Ir-Reżistenza għall-Apoptożi taċ-Ċelloli Senexxenti Hija Ostakolu Intrinsiku Għal Senoliżi Indotta minn Glycosides Kardijaċi

Jekk jogħġbok ikkuntattjaoscar.xiao@wecistanche.comgħal aktar informazzjoni

AstrattEliminazzjoni mmirata ta 'ċelluli senescent, analiżi, hija waħda mix-xejriet ewlenin fit-terapija kontra t-tixjiħ. Il-glikożidi tal-qalb reċentement ġew ippruvati li huma senolitiċi ta 'spettru wiesa'. Hawnhekk ittestjajna proprjetajiet senolitiċi ta 'glikożidi kardijaċi lejn ċelloli staminali mesenkimali umani (hMSCs). Il-glikożidi tal-qalb ma kellhom l-ebda kapaċità senolitika lejn hMSCs senescent ta 'oriġini varji. Bl-użu ta' approċċi bijoloġiċi u bijoinformatiċi nqabblu l-iżvilupp tas-senescence f'hMSCs 'cardiac glycosides-sensitive'A549 u '-insensitive'hMSCs. In-nuqqas ta 'analiżi nstab li kien medjat mill-importazzjoni effettiva tal-potassju u reżistenza miżjuda għall-apoptożi f'hMSCs senescent. Id-dgħajjef tad-"difiża antiapoptotika" jippredisponi l-hMSCs għall-analiżi. Aħna żvelaw li r-reżistenza għall-apoptożi, rikonoxxuta qabel bħala karatteristika komuni tas-senescence, fil-fatt, mhijiex karatteristika ġenerali taċ-ċelloli senescent. Barra minn hekk, ċelluli senescent apoptożi-proline biss huma sensittivi għall-analiżi indotta mill-glikoside kardijaku. Għalhekk, nistgħu nispekulaw li l-effettività ta 'l-analiżi tista' tiddependi fuq jekk iċ-ċelluli senescent tabilħaqq isirux reżistenti għall-apoptożi meta mqabbla mal-kontropartijiet proliferanti tagħhom.

Kliem ewlieniĊelloli staminali. Senolysis·Senescence·Apoptosis·Reżistenza għall-istress

Jekk jogħġbok ikklikkja hawn biex tkun taf aktar

Introduzzjoni

Illum is-senescenza ċellulari hija meqjusa bħala reazzjoni komuni ta' kważi kull tip ta' ċelluli li qed jipproliferu, inklużi dawk tal-kanċer u dawk staminali, kif ukoll xi ċelluli post-mitotiċi għal varjetà ta' stimuli stressanti [1-3]. It-tipi li ġejjin ta 'senescence ċellulari jistgħu jiġu distinti skont l-oriġini tal-fattur li jinduċi: replikattiva (minħabba l-ħsara fid-DNA fit-truf tat-telomeri mqassra), indotta mill-onkoġeni (bi tweġiba għal attivazzjoni aberranti ta' sinjalazzjoni onkoġenika), indotta minn stress ( medjat mill-ħsara fid-DNA kkawżata mill-istress ossidattiv, xokk tas-sħana, radjazzjoni UV u y, eċċ.) u kkaġunata mill-kimoterapija (attivata fiċ-ċelloli tal-kanċer b'reazzjoni għal mediċini kimoterapewtiċi)[4-7]. Hemm eteroġeneità fil-markaturi espressi minn ċelluli senescent jiddependi kemm fuq it-tip ta 'ċellula u insult użat biex jinduċi senescenza. Madankollu, hemm diversi karatteristiċi komuni tipiċi għal ħafna tipi ta 'ċelluli senescent. Il-karatteristika essenzjali tas-senescence għal kull tip ta 'ċellula li tiddividi hija t-telf irriversibbli ta' proliferazzjoni [8].estratt ta' cistanche tubulosaL-irreversibbiltà ta 'l-arrest taċ-ċiklu taċ-ċelluli hija kkontrollata mill-inibituri ta' cyclin-dependent kinase (CDK) pl6 u p21 u ħafna drabi hija rregolata mill-proteina li jrażżan it-tumur p53 [8,9]. Il-karatteristiċi importanti l-oħra taċ-ċelloli senescent huma l-attivazzjoni ta 'rispons ta' ħsara persistenti fid-DNA; ipertrofija taċ-ċelluli, li ħafna drabi tqum bħala riżultat ta 'bijoġenesi ribosomali indebolita u sintesi tal-proteini; disturb tad-degradazzjoni lisosomali u disfunzjoni tas-sistemi ta' degradazzjoni tal-bqija; żieda fl-attività ta' l-enzima liżosomali speċifika assoċjata mas-senescence- -galactosidase; diversi alterazzjonijiet mitokondrijali; akkwist tal-fenotip sekretorju assoċjat mas-senescence (SASP), magħmul minn fatturi pro-infjammatorji, enzimi li jiddegradaw il-matriċi, speċi reattivi tal-ossiġnu, eċċ.; alterazzjonijiet epiġenetiċi u tal-pajsaġġ tal-kromatina, inkluża l-formazzjoni ta’ fokali eterokromatiċi assoċjati mas-senescence u distensjoni tas-satelliti assoċjati mas-senescence [8-10].Fi kliem ieħor, iċ-ċelloli senescent jippreservaw l-attività metabolika u l-vitalità, iżda l-funzjonament tagħhom jinbidel b’mod sinifikanti meta mqabbel ma’ iċ-ċelloli tal-oriġini.

