Assenza apparenti ta' BMAL1-Dipendenti Muskoli Skeletriċi–Kidney Cross Talk fil-ġrieden

FORMULAZZJONI ERBALI GĦAL MARD KRONIKA TAL-KLIEI

Kliem ewlieni: ġeni tal-arloġġ ċirkadjan; funzjoni renali; fiżjoloġija integrattiva

1. Introduzzjoni

Ir-ritmi ċirkadjani huma prominenti fil-biċċa l-kbira tal-proċessi fiżjoloġiċi. Il-kontroll ta 'dawn ir-ritmi huwa medjat parzjalment minn arloġġ ċentrali li jirrisjedi fin-nukleu suprachiasmatic tal-moħħ, iżda arloġġi ċirkadjani periferali jinfluwenzaw ukoll ir-ritmi fil-funzjoni fiżjoloġika [1]. L-arloġġ molekulari jikkonsisti f'linja ta' feedback ta' traskrizzjoni-traduzzjoni. Fil-qosor, il-proteini tal-qalba aryl-hydrocarbon-receptor-nuclear-translocator-like protein (ARNTL; jew BMAL1) u ċ-ċikli tal-produzzjoni tal-lokomotriċi ċirkadjani kaput (CLOCK) jirregolaw b'mod pożittiv it-traskrizzjoni tal-ġeni Period and Cryptochrome; ir-rispons tal-proteini Period (PER) u Cryptochrome (CRY) fuq u jinibixxi l-attività ta 'BMAL1/CLOCK (revedut f'[2,3]). It-tfixkil ta 'proċessi kkontrollati minn ċirkadjani huwa assoċjat ma' ħafna patoloġiji, inkluż mard kardjovaskulari u tal-kliewi [4,5]. Sal-lum, it-taħdit inkroċjat bejn sistemi ta' organi differenti wara tfixkil ċirkadjan immirat mhuwiex mifhum tajjeb. Dan l-istudju jiffoka fuq it-tħassir tal-proteina tal-qalba tal-arloġġ BMAL1 fil-muskolu skeletriku u r-ramifikazzjonijiet potenzjali li dan it-tfixkil tal-arloġġ għandu fuq il-kliewi.

Il-mudell tal-ġurdien BMAL1-inducible-knockout (iMS-BMAL1 KO) speċifiku għall-muskoli skeletriċi ġie deskritt qabel li jippossjedi karatteristiċi simili għal dawk li dehru fit-tixjiħ. Dawn il-ġrieden juru mixja mibdula, mobilità mnaqqsa, dgħjufija fil-muskoli, u teħid indebolit tal-glukożju [6,7]. Il-mard tal-kliewi huwa sinonimu mat-tixjiħ peress li l-prevalenza tal-mard tal-kliewi tiżdied flimkien mal-età [8]. Karatteristika oħra rrappurtata fil-ġrieden iMS-BMAL1 KO hija li juru żieda fil-kalċifikazzjoni tal-għerq [6]. Ir-rwol tal-kliewi fil-bilanċ tal-aċidu-bażi u l-omeostasi minerali jorbot direttament is-saħħa tal-għadam mal-mard tal-kliewi. Konsegwentement, ipotizzajna li l-ġrieden iMS-BMAL1 KO jistgħu potenzjalment ikunu mudell għall-mard tal-kliewi.

L-għan ta 'dan l-istudju kien li jiddetermina jekk it-tfixkil tal-arloġġ fil-muskoli skeletriċi jwassalx għal disfunzjoni renali. It-tħassir ta' BMAL1 fil-muskolu skeletriku jikkawża żieda fil-markaturi infjammatorji fil-kliewi. Madankollu, la l-funzjoni renali u lanqas l-istoloġija tal-kliewi ma jidhru li huma affettwati minn iMS-BMAL1 KO. Din id-dejta tissuġġerixxi li l-konsegwenza tat-tfixkil tal-arloġġ fil-muskoli skeletriċi twassal għal bidliet minimi fil-kliewi taħt il-kundizzjonijiet ittestjati.

