Vesikuli Batterjali tal-Membrana ta' Barra Induċu Ċaqliq Traskrizzjoni f'Arabidopsis Lejn Attivazzjoni tas-Sistema Immuni li twassal għas-Soppressjoni tat-Tkabbir tal-Patoġenu fil-Pjanta

Astratt

Il-batterji Gram-negattivi jiffurmaw blebs sferiċi fuq il-periferija taċ-ċelluli tagħhom, li aktar tard jinfirdu mill-ħajt taċ-ċellula batterjali biex jiffurmaw veżikoli extraċellulari. Dawn l-istrutturi fuq skala nano, magħrufa bħala vesicles tal-membrana ta 'barra (OMVs), intwerew li jippromwovu l-infezzjoni u l-mard u jistgħu jinduċu outputs immuni tipiċi kemm fil-mammiferi kif ukoll fl-ospiti tal-pjanti. Biex nifhmu aħjar il-pjanti ta 'bidla traskrizzjoni wiesgħa li jgħaddu wara l-espożizzjoni għal OMVs, aħna ttrattati nebbieta Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) b'OMVs ippurifikati mill-batterju patoġeniku tal-pjanti Gram-negattivi Xanthomonas campestris pv. campestris u wettaq analiżi RNA-seq fuq pjanti OMV u mock-trattati fi 2, 6, u 24 siegħa wara l-isfida. Il-bidla traskrizzjoni l-aktar evidenti seħħet fl-ewwel żewġ punti ta 'żmien ittestjati, kif rifless min-numru ta' ġeni espressi b'mod differenzjali u l-bidla medja darbiet. L-OMVs jinduċu bidla traskrizzjoni kbira lejn l-attivazzjoni tas-sistema immuni, u jirregolaw għadd kbir ta 'mogħdijiet relatati mal-immunità inklużi varjetà ta' riċetturi immuni. It-tqabbil tar-rispons ta 'Arabidopsis għal OMVs u għal elicitors purifikati, wera li l-OMVs jinduċu sett simili ta' ġeni u mogħdijiet bħal elicitors singoli, madankollu, ġew skoperti mogħdijiet attivati ​​minn OMVs u mhux minn elicitors oħra. It-trattament minn qabel ta 'pjanti Arabidopsis b'OMVs u sussegwentement infettathom b'patoġenu batteriku wassal għal tnaqqis sinifikanti fit-tkabbir tal-patoġenu. Mutazzjonijiet fir-riċettur tal-fattur tat-titwil tal-pjanti (EFR), ir-riċettur tal-flagellin (FLS2), jew il-ko-riċettur tal-kinase assoċjat 1-insensittiv għall-brassinosterojdi (BAK1), ma affettwax b'mod sinifikanti l-effett ta 'priming immuni tal-OMVs. Flimkien dawn ir-riżultati juru li l-OMVs jinduċu bidla traskrizzjoni wiesgħa f'Arabidopsis li twassal għal regolazzjoni 'l fuq ta' mogħdijiet immuni multipli, u li din il-bidla traskrizzjoni tista 'tiffaċilita r-reżistenza għall-infezzjoni batterika.

KLIEM EWLENIN

Arabidopsis thaliana, infezzjoni batterjali, vesicles extraċellulari, OMVs, vesicles tal-membrana ta 'barra, immunità tal-pjanti, RNA-seq, Xanthomonas campestris pv. campestris

benefiċċji cistanche għall-irġiel isaħħu s-sistema immuni

1 INTRODUZZJONI

Il-pjanti huma kontinwament iħabbtu wiċċhom ma 'mikrobi li jagħmlu ħsara li jirnexxu fuq it-tessuti tagħhom u jfixklu t-tkabbir normali. Reazzjoni tad-difiża effiċjenti tiddependi ħafna fuq skoperta u identifikazzjoni rapida u preċiża tal-mikrobu li jinvadi. Għal dan il-għan, il-pjanti jużaw sistemi ta 'sorveljanza wesgħin biex jimmonitorjaw l-invażjoni tal-patoġeni (Cook et al., 2015). Huwa spekulat li l-ewwel linja tas-sistema ta 'sorveljanza tal-pjanti, jew l-ewwel interface ċellulari fejn il-pjanti u l-mikrobi jinteraġixxu, huwa l-ispazju interċellulari, l-apoplast. Hemmhekk, ir-rikonoxximent ta 'mikrobi li jinvaduh huwa medjat minn riċetturi ta' rikonoxximent tal-mudell (PRRs) marbuta mal-membrana, esposti extraċellulari (Boutrot & Zipfel, 2017; Couto & Zipfel, 2016). Il-PRRs jirrikonoxxu determinanti mikrobjali li huma preżenti u kkonservati b'mod wiesa 'fost ħafna mikrobi u huma magħrufa bħala mudelli molekulari assoċjati ma' mikrobi jew patoġeni (MAMPs) (Ranf et al., 2016). Peress li l-mikrobi jgħaddu minn mutaġenesi b'rata mgħaġġla, riċetturi immuni evoluzzjonarji utli huma adattati biex jiskopru reġjuni kkonservati ħafna ta 'komponenti mikrobjali kruċjali li ma jistgħux jintremew jew jiġu mutati faċilment minħabba spiża serja tal-kundizzjoni. Pereżempju, flagellin batterjali huwa element kruċjali fil-fiżjoloġija ta 'ħafna mikrobi inklużi patoġeni, u bħalissa huwa wieħed mill-MAMPs l-aħjar studjati (Felix et al., 1999; Zipfel et al., 2004). Il-perċezzjoni ta' flagellin, jew l-epitope sintetiku flg22 (magħmul minn 22 aċidu amminiku kkonservat ħafna fit-tarf N tal-blokka tal-bini tal-flagell, flagellin), mir-riċettur immuni tal-pjanta konnessi, flagellin sensing 2 (FLS2), iwassal għal bidla traskrizzjoni kbira. , segwit minn rispons immuni effettiv li jwaqqaf l-infezzjoni (Chinchilla et al., 2007; Gómez-Gómez & Boller, 2000). Ħafna MAMPs magħrufa huma assoċjati mal-ħajt taċ-ċelluli tal-mikrobi. Pereżempju, kitin fungali (Fesel & Zuccaro, 2016), peptidoglycan batterjali (PG) (Erbs et al., 2008; Gust et al., 2007), lipopolisakkaridi batterjali (LPS) (Dow et al., 2000; Silipo et al. ., 2005), flagellin (Boutrot & Zipfel, 2017; Felix et al., 1999), u aktar. Madankollu, mhuwiex ċar kif dawn il-komponenti assoċjati mal-ħajt taċ-ċelluli jinteraġixxu mar-riċetturi immuni konnessi tagħhom fil-planta. Jekk dan iseħħx minħabba mewt taċ-ċelluli u/jew degradazzjoni tal-ħajt taċ-ċellula, jew permezz ta 'rilaxx attiv ta' komponenti bħall-flagellum, huwa suġġett li jeħtieġ aktar investigazzjoni (Bahar, 2020).

Eżempju tar-rilaxx attiv ta 'frammenti tal-ħajt taċ-ċelluli minn batterji Gram-negattivi huwa l-isparar ta' veżikoli extraċellulari (EVs) li jnaqqas u joqros mill-membrana ta 'barra fl-ambjent tal-madwar (Kulp & Kuehn 2010; Théry et al., 2018). ). Dawn l-EVs batterjali huma komunement imsejħa vesicles tal-membrana ta 'barra (OMVs), u minn issa 'l quddiem se nżommu ma' din in-nomenklatura (Schwechheimer & Kuehn, 2015). Il-proċess tar-rilaxx tal-OMV iseħħ kontinwament u taħt kundizzjonijiet ambjentali varji, inkluż waqt il-kolonizzazzjoni tal-ospitanti (Gurung et al., 2011; Ionescu et al., 2014; Jin et al., 2011). Minbarra l-molekuli integrali tal-membrana ta 'barra bħal proteini tal-membrana ta' barra (OM), LPS, u lipidi, l-OMVs jinkapsulaw fluwidi periplasmiċi, li jikkonsistu minn firxa diversa ta 'molekuli bħal proteini, enzimi degradanti tal-ħajt taċ-ċelluli, polisakkaridi, u aċidi nuklejċi (Kuehn & Kesty, 2005). Peress li l-OMVs huma rilaxxati waqt il-kolonizzazzjoni tal-ospitanti, u peress li l-merkanzija tagħhom tikkonsisti f'MAMPs, huwa jitħajjar li wieħed jispekula li jaġixxu bħala trasportaturi ta' elicitors immuni li jwasslu l-molekuli li jqanqlu fil-viċin tar-riċetturi immuni konnessi tagħhom (Bahar, 2020; Katsir & Bahar, 2017). Tabilħaqq, l-OMVs intwerew li jinduċu kemm is-sistemi immuni tal-mammiferi kif ukoll dawk tal-pjanti meta jiġu ppreżentati lill-ospiti tagħhom (Bahar et al., 2016; Ellis & Kuehn, 2010; Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021). Filwaqt li fiċ-ċelloli tal-mammiferi kemm l-LPS kif ukoll il-komponenti tal-proteini tal-OMVs jaġixxu bħala elicitors immuni (Ellis et al., 2010), fil-pjanti, għadu mhux ċar liema molekuli OMV huma l-elicitors immuni primarji.