Cistanche jista 'anti-aging

Issa huwa ċar li ċ-ċelloli senescent jistgħu jimmodifikaw il-mikroambjent tal-madwar li jaffettwaw kemm iċ-ċelloli ġirien kif ukoll in-niċeċ ċellulari, li jistgħu jwasslu għal funzjonament ħażin tat-tessuti u għalhekk jistgħu jkunu relatati mal-progressjoni tat-tixjiħ u l-mard relatat mal-età [11,12]. Meta wieħed iżomm dan f'moħħu, illum aktar attenzjoni hija ffukata fuq l-istrateġiji għal "qtil" immirat taċ-ċelloli senescent[13-15]. Għal dan il-għan, qed tiżviluppa b'mod attiv klassi ġdida ta 'mediċini msejħa senolytics. Senolytics jimmiraw mogħdijiet ta' sinjalazzjoni li jikkontribwixxu għar-reżistenza taċ-ċelloli senescent lejn l-apoptożi, u b'hekk jinduċu l-apoptożi preferenzjali fiċ-ċelloli senescent[16]. Il-lista ta 'senolytics hija kontinwament timla b'aġenti ġodda. L-aktar komposti magħrufa bl-attività senolitika ddikjarata huma navitoclax (inibitur tal-familja Bcl-2), taħlita ta’ dasatinib (inibitur ta’ tyrosine kinases multipli) u quercetin (flavonol naturali), inibituri Hsp90, inibituri MDM2, FOXO{ {8}}Peptide li jinterferixxi p53, degradatur tal-proteini tal-familja BET, CAR-T speċifiku għall-uPAR, navitoclax konjugat bil-galatto u diversi komposti naturali senolitiċi[16-24]. Riċentement, bl-użu ta 'screening ta' drogi b'rendiment għoli żewġ gruppi ta 'riċerka indipendenti identifikaw glikosidi kardijaċi, partikolarment ouabain, digoxin, u bufalin, bħala senolitiċi ta' spettru wiesa '[25,26].reviżjonijiet cistanche tubulosaTa 'min isemmi li kważi s-senolitiċi ddikjarati kollha għandhom limitazzjonijiet, bħal effetti sekondarji mhux mixtieqa jew ineffettività lejn xi tipi ta' ċelluli. Iċ-ċelloli staminali mesenkimali (MSCs), misjuba prattikament fl-organi/tessuti kollha ta’ wara t-twelid, huma kkaratterizzati mill-kapaċità li jġeddu lilhom infushom (diviżjonijiet simmetriċi) u li jiddifferenzjaw, u b’hekk jikkontribwixxu għaż-żamma u r-riġenerazzjoni tat-tessut residenti [27]. Minħabba dawn il-proprjetajiet uniċi, flimkien mal-funzjonijiet anti-infjammatorji u immunosoppressivi qawwija, l-MSCs huma applikati b'mod wiesa 'fit-terapija ta' sostituzzjoni taċ-ċelluli għat-trattament ta 'diversi mard, inkluż id-dijabete Mellitus, sklerożi multipla, infart mijokardijaku, eċċ [28]. Madankollu, simili għall-proġenji differenzjati tagħhom u ċelluli unipotenti oħra, l-MSCs huma kapaċi li jonqsu jew replikattivi jew qabel iż-żmien b'reazzjoni għall-attivazzjoni tal-onkoġeni u stimuli stressanti [29, 30]. Is-senescenza tal-MSCs għandha ħafna konsegwenzi mhux mixtieqa, fosthom l-eżawriment. tal-ġabra ta 'ċelloli staminali, manutenzjoni u riġenerazzjoni mnaqqsa tat-tessuti, kapaċità ta' differenzjazzjoni indebolita, tixrid ta 'senescence medjat minn SASP, proprjetajiet anġjoġeniċi mnaqqsa, modifika tan-niċċa taċ-ċelloli staminali [29,31-33]. Meta wieħed iqis is-sinifikat bijoloġiku tal-funzjonament xieraq tal-MSCs, l-MSCs senescent jistgħu jitqiesu bħala l-mira kruċjali għall-analiżi. F'konformità ma 'dan is-suġġeriment, għadd ta' reviżjonijiet li jenfasizzaw riżultati vantaġġużi possibbli tat-tneħħija ta 'MSCs senescent ġew ippubblikati matul is-sena li għaddiet [29, 31,34,35]. Madankollu, hemm biss ftit dejta sperimentali dwar din il-kwistjoni [36-40].

Fi ħdan l-istudju preżenti, aħna nuru għall-ewwel darba li glikosidi kardijaċi, jiġifieri ouabain u bufalin, jonqsu milli juru attività emolitika lejn MSCs umani (hMSCs) derivati ​​mill-endometriju (END-MSCs), tessut xaħmi (AD-MSCs), il- polpa dentali (DP-MSCs) u Warton jelly (WJ-MSCs). Barra minn hekk, nikkonfermaw li ż-żewġ glikożidi kardijaċi huma kapaċi li jinduċu apoptożi preferenzjali f'senes-cent A549 u SK-HEP -1, kif kien deskritt qabel fl-istudji pilota [25,26]. Billi nevalwaw l-alterazzjonijiet fl-omeostażi jonika kkawżati mill-imblukkar ta’ Nat/K plus -ATPase u l-livelli ta’ espressjoni tal-ġeni relatati aħna niżvelaw li n-nuqqas ta’ analiżi indotta minn ouabain jista’ jkun medjat mill-effettività msaħħa tal-K kumpensatorju flimkien mal-importazzjoni f’senescent END- MSCs meta mqabbla ma' A549 senescent. Barra minn hekk, bl-użu ta 'bijoinformatika avvanzata nuru li s-senescence ta' END-MSCs, reżistenti għall-analiżi indotta minn ouabain, hija akkumpanjata mill-akkwist ta 'fenotip reżistenti għall-apoptożi, filwaqt li s-senescence ta' A549 sensittiv għal ouabain mhix. Importanti, l-imblukkar tal-attività tal-proteina antiapoptotika MCL-1 qabel it-trattament tal-glikosidi kardijaċi rriżulta fl-analiżi ta' END-MSCs senescent reżistenti għall-apoptożi. Għalhekk, aħna nipprovdu evidenza ċara li r-reżistenza għall-apoptosi mhijiex karatteristika ġenerali taċ-ċelloli senescent. Ibbażat fuq id-dejta miksuba aħna nikkonkludu li l-effettività ta 'approċċi analitiċi tista' tiddependi fuq jekk iċ-ċelloli tabilħaqq sarux reżistenti għall-apoptożi matul l-iżvilupp tas-senescence.