2. Materjali u Metodi

Annimali. Il-mudell tal-ġurdien użat f'dan l-istudju ġie ġġenerat bl-użu ta 'ġrieden floxed exon 8 BMAL1 [9] imqassma ma' ġrieden Cre-recombinase speċifiċi għall-muskoli skeletriċi (human skeletal actin–Cre). Cre ġie attivat b'injezzjonijiet ta 'tamoxifen (magħmula f'15% etanol fiż-żejt taż-żerriegħa tal-ġirasol) 5 ġimgħat qabel l-istudju (2 mg / jum; 5 ijiem ip.) Biex jinħoloq iMS BMAL1 KO. Ġrieden Cre+ injettati bil-vettura (15% etanol fiż-żejt taż-żerriegħa tal-ġirasol) intużaw bħala kontrolli. Ġrieden żgħar verġni maskili ġew studjati fi 17-19-il ġimgħa, u ġrieden età ġew studjati fi 13-14-il xahar. L-esperimenti kollha twettqu mill-Gwida tal-Istituti Nazzjonali tas-Saħħa għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Laboratorju u approvati u mmonitorjati mill-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Università ta 'Florida u l-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Amministrazzjoni tal-Veterani ta' North Florida/South Georgia. Ġrieden kienu miżmuma f'temperatura (20-26 ◦C) u kkontrollati bl-umdità, 12: 12 h kmamar ċiklati dawl-dlam. Ġrieden ġew ipprovduti aċċess ad libitum għall-ilma u standard 18% proteina gerriema chow (nru. 2918, Harlan Teklad/Envigo, Madison, WI, USA) sakemm ma jkunx innutat mod ieħor.

Studju Metaboliku Gaġġa. Koorti ta' ġrieden irġiel żgħar (5 kontroll u 5 KS-BMAL1 KO) inżammu f'gaġeġ metaboliċi biex jiġbru l-awrina u jimmonitorjaw il-konsum tal-ikel/ilma [10]. Dieta tal-ġell ibbażata fuq trab (Envigo Teklad Custom Diet) li fiha 1% agar ġiet ippreparata u użata matul il-kollezzjonijiet tal-gaġeġ metaboliċi. Il-ġrieden ingħataw 3 ijiem biex jakklimataw mal-gaġeġ metaboliċi qabel il-bidu tal-ġbir fuq dieta ta' kontroll ({{10}}.25% NaCl; 0.6% K; Envigo 99131). Wara ġurnata ta' reġistrazzjoni b'dieta ta' kontroll, il-ġrieden imbagħad ġew ittrattati b'dieta defiċjenti ta' potassju (0.25% NaCl; 0.0001% K; Envigo 99134) għal ħamest ijiem. Inġabru kampjuni tal-awrina kull 12-il siegħa fl-aħħar tal-perjodi ta' dawl tal-ġurnata u ta' bil-lejl (ħin Zeitgeber 0 u 12). Ġew irreġistrati l-ħruġ tal-awrina, it-teħid tal-ikel u l-konsum tal-ilma. Il-konċentrazzjonijiet tal-elettroliti tal-awrina tkejlu permezz ta' fotometru tal-fjamma (Mudell Cole-Parmer 2655- 00, Vernon Hills, IL, USA) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-ġrieden ġew ewtanizzati, u t-tessut inġabar fil-ħin Zeitgeber 6.

Kompożizzjoni tal-Korp. Il-kompożizzjoni tal-ġisem ġiet kwantifikata fi ġrieden irġiel żgħar konxji qabel u ħamest ijiem wara l-għoti ta 'dieta mnaqqsa mill-potassju. Il-kejl twettaq fil-ħin Zeitgeber 4-6 bl-użu ta 'Analizzatur tal-Kompożizzjoni tal-Korp ta' Reżonanza Manjetika Kwantitattiva EchoMRI (Echo Medical Systems, Houston, TX, USA) [11].