Minbarra li jimmodulaw ir-rispons immuni ospitanti, l-OMVs intwerew ukoll li jġorru fatturi ta 'virulenza u li huma involuti f'numru kbir ta' proċessi. Dan jinkludi komunikazzjoni ċellula-ċellula (Deatheragea & Cooksona, 2012; Mashburn & Whiteley, 2005; Raposo & Stahl, 2019), kunsinna ta’ tossini għal ċelloli mmirati (Ellis & Kuehn, 2010; Kadurugamuwa & Beveridge, 1996), formazzjoni ta’ bijofilms (Schooling). & Beveridge, 2006), it-tifi ta 'komposti antimikrobiċi (Manning & Kuehn, 2011), rispons għall-istress (MacDonald & Kuehn, 2013), trasferiment orizzontali tal-ġeni (Fulsundar et al., 2014; Velimirov & Ranftler, 2018) u virulenza (Ellis). & Kuehn, 2010; Kunsmann et al., 2015). Filwaqt li ħafna minn dawn l-eżempji ġejjin minn studji ta 'patoġeni batteriċi tal-mammiferi, studji reċenti b'batterji patoġeniċi tal-pjanti jappoġġjaw ukoll li l-OMVs jippromwovu virulenza batterjali u kolonizzazzjoni tal-pjanti. Ionescu et al. (Ionescu et al., 2014) wera li l-produzzjoni OMV mill-patoġenu tal-pjanti Xylella fastidiosa matul il-kolonizzazzjoni tal-bastiment tal-xylem jinibixxi t-twaħħil batterjali mal-elementi li jwasslu l-ilma tal-pjanta (il-xylem), billi tmejjel il-bilanċ bejn il-forom sessili u mobbli tal- patoġenu lejn il-forma mobbli. Din il-forma hija maħsuba li tippromwovi t-tixrid taċ-ċelluli fil-xylem, li twassal għal tnaqqis aktar mgħaġġel tal-pjanta (Ionescu et al., 2014). Żewġ studji oħra wrew li fatturi ta’ virulenza bħal lipases/esterase u xylanase secreted tat-tip II, u effectors secreted tat-tip III, huma secreted f’assoċjazzjoni ma’ OMVs (Chowdhury & Jagannadham, 2013; Sidhu et al., 2008; Solé et al. ., 2015) li jissuġġerixxi li l-OMV jista 'jkollu rwol importanti fil-virulenza batterjali. Il-kumplessità molekulari tal-OMVs, flimkien mal-funzjonijiet doppji u possibilment opposti tagħha fl-ospitanti (induzzjoni tal-immunità u promozzjoni tal-virulenza), tqanqalna biex nistudjaw ir-rispons traskrizzjoni usa tal-pjanti Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) għall-isfida tal-OMV u biex nittestjaw jekk din il-bidla traskrizzjoni. jinduċi reżistenza jew suxxettibilità għal infezzjoni batterjali sussegwenti.

2 MATERJALI U METODI

2.1 Materjal tal-pjanti u kundizzjonijiet tat-tkabbir

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) wild-type Col-0 linja kif ukoll il-linji mutanti li ġejjin: bak- (Schlesinger et al., 2011) u waqgħat qatt (Nekrasov et al., 2009) intużaw f'dan l-istudju. Iż-żrieragħ ta 'Arabidopsis ġew sterilizzati fil-wiċċ u miżrugħa fuq pjanċi tal-agar Murashige u Skoog (MS) kif deskritt (Bahar et al., 2016). Il-pjanċi nżammu fid-dlam f'4◦C għal 2-4 ijiem u mbagħad tmexxa għal 22◦C għall-ġerminazzjoni għal 5-8 ijiem. Nebbieta ġerminati ta’ daqs simili ġew trasferiti fi 24-pjanċi bir-bir (żewġ nebbieta kull bir) li kien fihom 1 ml ta’ MS medium b’1% (w:v) ta’ sukrożju (Duchefa Biochemie) u mkabbra għal 8–10 ijiem oħra f’ l-istess kundizzjonijiet qabel ikkontestati bl-elicitor kif deskritt hawn taħt. Għal testijiet tal-priming, żrieragħ ta' Arabidopsis wild type Col-0 line u linji mutanti (waqgħat qatt u back-) ġew ġerminati kif deskritt hawn fuq u mbagħad trapjantati fi qsari ta' 7 × 7 × 6 ċm (nebbieta 1 /borma) li kien fihom taħlita ħamrija Ħadra #7611 (Evenari, Ashdod, Iżrael) u mkabbra f'fotoperjodu ta' 9.5 sigħat f'22–24˚C. Pjanti kienu

2.2 Purifikazzjoni tal-vesikuli tal-membrana ta 'barra batterjali

Ħażniet tal-gliċerol ta' Xanthomonas campestris pv. campestris(Xcc) 33913 ġew strixxi fuq pjanċi Nutrient Agar (Difco, NA, Becton, Dickinson, and Company) u mkabbra għal 2-5 ijiem f'28˚C. Inġabru kolonji singoli u ntużaw biex jitlaqqmu 3-mL YEB (brodu tal-estratt tal-ħmira) li kien fih 10 ug/ml cephalexin hydrate (Cp, Sigma-Aldrich). Starters tkabbru matul il-lejl f'28◦C b'ċaqliq ta' 185–200 rpm u mbagħad intużaw biex jitlaqqmu 500 ml ta' PSB (peptone sucrose broth) medju b'antibijotiċi (kif deskritt hawn fuq) fi 2-L Flasks fi proporzjon ta '~1:1000 (v:v). Il-kulturi tkabbru kif deskritt hawn fuq għal OD600 ta '0.6–0.8 u mbagħad iċ-ċelluli batteriċi ġew mibrumin 'l isfel u OMVs ġew estratti mis-supernatant kif deskritt (Mordukhovich & Bahar, 2017). Il-preparazzjoni OMV mhux raffinata mbagħad ġiet soġġetta għal ċentrifugazzjoni tal-gradjent Optiprep biex tikseb OMVs purifikati, kif deskritt (Bahar et al., 2016; Mordukhovich & Bahar, 2017). Kull lott OMV ġie ppurifikat minn 1.5-L kultura batterjali u finalment ġie sospiż mill-ġdid f'1 ml ta 'PBS (pH 7.3). OMVs ippurifikati ntużaw immedjatament jew maħżuna f'4◦C sa 7 ijiem qabel l-użu. Id-distribuzzjoni tad-daqs OMVs tkejjel bl-użu ta 'apparat dinamiku ta' tifrix tad-dawl (Zetasizer Nano ZS, Malvern Panalytical, Worcestershire, UK) u kellu dijametru medju ta '121.7 ± 55.43 nm (SD). Il-konċentrazzjoni tal-partiċelli kienet imkejla bl-istess mod u hija pprovduta f'kull deskrizzjoni tal-esperiment hawn taħt.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

2.3 Sfida tan-nebbieta ta' Arabidopsis b'OMVs

Biex teżamina r-rispons tat-traskrizzjoni ta' Arabidopsis għall-isfida tal-OMV, intużaw nebbieta Col-0 imkabbra fi 24-pjanċi tal-bir kif deskritt hawn fuq. Il-ġurnata qabel l-isfida tal-OMV, il-medja tal-MS ġiet irtirata mill-pjanċi u mibdula b'250 ul ta 'dH2O sterili, u l-pjanċi tħallew fuq il-bank matul il-lejl. Filgħodu ta 'wara, 20 ul ta' OMVs purifikati (30 ug għal kull ml li jikkorrispondu għal 1.44 × 109 partiċelli għal kull bir), jew dH2O sterili bħala mock, ġew miżjuda ma 'kull bir. In-nebbieta nġabru 2, 6, u 24 siegħa wara l-isfida, niexfa fuq karta, u snap-ffriżati b'nitroġenu likwidu f'2-mL tubi Eppendorf Safe-Lock (Hamburg, il-Ġermanja). F'kull punt tal-ħin, inġabru erba' bjar ttrattati b'OMV u erba' bjar mock-trattati, li jirrappreżentaw erba' repliki bijoloġiċi għal kull trattament f'kull punt tal-ħin.

2.4 Purifikazzjoni tal-RNA

RNA ġie estratt minn nebbieta Arabidopsis bl-użu tar-reaġent TRIzol (Invitrogen) skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. L-RNA kien ippurifikat aktar bl-użu tal-Kit Turbo mingħajr DNA (Ambion, Thermo Fisher Scientific), u l-Kit tat-Tindif u l-Konċentrazzjoni tal-RNA (Norgen Biotek) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Kampjuni ta' RNA purifikati ġew soġġetti għal analiżi ta' konċentrazzjoni u kwalità bl-użu ta' magna TapeStation 2200 (Teknoloġiji Agilent), RNA Screen Tape, u RNA Screen

2.5 Kostruzzjoni u sekwenzar tal-librerija tal-RNA

Għal kull trattament u punt ta 'żmien, żewġ kampjuni li juru l-ogħla purità ġew magħżula għall-analiżi. Il-libreriji tal-mRNA TruSeq (Illumina) bil-qbid PolyA ġew ippreparati mill-kampjuni tal-RNA magħżula fl-Istitut tal-Kuruna tal-Ġenomika fl-Istitut tax-Xjenza Weizmann (Rehovot, Iżrael). Kull kampjun ġie mmarkat, u ġabra ġiet ippreparata mill-kampjuni. Din il-ġabra mbagħad ġiet mgħobbija ġewwa żewġ korsiji NGS, u mmexxija f'magna ta 'sekwenzjar Illumina HiSeq, f'modalità ta' ġirja ta 'produzzjoni għolja, single read (SR) 60 (v4).