materjali u metodi

Ċelloli

END-MSCs, WJ-MSCs, DP-MSCs, AD-MSCs, A549, u SK-Help inkisbu mill-Kollezzjoni Russa ta 'Kulturi taċ-Ċelloli (Istitut taċ-Ċitoloġija, San Pietruburgu, ir-Russja). Il-linji A549 u SK-Help ġew awtentikati b'testijiet tal-karjoloġija, tumoriġeniċità, isoenzyme (LDH u G6PD), u analiżi STR. Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​f'medja kompluta DMEM F12 (Gibco BRL) supplimentat b'10 fil-mija FBS (HyClone), 1 fil-mija penicillin-streptomycin (Gibco BRL) u 1 fil-mija glutamic (Gibco BRL).Iċ-ċelluli kollha ġew ittestjati b'mod rutina għal kontaminazzjoni mikoplażma.

Kundizzjonijiet li jinduċu s-senescence u l-istress

Għal senescence indotta mill-istress ossidattiv, END-MSCs / WJ-MSCs ġew ittrattati b'200 uM / 100 uM HO (Sigma) għal siegħa. Għal senescence indotta minn doxorubicin, DP-MSCs/A549 ġew ittrattati b'1 μM ta 'doxorubicin （Veropharm） għal 3 ijiem. F'kull każ, iċ-ċelloli tqiesu senescent mhux qabel 14-il jum wara t-trattament. Għal senescenza replika AD-MSCs qabel ir-4 passaġġ ġew identifikati bħala ċelloli ta 'kontroll u aktar tard mill-10 bħala dawk senescent. Għal senescence indotta minn etoposide A549/END-MSCs/SK-Help ġew ittrattati b'2 uM/5 uM/3 uM etoposide (Veropharm) għal 3 ijiem u analizzati mhux qabel 7 ijiem wara l-induzzjoni tas-senescence. F'dan il-każ, id-disinn tat-trattament ikkoinċida kompletament ma 'dawk deskritti fl-istudju li minnu oriġinat id-dejta RNA-seq (Wang et al.,2017). Żewġ glikosidi kardijaċi applikajna bħala komposti senolitiċi——Ouabain (Sigma) u Bufalin (Calbiochem).

Sabiex titqabbel ir-reżistenza għall-istress bejn il-kontroll u END-MSCs senescent jew A549, iċ-ċelloli ġew ittrattati jew b'4 00/800 uM H O2 (Sigma) għal siegħa jew b'0.3/1 uM staurosporine (Sigma). Il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet analizzata 48 siegħa wara l-induzzjoni tal-istress.

Biex timblokka l-attività tal-MCL-1 END-MSCs ġew ittrattati minn qabel b'10 uM ta' A-1210477(Sigma) għal 3 ijiem.

Analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss

Kejl tal-vijabbiltà taċ-ċelluli, proliferazzjoni, daqs taċ-ċelluli, awto-fluworexxenza, rati ta 'apoptożi, qsim ta' caspase 3/7, potenzjal tal-membrana mitokondrijali, u depolarizzazzjoni tal-membrana twettqu permezz ta 'ċitometrija tal-fluss. Iċ-ċitometrija tal-fluss saret bl-użu ta' CytoFLEX (Beckman Coulter) u d-dejta miksuba ġiet analizzata bl-użu tas-softwer CytExpert verżjoni 2.0. Iċ-ċelloli aderenti ġew laħlaħ darbtejn b'PBS u maħsuda bit-tripsinizzazzjoni. Ċelloli maqlugħa ġew miġbura u sospiżi mill-ġdid f'medja friska u mbagħad magħduda u analizzati għall-awtofluworexxenza. Sabiex ikun hemm aċċess għall-vijabbiltà taċ-ċelluli, 50ug/ml propidium iodide (Teknoloġiji tal-Ħajja) ġie miżjud ma 'kull kampjun eżatt qabel l-analiżi. Id-daqs taċ-ċellula ġie evalwat permezz ta 'tixrid ċitometriku tad-dawl 'il quddiem ta' ċelluli PI-negattivi. L-induzzjoni tal-apoptożi ġiet ivverifikata bl-użu ta' ko-tebgħa ta' Annexin-V-APC (Invitrogen) u DAPI (Sigma) wara l-istruzzjonijiet tal-manifattur. L-attività ta' Caspase ġiet evalwata bl-użu ta' CellEventTM Caspase-3/7 Green Flow Cytometry Assay Kit (Invitrogen) wara protokoll tal-manifatturi. It-telf tal-potenzjal tal-membrana mitokondrijali ġie vvalutat bl-użu taż-żebgħa ratiometrika JC-1 (Invitrogen). Il-proċedura tat-tbajja twettqet skont il-protokoll tal-manifattur. Għad-depolarizzazzjoni tal-membrana, użajna sonda fluworexxenti DiBAC4(3) (Invitrogen).