Protokoll ta' Avvanzament tal-Fażi. Koorti separata ta 'ġrieden maskili ta' età kienu miżmuma waħedhom f'gaġeġ mgħammra b'rota li taħdem b'aċċess ad libitum għal chow (nru 2918, Harlan Teklad) u ilma. Il-gaġeġ kienu maħżuna f'kaxxa kkontrollata bid-dawl bi skambju ta 'arja kostanti (Actimetrics, Wilmette, IL, USA). L-iskeda tad-dawl inżammet fuq ċiklu ta 'dawl-dlam ta' 12:12 h bl-użu ta 'sors tad-dawl LED aħdar (~ 200 lux). Wara ġimgħa ta 'linja bażi, iċ-ċiklu skur kien avvanzat b'7 sigħat, u l-ġrieden inżammu fuq din l-iskeda ġdida ta' ċiklu ta 'dawl-dlam 12:12 h għal ġimgħa. Dan il-proċess ġie ripetut għat-tieni darba biex jipproduċi avvanz ta' fażi ta' 14-h. Il-ġrieden ġew ewtanizzati fil-ħin Zeitbeger 2 fi gruppi ta '2-3, u t-tessut inġabar 7-10 ijiem wara t-tieni ġimgħa ta' avvanz tal-fażi.

Speċifiċità tar-rikombinazzjoni. Biex tikkonferma l-ispeċifiċità tar-rikombinazzjoni ta 'Bmal1, lestejna PCR bl-użu ta' 40 ng ta 'DNA ġenomika tal-muskoli skeletriċi u primers għall-alleli rikombinati u mhux rikombinati. (fwd primer: ACTGGAAGTAACTTTATCAAACTG, rev primer: CTGACCAACTTGCTAACAATTA, primer tar-rikombinazzjoni: CTCCTAACTTG GTTTTTGTCTGT). Il-primers forward u reverse għall-allel Bmal1 floxed jagħtu prodott 431-bp. It-tieni primer forward 50 -CTCCTAACTTGGTTTTTGTCTGT-30 ġie inkluż biex jinstab il-prodott rikombinat, li juri faxxa f'572 bp. Il-prodotti tar-reazzjoni tal-PCR tħaddmu fuq ġel agarose 1.7%, u l-identifikazzjoni ta 'faxxa ġenomika u faxxa speċifika għar-rikombinazzjoni kkonfermat l-annimali kollha ttrattati b'tamoxifen kienu KO speċifiċi għat-tessut kif deskritt qabel [7,12].

Immunoistokimika. Mal-anestetizzazzjoni bl-isoflurane inalanti, il-kliewi tal-lemin inġabru u immedjatament maqtugħin b'mod trasversali fin-nofs imbagħad maħżuna f'periodat-lysine-2% paraformaldehyde għal madwar 48 siegħa f'4 ◦C. Il-fluwidu mbagħad inbidel għal PBS biex jipprepara għall-ipproċessar. Kampjuni tal-kliewi minn kull annimal ġew inkorporati fil-paraffin, u 4-sezzjonijiet ħxuna ta' mikrometri ġew maqtugħin u mmuntati fuq slides tal-ħġieġ. Is-sezzjonijiet kienu jew imtebba' b'ematossilina u eosina jew imtebba' b'substrat kromoġeniku ta' 3,30 -diaminobenzidine (Vector) biex jimmiraw BMAL1 (D2L7G Cell Signaling; 1:3000; RRID: AB_2728705, Danvers, MA, USA). Sezzjonijiet ġew osservati permezz ta 'mikroskopija tad-dawl (Nikon E600 mgħammra b'kamera diġitali Nikon DXM1200F, Melville, New York, NY, USA). Identifikaturi tal-grupptneħħew minn kull slide, u l-espressjoni BMAL1 ġiet eżaminata jew slides ġew skurjati għal korriment tubulari bl-użu tal-kriterji li ġejjin: persentaġġ ta 'tubuli li wrew sinjali ta' nekrożi tubulari, nuqqas ta 'bord ta' pinzell, dilatazzjoni tubulari, u formazzjoni ta 'proteina fonduta.