2.6 Is-sekwenzjar jaqra l-ipproċessar inizjali

The raw sequence reads were cleaned with Trimmomatic software v 0.36 (Bolger et al., 2014), removing low-quality reads and remaining adapter sequences. The clean reads were mapped to the reference Arabidopsis TAIR10 reference genome (Lamesch et al., 2012) using bowtie2 (Langmead & Salzberg, 2012) and quantification of gene expression was done using RSEM (Li & Dewey 2011). Principal component analysis and sample correlation matrix were calculated with the function cor() and pre-comp (), respectively, of the R base package version 3.6.1. DEGs were determined using the DESeq2 tool (Love et al., 2014). The FDR (false discovery rate) cutoff chosen was FDR < 0.05. The LogFC (Log of the fold change) cutoff for the up-regulated and the downregulated genes, was > 

2.7 Ontoloġiji tal-ġeni u deskrizzjonijiet tal-ġeni 

Gene Ontologies (GO) ġew irkuprati bl-użu ta' Annotazzjonijiet GO ta' TAIR (http://www.arabidopsis.org/tools/bulk/go/index.jsp). Id-deskrizzjonijiet tal-ġeni, skont il-mudelli tal-ġeni, inkisbu bl-użu tat-tfittxija tad-deskrizzjoni tal-ġeni ta' TAIR (http://www.arabidopsis.org/tools/bulk/genes/). L-arrikkiment GO ġie kkalkulat bl-użu tal-għodda tal-web AgriGO (http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/index.php) bl-użu ta’ Arabidopsis genome locus (TAIR10) bħala referenza

2.8 Validazzjoni kwantitattiva-PCR u RNA-seq

Biex tiġi vvalidata d-dejta tal-RNA-seq, intużaw kampjuni ta 'RNA ta' nebbieta mock- u OMV-challenged għal sinteżi ta 'cDNA, segwiti minn PCR kwantitattiv (qPCR) bl-użu ta' primers speċifiċi għall-ġene (Supp. Tabella S4), kif deskritt (Bahar et al. , 2016). B'mod ġenerali, ġew ittestjati 17-il DEG mis-sett tad-dejta RNA-seq, bl-użu ta 'erba' repliki bijoloġiċi ta 'RNA ta' nebbieta ttrattati b'OMV jew mock. L-espressjoni relattiva tal-ġeni ttestjati ġiet imqabbla ma 'l-espressjoni ta' ubiquitin, bl-użu ta 'magna 7500 Fast PCR f'ħin reali (Applied Biosystems), kif deskritt (Bahar et al., 2016).

2.9 Tqabbil tar-rispons tat-traskrizzjoni ta' Arabidopsis ma' MAMPs u ma' OMVs 

Is-sett tad-dejta indott mill-OMV tagħna tqabbel mat-traskriptomi disponibbli ta' Arabidopsis ikkontestati b'flg22, (Denoux et al., 2008) elf26 (Zipfel et al., 2006), PGN (Willmann et al., 2011), OG (Davidsson et al., 2011). , 2017) u LPS (Livaja et al., 2008). Għat-tqabbil tad-dejta, sar arrikkiment tat-termini GO u l-GOs indotti ġew viżwalizzati permezz ta 'dijagrammi Venn kif deskritt hawn fuq.

2.10 Esperimenti ta' priming ta' Arabidopsis

Biex jiġi ttestjat l-effett ta' priming ta' Xcc OMVs fuq Arabidopsis infettat b'Pseudomonas syringae pv. tadam DC3000 (Pst), segwejna l-proċedura deskritta minn Zipfel et al. (2004). Fil-qosor, weraq ta’ pjanti Arabidopsis ta’ 6–8 ġimgħat, imkabbra kif deskritt hawn fuq, ġew infiltrati b’50–100 ul ta’ Xcc OMVs ippurifikati (30 ug/ml, li jikkorrispondu għal 3.6-7.2 × 109 partiċelli). għal kull werqa), 1 μM flg22, jew ilma bl-użu ta' siringa mingħajr labra. Għal kull trattament, intużaw 5 weraq/pjanta u tliet repliki tal-pjanti. L-inoculum Pst ġie ppreparat billi kkultiva l-batterju fuq pjanċi medji King's B (20 g/L peptone, 1.5 g/L MgSO4 x7H2O, 10 ml/L glycerol, u 15 g/L agar) f'28˚C għal 2-3 ijiem, u mbagħad issospendi mill-ġdid il-kolonji bl-ilma u aġġusta l-konċentrazzjoni tal-inoculum għal 105 CFU/ml. L-inoculum Pst ġie infiltrat f'weraq ipprajmat 24 siegħa wara l-priming, bl-użu ta 'siringa mingħajr labra (madwar 100 ul ġew infiltrati f'kull werqa). It-tkabbir tal-batterja ġie determinat f'0 (siegħa wara t-tilqim) u jumejn wara t-tilqim (dpi) billi jinġabru u jiżnu l-weraq imlaqqma, maċerathom f'1 ml ta' 10 mM MgCl2 u kisi 10-darbiet dilwizzjonijiet serjali fuq King's B pjanċi tal-agar. In-numru ta 'CFU fuq kull pjanċa ġie determinat jumejn wara u kkalkulat għal kull g werqa.

FIGURA 1 Rispons tat-traskrizzjoni ta' Arabidopsis għal OMVs fi 2, 6 u 24 wara l-isfida. Analiżi tal-komponenti prinċipali (A) u matriċi ta' korrelazzjoni tal-kampjun (B) ta' rispons traskrizzjoni tan-nebbieta ta' Arabidopsis għal OMV, jew mock, fi 2, 6 u 24 siegħa wara l-isfida

2.11 Analiżi in vitro tat-tkabbir batterjali 

Biex jiġi vvalutat l-effett ta’ Xcc OMVs ippurifikati fuq it-tkabbir ta’ Pst in vitro, Pststarters tkabbru f’mezz likwidu King’s B għal 24 siegħa f’28˚C u mbagħad użati biex jitlaqqmu tliet kulturi differenti li fihom 12 ml ta’ medja King’s B kull wieħed, fi {{3 }}mL Tubi Falcon fi proporzjon ta’ 1:100. Il-kulturi batterjali ġew emendati bi 30 ug/ml OMVs (1:50 jew 1:100, li jikkorrispondu għal 1.44 × 109 jew 7.2 × 108 partiċelli kull ml, rispettivament), jew PBS bħala kontroll, u inkubati għal 20 siegħa f'28˚C. It-tkabbir tal-batterja tkejjel bl-użu ta 'spettrofotometru (Amersham Biosciences) f'densità ottika (OD) ta' 600 nm fuq 22 siegħa.

3 RIŻULTATI

3.1 Analiżi RNA-seq tiżvela sett kbir ta' ġeni Arabidopsis espressi b'mod differenzjat bi tweġiba għall-isfida OMV

Biex nistudjaw il-bidla tat-traskrizzjoni f'Arabidopsis wara l-isfida tal-OMV, ittrattajna nebbieta Arabidopsis b'OMVs ippurifikati mill-patoġenu batterjali Xanthomonas campestris pv. campestris 33913 (Xcc) u miġbura RNA tal-pjanti fi 2, 6 u 24 siegħa wara l-isfida (hpc). L-RNA minn kampjuni ttrattati b'OMV u mock ġew imbagħad sekwenzati u analizzati kif deskritt f'Materjali u Metodi. Korrelazzjoni prinċipali (Figura 1A) u analiżi tal-matriċi ta 'korrelazzjoni tal-kampjun (Figura 1B) juru li r-repliki bijoloġiċi f'kull raggruppament ta' trattament mill-qrib flimkien, indikazzjoni tax-xebh ġenerali tar-rispons tat-traskrizzjoni bejn ir-repliki bijoloġiċi. L-OMV ittrattat kampjuni f'grupp ta' 2 u 6 hpc flimkien, li jindika li t-trattament OMV kellu effett akbar fuq ir-rispons tat-traskrizzjoni mill-ħin tat-teħid tal-kampjuni (Figura 1B). Min-naħa l-oħra, il-kampjuni ttrattati bl-OMV jiġbru flimkien mat-trattament mock rispettiv tagħhom f'24 hpc, li jindika li l-bidla traskrizzjoni indotta mill-OMVs f'dan il-punt kienet naqset u kienet simili għal dik ta 'pjanti ttrattati finta.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

F'kull punt ta 'żmien ittestjat, in-nebbieta ttrattati bl-OMV tqabblu ma' nebbieta ttrattati b'mod finta u ġew estratti ġeni espressi b'mod differenzjali (DEGs). Fil-punti kollha tal-ħin magħquda, total ta' 984 u 175 ġeni nstabu li kienu b'mod sinifikanti (Bidla ta' darbiet tal-ġurnal > 1 jew ← 1, valur p u FDR < 0.05) regolati 'l fuq jew 'l isfel, rispettivament, bi tweġiba għall-isfida OMV (Figura 2A; Supp. Tabella S1). L-espressjoni tal-ġeni Log fold-change (LogFC) varja minn massimu ta' 9.08 (AT1G26410, 6 hpc), li jikkorrispondi għal aktar minn 500-bidla darbiet, għal -5.73 (AT3G17520, 24 hpc). L-ogħla numru ta 'DEGs instab f'2 u 6 hpc, fejn total ta' 647 u 876 DEG, rispettivament, ġew identifikati (irregolati 'l fuq u 'l isfel flimkien). F'24 hpc, instabu 121 DEG. Aktar minn 50 % tal-ġeni regolati 'l fuq f'2 u 6 sigħat wara l-isfida tal-OMV kienu maqsuma bejniethom (Figura 2B). Biex neżaminaw il-bidla temporali tal-espressjoni tal-ġeni, estrajna d-DEGs kollha up-regolati li nstabu fil-punti kollha tal-ħin (37 ġene) u qabbilna l-bidla tal-ħinijiet tagħhom maż-żmien (Figura 2C). L-espressjoni tal-bidla tat-tinja ta 'dawn il-ġeni kienet differenti b'mod sinifikanti fost il-punti ta' ħin differenti (ANOVA f'direzzjoni waħda; F2, 108=8.1633, p=0.0005). Tqabbil post hoc bl-użu tat-test Tukey Kramer HSD indika li l-LogFC kemm f'2 (M=3.45, SD=1.72) kif ukoll f'6 hpc (M=3}.87, SD=1.98) kien ogħla b'mod sinifikanti minn 24 hpc (M=2.32, SD=1.31) (p=0.0145 u p=0 .0005, rispettivament) (Figura 2D). Filwaqt li l-espressjoni medja LogFC f'6 hpc kienet ogħla minn f'2 hpc, ma kinitx statistikament differenti (p=0.5413). Għalhekk, meta nikkunsidraw in-numru ta 'DEGs u l-ġene ġenerali LogFC fit-tliet punti ta' ħin ittestjati, nistgħu nikkonkludu li l-bidla traskrizzjoni l-aktar sinifikanti seħħet fi 2 u 6 sigħat wara l-isfida tal-OMV. Biex teżamina l-validità tar-riżultati tal-RNA-seq, l-espressjoni ta '17-il ġene regolat 'il fuq ġiet determinata bl-użu ta' PCR kwantitattiv (qPCR) b'primers speċifiċi. Erbatax mill-ġeni ttestjati wrew l-istess mudell bħal fl-analiżi RNA-seq u kienu rregolati b'mod sinifikanti meta mqabbla ma 'mock. Tlieta mill-ġeni ttestjati kellhom espressjoni relattiva ogħla iżda ma kinux differenti b'mod sinifikanti minn mock b'dan il-metodu (Supp. Figura S1).