Tbajja ta' galactosidase assoċjata mas-senescence

It-tbajja’ tas-senescence-Galactosidase (SA{2}}Gal)twettqet bl-użu ta’ kit tat-tbajja’ tas-senescence-galactosidase (Cell Signaling Technology) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Analiżi kwantitattiva tal-immaġini ġiet prodotta bl-applikazzjoni tal-pakkett MatLab, skont l-algoritmu deskritt qabel[41]. Għal kull punt sperimentali, ġew analizzati mhux inqas minn 50 ċellula magħżula b'mod każwali.

Western blotting

Western blotting sar kif deskritt qabel [41]. L-elettroforeżi SDS-PAGE, it-trasferiment għal membrana tan-nitrocellulose, u l-immunoblotting b'detezzjoni ECL (Thermo Scientific) saru skont protokolli standard tal-manifattur (Laboratorji Bio-Rad). Intużaw antikorpi kontra l-proteini li ġejjin: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (klonu 14C10), phospho-p53 (Ser15), p21 (klonu 12D1), phospho-Rb (Ser807/811) , HMGB1(klonu D3E5), kif ukoll IgG tal-mogħoż antifenek konjugat bil-perossidasi taż-żwiemel. Ir-rati ta' dilwizzjoni kienu 1:1000 għall-antikorpi primarji kollha u 1:7000 għal dawk sekondarji. L-antikorpi kollha nxtraw minn Cell Signaling. L-Immaġni Scion 4.0(Scion Corporation) intużat biex tagħżel u tiddetermina d-densità mnaqqsa mill-isfond tal-meded fil-ġellijiet u l-blots kollha.

Analiżi traskrittomika

Fl-analiżi ntużaw kampjuni mit-tliet settijiet tad-dejta Gene Expression Omnibus (GEO)RNA-seq li ġejjin: GSE102639(GSM2742113-GSM2742114 u GSM2742121-GSM2742122forcontrol u senescentA549cells, kif xieraq); GSE122081(GSM3454482-GSM3454484 u GSM3454500-GSM3454502 għal ċelloli ta' kontroll u IMR-90 senescent, kif xieraq); u s-sett tad-dejta tagħna GSE160702 (GSM4877895-GSM4877898 u GSM4877907-GSM4877910 għall-kontroll u END-MSCs senescent, rispettivament). Id-dejta għas-settijiet tad-dejta kollha ġiet ipproċessata bl-istess mod.

Id-dejta tal-qari mhux ipproċessat għaddiet minn iffiltrar ta 'kwalità u tirqim tal-adapter permezz ta' skripts FilterByTile u BBDuk mill-pakkett BBtools (verżjoni 38.75) bl-użu tal-għażliet default. Il-qari li kien fadal ġew addizzjonalment iffiltrati u mirquma bl-użu ta 'skript trimestrali mill-pakkett FastqPuri (verżjoni 1.0.7).cistanche UKL-operazzjoni tat-tirqim ġiet applikata għaż-żewġt itruf tal-qari jekk kien fihom N jew il-kwalità tagħhom kienet taħt il-limitu ta 'kwalità stabbilit għal 27, il-qari kollha iqsar minn 25 bażi ġew mormija. Il-kontroll tal-kwalità tat-tirqim sar bis-softwer FastQC (verżjoni 0.11.7) u skripts FastqPuri. Il-qari, wara li għaddew mill-operazzjonijiet kollha, jinkludu mhux inqas minn 90 fil-mija tad-dejta inizjali.

L-abbundenzi tat-traskrizzjoni ġew stmati bl-użu tal-immappjar ħafif tas-Salmon (verżjoni 1.1.0) li jaħdem fil-modalità tal-allinjament selettiv. Il-lista ta 'decoys ġiet iġġenerata abbażi tal-ġenoma ta' referenza tal-bniedem Gencode GRCh38.p13 (rilaxx 33) u użata aktar għall-bini tal-indiċi fuq fajls ta 'referenza ta' transcriptome konkatenat u ġenoma Gencode (rilaxx 33) bl-użu ta 'daqs kmer ta' 21. Twettqu operazzjonijiet ta 'mapping b'bnadar addizzjonali——numBootstraps 30——sequins——gcBias——valida l-immappjar. Ir-rati ta' mapping li rriżultaw kienu madwar 70 fil-mija.

Aktar ipproċessar tad-dejta sar bl-użu tal-verżjoni R 3.6.3 bil-ġbir ta' pakketti Tidyverse (verżjoni 1.3.0). L-għadd tal-ġeni stmat, il-metadejta, u l-firxiet tat-traskrizzjoni ġew mgħobbija f'R u miġbura fil-qosor għal livell ta 'ġene bl-użu ta' tximeta (verżjoni 1.4.5). Il-matriċi tal-għadd li rriżultat ġiet iffiltrata biex ikun fiha ringieli li kellhom mill-inqas 5 għadd stmat fil-kampjuni kollha, il-matriċi li tirriżulta kien fiha 20,400 ġene.

