Awtofluworexxenza Bħala Biomarkatur Mhux Invażiv Ta' Senescence U Prodotti Tmiem Avvanzati ta' Glycation f'Caenorhabditis Elegans

Biex tevalwa l-utilità tal-awtofluworexxenza bħala bijomarkatur mhux invażiv tas-senescence f'Caenorhabditis elegans, kejlna l-awtofluworexxenza ta 'nematodi individwali bl-użu ta' spettrofluorimetrija. Il-fluworexxenza ta 'kull dud żdiedet bl-età. Annimali b'intensità ta 'fluworexxenza aktar baxxa urew stennija ta' ħajja itwal. Meta proteini estratti mid-dud ġew inkubati biż-zokkor, l-intensità tal-fluworexxenza u l-konċentrazzjoni ta 'prodotti finali ta' glikazzjoni avvanzata (AGEs) żdiedu maż-żmien. Ribose saħħaħ dawn il-bidliet mhux biss in vitro iżda wkoll in vivo. L-imblokkatur tal-glikazzjoni rifampicin irażżan din iż-żieda fil-fluworexxenza. Spettrometrija tal-massa b'riżoluzzjoni għolja wriet li l-vitellogenins akkumulaw fid-dud qodma, u l-vitellogenins glycated emettu fluworexxenza sitt darbiet ogħla minn vitellogenins naive.Iż-żieda fil-fluworexxenza mat-tixjiħ toriġina minn sustanzi glycatedu għalhekk jista 'jservi bħala bijomarkatur mhux invażiv utli ta' AGEs.Cistanchejista' jservi bħala mudell ġdid biex tfittex fatturi kontra l-AGEu biex tistudja r-relazzjoni bejn l-AGEs u s-senescence.

Cistanche Ħwawar Għall-Fatturi Kontra l-AGE

INTRODUZZJONI

Il-ħajja medja fil-bnedmin ġiet estiża b'mod drammatiku fil-pajjiżi żviluppati matul l-aħħar nofs seklu. Madankollu,ħsara progressiva mat-tixjiħ tikkawża effetti detrimentali fuq il-funzjonijiet fiżjoloġiċi, magħrufa bħalasenescence, umard relatat mas-senescenceqed jiżdiedu wkoll fiproporzjon mal-lonġevità. Estensjoni tal-"saħħa" issa hija meħtieġa aktar milli testendi l-ħajja waħedha. Interventi li jnaqqsu s-senescence u jestendu l-medda tas-saħħa huma mixtieqa. Brenner et al. introdottiCaenorhabditis elegans, li huwa nematodu żgħir tal-ħamrija li jgħix ħieles li jitma 'batterji, għall-użu fistudji tal-ġenetika molekulari tad-divrenzjar u l-iżvilupp.

Sussegwentement, id-dud intuża b'mod estensiv bħala sistema sperimentali għal studji bijoloġiċi, inkluża riċerka dwar is-senescenza, minħabba dan l-annimal's sempliċità, trasparenza, faċilità ta 'kultivazzjoni, ħajja qasira, u l-idoneità għall-analiżi ġenetika2. Fid-dudu, is-senescence tista 'tiġi eżaminata bl-attenwazzjoni tal-kapaċità lokomottiva, reżistenza għall-istress, kapaċità konjittiva, u ippumpjar farinġali, u bl-akkumulazzjoni tal-hekk imsejjaħ pigment lipofuscin tal-età3–5 .

Varjetà ta 'kimiċi, inklużi antiossidanti u diversi mediċini, huma kandidati biex jipprevjenu s-senescence6,7. Barra minn hekk, peress li rrapportajna li l-medda tas-saħħa u l-ħajja tan-nematodi jistgħu jiġu estiżi billi nidħlu batterji probijotiċi8,9, l-effetti ta 'lonġevità ta' batterji ta 'benefiċċju ġew murija wkoll minn numru ta' laboratorji10–12. L-effetti tal-lonġevità ġew eżaminati mill-kurvi tas-sopravivenza, iżda studji bħal dawn fid-dud jeħtieġu aktar minn 3 ġimgħat, minkejja l-ħajja relattivament qasira ta 'C. elegans. Biex jiġu evalwati l-effetti ta 'interventi kontra s-senescence, indikaturi konvenjenti u mhux invażivi tas-senescence huma mixtieqa biex tiġi rintraċċata l-influwenza f'dud individwali u (aħħar) fil-bnedmin bħala l-mira finali.

