'CPhGs u 323 mira relatata. CPhGs u DKD qasmu 99 mira. Il-miri ewlenin kienu STAT3, SRC, EGFR, eċċ. L-analiżi tal-mogħdija KEGG skrinjat 151 mogħdija tas-sinjalar, li turi li l-mogħdija tas-sinjalar IL-17, mogħdija tas-sinjalar PI3K/Akt, mogħdija tas-sinjalar TNF, eċċ. it-trattament tad-DKD minn CPhGs. CPhGs jistgħu jżidu l-piż tal-ġisem tal-firien DKD (P<0.01), inaqqsu l-konsum tal-ilma (P<0.01), jirregolaw il-glukożju u l-metaboliżmu tal-lipidi, inaqqsu 24-livelli UTP u BUN (P<0.01), u jtejbu t-tessut tal-kliewi . Il-ħsara patoloġika naqqset l-espressjoni tal-proteina ta 'p-JAK2/JAK2 u p-STAT3/STAT3 fit-tessut renali (P<0.01) u żiedet l-espressjoni tal-proteina ta' SOCS3 (P<0.01). Konklużjoni CPhGs jintervjenu f'DKD permezz ta' komponenti multipli, miri multipli, u mogħdijiet multipli, possibbilment billi jinibixxu JAK2/

mogħdija tas-sinjalar STAT3.

Kliem ewlieni: Cistanche phenylethanol glycoside; nefropatija dijabetika; UHPLC-QE-MS; farmakoloġija tan-netwerk; esperiment fuq l-annimali; Mogħdija tas-sinjalar JAK2 /STAT3

KEMM JIEĦU BIEX ĊISTANCHE TAĦDEM GĦAL PAZJENTI BIL-KLIEI?

Mard dijabetiku tal-kliewi (DKD), bħala waħda mill-aktar kumplikazzjonijiet mikrovaskulari importanti tad-dijabete, mhix biss il-fattur primarju li jwassal għalmard kroniku tal-kliewiiżda wkoll il-kawża ewlenija tal-marda tal-kliewi fl-aħħar stadju (ESRD) madwar id-dinja. Raġuni [1-2]. It-trattament kliniku tad-DKD prinċipalment jinvolvi l-ewwel il-kontroll taz-zokkor fid-demm, il-pressjoni tad-demm u l-lipidi tad-demm, u t-tieni jipproteġi l-funzjoni renali, jevita l-użu ta 'drogi nefrotossiċi, u jtejjeb l-istil tal-ħajja [3-4]. Madankollu, minħabba l-patoġenesi kumplessa tad-DKD u n-nuqqas ta 'miri speċifiċi ta' intervent, l-għażliet ta 'trattament attwali għandhom limitazzjonijiet u mhumiex effettivi. L-inċidenza tad-DKD fl-aħħar stadju għadha qed tiżdied. Għalhekk, huwa ta 'sinifikat kbir li ssib mediċini naturali effettivi.

Cistanche Deserticola Y. Ċ． Ma orCistanche C.Iz-zkuk imnixxfin imlaħħam taCistanche tubulosa (Schenk) Wightbil-weraq bil-qoxra [5] ġew irreġistrati għall-ewwel darba fil-"Materia Medica ta 'Shen Nong" u ġew elenkati bħala l-ogħla grad. Huma magħrufa bħala "ġinseng tad-deżert" [6]. Huma ħelwin, mielħa, u sħun. , jirritorna lejn il-meridjani tal-kliewi u tal-musrana l-kbira, u għandu l-effetti li jrawwem il-yang tal-kliewi, jimlew l-essenza u d-demm, xarrab l-imsaren, u lassattiv. Ir-riċerka turi li phenylethanoid glycosides (CPhGs) huma wieħed mill-ingredjenti attivi ewlenin tiegħu u huma responsabbli għall-iżvilupp tiegħu.

Il-bażi materjali biex jiġu eżerċitati effetti farmakoloġiċi; L-estratt ta' Cistanche għandu effetti kontra d-dijabete [7-8], kontra l-kanċer tal-fwied [9], protezzjoni tal-kliewi [10-11], newroprotettivi [12-13] u effetti farmakoloġiċi oħra, iżda fil-preżent, CPhGs mhumiex effettivi fit-trattament tad-DKD. L-effetti u l-mekkaniżmi tagħha mhumiex ċari.