inkubati b'antikorp sekondarju kontra l-fenek konjugat bil-perossidasi taż-żwiemel. Wara ħasil addizzjonali b'TBS-T għal 30 min, is-sejba twettqet bl-użu ta 'reaġent SignalFire ECL (Cell Signaling Technology) b'ħin ta' espożizzjoni ta '30 s għall-immaġini. Id-densitometrija saret bl-użu tal-Fiġi, u l-abbundanza tal-proteini ġiet normalizzata għal tbajja 'Ponceau.

Immunoassaġġi Multiplex. Reġjuni kortikali u medullari ġew dissected minn nofs kilwa fi ġrieden maskili ta 'età. It-tessut ġie omoġenizzat jew fi 300 µL (kortiċi) jew 250 µL (medulla) ta’ buffer (1% cocktail ta’ inibitur tal-protease–phosphatase (Thermo Scientific) 1% 1 M ethylenediaminetetraacetic acid, 0.1% Tween 20 f’fosfat- salina buffered). Il-konċentrazzjoni tal-proteina għal kull kampjun ġiet iddeterminata b'BCA (Pierce, Thermo Scientific). L-omoġenati tkejlu f'duplikati għal analiti magħżula bl-użu ta' kits kummerċjali ta' immunoassaġġ multiplex (cat#'s MCYTOMAG-70K, MBNMAG-41K, u MKI1MAG{-94K; EMD MilliporeSigma) fuq MILLIPLEX® Analizzatur 3.1 xPONENT System (Luminex 200, Austin, TX, USA) b'analiżi tad-dejta permezz tas-softwer MILLIPLEX Analyst. Is-CVs medji intraassay kienu<5% and the average inter-assay CVs were <15%. The data were converted from pg/mL to pg/mg, using the previously determined protein concentrations. 