Għar-rappreżentazzjoni tal-PCA u tal-mappa tas-sħana, l-għadd tal-qari ġew normalizzati bl-użu ta 'trasformazzjoni ta' log mill-pakkett DESeq2 (verżjoni 1.26.0).cistanche wirkungIl-mapep tas-sħana nbnew bl-użu ta' pakketti ta' filtru tal-ġeni (verżjoni 1.38.0) u mappa tas-sħana (verżjoni 1.0.12)R. Il-validazzjoni ta' kampjuni ta' diviżjoni skond il-varjabbli tas-senescence saret permezz ta' sottosettjar ta' għadd ta' qari normalizzat minn ġeni relatati mat-terminu Ontoloġija tal-Ġene "Senescence Ċellulari"(GO 0090398). L-analiżi tal-espressjoni differenzjali u l-istima tal-bidliet log darbiet ġiet ikkalkulata bl-użu ta 'DESeq2 għall-aħħar varjabbli fil-formula tad-disinn control-ling għall-istatus ta' senescenza taċ-ċelluli, reazzjoni ta 'trattament ta' ouabain, u interazzjoni tal-fatturi indikati. Biex tissaħħaħ l-ittestjar tal-espressjoni differenzjali, ġiet applikata korrezzjoni tal-bidla log fold bl-użu ta 'kombinazzjoni ta' stimatur ta 'jinxtorob adattiv mill-pakkett tal-palm (verżjoni 1.8.0) u li tispeċifika limitu ta' bidla log fold addizzjonali ugwali għal 0.667. L-istimi mnaqqsa li rriżultaw intużaw aktar għall-klassifikazzjoni tal-ġeni u t-tħaddim tal-Analiżi tal-Arrikkiment tas-Sett tal-Ġeni bl-użu tal-profil tal-cluster (verżjoni 3.14.3) u pakketti tal-fjus (verżjoni 1.12.0)R b'valuri p aġġustati għal paraguni multipli skont il-metodu Benjamin-Hochberg. Kampjuni tal-mikroarray Affymetrix għall-kontroll u AD-MSCs senes-cent inkisbu mid-database GEO (GSE66236) u pproċessati bl-applikazzjoni tal-web Phantasus b'normalizzazzjoni tal-għadd log2 u quantile. L-Analiżi tal-Arrikkiment tas-Sett tal-Ġene saret bl-użu ta 'pakkett tal-fjus (verżjoni 1.12.0)R.

Estrazzjoni ta 'RNA, traskrizzjoni inversa, u PCR f'ħin reali

L-estrazzjoni tal-RNA, it-traskrizzjoni inversa u l-PCR f'ħin reali saru kif deskritt fl-istudju preċedenti tagħna [32]. Reaġenti għall-estrazzjoni tal-RNA (reaġent ExtractRNA), traskrizzjoni inversa (kit MMLV RT), u PCR f'ħin reali (kit HS SYBR) inkisbu minn Evrogen. Il-livelli ta' espressjoni tal-ġeni ġew evalwati bl-użu tal-amplifikatur PCR BioRad CFX-96 f'ħin reali (BioRad) bil-programm li ġej għall-ġeni investigati kollha: 40 ċiklu ta' tidwib għal 10 s f'95 grad, ittemprar għal 15 s f'57.5 grad , u sinteżi għal 15 s fi 72 grad . Analiżi tal-kurvi tat-tidwib ġiet applikata biex tikkontrolla l-ispeċifiċità tar-reazzjonijiet. L-analiżi li ġejja tad-dejta miksuba twettqet bl-użu tas-softwer Bio-Rad CFX Manager (BioRad) bil-metodu ta 'kwantifikazzjoni standard 2deltaCt bl-użu tal-espressjoni GAPDH bħala referenza. Is-sekwenzi tal-primer huma elenkati fit-Tabella 1.

Analiżi statistika

Biex tinkiseb sinifikat fid-differenza bejn iż-żewġ gruppi ġie applikat it-test t ta' Student jew it-test t ta' Welch. Għal paraguni multipli bejn il-gruppi, intużat ANOVA b'HSD ta' Tukey. Sakemm ma jkunx indikat mod ieħor, id-dejta kwantitattiva kollha tidher bħala medja±SD u l-asterisks jindikaw differenzi sinifikanti kif ġej: ns, mhux sinifikanti,*p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">

Riżultati

H2O2-END-MSCs ittrattati jidħlu fis-senescence prematura

Fi ħdan l-istudju preżenti, użajna ċelloli staminali mesenkimali umani iżolati minn endometriju desquamated (END-MSCs), li jissodisfaw il-kriterji minimi ssuġġeriti mill-ISCT għad-definizzjoni tal-hMSCs [41]. Preċedentement, żviluppajna mudell sperimentali affidabbli biex nistudjaw diversi aspetti tas-senescence prematura ta 'END-MSCs [30]. Jiġifieri, urejna li END-MSCs soġġetti għal stress ossidattiv subletali gradwalment akkwistaw il-karatteristiċi tipiċi kollha taċ-ċelluli senescent, inklużi fokali persistenti ta’ ħsara fid-DNA u rispons attiv għall-ħsara tad-DNA, arrest taċ-ċiklu taċ-ċelluli irriversibbli medjat mill-p53/p21/Rb klassiku. mogħdija, telf ta 'proliferazzjoni, ipertrofija taċ-ċelluli, dehra ta' SA- -tbajja Gal u żvilupp ta 'fenotip sekretorju assoċjat mas-senescence [30, 32, 42]. Hawnhekk applikajna l-mudell iddisinjat biex nistudjaw l-effett senolitiku ta 'ouabain kif ukoll biex jiżvelaw l-alterazzjonijiet intraċellulari sottostanti fl-omeostasi tal-jone. Inizjalment, bl-istima tal-parametri l-aktar komuni kkonfermajna li t-trattament b'doża waħda (1 h, 200 μM) HO kien biżżejjed biex jinduċi senescence f'END-MSCs. Importanti, END-MSCs enfasizzati kienu kkunsidrati senescent ġimgħatejn wara l-istress ossidattiv; għalhekk, il-markaturi kollha tas-senescence ġew evalwati mhux qabel 14-il jum wara t-trattament H-Oz. Tabilħaqq, it-trattament ta 'H-Oz ta' END-MSCs wassal għal blokk tal-proliferazzjoni, ipertrofija taċ-ċelluli kif indikat mid-daqs miżjud taċ-ċelluli, akkumulazzjoni tal-lipofuscin misjuba mill-elevazzjoni tal-awtofluworexxenza, dehra tas-SA- -Gal, attivazzjoni tal- mogħdija p21/Rb u telf ta 'HMGB1 flimkien jappoġġjaw l-istabbiliment senescence taħt il-kundizzjonijiet sperimentali magħżula (Fig. ac, e, f).