Dan l-istudju uża metodi ta 'farmakoloġija tan-netwerk u ta' docking molekulari [14], filwaqt li CPhGs bħala l-oġġett ta 'riċerka, ibassar u janalizza l-ingredjenti attivi ewlenin tiegħu u l-miri potenzjali għat-trattament tad-DKD, u mbagħad stabbilixxa taħlita ta' streptozocin (STZ) indott għoli Il- Il-mudell tal-far DKD mitmugħ b'għalf tal-lipidi intuża bħala s-suġġett ta 'riċerka in vivo, biex jipprovdi referenza għall-espansjoni klinika u l-applikazzjoni ta' trattamenti relatati u aktar riċerka dwar il-mekkaniżmu ta 'azzjoni.

1 materjal

1.1 Annimali

70-firien SD maskili ta' ġimgħa b'livell SPF, piż tal-ġisem (240±20) g, inxtraw miċ-Ċentru tal-Esperiment tal-Annimali tal-Università Medika ta' Xinjiang [Liċenzja għall-Użu tal-Annimali Sperimentali Nru SYXK (ġdid) {{4} }], at L-annimali kienu mrobbija b'mod adattiv għal ġimgħa 1 f'temperatura ta '(22 ± 2) grad , umdità relattiva ta' 50% sa 70%, u ċiklu alternanti ta 'dawl u dlam ta' 12 h/12 ​​h. L-esperiment ġie approvat mill-Kumitat tal-Etika tal-Annimali taċ-Ċentru Mediku Sperimentali tal-Annimali tal-Università Medika ta 'Xinjiang (numru tal-etika IACUC-20220127-19).

1.2 Reaġenti u drogi

CPhGs (batch number 201610, purity >80%) ġew ipprovduti minn Xinjiang Hotan Dichen Co., Ltd Dapagliflozin (numru tal-lott NB2248) inxtara minn AstraZeneca, UK. Għalf b'ħafna zokkor u b'ħafna xaħam (Kat. Nru Boaigang-B1135DM) u STZ (Lott Nru. 2021110307) inxtraw minn Beijing Boai Port Biotechnology Co., Ltd.; mikroalbumina tal-awrina (Lott Nru. 20220611), nitroġenu tal-urea (Lott Nru. 20220626), aċidu uriku (Lott Nru. 20220613), Kolesterol totali (numru tal-lott 20220615), trigliċeridi (numru tal-lott 20220616), densità għolja (numru tal-lott lipo202020202020615), trigliċeridi ), u lipoproteini ta 'densità baxxa (numru tal-lott 20220615) inxtraw minn Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute; interleukin-6 (IL-6, numru tal-lott JL20896), interleukin-1 (IL{-1 , numru tal-lott JL20884), u fattur tan-nekrożi tat-tumur- (TNF- , numru tal-lott 13202 ) inxtraw minn Shanghai Jianglai Biotechnology Co., Ltd.; Antikorp poliklonali tal-fenek JAK2 (numru tal-lott 22v9316), antikorp poliklonali tal-fenek p-JAK2 (numru tal-lott 78g9360), antikorp poliklonali tal-fenek STAT3 (numru tal-lott 15x8824), antikorp poliklonali tal-fenek p-STAT3 (numru tal-lott 74m1478), antikorp poliklonali tal-fenek SOCS3 (fenek poliklonali numru 31d4841) kienu kollha mixtrija minn Jiangsu Qianke Biotechnology Research Center Co., Ltd.; L-antikorp poliklonali IgG tal-mogħoż tikkettat bl-HRP (numru tal-lott 20000758) inxtara minn Wuhan Mitaka Biotechnology Co., Ltd.; -actin fenek monoklonali antikorp (lott numru AC230205001), RIPA lysis buffer (lott numru 20220416), BCA proteina konċentrazzjoni determinazzjoni kits (lott numru 20230401) kienu mixtrija minn Beijing Solebao Technology Co., Ltd.