FIGURA 2 Arabidopsis espress b'mod differenzjat ġeni bi tweġiba għall-isfida OMV. (A) Numru totali ta' ġeni espressi b'mod differenzjali (DEGs) (irregolati 'l fuq jew 'l isfel, LogFC > 1 jew ← 1, valur p u FDR < 0.05) f'2, 6, u 24 siegħa wara l-isfida. (B) Koinċidenza bejn DEGs f'punti ta 'żmien differenti (xellug, regolati 'l fuq; lemin, regolati 'l isfel). (C) Ġeni regolati 'l fuq misjuba fil-punti kollha ta' tliet ħinijiet ġew impinġi fuq graff ta 'espressjoni LogFC, li juri l-espressjoni tal-ġeni maż-żmien. (D) LogFC medja tad-DEGs kollha f'punti ta' ħin differenti. Ittri differenti jindikaw differenza statistika f'p < 0.05 mit-test Tukey-Kramer HSD

3.2 Arabidopsis jirrispondi għal OMVs b'bidla traskrizzjoni lejn l-attivazzjoni tas-sistema immuni

Biex nidentifikaw mogħdijiet ta' Arabidopsis affettwati b'mod sinifikanti mill-isfida tal-OMV, użajna l-għodda tal-web AgriGO (Du et al., 2010; Tian et al., 2017). Aħna identifikajna 333 u 55 b'mod sinifikanti (FDR < 0.05) termini ta' ontoloġija tal-ġene regolata 'l fuq u 'l isfel (GO), rispettivament, fil-punti kollha tal-ħin magħquda bi tweġiba għall-isfida OMV. Kważi 25 % tal-GOs up-regolati kienu relatati mar-rispons tal-pjanti għall-istimolu (Figura 3A). Fi ħdan il-kategorija "rispons għal stimolu", it-termini GO l-aktar dominanti kienu assoċjati ma 'rispons għall-istress, għal stimolu bijotiku, kimiċi, u stimulu endoġenu (Figura 3B; Supp. Tabella S2). L-għodda AgriGO identifikat ukoll 103 funzjonijiet molekulari regolati b'mod sinifikanti inklużi 'attività ta' transferase', attività kinażi', 'attività tal-fattur ta' traskrizzjoni', 'irbit tal-jone u tal-metall', 'irbit tal-karboidrati', 'irbit tal-proteini', 'attività katalitika' , 'Adenyl nucleotide binding', 'attività tar-riċettur transmembrana' u aktar funzjonijiet ta' rbit (Sup. Tabella S2). Il-post ċellulari tat-termini sinifikanti kien f'kompartimenti differenti taċ-ċellula inklużi n-nukleu, il-vakuole u s-sistema endomembrana, iżda l-aktar kienet assoċjata mal-periferija taċ-ċellula u kienet tinkludi 'membrana tal-plażma', 'reġjun extraċellulari', 'ħajt taċ-ċelluli' u ontoloġiji 'apoplast' (Sup. Tabella S2). Il-GOs irregolati b'mod sinifikanti 'l isfel, min-naħa l-oħra, inkludew it-termini 'proċess kataboliku u metaboliku tat-tossini', 'rispons għal deprivazzjoni ta' ilma u ilma', 'trasport u lokalizzazzjoni tal-lipidi', u oħrajn (Sup. Tabella S2). GOs relatati mar-rispons għal stimolu bijotiku ma ġewx arrikkit fil-ġeni regolati 'l isfel. Funzjonijiet molekulari regolati b'mod sinifikanti 'l isfel kienu jinkludu ħafna termini redox bħal 'attività ta' ossidorduttażi', 'irbit tal-heme', 'irbit tal-jone tal-ħadid', 'irbit tal-lipidi', 'irbit tal-ossiġnu', u aktar funzjonijiet relatati mal-ossiġnu (Sup. Tabella S2) . Termini Down-Regulated kienu jinsabu wkoll fir-reġjun extraċellulari. Biex niddeterminaw għal liema termini GO jappartjenu DEGs bl-ogħla espressjoni, iffiltrajna l-lista DEG oriġinali billi għażilna ġeni li kellhom LogFC ogħla minn 4, jew iżgħar minn -4 (li jikkorrispondi għal 16-differenza darbiet) . Aħna identifikajna 117-il ġeni li ssodisfaw dawn il-kriterji, li minnhom 115 kienu regolati 'l fuq u 2 regolati 'l isfel fil-punti kollha tal-ħin magħquda. Minħabba n-numru żgħir ta' ġeni regolati 'l isfel b'LogFC ta' inqas minn -4, ma ġew identifikati l-ebda GOs ripressi b'mod sinifikanti. Min-naħa l-oħra, ġew identifikati 72 GO regolati b'mod sinifikanti, li minnhom l-aktar sinifikanti huma relatati ma ''rispons għal stimolu bijotiku estern', 'rispons għal organiżmi oħra', 'rispons ċellulari għal livelli ta' ossiġnu', 'rispons ta' difiża'. , 'rispons għall-istress' u GOs aktar relatati mal-immunità (Figura 3C).

FIGURA 3 termini ta' ontoloġija tal-ġeni Arabidopsis (GO) arrikkit bi tweġiba għall-isfida Xcc OMV. Rappreżentazzjonijiet ta' pie chart tad-distribuzzjoni tal-kategorija f'termini GO ta' Proċess Bijoloġiku (A) u Rispons għal stimolu (B) regolati. (C) Lista ta 'ġeni Arabidopsis b'LogFC ta' > 4 bi tweġiba għall-isfida OMV. Ġeni ġew iffiltrati mis-sett tad-dejta komplut ta 'DEGs u użati biex jidentifikaw termini arrikkit GO bl-użu tal-webtool AgriGo. FDR cutoff < 0.05

3.2 L-isfida tal-OMV wasslet għal regolazzjoni 'l fuq tar-riċetturi immuni

Is-sensing tal-MAMP u r-rispons tal-pjanti għal MAMPs huma fil-biċċa l-kbira medjati minn PRRs marbuta mal-membrana li jimmedjaw il-perċezzjoni tal-patoġenu u l-mitigazzjoni effiċjenti tal-infezzjoni. PRRs huma komunement ikklassifikati f'żewġ gruppi riċetturi kinases (RKs) u proteini simili għar-riċetturi (RLPs) (Boutrot & Zipfel, 2017). Biex tidentifika PRRs li ġew espressi b'mod differenzjali bi tweġiba għal OMVs, qabbilna s-sett DEG tagħna ma 'listi stabbiliti qabel ta' Arabidopsis RKs (Kemmerling et al., 2011; Mott et al., 2016) u RLPs (Wang et al., 2008). Aħna identifikajna fis-sett tad-dejta tagħna 33 u 10 RKs u RLPs regolati 'l fuq, rispettivament, fil-punti kollha tal-ħin magħquda (Tabella 1). L-ebda RKs jew RLP ma nstabu fil-lista tagħna ta '175 ġeni regolati 'l isfel. Kemmerling et al. (2011) iddefinixxew lista ta '49 RK, li l-espressjoni tagħhom kienet indotta b'mod sinifikanti minn MAMPs bħal flg22 u NLP (nekrożi u peptide li jinduċi l-etilene 1-bħal proteina), jew trattament ta' patoġenu. Aħna qabblu din il-lista mal-RLKs regolati 'l fuq mill-esperiment tagħna u sibna li 45 % tal-RKs definiti minn Kemmerling et al. (2011) ġew indotti wkoll bi tweġiba għall-OMVs. Fost dawn, notevoli huma FRK1, SOBIR1, SERK4, RLK/IKU2, PSKR1, HAESA, EFR, BIR u IOS1 (Tabella 1). Fost il-grupp RK, FRK1 kellu l-ogħla espressjoni kemm f'2 u 6 hpc b'LogFC ta '7.11 u 5.2, rispettivament, filwaqt li l-LogFC medja tal-RKs kollha kienet 2.11 u 2.13 f'2 u 6 hpc, rispettivament. Filwaqt li RKs u RLPs marbutin mal-membrana l-aktar jimmedjaw sensing extraċellulari ta 'mikrobi li jinvaduh, ir-riċetturi ta' ripetizzjoni b'ħafna lewċina (LRR) li jgħaqqdu nukleotidi (NLRs), huma riċetturi immuni intraċellulari. Sibna 7 ġeni NLR differenti regolati 'l fuq b'rispons għal sfida OMV f'2 u 6 hpc, l-ebda wieħed ma nstab f'24 hpc (lista NLR ġiet estratta minn TAIR, 102 ġeni) (Tabella 1).