Lipofuscin, l-hekk imsejjaħ pigment tal-età, intuża b'mod estensiv bħala indikatur tas-senescence. Madankollu, ir-relazzjoni eżatta bejn l-awtofluworexxenza, is-senescence, u l-ħajja fid-dudu baqgħet mhux ċara. Gerstbrein et al. irrapporta li l-pigmenti tal-età huma reporters validi ta 'saħħa tan-nematodu13, billi Coburn et al. irrapporta li l-fluworexxenza blu (tul ta’ mewġ ta’ eċitazzjoni/emissjoni ċċentrata fuq 340/430 nm) isservi bħala markatur tal-mewt għal diversi sigħat qabel u wara l-mewt f’C. elegans14. Ġie ssuġġerit li ż-żidiet fl-awtofluworexxenza blu matul iż-żmien osservati f'popolazzjonijiet ta 'tixjiħC. elegansjistgħu jirriflettu mhux ir-rata ta’ tixjiħ jew l-istat tas-saħħa tal-popolazzjoni per se, iżda minflok il-frazzjoni ta’ individwi mejta jew kważi mejta fil-kampjun15.

Il-prodotti finali tal-glikazzjoni avvanzata (AGEs) ġibdu l-attenzjoni xjentifika16 minħabba li huma ffurmati f'ammonti għoljin f'każijiet ta 'dijabete, iżda wkoll waqt it-tixjiħ fiżjoloġiku, u jwasslu għal stress ossidattiv. L-AGEs huma komposti kumplessi ffurmati minn reazzjonijiet mhux enżimatiċi bejn zokkor li jnaqqas u gruppi amino fi proteini, lipidi jew aċidi nuklejċi; Il-bażijiet Schiff u l-prodotti Amadori mbagħad jiġu ffurmati permezz ta 'reazzjonijiet Maillard, li jipproduċu AGEs. Il-kontenut ta 'AGE huwa għoli f'pazjenti bid-dijabete, artrite rewmatojde, Alzheimer's marda, u mard ieħor17–19. F'pazjenti bid-dijabete, l-akkumulazzjoni tal-AGE tikkorrelata sew mas-severità tal-marda mikrovaskulari u tiżdied mal-età. Madankollu, jekk l-AGEs jirrappreżentawx kawża ta 'patoġenesi jew humiex biss prodotti sekondarji għad irid jiġi eluċidat. L-AGEs huma kkunsidrati wkoll bħala kawżi possibbli ta 'senescence20,21, kif issuġġerit mis-sejbiet f'aC. elegansmudell tat-tossiċità taz-zokkor22,23.

Ġie żviluppat metodu sistematiku ta' analiżi immunosorbenti marbuta ma' enżimi (ELISA) bl-użu ta' antikorpi b'ispeċifiċità għal diversi komposti AGE24–26. Madankollu, huma meħtieġa wkoll metodi mhux invażivi biex jippermettu stimi approssimattivi tal-livelli AGE. Peress li bosta AGEs huma rrappurtatifluorescent u assoċjati tagħhomfll-intensità tal-uorescenza turi sinjalififima tistax korrelazzjoni mal-livelli mkejla mill-ELISA27, aħna eżaminajna jekk danfll-uorescenza tista' tintuża bħala markatur alternattiv għat-traċċar tal-istatus tal-AGEs u s-senescence f'C. elegansmudell.

