Potenzjal Antifungali Ta' Metaboliti Sekondarji Involuti fl-Interazzjoni Bejn Patoġeni taċ-Ċitru u Cistanche

Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Il-frott taċ-ċitru għandu impatt importanti fuq l-ekonomija tad-dinja peress li għandu l-akbar produzzjoni meta mqabbel ma’ frott ieħor; pereżempju, il-produzzjoni globali tal-larinġ għall-2018/19 hija mbassra li tilħaq 54.3 miljun tunnellata. Il-fattur ewlieni li jaffettwa l-kwalità taċ-ċitru huwa wara l-ħsadmard fungali,b'mod partikolari, il-moffa ħadra kkawżata minn Penicillium digitatum li hija responsabbli għal 90 fil-mija tat-telf taċ-ċitru matul il-perjodu ta 'wara l-ħsad1,3. Biex jiġi kkontrollat ​​il-mard ta 'wara l-ħsad, il-fungiċidi sintetiċi jintużaw ħafna, li jikkawżaw kwistjonijiet ta' saħħa u ambjentali. Barra minn hekk, xi razez tal-fungi żviluppaw reżistenza għal funġiċidi użati b'mod komuni. Kifantifungalireżistenza qed issir tħassib sinifikanti, it-tfittxija għal komposti bijoattivi ġodda għandha rwol importanti biex tevita l-użu estensiv ta 'fungiċidi7. Il-mikro-organiżmi huma wieħed mis-sorsi ewlenin għal prodotti naturali b'attivitajiet bijoloġiċi utli, jiġifieri, potenzjalantifungali, antibijotiċi, aġenti kontra l-kanċer, surfactants. Madankollu, minbarra l-potenzjal ġenetiku u d-diversità tal-mikrobi, ħafna ġeni bijosintetiċi mikrobiċi mhumiex attivati ​​fil-kundizzjonijiet ta’ kultivazzjoni mhux naturali użati fil-laboratorju u ftit partijiet biss tal-metaboliti huma aċċessibbli10. Diversi strateġiji huma implimentati biex jingħelbu l-limitazzjonijiet fl-iskoperta ta 'prodotti naturali minn sorsi mikrobjali, jiġifieri, approċċ OSMAC10,11, l-użu ta' modifiki epiġenetiċi, u ko-kultivazzjoni14. Kokulturi li jimitaw ambjenti naturali, li juru kompetizzjoni mikrobjali għal spazju limitat u nutrijenti, ġew żvelati li huma forza ekoloġika ewlenija li tista 'tattiva raggruppamenti ta' ġeni siekta u mekkaniżmi ta 'difiża li jistgħu jwasslu għall-produzzjoni ta' metaboliti sekondarji bijoattivi. L-esperimenti ta' kokultura huma ferm 1 Istitut tal-Kimika, Università ta' Campinas, CP 6154, 13083-970, Campinas, SP, Brażil. 2 Ċentru għax-Xjenzi Naturali u Umani, Università Federali ta' ABC, 09210-580, Santo André, SP, Brażil. 3Dipartiment tal-Kimika Bijomolekulari, Istitut Leibniz għar-Riċerka tal-Prodotti Naturali u l-Bijoloġija tal-Infezzjonijiet - Istitut Hans Knöll, Jena, il-Ġermanja. 4President tal-Kimika tal-Prodotti Naturali, Friedrich Schiller University Jena, 07743, Jena, il-Ġermanja. rilevanti biex tippermetti mhux biss l-identifikazzjoni ta’ komposti ġodda iżda wkoll biex jiġu investigati avvenimenti kimiċi li jirregolaw l-interazzjonijiet bejn mikro-organiżmi fin-natura. Sal-lum, m'hemm l-ebda informazzjoni dwar kif il-fungi patoġeniċi taċ-ċitru jinteraġixxu ma 'mikro-organiżmi oħra fl-istess ambjent u x'inhuma l-mekkaniżmi ta' attakk u difiża kontra mikro-organiżmi endofitiċi jew fitopatoġeni oħra. Din l-informazzjoni tista 'twassal għall-iskoperta ta' metaboliti sekondarji ġodda involuti f'interazzjonijiet mikrobiċi u tipprovdi għarfien aħjar dwar l-importanza tal-ekoloġija mikrobjali matul il-proċess ta 'infezzjoni. Hawnhekk nuru interazzjoni bejn Penicillium digitatum u Penicillium citrinum, bil-għan li tfittex għal ġoddaantifungalikomposti li jistgħu jintużaw biex jikkontrollaw il-mard ta’ wara l-ħsad. Meta wieħed iqis dan l-iskop, l-istrateġija tal-kokultura u l-MSI ġew applikati biex jinduċu l-produzzjoni ta 'metaboliti sekondarji u jipprovdu għarfien inizjali dwar ir-rwol bijoloġiku tagħhom ibbażat fuq id-distribuzzjoni spazjali tagħhom fl-interazzjoni. Il-metaboliti ta 'interess ġew iżolati u l-istrutturi kollha ġew spjegati abbażi ta' spettrometrija tal-massa u esperimenti NMR. Madankollu,antifungaliTwettqu analiżijiet u analiżi tal-mikroskopija konfokali sabiex jiġi investigat il-potenzjal tal-metaboliti fungali bħala ġoddaantifungaliaġenti.