Iżolament u Respirometrija tal-Mitokondrija Renali. Tessut kortikali tal-kliewi frisk ġie mqassam mill-ġrieden wara l-avvanz tal-fażi. Il-mitokondrija ġew iżolati bl-użu tal-Mitochondria Isolation Kit for Tissue (#ab110169; Abcam, Waltham, MA, USA) wara l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-konċentrazzjoni tal-proteina tal-preparazzjoni mitokondrijali ġiet iddeterminata bl-użu ta 'Kit ta' Assaġġ tal-Proteina BCA (Pierce, Thermo Scientific). Ir-respirazzjoni mitokondrijali ta' l-iżolat ġiet iddeterminata f'duplikat f'kamra xylograph kkalibrata qabel miżmuma f'37 ◦C (Oroboros O2K; Oroboros Instruments, Innsbruck, Awstrija) li fiha buffer ta' respirazzjoni (MiR05; 0.5; mM EGTA, 3 mM MgCl2·6H2O, 60 mM aċidu latto-bijoniku, 20 mM taurina, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM D-sukrożju, u 1 g/L BSA essenzjalment mingħajr aċidu tax-xaħam, pH 7.1) [13]. Il-konċentrazzjoni tal-ossiġnu tal-buffer tar-respirazzjoni nżammet bejn is-saturazzjoni tal-arja (~200 µM) u 50 µM. Ir-rata tal-konsum tal-ossiġnu (OCR; ρmol O2/s/mg proteina mitokondrijali) ġiet imkejla bl-użu tal-protokoll li ġej ta’ substrate-uncoupler-inhibitor-titration (SUIT) (il-konċentrazzjoni tar-reaġenti nnutati fil-parentesi huma finali fi ħdan il-kmamar): (1) LEAK (L) ) ir-respirazzjoni ġiet ivvalutata wara stimulazzjoni taċ-ċiklu TCA b'sottostrati marbuta ma 'NADH piruvate (5 mM), malate (2 mM), u glutamate (10 mM) biex isostni l-fluss tal-elettroni permezz tal-kumpless I (CI) tas-sistema tat-trasport tal-elettroni (ETS; E) ); (2) fosforilazzjoni ossidattiva (OXPHOS; P) ġiet stimulata b'adenosine diphosphate (ADP; 2.5 mM) u rreġistrata bħala PCI; (3) żieda ta 'succinat (10 mM) appoġġjat fluss ta' elettroni konverġenti permezz ta 'kumplessi I u II ta' l-ETS (PCI + II); (4) il-kwalità tal-preparazzjoni mitokondrijali ġiet evalwata permezz tal-ittestjar tal-integrità tal-membrana ta 'barra mitokondrijali billi żżid cytochrome c (10 µM); (5) l-uncoupler carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP; 0.5 µL-passi ta’ soluzzjoni stokk ta’ 0.1 mM) ġie ttitrat bil-pass sakemm intlaħqet respirazzjoni mhux akkoppjata massima u ġiet irreġistrata bħala kapaċità massima ETS (ECI+) II); (6) iż-żieda ta 'rotenone (0.5 µM) inibit il-kumpless I tal-ETS, u l-OCR li jifdal ġie rreġistrat bħala kapaċità massima tal-ETS appoġġjata minn substrat tal-kumpless II (ECII); (7) iż-żieda ta 'antimycin A (2.5 µM) inibit il-kumpless III tal-ETS u b'hekk it-trasport kollu tal-elettroni għall-kumpless IV, u l-OCR li kien fadal ġie rreġistrat bħala konsum residwu ta' ossiġnu mhux mitokondrijali (ROX) u mnaqqas mill-OCRs preċedenti kollha ; (8) il-konsum ta 'ossiġnu mbagħad ġie stimulat mill-ġdid biż-żieda ta' N,N,N0 ,N0 -Tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (TMPD; 0.5 mM; fil-preżenza ta 'ascorbate (2 mM) biex tiġi evitata awtossidazzjoni mhux ikkontrollata). ta' TMPD) bħala sottostrat artifiċjali għat-tnaqqis taċ-ċitokromu ċ; (9) ir-rata ta 'ossidazzjoni ta' l-isfond kimiku fil-preżenza ta 'TMPD / ascorbate ġiet evalwata billi żżid il-kumpless IV inibitur sodium azide (100mM), u tnaqqset mill-fluss preċedenti, li rriżultat f'kapaċità massima ta' attività ta 'cytochrome c oxidase (ECIV). Id-dejta dwar il-konsum tal-ossiġnu ġiet akkwistata u analizzata bl-użu ta 'DatLab vs 7.4 (Oroboros Instruments). Il-proporzjonijiet tal-kontroll tal-fluss (FCR) ġew ikkalkulati bħala konsum tal-ossiġnu fi kwalunkwe stat respiratorju partikolari relattiv għall-kapaċità massima tal-ETS (ECI+II).

Ċitometrija tal-fluss. It-tessut tal-pulmun ġie diġerit, u l-analiżi ċitometrika tal-fluss saret kif deskritt qabel [14].

Analiżi statistiċi. Id-dejta grafika hija ppreżentata bħala medja ± SEM. ANOVA f'żewġ direzzjonijiet, b'miżuri ripetuti meta possibbli, intużat biex janalizza d-differenzi bejn erba 'gruppi. It-test ta' paraguni multipli ta' Sidak intuża biex iqabbel gruppi ta' ġrieden ma' gruppi ta' trattament. It-test t tal-Istudent intuża biex iqabbel iż-żewġ gruppi. L-analiżi saret bl-użu tas-softwer GraphPad Prism verżjoni 9.2 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).

Is-sinifikat statistiku ġie definit bħala p < 0.05.

Servizz ta' Appoġġ Ta' Wecistanche:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950