Biex tivverifika jekk l-osservatfluworexxenzatirrifletti biss il-mewtfluworexxenzairrappurtati minn Coburn et al., id-dud ġew eżaminati billi jintraċċaw il-fluorescenza tad-dud individwali filwaqt liiż-żmien tal-mewt tal-annimali rispettivi. Barra minn hekk, il-effetti ta 'inibituri tal-formazzjoni ta' AGE fuqfluworexxenzau l-akkumulazzjoni AGE ġew investigati wkoll biex tiġi vvalidata l-utilità ta 'C. elegansbħala annimal mudell għar-riċerka AGE.

RIŻULTATI

Awtofluworexxenza ta 'proteini estratti bħala bijomarkatur tat-tixjiħ u AGEs fid-dud

L-ispettrofotometrija tal-fluworexxenza tal-proteini estratti indikat li l-eċitazzjoni f'325–365 nm għamlu 17-dud ta' jumfluoresce bl-ogħla emissjoni fl-400–430 nm (il-quċċata 420 nm) intervall (Fig.1a). Il-blufll-uorescenza kienet komparattivament aktar baxxa matul l-età adulta żgħira (3-ta' jum sa 5-jum) iżda żdiedet maż-żmien (f'annimali ta' 7-jum) (Fig.1b). Lipofuscin, l-hekk imsejjaħ pigment tal-età, joħroġ aħmarfluorescenza (eċċitazzjoni f'530–560 nm, emissjoni f'585–645 nm)15; fl-istudju preċedenti tagħna, dan il-markatur ġie skopert fi dud ta' ħajja tard (aktar minn 13-jum)9. 

Peress li l-autofluorescence misjuba fl-istudju preżenti dehret fi stadju aktar bikri u żdiedet maż-żmien, blu autofluorescence kienet mistennija li tkun bijomarkatur aħjar għat-traċċar tas-senescence. Peress li bosta komposti AGE huma magħrufa li huma awto-fluworexxenti27, aħna eżaminajna r-relazzjoni bejn il-kontenuti AGE u blufluorescenza permezz ta' western blotting li fiha antikorp għal Nε- Intuża (carboxymethyl) lysine (CML), AGE rappreżentattiv. Il-blotting wera li faxxa pendenti ġiet amplifikata maż-żmien (Fig.1c u Fig. 1 Supplimentari). Tabilħaqq, il-kwantifikazzjoni tar-reġjun indikat żieda fl-AGE (Fig.1d), għalkemm CML mhix awtomatikafluorescent.

Biex tiddetermina jekk l-autofluorescenza indirettament indikat anżieda fl-AGEs iffurmati mir-reazzjoni Maillard, proteiniestratti mill-omoġenati tad-dudu ġew inkubati b'mod asettiku sa 4 ġimgħat b'zokkor li jnaqqas bħal glukożju, ribożju u fruttożju. Il-fluorescenza tal-proteini żdiedet maż-żmien fil-preżenza taz-zokkor, filwaqt li ma kien hemm l-ebda żieda notevoli filfluorescenza f'reazzjonijiet imwettqa mingħajr zokkor (Fig.2a). Proteini tad-dud sarufluorescent permezz tal-glikazzjoni anke in vitro. Fost ir-reazzjonijiet imwettqa b'kull wieħed mit-tliet zokkor, dawk bir-ribose ipproduċew l-ogħlafluorescenza, segwita miż-żewġ zokkor l-oħra. DanfiIs-sejba tista' tiġi spjegata minn rapport minn Bunn u Higgins li fih ir-reattività ta' kull mono-saccharide ma' gruppi amminiċi biex jiffurmaw rabtiet ta' bażi ta' Schiff hija dipendenti fuq kemm teżisti fl-istruttura miftuħa (carbonyl) aktar milli f'ċirku ( hemiacetal jew hemiketal), u r-rati ta’ reattività żdiedu fl-ordni ta’ ribożju (10.0), fruttożju (4.5), u glukożju (0.6) (×10).−3 mM−1 h−1 ), rispettivament28.