1. 3 Strumenti

Kromatografija likwida ta 'prestazzjoni ultra għolja Vanquish, spettrometru tal-massa b'riżoluzzjoni għolja Q Exactive Focus, ċentrifuga Heraeus Fresco17, qarrej awtomatiku tal-mikroplate FC (Thermo Fisher Scientific, USA); JXFSTPRP-24 grinder (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd.); Miter tal-ilma pur Mingche D24 UV (il-Ġermanja Merck Millipore Company); Kolonna ACQUITY UPLC BEH C18 (1. 7 μm, 2. 1 mm × 100 mm) (American Waters Company); Miter tal-glukożju fid-demm Accu Chek Performa (Kumpanija Svizzera Roche); Kriostat CM1850UV, mikroskopju fluworexxenti wieqfa DM300 (Leica Company, il-Ġermanja); GL-88B vortex meter (Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.); bilanċ analitiku elettroniku (Bio-Rad Company, l-Istati Uniti).

2 metodi

2. 1 Analiżi UHPLC-QE-MS

2.1.1 Preparazzjoni tas-soluzzjoni tat-test

Iżen 100 mg CPhGs, żid 500 μL 80% metanol, vortex għal 30 s, ultrasonika f'banju ta' ilma tas-silġ għal siegħa, ħalli joqgħod fi grad -40 għal siegħa, ċentrifuga f'4 gradi , 12 000 r/min għal 15-il minuta, aspira s-supernatant, 0. Iffiltra minn membrana mikroporuża ta' 22μm u aħżen fi friġġ ta' -80 grad.

2.1.2 Kundizzjonijiet kromatografiċi

Kolonna ACQUITY UPLC BEH C18 (1. 7 μm, 2. 1 mm × 100 mm); fażi mobbli acetonitrile (A) -1% aċidu formiku (B), elużjoni gradjent (0 ~ 11 min, 15% ~ 75% A; 11 sa 12 min, 75% sa 98% A; 12 sa 14 min, 98% A 14 sa 14. 1 min, 98% sa 15% A 14. 1 sa 15 min, 15% A); Rata tal-fluss tal-volum 0. 5 mL/min; temperatura tal-kolonna 35 grad; volum ta 'injezzjoni 5 μL.

2.1.3 Kundizzjonijiet tal-ispettrometrija tal-massa

full-scan ddMS2 full-scan modalità; Rata tal-fluss tal-volum tal-gass għant 45 arb; rata tal-fluss tal-volum tal-gass awżiljarju 15 arb; temperatura kapillari 400 grad ; Enerġija tal-ħabta fil-modalità NCE 15% ~ 30% ~ ċiklu 45%; vultaġġ sprej ± 4. 0 kV.

2.2 Riċerka Farmakoloġija tan-Netwerk

2. 2. 1 CPhGs

Skrun fil-mira tal-komponenti: Issortja l-komponenti kimiċi analizzati minn UHPLC-QE-MS skont il-kontenut relattiv, u ħassar dawk li l-istrutturi kimiċi tagħhom għadhom ma ġewx determinati. Daħħal in-numru tas-serje InChIKey tal-ingredjenti skrinjati fid-database TCMSP biex tikseb il-parametri farmakokinetiċi ta' kull ingredjent. Ibbażat fuq il-kundizzjonijiet tal-bijodisponibilità orali (OB) > 30% u x-xebh tad-droga (DL) > 0.18, il-kandidati li jissodisfaw ir-rekwiżiti jiġu skrinjati. Daħħal in-numru SMILES ta' kull komponent fid-database ta' Tbassir tal-Mira Svizzera biex tbassar il-mira, u tikseb il-mira tal-komponent kimiku CPhGs.

2. 2. 2 DKD

Screening tal-mira tal-mard Uża "nefropatija dijabetika" bħala t-terminu ta' tfittxija biex tfittex miri tal-mard fid-databases tal-OMIM, GeneCards, u NCBI.