L-aktar effetti ta 'ħsara taċ-ċelloli senescent fil-livelli tat-tessuti u tal-organiżmi huma maħsuba li huma l-konsegwenza tal-vitalità fit-tul tagħhom. F'konformità ma' dan il-punt, END-MSCs ittrattati b'HO? żammew vijabbiltà għolja anke fl-istadji tard tal-iżvilupp tas-senescence (il-vijabbiltà tal-END-MSCs senescent ġiet evalwata 17-il jum (14-il jum+3 ijiem) wara l-istress ossidattiv inizjali) (Fig.1d ). Fil-qosor, it-trattament subletali HO2- ta' END-MSCs huwa l-mudell xieraq tas-senescenza prematura u huwa rilevanti biex jiġu investigati l-effetti ta' komposti senolitiċi fuq END-MSCs.

Glycoside ouabain kardijaku m'għandu l-ebda attività senolitika lejn END-MSCs senescent f'firxa wiesgħa ta 'konċentrazzjoni

Evidenza reċenti tissuġġerixxi li glycosides kardijaċi, inklużi ouabain, digoxin, u bufalin, jirrappreżentaw familja ta 'komposti b'attività emolitika [25,26]. Anke jekk illum il-glikosidi kardijaċi huma kkunsidrati bħala senolitiċi ta 'spettru wiesa', id-dejta dwar l-effetti tagħhom fuq l-hMSCs senescent hija nieqsa. Għalhekk, hawnhekk ittestjajna jekk ouabain għandux il-potenzjal li jikkaġuna l-mewt b'mod selettiv f'END-MSCs senescent. Biex nagħmlu dan, ivvalutajna l-vijabbiltà ta 'kontroll u END-MSCs senes-cent wara trattament b'ouabain fil-firxa wiesgħa ta' konċentrazzjoni (minn 10-' sa 10 ~ M). Interessanti, l-ebda konċentrazzjoni applikata ma wasslet għal tnaqqis notevoli fil-vijabbiltà kemm taċ-ċelluli ta 'kontroll kif ukoll senescent fl-ewwel jum wara l-applikazzjoni ta' ouabain (Fig.2 u Supplementari Fig.S1).

Madankollu, fit-tielet jum wara t-trattament ta 'ouabain, aħna żvelaw tnaqqis sinifikanti dipendenti fuq id-doża fil-vijabbiltà tal-kontroll END-MSCs (Fig. 2a u Supplementari Fig. S1). B'mod mhux mistenni, iċ-ċelloli senescent irriżultaw li kienu aktar reżistenti għall-ouabain f'kull konċentrazzjoni ttestjata. F'konformità ma' dan ir-riżultat, 10-M ouabain wassal għal mewt apoptotika aktar suxxettibbli fiċ-ċelloli tal-kontroll (20.75 fil-mija An plus /PI-u 36.47 fil-mija An plus /PI plus ) meta mqabbla ma' dawk senescent (15.01 fil-mija An +/PI). -u 12.15 fil-mija An plus /PI plus )(Fig.2b). Ir-riżultati miksuba juru biċ-ċar li fil-kuntest ta' END-MSCs senescent, ouabain m'għandu l-ebda attività senolitika.

Biex teskludi l-effetti possibbli assoċjati mal-varjabbiltà tal-istimoli li jinduċu s-senescence fuq l-azzjoni senolitika ta 'ouabain, wettaqna sett addizzjonali ta' esperimenti. Jiġifieri, ittrattati END-MSCs b'etoposide minflok stress ossidattiv biex jinduċu senescence prematura.bijoflavonojdi taċ-ċitruEND-MSCs ittrattati b'etoposide wrew il-karatteristiċi kollha tipiċi għaċ-ċelloli senescent (Fig.3a-e).

Importanti, ouabain ma kellu l-ebda azzjoni emolitika lejn END-MSCs senescent ittrattati b'etoposide (Fig. 3f u Supple-mental Fig. S2). Din id-dejta tipprovdi konferma addizzjonali għar-riżultati ta 'hawn fuq u evidenza li n-nuqqas ta' analiżi indotta minn ouabain mhijiex il-konsegwenza tal-grillu tas-senescence konkret użat biex jinduċi s-senescence.

Fig.1 Validazzjoni ta 'mudell ta' senescenza prematura END-MSCs indotta mill-istress ossidattiv. Senescent END-MSCs a proliferazzjoni laxka, b jgħaddu minn ipertrofija, c jiksbu awtofluworexxenza elevata, iżommu vijabbiltà għolja taċ-ċelluli d u e juru attività SA- -Gal meta mqabbla ma 'dawk ta' kontroll. f Livelli ta’ fosforilazzjoni ta’ p53 u Rb u livelli ta’ espressjoni ta’ proteini p21 u HMGBI f’kontroll u senescent END-Ouabain m’għandu l-ebda azzjoni emolitika lejn ċelloli staminali mesenkimali umani ta’ oriġini varji Biex twessa’ l-osservazzjonijiet tagħna dwar in-nuqqas ta’ analiżi indotta minn ouabain f’END-MSCs , analizzajna l-effetti ta 'ouabain fuq hMSCs iżolati minn sorsi oħra inklużi tessut xaħmi, polpa dentali, u ġelatina ta' Wharton. Biex insaħħu wkoll id-dejta tagħna, applikajna mudelli differenti ta 'senescence——senescence replikattiva għal AD-MSCs, senescence indotta minn doxorubicin għal DP-MSCs, u senescence indotta mill-istress ossidattiv għal WJ-MSCs (Fig.4a-f).