Fig. 1 Spettrofotometrija tal-fluworexxenza u l-AGEs tal-kampjuni tal-proteini tad-dudu. anPlottijiet tal-matriċi ta' emissjoni ta' eċċitazzjoni (EEM) ta' awtofluworexxenza minn dud lised ta' 3-jum u 17-jum. Il-flil-livelli ta' uorescenza fil-wavelength ta' l-emissjoni fil-plots EEM huma murija bħala heatmaps ikkuluriti. Mitt dud (N2 tat-tip selvaġġ) kull wieħed minn 3-jum u 17-jum ġew lysed fi 3 µL ta’ lysis buffer u 4 µL ta’ 15 fil-mija SDS. Il-proteini ġew rilaxxati permezz ta 'ċikli ta' friża-tidwib, u l-ispettri fotoluminixxenti nġabru b'flspettrofotometru tal-uorescenza (Hitachi FL-4500). Il-proprjetajiet tal-fluworexxenza tan-nematodi lysed ġew analizzati bl-użu tal-EEMflspettroskopija ta' uorescenza. Eċitazzjoni fi 325–365 nm għamlu 17-dud ta' jumfluoresce bl-ogħla emissjonijiet fl-400–430 nm intervall trajettorji korrispondenti bħala serje taflintensitajiet ta' uorescenza, filwaqt li 3-dud żgħar ta' ġurnata lefluoresce. Analiżi multivarjata (eċitazzjoni b'tul ta' mewġ wieħed b'emissjoni ta' tul ta 'mewġ multipli, u skannjar sinkronikufluorometrija) taw plots EEM li jikkonsistu f’eċitazzjoni ta’ skan wieħed.b Livelli ta 'autofluorescenza (ex 340/em 360–600) minn kampjuni ta’ proteina tad-dud estratti minn annimali ta’ kull grupp ta’ età (3–13-il jum). Id-dud (N2 tat-tip selvaġġ) inġabru f'tubi, maħsulaħamsadrabi, u lysed f'kull tubu. Il-kampjuni mbagħad ġew mitħunin bl-użu ta 'Mini Cordless Grinder (Funakoshi, Tokyo, Ġappun) biex jirrilaxxa proteina. Il-kontenut tal-proteini tkejjel kwantitattivament kif deskritt fil-Metodi. Afll-ispettru tal-uorescenza ġie determinat għal kull kampjun 30-µL (li fih 1.5μg ta' proteina totali) bl-użu ta' mudell ta' qarrej ta' microplate grating multimode SH-9000Lab (Corona Electric, Ibaraki, Ġappun). Kull kejl sar tliet darbiet.c Analiżi Western blotting tal-AGE CML f'kampjuni estratti minn popolazzjonijiet tad-dud (tip selvaġġ N2) ta 'etajiet differenti. Jintwera ritratt rappreżentattiv ta' tliet esperimenti riproduċibbli. Il-blots ġew derivati ​​minn partijiet differenti tal-istess ġel (muri fil-Fig. 1 Supplimentari) u ġew ipproċessati b'mod parallel.d Kwantifikazzjonita 'AGEs fil-western blots bl-użu ta' densitometrija. Il-meded imdawra minn frejms rettangolari fil-Fig.1c ġew kwantifikati, u data minn tliet esperimenti riproduċibbli hija murija bħala medja ± SE.

rispettivament.

Biex tivvaluta direttament jekk iż-żidiet fifluorescence fil-preżenza ta 'zokkor kienu dovuti għall-formazzjoni ta' AGE, ELISA intużat biex tiskopri l-kompost AGE rappreżentattiv CML. CML żdied f'dawn ir-reazzjonijiet, u l-livell fil-kampjuni inkubati bir-ribose kien sa kważi seba' darbiet ogħla minn dawk fil-kontrolli inkubati mingħajr zokkor għal 4 ġimgħat (Fig.2b). Meta mqabbla mar-ribożju, l-ammonti ta 'CML prodotti bil-glukożju jew fruttożju kienu baxxi, simili għal CML fil-kontroll; dansejbahija konformi ma’ rapport preċedenti29.