benefiċċji cistanche għall-irġiel isaħħu s-sistema immuni

3.3 OMVs jinduċu l-espressjoni ta 'fatturi ta' traskrizzjoni WRKY multipli

Fatturi ta' traskrizzjoni WRKY (TFs) instabu li għandhom rwoli fir-risponsi immuni tal-pjanti, li jipparteċipaw kemm f'reazzjonijiet ta' immunità attivata minn MAMP (MTI) kif ukoll ta' immunità attivata minn effetur (ETI) (Birkenbihl et al., 2018; Rushton et al., 2010). ). L-isfida tal-OMV wasslet għar-regolamentazzjoni 'l fuq ta' 20 WRKY TFs differenti (lista estratta minn TAIR, 70 ġeni) biss f'2 u 6 HPC (Tabella 1). WRKY TFs kienu assenti mis-sett tal-ġeni regolat 'l isfel tagħna. Familja oħra ta 'TFs affettwati mill-isfida OMV huma proteini li fihom dominju MYB (Tsuda & Somssich, 2015), magħrufa li huma involuti fi proċessi multipli inklużi stress bijotiku u abijotiku (Ambawat et al., 2013). B'mod ġenerali, 9 MYB TFs differenti (lista estratta minn TAIR, 211 ġeni) ġew espressi b'mod differenzjat bi tweġiba għall-isfida OMV, 5 regolati 'l fuq u 4 regolati 'l isfel (Tabella 1). Klassijiet addizzjonali ta' TFs espressi b'mod differenzjat li ġew skoperti huma elenkati fit-Tabella 1.

3.4 Tqabbil tar-rispons tat-traskrizzjoni ta' Arabidopsis għal OMV ma' rispons għal MAMPs purifikati

Biex titgħallem dwar id-differenzi fir-rispons ta' Arabidopsis għal elicitor purifikat kontra struttura mhux raffinata u molekulari kumplessa - OMVs, qabbilna d-dejta tal-RNA-seq tagħna ma 'dejta traskrittomika eżistenti tar-rispons ta' Arabidopsis għal MAMPs magħrufa inkluż flg22, (Denoux et al., 2008) elf26 (Zipfel et al., 2006), PGN (Willmann et al., 2011), OGs (Davidsson et al., 2017) u LPS (Livaja et al., 2008). GOs arrikkit ġew estratti mis-settijiet tad-dejta msemmija hawn fuq kif deskritt hawn fuq (Supp. Tabella S3) u mqabbla ma 'GOs arrikkit wara l-isfida OMV. Ġeneralment, it-termini ta 'Arabidopsis GO indotti minn OMVs kienu simili għal dawk indotti minn MAMPs singoli, proteinaċeji, u mhux proteinaċeji, jaqsmu 56, 51 u 47 % ta' GO indotti minn OMV ma GOs indotti minn flg22, elf26 u PGN, rispettivament. Min-naħa l-oħra, dehret koinċidenza aktar baxxa f'GOs indotti ma' LPS u OGs, li jaqsmu 24 u 33 %, rispettivament, ma' GOs indotti minn OMV (Figura 4A). Notevolment, il-ġene 1 (PR1) relatat mal-patoġenesi (At2g14610), karatteristika tar-risponsi immuni indotti minn LPS (Silipo et al., 2005, 2008), kien assenti mil-lista tal-ġeni indotti mill-OMV fil-punti kollha tal-ħin ittestjati. Wieħed u erbgħin GO instabu li ġew indotti minn OMV u mhux minn kwalunkwe MAMPs oħra ttestjati hawn (Figura 4B). Din il-lista kienet tinkludi GOs relatati ma' 'apoptożi', 'rispons għad-droga', 'trasport tad-droga u 'trasport multi-droga', u 'attività tal-lipase' (Sup. Tabella S3, indikata b'asterisks u b'tipa grassa).

3.5 OMVs jinduċu reżistenza Arabidopsis għal infezzjoni batterjali

Hawnhekk u qabel (Bahar et al., 2016), ipprovdejna evidenza li turi li s-sistema immuni ta' Arabidopsis hija indotta mill-isfida OMV. Biex neżaminaw jekk din l-induzzjoni immuni medjata mill-OMV hijiex tradotta f'rispons immuni effettiv, użajna test tat-tkabbir tal-batterji tal-pjanti (Zipfel et al., 2004) li fih il-pjanti Arabidopsis jiġu ttrattati minn qabel b'OMVs segwiti minn inokulazzjoni batterjali. Tnaqqis sinifikanti ta' aktar minn 10-darbiet f'Pseudomonas syringae pv. weraq tat-tadam DC3000 (Pst) CFU/g kien osservat kemm f'impjanti ttrattati minn qabel OMV- u flg22- meta mqabbla ma 'trattament minn qabel finta, jumejn wara t-tilqim (Figura 5A). It-tkabbir in vitro ta 'Pst ma kienx affettwat b'mod negattiv biż-żieda ta' OMVs mal-medju, li jissuġġerixxi li t-tkabbir imnaqqas ta 'Pst fil-planta huwa relatat mal-effett priming ta' OMV, u mhuwiex effett dirett ta 'OMVs fuq il-batterja (Figura Supp. S2). Biex tittestja jekk ir-reżistenza indotta mill-OMV għal Pst hijiex medjata minn FLS2, EFR, jew BAK1 aħna rrepejna dan l-esperiment b'Col-0, bak- mutant, u l-linja mutant doppju taqa' efr. Biż-żewġ linji mutanti, it-trattament minn qabel OMV irriżulta fi tnaqqis sinifikanti fil-weraq Pst CFU / g meta mqabbel ma 'pjanti ttrattati b'mod finta (Figura 5B-C). Kif mistenni, fls efr u bak- linji mutanti ttrattati b'fg22 kellhom titri Pst simili bħall-pjanti mhux ittrattati peress li huma magħrufa li huma irresponsivi għal flg22. Biex tqabbel it-tnaqqis relattiv fit-titer tal-patoġenu f'Col-0 kontra l-linji mutanti tar-riċettur immuni waqa' qatt u bak f'pjanti ipprajmata, aħna kkalkulajna d-differenza fit-titer Pst f'impjanti ttrattati b'OMV u mock fi tliet esperimenti indipendenti (Supp Figura S3). It-tnaqqis medju fit-titer Pst f'pjanti tad-dahar ittrattati minn qabel b'OMV kien iżgħar minn dak osservat f'pjanti Col-0 (0.89 vs.1.14 Log CFU/gr tnaqqis tal-weraq għal bak u Col{-0, rispettivament, wieħed- mod ANOVA;F2,4=4.3781, p=0.0523). Ma rajniex tnaqqis simili bil-linja mutant fls efr (1.26 vs. 1.32 Log CFU tnaqqis għal fls efr u Col-0, rispettivament, one-way ANOVA: F1,4=0.0352, p=0.5698) (Figura 5D-E).

TABELLA 1 RKs/RLPs indotti mill-OMV u fatturi ta’ traskrizzjoni relatati mal-immunità fin-nebbieta ta’ Arabidopsis

TABELLA 1 (Ikompli)

TABELLA 1 (Ikompli)