Kif muri f'Fig.4g, diversi tipi ta 'hMSCs kienu differenti fil-vijabbiltà fuq it-trattament ta' ouabain, per eżempju, kemm il-kontroll kif ukoll is-senescent DP-MSCs kienu ħafna aktar reżistenti għall-azzjoni ta 'ouabain minn WJ-MSCs (Fig.4g u Supplementari Fig. S3b, c). Madankollu, ouabain ma kienx kapaċi li jinduċi senolysis fi kwalunkwe tip ta 'hMSCs senescent (Fig. 4g u Supplementari Fig. S3). Flimkien, id-dejta miksuba turi li n-nuqqas ta 'analiżi indotta minn ouabain hija karatteristika komuni għal diversi tipi ta' hMSCs. MSCs. Il-valuri ppreżentati huma medji±SD. Għal paraguni ta' gruppi multipli f'a u d, ġiet applikata ANOVA one-way, n=3, ns mhux sinifikanti,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">

GAPDH intuża bħala kontroll tat-tagħbija

Cardiac glycoside bufalin jonqos milli joqtol END-MSCS senescent

Biex tivverifika n-nuqqas ta 'azzjoni senolitika ta' glikosidi kardijaċi lejn hMSCs, applikajna bufalin, kompost ieħor bl-attività senolitika ddikjarata li tappartjeni għall-familja ta 'glikosidi kardijaċi [25]. Bufalin ma kellu kważi l-ebda effett fuq il-vijabbiltà tal-kontroll u H2O2-trattati senes-cent END-MSCs f'firxa wiesgħa ta' konċentrazzjoni (minn 10-7 sa 10-5 M) (Fig. 5a u Supplimentari Fig. S4a).

Simili għal dak li osservajna għat-trattament ta 'ouabain, in-nuqqas ta' analiżi fuq bufalin kien indipendenti mill-istimoli li jinduċu senescence, peress li l-vijabbiltà ta 'ESCs li senesced jew bi tweġiba għal stress ossidattiv jew għal etoposide ma kinitx affettwata (Fig. 5a, b, Fig Supplimentari S4a, b). Ir-riżultati deskritti hawn fuq jikkonfermaw li glycosides kardijaċi rriżultaw li ma kinux effettivi għall-induzzjoni mmirata tal-mewt f'END-MSCs senescent. MSCs. Il-valuri ppreżentati huma medji±SD. Għal paraguni ta' gruppi multipli f'a u d, ġiet applikata ANOVA one-way, n=3, ns mhux sinifikanti,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">

Cardiac glycoside bufalin jonqos milli joqtol END-MSCS senescent

Biex tivverifika n-nuqqas ta 'azzjoni senolitika ta' glikosidi kardijaċi lejn hMSCs, applikajna bufalin, kompost ieħor bl-attività senolitika ddikjarata li tappartjeni għall-familja ta 'glikosidi kardijaċi [25]. Bufalin ma kellu kważi l-ebda effett fuq il-vijabbiltà tal-kontroll u H2O2-trattati senes-cent END-MSCs f'firxa wiesgħa ta' konċentrazzjoni (minn 10-7 sa 10-5 M) (Fig. 5a u Supplimentari Fig. S4a).

Simili għal dak li osservajna għat-trattament ta 'ouabain, in-nuqqas ta' analiżi fuq bufalin kien indipendenti mill-istimoli li jinduċu senescence, peress li l-vijabbiltà ta 'ESCs li senesced jew bi tweġiba għal stress ossidattiv jew għal etoposide ma kinitx affettwata (Fig. 5a, b, Fig Supplimentari S4a, b). Ir-riżultati deskritti hawn fuq jikkonfermaw li glycosides kardijaċi rriżultaw li ma kinux effettivi għall-induzzjoni mmirata tal-mewt f'END-MSCs senescent.

Fig.2 Ouabain m'għandu l-ebda attività emolitika lejn END-MSCs senes-cent ittrattati b'HO 2- f'firxa wiesgħa ta 'konċentrazzjoni. Vijabilità relattiva taċ-ċelluli (perċentwali) tal-kontroll u END-MSCs senescent fi 3 ijiem wara t-trattament b'1077,10~6,10-5 M ouabain. b Induzzjoni ta' apoptożi f'END-MSCs fuq 10-6 M ouabain evalwat permezz ta' tbajja' doppja ta' Annexin V/DAPI. n=3 esperimenti indipendenti. Id-dejta kollha tikkorrispondi mal-medja±SD. Is-sinifikat statistiku ġie vvalutat bit-test t ta' Welch: ns mhux sinifikanti,***p<>

Kemm il-glikosidi kardijaċi ouabain kif ukoll il-bubalin huma kapaċi li jinduċu mewt taċ-ċelluli b'mod selettiv fiċ-ċelloli senescent A549 u SK-Hep1