Awtofluworexxenza bħala bijomarkatur tat-tixjiħ u AGEs in vivo

Li jmiss aħna ttestjati jekk il-fll-uorescenza setgħet tiġi skoperta mhux biss minn proteini estratti iżda wkoll fid-dud ħajjin. Meta l-awtofluworexxenza tad-dud individwali nqrat fuq film tal-plastik imġebbda fuq 384-pjanċi sew b'qarrej tal-mikroplate grating multimode, ir-riżultati tal-ispettrofotometrija kienu simili għal dawk tal-proteini estratti (Fig.3a). L-intensità individwali tal-blufll-uorescenza żdiedet maż-żmien (Fig.3b u Supplimentari Fig. 2), filwaqt li l-ebda aħmarfll-uorescenza ġiet skoperta b'dan il-metodu. Peress blufll-uorescenza (340/430 jew 350/460 nm) kienet preċedentement irrappurtata li kienet assoċjata mal-mewt14,15, l-analiżi saret billi ġiet eskluża d-dejta miksuba fi żmien jumejn qabel annimal's mewt. Madankollu, il-blufluorescenza tad-dud xorta żdiedet maż-żmien: iż-żieda tafll-uorescenza għandha għalhekk tkun parzjalment indipendenti mill-mewtfluorescenza. Biex nittestjaw jekk l-awtofluworexxenza tistax tkun bijomarkatur tas-senexxenza, eżaminajna kemm-il ġurnata d-dud setgħu jgħixu wara li l-awtofluworexxenza ġiet imkejla fuq 13-dud ta' ġurnata. L-istennija tal-ħajja ta 'kull dud kienet inversament relatata mal-intensità tal-awtofluworexxenza (Fig.3c).

Il-flL-intensità tal-uorescenza kienet elevata wkoll fid-dud imkabbra bir-ribose (Fig.4a); it-tul tal-hajja ta dawn id-dud kien signififibilkemm iqsar minn dak tad-dud tal-kontroll (Fig.4b). B'kuntrast, id-dud imkabbra fuq medju li fih ir-rifampicin, imblokkatur tal-AGEs, ħareġ inqasfluorescenza meta mqabbla ma' dud ta' kontroll imkabbar mingħajr rifampiċina (Fig.4c); l-effett favur il-lonġevità ta' rifampicin ġie rrappurtat qabel30. Barra minn hekk,daf-2, mutant rappreżentattiv favur il-lonġevità, ukoll awto-fluworexxenti inqas meta mqabbel mat-tip selvaġġ (Fig.4d), filwaqt li l-flintensità uorescence tat-tip selvaġġ żdiedet mat-tixjiħ.

Porzjon tal-fll-uorescenza hija mistennija li tkun derivata minn komposti prodotti f'assoċjazzjoni mal-mewt tal-annimali. Il-blufluorescenza tista 'tkun il-markatur tal-mewt li Coburn et al. osservati fiC. elegansgħal diversi sigħat qabel u wara l-mewt; id-dawl blu jiġi minn aċidu antraniliku li jiġi ffurmat immedjatament wara li jmutu d-dud14. Allegatament, mewtfluorescenza hija emessa mill-forma glikosilata ta 'aċidu anthranilic prodotta mill-mogħdija kynurenine14. kyu-1dud mutanti, li m'għandhomx il-kynureninase, kienu għalhekk mistennija li ma jarmux il-mewtfluorescenza. Madankollu, anke fil-preżenza ta 'din il-mutazzjoni, id-dud ta' età xorta deher li jarmu ogħlafluworexxenzaminn dud iżgħar (Fig.5a), u dud imkabbra fuq medju tat-tkabbir tan-nematodi (NGM) supplimentat bir-ribose urew sinjalifificantly ogħlafluorescenza minn dawk imkabbra fin-nuqqas ta’ ribożju supplimentari jew bis-sorbitol taz-zokkor tal-kontroll (Fig.5b). Il-ħajja tad-dud miżmuma bir-ribose kienet ovvjament iqsar minn dik tal-oħrajn (Fig.5c), li jissuġġerixxi effetti favur it-tixjiħ ta 'AGEs fid-dud.