2. 2. 3 Kostruzzjoni tan-netwerk tal-komponent-mira-marda

Il-miri inkroċjati tal-komponenti u l-mard CPhGs inkisbu permezz tal-immappjar tas-softwer R, u s-softwer Cytoscape 3.7.2 intuża biex tinbena sistema ta 'netwerk ta' komponent-mira, li fiha l-plug-in tanalizza skopra miri ewlenin.

2. 2. 4 Kostruzzjoni ta' netwerk ta' interazzjoni proteina-proteina (PPI)

Importa l-proteini fil-mira tal-intersezzjoni tal-komponenti u l-mard fid-database STRING, ibni netwerk ta' interazzjoni proteina-proteina (PPI), ħassar proteini mingħajr nodi konnessi fin-netwerk, u ssettja l-livell ta' kunfidenza tal-punteġġ ta' interazzjoni tal-proteini l-aktar baxx għal {{1} }.700. Ibni netwerk PPI, niżżel ir-riżultati tal-format TSV tagħha, timportahom fis-softwer Cytoscape 3.7.2, u uża l-plug-in tal-analiżi biex tgħarraf aktar il-miri ewlenin.

2. 2. 5 GO, analiżi KEGG

Uża s-sezzjoni ta 'Annotazzjoni Funzjonali fid-database DAVID biex twettaq analiżi ta' arrikkiment fuq il-miri ta 'intersezzjoni ta' mard komponenti. L-ewwel issettja l-parametri tal-analiżi, daħħal il-mira tal-intersezzjoni fil-kaxxa tal-Lista tal-Ġene, agħżel official-gene-symbol bħala l-identifikatur tal-mira, agħżel il-Lista tal-Ġeni bħala t-tip tad-dejta (Tip tal-Lista), u agħżel "Homo Sapiens (Speċi)" bħala l- sors fil-mira (Speċi). Razza)", ibda l-analiżi wara li tikkonferma l-parametri tal-analiżi, tikseb ir-riżultati tal-analiżi GO u KEGG, u mbagħad uża l-pjattaforma tat-tpinġija onlajn ImageGP biex tiġbed id-dijagramma tal-bużżieqa tar-riżultati tal-analiżi KEGG u GO. Is-softwer Cytoscape 3.7.2 jibni l-komponent -target-pathway stampa tan-netwerk.

2. 2. 6 Docking molekulari

L-ewwel niżżel id-dijagramma tal-istruttura 3D tal-ingredjent attiv fil-format SDF mid-database PubChem, imbagħad niżżel id-dijagramma tal-istruttura 3D tal-mira tal-intersezzjoni fil-format PDB mid-Database Globali tal-Proteini (PDB) tal-Istati Uniti, u fl-aħħar ittellaha fis-CB-Dock websajt għall-docking molekulari. Skrinja l-konformazzjonijiet tad-docking dominanti u Ħareshom b'Pymol.

2.3 Esperimenti fuq l-annimali

2.3.1 Immudellar, raggruppament, u amministrazzjoni tad-droga

10 firien ġew magħżula b'mod każwali bħala l-grupp normali u mitmugħa b'għalf ordinarju, u l-firien li kien fadal ġew mitmugħa b'għalf b'ħafna zokkor u xaħam. Wara 6 ġimgħat, ingħataw injezzjoni intraperitoneali ta 'darba ta' 30 mg/kg STZ (0. 1 mmol/L STZ maħlul f'pH 4. 5 sodium citrate buffer), u 72 siegħa wara, id-demm ittieħed mill-vina tad-denb. biex tiskopri glucose fid-demm sawm (FBG). Jekk FBG Ikbar minn jew ugwali għal 16. 7mmol/L, il-mudell tad-dijabete ġie stabbilit b'suċċess [15]; ikompli Ġew mitmugħa b'għalf b'ħafna zokkor u xaħam għal ġimgħatejn. L-immudellar DKD ġie determinat li kien ta' suċċess abbażi tal-pożittività tal-glukożju fl-awrina u 24-siegħa ta' proteina totali tal-awrina (24-UTP) Iktar minn jew ugwali għal 20 mg. Fosthom, 3 mietu waqt il-proċess tal-immudellar u 7 ma rnexxewx. , total ta’ 50 kienu ta’ suċċess. Il-firien li ġew immudellati b'suċċess ġew maqsuma b'mod każwali fil-grupp mudell, grupp dapagliflozin (1 mg/kg), u gruppi ta 'doża għolja, medja u baxxa CPhGs (500, 250, 125 mg/kg). Kull grupp ta' amministrazzjoni ngħatat b'mod intragastriku. Il-firien fil-grupp normali u l-grupp mudell ingħataw mediċini korrispondenti, u l-firien fil-grupp normali u l-grupp mudell ingħataw l-istess ammont ta 'salina normali permezz ta' gavage, darba kuljum għal total ta '6 ġimgħat. Matul il-perjodu ta' amministrazzjoni, il-firien f'kull grupp minbarra l-grupp normali komplew jingħataw għalf b'ħafna xaħam.