4 DISKUSSJONI

Il-vesicles batterjali tal-membrana ta 'barra (OMVs) huma nanostrutturi kumplessi li joriġinaw mill-membrana ta' barra tal-batterja u huma komposti minn mijiet ta 'proteini u komponenti oħra tal-ħajt taċ-ċelluli. Preċedentement intwera li l-pjanti Arabidopsis jirrispondu għall-isfida OMV billi jattivaw risponsi immuni tipiċi bħall-fqigħ ta 'ROS, l-espressjoni tal-ġeni tal-markatur immuni, u l-alkalizzazzjoni medja (Bahar et al., 2016). F'dan l-istudju, eżaminajna r-rispons tat-traskrizzjoni usa' ta' Arabidopsis għal OMVs batterjali u l-effett tiegħu fuq infezzjoni sussegwenti. Il-konklużjoni ġenerali mill-analiżi tad-dejta RNA-seq imwettqa f'dan l-istudju hija li s-sistema immunitarja ta' Arabidopsis hija ipprajmata wara espożizzjoni għal Xanthomonas campestris pv.campestris (Xcc) OMVs. Din il-konklużjoni hija sostnuta minn analiżi distinti u komplementari. L-ewwel, l-arrikkiment tal-ontoloġija tal-ġeni (GO) f'pjanti esposti għal Xcc OMVs juri biċ-ċar li l-OMVs huma pperċepiti minn Arabidopsis bħala stressors. Il-post ċellulari tar-rispons tal-pjanti kien assoċjat primarjament mal-periferija taċ-ċellula li tissuġġerixxi perċezzjoni ċellulari ta 'barra tal-materjal ta' sfida, OMVs. Dan jipprovdi aktar appoġġ għall-idea li l-OMVs u l-kostitwenti tagħhom huma sensati minn riċetturi extraċellulari, simili għal ħafna MAMPs magħrufa. It-tieni nett, aħna ndunajna sett kbir ta 'RKs u RLPs huma regolati b'reazzjoni għall-isfida OMV. Ħafna minn dawn ir-riċetturi huma magħrufa li jimmedjaw il-perċezzjoni tal-patoġenu jew qabel intwerew li jassoċjaw mar-rispons immuni tal-pjanti. FLG22-indott riċettur simili kinase 1 (FRK1) kien l-aktar riċettur indott ħafna. Dan huwa interessanti peress li ma stajniex niskopru flagellin fl-analiżi tal-proteomika Xcc OMV tagħna (dejta mhux murija). Huwa magħruf li FRK1 huwa wkoll indott minn elicitors immuni oħra, iżda huwa intriganti għaliex l-espressjoni tagħha hija tant ogħla mill-bqija tal-RKs up-regolati hawn. L-espressjoni tar-riċettur tal-fattur ta 'elongazzjoni (EFR), min-naħa l-oħra, kienet irregolata b'mod sinifikanti biss fil-punt tal-ħin ta' 2 h, u kellha LogFC ta '1.12, anke jekk EF-Tu jinstab f'OMVs Xcc (Bahar et al., 2016 ). Sibna wkoll ftit ġeni NLR regolati 'l fuq b'reazzjoni għall-isfida OMV, li nofshom huma annotati bħala proteini ta' reżistenza għall-mard, iżda l-funzjoni tagħhom fl-immunità tal-pjanti ma ġietx deskritta. Filwaqt li ma nipoteżizzawx li l-NLRs huma involuti direttament fil-perċezzjoni tal-OMV, jistgħu jiġu indotti 'l isfel mis-sensing RK/RLPs ta' molekuli OMV kif ġie osservat ukoll b'reazzjoni għal MAMPs purifikati bħal flg22, elf18 u LPS (Denoux et al., 2008). ; Livaja et al., 2008; Zipfel et al., 2006). It-tielet nett, ħafna fatturi ta 'traskrizzjoni relatati mal-immunità, WRKY, MYB, u oħrajn, kienu regolati b'mod sinifikanti minn OMVs (Bjornson et al., 2021). Fl-istudju tagħna, il-bidla traskrizzjoni ewlenija b'rispons għal OMV seħħet fl-ewwel żewġ punti ta 'żmien (2 u 6 hpc). Dan kien illustrat kemm minn numru akbar b'mod sinifikanti ta 'ġeni espressi b'mod differenzjali (DEGs) kif ukoll minn Log foldchange (LogFC) b'mod sinifikanti ogħla f'2 u 6 hpc. Madankollu, minn total ta' 121 DEG misjuba f'24 hpc, kważi nofs (52) ma nstabux f'2 jew 6 hpc. Dan jissuġġerixxi li nofs id-DEGs f'24 hpc huma ġeni regolati tard, li l-espressjoni tagħhom kienet regolata 'l fuq jew 'l isfel aktar tard minn 6 hpc. Tabilħaqq, ġeni Arabidopsis b'dinamika ta 'espressjoni differenti wara sfidi ta' elicitor ġew identifikati qabel (Bjornson et al., 2021).

FIGURA 4 Tqabbil ta' termini ta' ontoloġija tal-Ġene (GO) arrikkita b'reazzjoni għal OMV u għal MAMPs purifikati singoli. Is-settijiet ta 'dejta tal-espressjoni ta' Arabidopsis bi tweġiba għall-isfida MAMP (elf26, flg22, OGs, PGN, u LPS; ara t-taqsima Materjali u Metodi għal referenzi) intużaw biex jiġu estratti GOs arrikkit bl-użu tal-għodda tal-web AgriGo. Settijiet GO arrikkit ta 'kull MAMP tqabblu mal-lista GO arrikkita bi tweġiba għal OMVs bl-użu ta' Venny (A, u Supp. Tabella S3). It-termini GO arrikkit biss fis-settijiet tad-dejta OMV huma murija f'(B) magħżula bil-valur FDR tagħhom.

Fl-istudju tagħna, il-bidla traskrizzjoni ewlenija b'rispons għal OMV seħħet fl-ewwel żewġ punti ta 'żmien (2 u 6 hpc). Dan kien illustrat kemm minn numru akbar b'mod sinifikanti ta 'ġeni espressi b'mod differenzjali (DEGs) kif ukoll minn Log fold change (LogFC) b'mod sinifikanti ogħla f'2 u 6 hpc. Madankollu, minn total ta' 121 DEG misjuba f'24 hpc, kważi nofs (52) ma nstabux f'2 jew 6 hpc. Dan jissuġġerixxi li nofs id-DEGs f'24 hpc huma ġeni regolati tard, li l-espressjoni tagħhom kienet regolata 'l fuq jew 'l isfel aktar tard minn 6 hpc. Tabilħaqq, il-ġeni ta' Arabidopsis b'dinamika ta' espressjoni differenti wara l-elicitor cchallenges kienu identifikati qabel (Bjornson et al., 2021). Il-mudell ta 'espressjoni tal-ġeni mgħaġġla u l-aktar temporanja li rajna hawn huwa skond studji oħra li ttestjaw ir-rispons temporali ta' Arabidopsis għal MAMPs. Per eżempju, Denoux et al. (2008) u Bjornson et al. (2021) wrew li l-bidla traskrizzjoni f'Arabidopsis b'reazzjoni għal diversi MAMPs isseħħ fi ftit minuti sa sigħat, u f'ħafna każijiet, DEGs jerġgħu lura għal-livelli bażi ∼fi żmien 24 siegħa wara l-isfida tal-pjanti. B'differenza mill-interazzjonijiet bejn pjanta u patoġenu, fejn l-interazzjoni hija dinamika u kontinwa meta kkontestata b'kampjun mhux ħaj, bħal MAMP purifikat jew b'OMVs- jista 'jkun mistenni li r-rispons tal-pjanti, għall-inqas fuq livell ta' traskrizzjoni, tkun temporanja u mhux sostnuta fuq jiem. Riċerka intensiva fl-aħħar tliet deċennji wriet riċetturi immuni multipli tal-pjanti responsabbli għar-rikonoxximent tal-mikrobi. Ħafna minn dawn ir-riċetturi għandhom il-kapaċità li jiskopru karatteristiċi mikrobiċi singoli u qed jiġu studjati fid-dettall biex jifhmu aħjar il-perċezzjoni tal-patoġenu, is-sinjalar tas-sistema immuni, u r-rispons tal-mudelli u l-pjanti tar-raba’. Madankollu, il-pjanti huma simultanjament esposti għal karatteristiċi mikrobjali multipli minn sorsi differenti, li jżidu l-kumplessità mal-perċezzjoni u r-rispons immuni. Konna interessati li neżaminaw id-differenzi fir-rispons tat-traskrizzjoni ta 'Arabidopsis għal MAMPs purifikati singulari versus OMVs, li jirrappreżentaw struttura mikrobjali aktar naturali u kumplessa iżda grad ta' kumplessità mneħħija minn mikrobu nnifsu. L-OMVs iġorru fatturi ta 'virulenza, enzimi degradattivi, tossini, u bijomolekuli oħra li jista' jkollhom rwol funzjonali għat-tkabbir tal-batterja fil-pjanta, u għalhekk kien interessanti li jiġi ttestjat jekk l-isfida tal-OMV tinduċix GOs uniċi li mhumiex indotti minn MAMPs sintetiċi.

FIGURA 5 It-trattament minn qabel tal-weraq ta' Arabidopsis b'OMVs jinduċi reżistenza għal infezzjoni batterjali sussegwenti. Col-0 pjanti (A) ġew ittrattati minn qabel b'OMVs, ilma (mock), jew flg22 bħala kontrolli, u 24 siegħa wara mlaqqma b'105 CFU/ml sospensjoni ta' Pst DC3000 bl-użu ta' infiltrazzjoni ta' siringa mingħajr labra . It-titer taċ-ċelluli Pst DC3000 fil-weraq imlaqqma ġie ddeterminat 48 siegħa wara t-tilqim permezz ta 'platings ta' dilwizzjoni serjali. Pjanti Arabidopsis Col-0 u fls efr (B), jew bak (C) ġew ittestjati f'esperiment simili kif deskritt f'(A). It-tnaqqis medju Log Pst DC3000 CFU/gr wara trattament minn qabel OMV (meta mqabbel ma' pjanti mhux ittrattati) f'Col-0 u waqgħat efr (D), u Col-0 u lura (E), tqabbel. Kull bar tirrappreżenta t-tnaqqis medju Log Pst DC3000 CFU/gr minn tliet esperimenti indipendenti (id-dejta tal-esperimenti indipendenti hija ppreżentata fis-Sup. Fig. S3). Id-differenzi ma kinux statistikament sinifikanti (Two-tail student t-test. Il-valuri p huma indikati fuq il-vireg tal-graff). L-esperimenti A, B, u C saru mill-inqas tliet darbiet b'riżultati simili (3 pjanti/repliki għal kull trattament f'kull esperiment). L-asterisks (**) jindikaw differenza sinifikanti meta mqabbla ma' mock (test ta' Dunnet p < 0.001)