Identifikazzjoni tal-materjali awtofluworexxentiBiex jiġu identifikati sustanzi lifluoresced f'annimali li qed jixjieħu, sar analiżi LC MALDI fuq il-proteini estratti. Is-sitt proteini l-aktar abbundanti misjuba f'kull kampjun huma elenkati fit-Tabella1; notevolment, il-vitellogenins u l-fatturi ta' elongazzjoni ġew arrikkit fost l-ogħla-45flproteini uorescenti fid-dud anzjani. Barra minn hekk, bl-użu ta' MS b'riżoluzzjoni għolja u l-ambjent komputazzjonali Mascot, fittex proteini li kienu aktar abbundanti f'15-dud ta' ġurnata milli f'3-dud ta' ġurnata u identifikajna 180 proteina (Tabelli Supplimentari 1–3). Għalkemm il-vitellogenins reġgħu ġew arrikkit (preżenti f'livelli sitt darbiet ogħla f'dud anzjani milli f'adulti żgħażagħ), il-livelli ta 'fatturi ta' elongazzjoni kienu simili fiż-żewġ gruppi (Figura 3 Supplimentari). Biex tivverifika jekk dawn il-proteini setgħux jiġu glycated biex jiffurmaw AGEs awtofluworexxenti, fattur ta 'titwil purifikat u vitellogenin ġew inkubati b'ribose in vitro. Il-fluworexxenza emessa minn vitelloġenini glycated uriet spettri simili għal dawk miksuba b'estratti mhux raffinati rkuprati mid-dud ta' 17-jum (Fig.6a). Għalkemm riboflavin huwa magħruf lifluoresce, sibna li l-wavelength tal-emissjoni ta riboflavin kien distint minndik tal-estratti tad-dud. Il-fluworexxenza FL tal-vitellogenin glycated u l-fattur ta 'elongazzjoni kienu sitt darbiet u tliet darbiet (rispettivament) dawk tal-proteini mhux glikat bi 23 jum in vitro (Fig.6b).

L-AGEs misjuba minn western blotting b'antikorpi anti-CML żdiedu wkoll maż-żmien minn 3-dud ta' ġurnata għal 13-dud ta' jum in vivo (Fig.1c). Permezz ta 'blotting simultanju tal-Punent ma' antikorpi anti-vitellogenin, sibna li s-sinjali anti-CML kienu l-istess meded ta 'daqs bħal vitellogenin (Fig.6c). Għalkemm il-vitellogenin YP170 u YP115 akkumulaw bl-età matul dan il-perjodu, l-intensità tas-sinjali AGE kienet imsaħħa ogħla miż-żieda fl-ammont ta 'vitellogenin YP170 (Fig.6d). Il-mikroskopija tal-fluworexxenza wriet li 13-dud ta’ jum (Fig.7d–f, kolonni 2 u 3) emessi signififidawl blu ħafna iktar intens minn 3-adulti żgħażagħ ta' jum (Fig.7a–c, kolonni 2 u 3; Fig.7g); il-gonadi wkoll dehru isbaħ (Fig.7d–f, kolonni 1 u 2). CML huwa AGE rappreżentattiv, għalkemm CML mhuwiex innifsu ft fluworexxenti. Pentosidine, AGE ieħor, huwa magħruf li huwa fluworexxenti. Madankollu, l-immunotebgħa bl-ebda anti-korpi anti-CML u lanqas anti-pentosidine ipprovda differenzi prominenti bejn dud qodma u żgħażugħ (dejta mhux murija). Anti-CML madankollu wera tixrid mifrux madwar it-tessuti, filwaqt li anti-pentosidine bilkemm wera dan.