2.3.2 Sejbien ta' Indikatur Bijokimiku

Wara 6 ġimgħat ta' intervent CPhG, 24-siegħa awrina nġabret mill-firien, u 24-siegħa proteina totali tal-awrina (24-UTP) ġiet imkejla; inġabar id-demm mill-vina tad-denb tas-sawm biex jinstabu l-livelli ta 'FBG; inġabar demm mill-aorta addominali, 4 gradi, 1500 r/min. Iċċentrifuga għal 10 minuti biex tissepara s-serum u tiskopri n-nitroġenu tal-urea fis-serum.

BUN), aċidu uriku (UA), kolesterol totali (TC), trigliċeridi (TG), lipoproteini ta 'densità għolja (HDL), livelli ta' lipoproteini ta 'densità baxxa (lipoproteini ta' densità baxxa LDL).

2.3.3 Osservazzjoni tal-morfoloġija patoloġika tat-tessut renali

Il-firien ġew anestetizzati bis-sodium pentobarbital u sagrifikati. Il-kliewi ġew imqaxxra, miżun, iffissati b'4% paraformaldehyde, deidratati, trasparenti, mgħaddsa fix-xama ', inkorporati, u qasmu għal tbajja ta' ematossilin-eosina (HE).

Wara t-tbajja 'Masson, il-morfoloġija tat-tessut ġiet osservata taħt mikroskopju, u softwer Image-Pro Plus 6.0 intuża biex janalizza d-densità ottika integrata u jikkwantifika ż-żona relattiva tal-fibra tal-kollaġen.

2. 3. 4 ELISA

Il-metodu ntuża biex jinstabu l-livelli ta 'fatturi infjammatorji tas-serum fil-firien. Il-livelli ta' IL-6, IL-1, u TNF- ġew skoperti skond l-istruzzjonijiet tal-kit.

2. 3. 5 Metodu Western blot biex tiskopri espressjoni ta 'proteina relatata

Ittieħed tessut tal-kliewi tal-firien, ġie miżjud RIPA lysate biex jiġi estratt il-proteina totali, u l-konċentrazzjoni ġiet iddeterminata bil-metodu BCA.

Wara sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, ittrasferixxi għal membrana PVDF, u wara l-imblukkar, JAK2 (1: 2000), p-JAK2 (1: 1000), STAT3 (1: 2000), p -STAT3 (1: 2000), SOCS3 (1:2000), -actin (1:2000) antikorpi, inkuba f'4 gradi matul il-lejl, żid antikorp sekondarju IgG ittikkettat b'HRP (1:5000), u inkuba f'temperatura tal-kamra għal siegħa, żviluppat b'kit elettroluminixxenza, espost minn imager tal-ġel tal-proteina, bl-użu ta 'softwer Image J

Analiżi kwantitattiva tal-biċċiet. Bl-użu ta '-actin bħala r-referenza interna, il-proporzjon tal-valur griż tal-faxxa fil-mira u l-faxxa ta' referenza interna hija l-espressjoni relattiva tal-proteina.

2.4 Analiżi statistika

Id-dejta ġiet ipproċessata minn softwer SPSS 25.0, u d-dejta ġiet espressa bħala (x±s). Intużat analiżi one-way tal-varjanza għat-tqabbil bejn il-gruppi. P<0.05 indicates that the difference is statistically significant.