Għat-tqabbil transcriptomic tagħna, aħna immuntati dejta minn studji b'kundizzjonijiet sperimentali simili, jiġifieri, fil-pjanti u f'punti ta 'żmien simili. Koinċidenza sinifikanti fl-arrikkiment GO dehret fir-rispons ta' Arabidopsis għal OMV u għal flg22, elf26, u PGN. Dan mhux mistenni peress li huwa magħruf li ħafna mill-mogħdijiet ta 'difiża attivati ​​fuq sensing tal-patoġenu huma simili, irrispettivament mill-elicitor speċifiku jew is-sors tiegħu (Bjornson et al., 2021; Zipfel et al., 2006). Madankollu, xi GOs uniċi nstabu li huma regolati mill-OMVs u mhux mill-MAMPs l-oħra li stħarrejna. Fost dawn hemm GOs relatati mad-degradazzjoni tal-ħajt taċ-ċelluli bħal 'attività lipażi' u 'attività idrolażi li taġixxi fuq rabtiet glycosyl', li jistgħu jindikaw li s-sistema ta' difiża tal-pjanti qed timmira lejn id-degradazzjoni tal-OMV. Interessanti, tliet GOs relatati mat-trasport tad-droga nstabu wkoll li kienu rregolati b'mod uniku mill-isfida tal-OMV. Dan jista 'jindika li l-pjanti qed iħabbtu wiċċhom ma' komposti tossiċi li qed jitwasslu fiċ-ċelloli tagħhom, forsi permezz ta 'kunsinna medjata mill-OMV. B'differenza mir-rispons ta 'Arabidopsis għal peptidi li jġibu l-immunità u PGN, osservajna relattivament ftit koinċidenza bejn ir-rispons ta' Arabidopsis għal OMVs OGs, u LPS. Din il-koinċidenza żgħira, speċjalment ma 'LPS, hija kemmxejn sorprendenti, meta wieħed iqis li fiċ-ċelloli tal-mammiferi, l-LPS huma rikonoxxuti sew bħala kontributuri qawwija għar-rispons immuni ospitanti indott minn OMVs (Ellis et al., 2010). Barra minn hekk, il-fatt li ma stajniex insibu regolazzjoni 'l fuq tal-karatteristika immuni LPS PR1 (Silipo et al., 2005), jista' jissuġġerixxi li l-LPS mhuwiex elicitor ewlieni tal-interazzjoni immuni tal-pjanti ma 'OMVs batterjali. Dan, madankollu, għad irid jiġi eżaminat aktar bir-reqqa. Intwera li l-OMVs jikkontribwixxu għall-kolonizzazzjoni tal-batterji kemm tal-mammiferi kif ukoll tal-pjanti u f'xi każijiet għall-virulenza batterika. Min-naħa l-oħra, l-OMVs jattivaw is-sistema immuni tal-ospitanti għalhekk, jaġixxu bħala xabla b'żewġ truf, jippromwovu s-sopravivenza tal-batterji u l-virulenza minn naħa waħda, u jitimgħu s-sistema ta 'sorveljanza tal-ospitanti u jattivaw l-immunità tal-host min-naħa l-oħra (McMillan & Kuehn, 2021 ). L-analiżi tal-priming tagħna wrew li l-isfida tal-OMV wasslet għal inibizzjoni sinifikanti ta 'Pseudomonas syringae pv. tkabbir tat-tadam DC3000 (Pst) fil-pjanta, simili għall-effett ta 'priming li deher b'MAMPs sintetiċi (Jung et al., 2009). Għalhekk, f'dan il-każ, l-amministrazzjoni minn qabel ta 'OMVs lit-tessut inokulat ma ppromwovietx kolonizzazzjoni batterjali iżda pjuttost ipprajmata l-pjanti biex jinduċu rispons immuni effettiv li jinibixxi t-tkabbir tal-patoġenu. Dan ir-riżultat huwa konformi mad-dejta tat-traskrizzjoni tagħna u mal-istudju preċedenti tagħna, li jappoġġja l-idea li l-OMVs jinduċu rispons immuni robust u effettiv f'Arabidopsis. Żewġ studji reċenti wrew ukoll li t-trattament minn qabel ta 'Arabidopsis b'OMVs minn speċi ta' Pseudomonas patoġenika jew kommensali, irażżan l-infezzjoni Pst sussegwenti (Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021). Dawn ir-riżultati jindikaw b'mod kumulattiv li taħt il-kundizzjonijiet ittestjati, l-infiltrazzjoni OMV ma tiffaċilitax l-infezzjoni tal-patoġenu. Fi studju preċedenti, wrejna li mutanti multipli tar-riċetturi immuni jżommu r-rispons WT għal Xcc OMVs. Dawn il-mutanti inkludew PRRs magħrufa, li jirrikonoxxu jew MAMPs proteinaceous (FLS2, EFR, RLPReMAX) jew mhux proteinaceous (LYM1/LYM3) (Bahar et al., 2016). Interessanti, Janda et al. (2021) irrappurtaw li meta l-linja mutanti tar-riċettur FLS2 ta 'Arabidopsis (influwenza) ġiet ikkontestata b'OMVs minn Pst, l-espressjoni FRK1 ma nbidlitx u kienet simili għal pjanti ttrattati b'mod finta, li tissuġġerixxi li FLS2 jimmedja r-rispons għal Pst OMVs. Huwa possibbli li l-flagellin huwa aktar abbundanti fil-preparazzjonijiet ta 'Pst OMV milli huwa f'Xcc 33913 OMVs, u għalhekk it-tneħħija tar-riċettur tal-flagellin kellha effett aktar evidenti fuq ir-rispons tal-pjanti għal Pst milli għal Xcc OMVs.

benefiċċji cistanche għall-irġiel isaħħu s-sistema immuni

Ikklikkja hawn biex tara l-prodotti Cistanche Enhance Immunity

【Staqsi għal aktar】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Intwera li testijiet differenti tal-immunità tal-pjanti jistgħu jagħtu riżultati differenti, li jwasslu għal konklużjonijiet allegatament kontradittorji. Pereżempju, urejna li f'assaġġ tal-fqigħ ROS ta' diska tal-weraq, ir-rispons ta 'Arabidopsis għal OMVs kien dipendenti fuq ir-riċettur EFR, madankollu, fl-assaġġ tal-espressjoni tal-ġene markatur immuni b'nebbieta Arabidopsis, linja qatt mutanti kienet tirrispondi għal OMVs daqs il-WT. McMillan et al. (2021) wrew li trattamenti fiżiċi differenti applikati għall-OMVs neħħew ċerti attivitajiet bħall-inibizzjoni tat-tkabbir tan-nebbieta. Madankollu, ma bidlitx outputs immuni oħra bħall-priming tal-pjanti. Għalhekk, huwa importanti li tikkombina varjetà ta 'assaġġi biex jiġu ttestjati outputs immuni differenti biex tinkiseb ħarsa kemm jista' jkun wiesgħa tar-rispons immuni tal-pjanti għal elicitor partikolari. Biex teżamina aktar l-involviment ta 'wħud mill-PRRs u ko-riċetturi magħrufa, ittestjajna l-waqgħat qatt u l-linji mutanti bak bl-użu tal-assaġġ tal-priming tal-pjanti. Ir-riżultati tagħna juru li l-waqgħat tal-linja mutant doppju Arabidopsis kienu ipprajmata bl-istess mod minn Xcc OMV bħalma kienu pjanti WT, li jappoġġjaw il-kunċett li MAMPs minbarra flagellin u EF-Tu huma wkoll preżenti f'Xcc 33913 OMVs. Ibbażat fuq analiżi tal-espressjoni tal-ġeni tal-markatur immuni, qabel issuġġerijna li l-ko-riċettur BAK1 huwa involut fil-perċezzjoni u/jew ir-rispons OMV (Bahar et al., 2016). F'dan l-istudju, irrevedejna dan is-suġġeriment billi użaw l-assaġġ tal-priming. Hawnhekk, il-linja mutant bak ġiet ipprajmata permezz ta' trattament minn qabel OMV, iżda sa ċertu punt kemmxejn inqas mill-pjanti WT Col-0. Filwaqt li dan il-marġni ma kienx statistikament sinifikanti kien akbar minn dak li deher bil-linja doppja fls qatt mutanti. Dan ir-riżultat huwa wkoll konformi ma 'studju reċenti li wera li l-linja mutant bak kienet risponsiva għall-OMV bħala pjanti WT f'esperimenti ta' priming immuni (Tran et al., 2021). B'mod ġenerali, dan jista 'jissuġġerixxi li filwaqt li BAK1 huwa involut fil-perċezzjoni OMV, perċezzjoni immuni oħra u mogħdijiet ta' sinjalazzjoni huma ppremjati minn OMV, li jwasslu għal rispons immuni effettiv u soppressjoni tat-tkabbir tal-patoġenu. L-involviment tal-ko-riċetturi BAK1 u SOBIR1 bi tweġiba għall-OMVs (Bahar et al., 2016) wassalna biex nassumu li riċetturi immuni multipli, probabbli PRRs, huma involuti fil-perċezzjoni tal-OMV. Madankollu, studju reċenti ssuġġerixxa li l-attivazzjoni immuni tal-pjanti minn OMVs tista 'tkun indipendenti mill-MAMP u tirriżulta minn bidliet fiżjo-kimiċi fil-membrana tal-plażma tal-pjanti indotti mill-integrazzjoni OMV (Tran et al., 2021). Din hija ipoteżi intriganti li għad trid tiġi indirizzata aktar. Interessanti, McMillan et al. (2021) irrappurtaw li l-OMVs ittrattati bil-proteinażi K żammew il-kapaċità ta 'priming immuni tagħhom, li jindikaw li din l-attività tista' tkun indipendenti mill-merkanzija proteinaceous OMV. Filwaqt li dan ir-riżultat jista 'jappoġġja l-ipoteżi ta' attivazzjoni immuni indipendenti mill-MAMP ta 'Tran et al. (2021), MAMPs oħra, mhux proteinaċi preżenti f'OMVs bħal LPS u PGN jistgħu jattivaw MTI (Bahar et al., 2016; McMillan et al., 2021). Barra minn hekk, l-OMVs ittrattati bil-proteinażi K żammew il-kapaċità tagħhom li jinduċu l-inibizzjoni tat-tkabbir tan-nebbieta, li jindika li l-inibizzjoni tat-tkabbir hija dipendenti fuq il-merkanzija proteinaceous tal-OMVs (McMillan et al., 2021). B'kollox, dawn ir-riżultati jenfasizzaw aktar il-kumplessità tar-rispons tal-pjanti għall-OMVs u l-importanza li tintuża varjetà ta 'outputs biex jiġi ttestjat l-involviment ta' elicitor partikolari f'mogħdijiet speċifiċi.