Meta wieħed iqis il-fatt li r-riżultati tagħna ma jikkorrispondux mal-evidenza ppubblikata reċentement dwar l-azzjoni senolitika ta 'spettru wiesa' ta 'glikosidi kardijaċi, iddeċidejna li nirriproduċu dan l-effett billi tuża l-mudell ċellulari deskritt fl-istudji rilevanti [25,26]. Għalhekk, għamilna serje ta 'esperimenti bl-użu ta' ċelluli ta 'karċinoma tal-pulmun A549 ta' kontroll u senescent. Senescence fiċ-ċelloli A549 ġiet indotta minn trattament b'etoposide. Senescence indotta minn etoposide taċ-ċelluli A549 hija mudell użat ta 'spiss u għalhekk ikkaratterizzat tajjeb ta' senescence indotta mit-terapija [4]. Ukoll, ouabain intwera li joqtol b'mod selettiv iċ-ċelluli A549 senescent ittrattati b'etoposide[25].Biex nippruvaw is-senescenza f'A549, ivvalujna r-rata ta' proliferazzjoni, id-daqs taċ-ċellula, l-akkumulazzjoni ta 'lipo-fine, SA- -tbajja' Gal, l-istatus ta' attivazzjoni tal-mogħdija p53/p21/Rb, u l-livell ta' espressjoni ta' HMGB1 (Fig. 6a-e).

Biex nivverifikaw l-attività emolitika ta 'ouabain lejn ċelluli tal-kanċer senescent, l-ewwel stmajna l-vijabbiltà taċ-ċelluli dipendenti mid-doża. F'konformità mar-riżultati tagħna deskritti hawn fuq, ma stajniex insibu xi tnaqqis sinifikanti fin-numru ta 'ċelluli A549 ta' kontroll vijabbli jew senescent fi żmien 24 siegħa wara l-applikazzjoni ta 'ouabain (Fig. Supplimentari S5a). Madankollu, fi ġranet 3 wara t-trattament ouabain naqqas b'mod sinifikanti l-vijabbiltà taċ-ċelluli senescent A549 b'mod dipendenti fuq id-doża, filwaqt li n-numru ta 'ċelluli A549 ta' kontroll naqas sa punt ferm inqas (Fig.7a u Supplementari Fig. S5a). Jiġifieri, madwar 90 fil-mija taċ-ċelloli tal-kontroll ippreservaw il-vijabbiltà f'10- M ouabain meta mqabbla ma' 50 fil-mija taċ-ċelloli A549 senescent ittrattati bl-istess doża (Fig.7a). Barra minn hekk, iċ-ċelluli senescent A549 kienu aktar suxxettibbli għall-mewt taċ-ċelluli kkaġunata minn bufalin mill-kontropartijiet ta 'kontroll tagħhom (Fig.7b) (Fig.5b u Supplemental Fig.S5b).

Skont id-dejta ppubblikata, l-ouabain qajjem apoptosi dipendenti fuq il-caspase-3-fiċ-ċelloli senescent A549 [26]. Tabilħaqq, aħna żvelaw żieda sinifikanti fil-frazzjoni doppja pożittiva u/jew PI fiċ-ċelloli tal-kanċer senescent ittrattati b'10-6 M ouabain (Fig.7c). Barra minn hekk, bl-użu ta 'assaġġ fluworexxenti osservajna attivazzjoni ta' caspase -3 f'ċelluli A549 senescent ittrattati b'ouabain (Fig.7d). Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati huma kompletament konsistenti mad-dejta deskritta minn awturi oħra u jikkonfermaw l-attività emolitika ta 'ouabain lejn A549.

Ukoll, użajna doxorubicin minflok etoposide biex tikkawża senescence f'A549 (Fig.8a-e). Kif mistenni, A549 senescent ittrattat b'doxorubicin, kif ukoll ittrattat b'etoposide wrew sensittività ogħla kemm għal ouabain kif ukoll għal bufalin meta mqabbla mal-kontropartijiet ta' kontroll tagħhom (Fig. 8g u Supplementari Fig. S6). Dan tal-aħħar jikkonferma li l-effetti senolitiċi tal-glikosidi kardijaċi huma indipendenti mill-istimoli li jinduċu s-senescence. Għalhekk, glycosides kardijaċi tabilħaqq għandhom senolytic

Fig.3 Ouabain ma jistax jinduċi senolysis f'END-MSCs senescent ittrattati b'etoposide. Validazzjoni tal-mudell ta 'senescence indotta minn episodju għal END-MSCs: kapaċità ta' proliferazzjoni, daqs taċ-ċelluli b, livelli ta 'awtofluworexxenza c u attività d SA- -Gal, e livell ta' fosforilazzjoni ta 'Rb u livelli ta' espressjoni ta 'proteini p21 u HMGBI. f Vijabilità relattiva taċ-ċelluli (perċentwali) taċ-ċelluli ta' kontroll u senescent wara trattament b'10-6 ouabain. Il-valuri huma medji±SD. Għal gruppi multipli ġew applikati paraguni f'ANOVA one-way, n=3, ns mhux sinifikanti,***p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">

Fl-aħħarnett, iddeċidejna li nirriproduċu esperimenti ta 'analiżi fuq ċelluli tal-kanċer tal-fwied ittrattati b'etoposide SK-Help, mudell ieħor taċ-ċelluli b'effetti senolitiċi ppruvati ta' glikosidi kardijaċi skond Guerrero et al. studju [25] (Fig.9a-e). SK-Help senescent ittrattat b'Etoposide wera sensittività ogħla għaż-żewġ aġenti meta mqabbla mal-kontropartijiet ta 'kontroll tagħhom, u ppruvaw l-azzjoni emolitika ta' glikosidi kardijaċi lejn dan it-tip ta 'ċellula (Fig.9f u Supplementari Fig. S7).

Flimkien din id-dejta evidenza li s-selettività tal-emolisi indotta minn glikosidi kardijaċi tiddependi aktar fuq in-natura taċ-ċelluli milli fuq il-grillu tas-senescence konkret.

Dan l-artikolu huwa estratt minn Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x