Matul l-2021, erba 'studji indipendenti inkluż dan (li x'aktarx seħħew fl-istess ħin), irrappurtaw li l-OMVs batterjali jimmodulaw is-sistema immunitarja tal-pjanti u jinduċu rispons effettiv kontra l-infezzjoni tal-patoġenu (Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021; Tran et al., 2021). Dawn ir-riżultati eċċitanti jpoġġu lill-OMVs bħala attur ġdid u importanti fl-interazzjonijiet tal-pjanti u l-mikrobi, fejn għad hemm ħafna xi titgħallem. F'dan l-istudju, aħna nipprovdu ħarsa usa' tar-rispons traskrizzjoni ta' Arabidopsis għal Xcc OMV. Se jkunu meħtieġa approċċi ta' riċerka komplementari biex jifhmu aktar il-komponenti u l-mekkaniżmi involuti fil-perċezzjoni tal-pjanti tal-OMVs.

REFERENZI

Ambawat, S., Sharma, P., Yadav, NR, & Yadav, RC (2013). Ġeni tal-fattur tat-traskrizzjoni MYB bħala regolaturi għar-reazzjonijiet tal-pjanti: Ħarsa ġenerali. Fiżjoloġija u Bijoloġija Molekulari tal-Pjanti, 307-321.

Bahar, O. (2020). Vesicles tal-membrana minn batterji patoġeniċi tal-pjanti u r-rwoli tagħhom waqt interazzjonijiet tal-pjanti-patoġeni. Fi: M. Kaparakis-Liaskos, & TA Kufer eds. Vesicles tal-membrana batterjali - Bijoġenesi, funzjonijiet, u applikazzjonijiet. Springer International Publishing, l-Isvizzera, 119–129.

Bahar, O., Mordukhovich, G., Luu, DD, Schwessinger, B., Daudi, A., Jehle, AK, Felix, G., & Ronald, PC (2016). Il-vesikoli batteriċi tal-membrana ta 'barra jinduċu risponsi immuni tal-pjanti. Interazzjonijiet Molekulari tal-Pjanti-Mikrobi, 374-384.

Birkenbihl, RP, Kracher, B., Ross, A., Kramer, K., Finkemeier, I., & Somssich, IE (2018). Prinċipji u karatteristiċi tan-netwerk regolatorju Arabidopsis WRKY matul l-immunità bikrija mqabbda minn MAMP. Ġurnal tal-Pjanti, , 487–502.

Bjornson, M., Pimprikar, P., Nürnberger, T., & Zipfel, C. (2021). Il-pajsaġġ tat-traskrizzjoni ta 'l-immunità li tqajjem mill-mudell ta' Arabidopsis thaliana. Pjanti tan-Natura, , 579–586.

Bolger, AM, Lohse, M., & Usadel, B. (2014). Trimmomatic: Trimmer flessibbli għad-dejta tas-sekwenza tal-Illumina. Bijoinformatika, 2114–2120.

Boutrot, F., & Zipfel, C. (2017). Funzjoni, skoperta, u sfruttament ta 'riċetturi ta' rikonoxximent tal-mudelli tal-pjanti għal reżistenza għall-mard ta 'spettru wiesa'. Reviżjoni Annwali tal-Fitopatoloġija, 257-286.

Chinchilla, D., Zipfel, C., Robatzek, S., Kemmerling, B., Nürnberger, T., Jones, JDG, Felix, G., & Boller, T. (2007). Kumpless indott minn flagellin tar-riċettur FLS2 u BAK1 jibda difiża tal-pjanti. Natura, 497–500.

Chowdhury, C., & Jagannadham, M. v. (2013). Fatturi ta' virulenza huma rilaxxati f'assoċjazzjoni ma' veżikoli tal-membrana ta' barra ta' Pseudomonas syringae pv. tadam T1 waqt it-tkabbir normali. Biochimica Et Biophysica Acta-Proteins u Proteomics, (1), 231–239.

Cook, DE, Mesarich, CH, & Thomma, BPHJ (2015). Nifhmu l-immunità tal-pjanti bħala sistema ta 'sorveljanza biex tiskopri l-invażjoni. Reviżjoni Annwali tal-Fitopatoloġija, 541–563.

Couto, D., & Zipfel, C. (2016). Regolament tas-sinjalar tar-riċetturi ta' rikonoxximent tal-mudell fil-pjanti. Nature Reviews Immunology, (9), 537–552.

Davidsson, P., Broberg, M., Kariola, T., Sipari, N., Pirhonen, M., & Palva, ET (2017). Oligogalacturonides qosra jinduċu espressjoni tal-ġeni assoċjata mar-reżistenza tal-patoġeni f'Arabidopsis thaliana. Bijoloġija tal-Pjanti BMC, 1-17.

Deatheragea, BL, & Cookson, BT (2012). Rilaxx tal-vesikuli tal-membrana f'batterji, ewkarjoti, u archaea: Aspett tal-ħajja mikrobjali kkonservat iżda mhux apprezzat biżżejjed. Infezzjoni u Immunità, 1948–1957.

Denoux, C., Galletti, R., Mammarella, N., Gopalan, S., Werck, D., De Lorenzo, G., Ferrari, S., Ausubel, FM, & Dewdney, J. (2008). Attivazzjoni ta 'mogħdijiet ta' rispons tad-difiża minn OGs u Flg22 elicitors f'nebbieta Arabidopsis. Impjant Molekulari, 423-445.

Dow, M., Newman, M.-A., & von Roepenack, E. (2000). L-induzzjoni u l-modulazzjoni tar-risponsi tad-difiża tal-pjanti minn lipopolisakkaridi batterjali. Reviżjonijiet Annwali tal-Fitopatoloġija, 241-261.

Du, Z., Zhou, X., Ling, Y., Zhang, Z., & Su, Z. (2010). agriGO: Toolkit ta' analiżi GO għall-komunità agrikola. Riċerka dwar l-Aċidi Nukleiċi, W64–W70.

Ellis, TN, & Kuehn, MJ (2010). Virulenza u rwoli immunomodulatorji ta 'vesikoli batteriċi tal-membrana ta' barra. Mikrobijoloġija u Bijoloġija Molekulari Reviżjonijiet,81–94.

Ellis, TN, Leiman, SA, & Kuehn, MJ (2010). Veżikoli tal-membrana ta 'barra prodotti b'mod naturali minn Pseudomonas aeruginosa iqanqlu rispons immuni intrinsiku qawwi permezz ta' sensing kombinat kemm ta 'komponenti lipopolysaccharide kif ukoll ta' proteini. Infezzjoni u Immunità, 3822–3831.

Erbs, G., Silipo, A., Aslam, S., de Castro, C., Liparoti, V., Flagiello, A., Pucci, P., Lanzetta, R., Parrilli, M., Molinaro, A. , Newman, M.-A., & Cooper, RM (2008). Peptidoglycan u muropeptides minn patoġeni Agrobacterium u Xanthomonas iġibu immunità innata tal-pjanti: Struttura u attività. Kimika u Bijoloġija, 438–448.

Felix, G., Duran, JD, Volko, S., & Boller, T. (1999). Il-pjanti għandhom sistema ta 'perċezzjoni sensittiva għall-aktar dominju kkonservat ta' flagellin batterjali. Ġurnal tal-Pjanti, 265–276.

Fesel, PH, & Zuccaro, A. (2016). -glucan: Komponent kruċjali tal-ħajt taċ-ċelluli fungali u MAMP elużiva fil-pjanti. Ġenetika u Bijoloġija Fungali, 53–60

Fulsundar, S., Harms, K., Flaten, GE, Johnsen, PJ, Chopade, BA, & Nielsen, KM (2014). Potenzjal tat-trasferiment tal-ġeni ta 'vesicles tal-membrana ta' barra ta 'Acinetobacter baylyi u effetti ta' stress fuq il-vesikulazzjoni. Mikrobijoloġija Applikata u Ambjentali, 3469–3483.

Gómez-Gómez, L., & Boller, T. (2000). FLS2: Kinażi bħal riċettur LRR involut fil-perċezzjoni tal-flagellin li elicitor batterjali f'Arabidopsis. Ċellula Molekulari, 1003–1011.

Gust, AA, Biswas, R., Lenz, HD, Rauhut, T., Ranf, S., Kemmerling, B., Gotz, F., Glawischnig, E., Lee, J., Felix, G., & Nürnberger , T. (2007). Peptidoglycans derivati ​​mill-batterji jikkostitwixxu mudelli molekulari assoċjati mal-patoġenu li jikkawżaw immunità intrinsika f'Arabidopsis. Ġurnal tal-Kimika Bijoloġika, 32338– 32348.

Ionescu, M., Zaini, PA, Baccari, C., Tran, S., da Silva, AM, & Lindow, SE (2014). Il-vesikuli tal-membrana ta 'barra ta' Xylella fastidiosa jimmodulaw il-kolonizzazzjoni tal-pjanti billi jimblukkaw it-twaħħil mal-uċuħ. Proċedimenti tal-Akkademja Nazzjonali tax-Xjenzi tal-Istati Uniti tal-Amerika, E3910–E3918.

Janda, M., Ludwig, C., Rybak, K., Meng, C., Stigliano, E., Botzenhardt, L., Szulc, B., Sklenar, J., Menke, FLH, Malone, JG, Brachmann, A., Klingl, A., & Robatzek, S. (2021). Analiżi bijofiżiċi u proteomiċi jissuġġerixxu funzjonijiet ta 'pseudomonas syringae pv tomato DC3000 vesicles extraċellulari fit-tkabbir batterjali waqt l-infezzjoni tal-pjanti. bioRxiv, 2021.02.08.430144.