CISTANĊI TAL-ĦAXUEX

Materjali u metodi

Kultura fungi.Ir-razza ta' P. digitatum (PD) użata fl-istudji hija depożitata mal-Kollezzjoni Spanjola tal-Kultura tat-Tip (CECT) taħt il-kodiċi ta' adeżjoni CECT20796. Ir-razza P. citrinum (PC) ġiet ipprovduta minn Sylvio Moreira Citrus Center (Cordeirópolis, SP, Brażil). P. digitatum u P. citrinum ġew ikkultivati ​​fuq agar dextrose tal-patata kummerċjali (PDA) (Acumedia). PDA ġie awtoklavat f'103 KPa (121 grad) għal 15-il minuta. Pjanċi PDA kienu maħżuna f'25 grad għal 7 ijiem fid-dlam. L-ispori nħasdu bil-ħasil tal-wiċċ tal-agar b'ilma distillat sterili u ddilwit għal konċentrazzjoni finali ta '106 jew 105 spori mL-1.

Ko-kultura kondizzjonijiet tat-tkabbir fungali soluzzjoni ta 'spori (106 spori mL-1) ġiet imlaqqma, fuq naħat opposti. Il-pjanċi ġew inkubati fid-dlam f'25 grad għal 7 ijiem.

Għal analiżi MSI u mikroskopija konfokali, il-kokultura in vitro ġiet ippreparata billi tqiegħed slide tal-mikroskopju sterili fid-dixx Petri, segwit mit-tferrigħ ta '11ml ta' PDA22, u l-inoculums saru 'l fuq mill-pjastra tal-mikroskopju. Il-pjanċi ġew inkubati fid-dlam f'25 grad għal 72 siegħa. Għal ko-kultura in vivo, larinġ maturi (Citrus sinensis) ġie sterilizzat fil-wiċċ u ferut23. Biċċa żgħira ta 'PDA li fiha P. citrinum ġiet imlaqqma fis-sit tal-ferita. Larinġ infettat u ta 'kontroll inħażen f'garafina sterili ta' 500mL, fid-dlam f'25 grad. Wara 10 ijiem, il-frott ġew feruti fuq ir-reġjun ekwatorjali oppost ta 'P. citrinum inoculum u infettati b'soluzzjoni ta' P. digitatum 106 spore mL-1. Il-frott inħażen għal aktar minn 5 ijiem fid-dlam f'25 grad.

Analiżi tal-Mass Spectrometry Imaging (MSI) u l-ġenerazzjoni tal-immaġni tal-MS.

Wara l-perjodu ta 'inkubazzjoni, il-pjastri tal-mikroskopju tneħħew mid-dixxijiet Petri u tpoġġew f'dessikatur vakwu, għal siegħa, għal deidrazzjoni sħiħa tal-agar (Angolini et al., 2015). L-analiżi tal-MSI saru direttament fuq il-mikroskopju li kien fih il-kokultura, f'mod pożittiv, bl-użu ta' sors ta' desorbiment elettrospray ionization (DESI) Prosolia Model Omni Spray 2D®-3201) akkoppjat ma' Thermo Scientific QExactive® Hybrid Quadrupole-Orbitrap Spettrometru tal-Massa. Id-dejta tal-MSI ġiet akkwistata b'qawwa ta' riżoluzzjoni tal-massa ta' 70.000 f'm/z 200. Il-konfigurazzjoni tad-DESI użata kienet l-istess sett mix-xogħol preċedenti22. Immaġini ġew iġġenerati b'wisa 'bin ta' Δm/z=± 0.07 bl-użu ta 'softwer ta' konverżjoni tad-dejta Firefly (verżjoni 2.1.05) u pproċessati bl-użu ta 'softwer BioMap (verżjoni 3.8.0.4) żviluppat minn Novartis Institutes for BioMedical Research. Fil-BioMap, l-iskala tal-kulur ġiet aġġustata għal valur fiss matul l-ipproċessar ta 'kull immaġini. L-ispettri tal-MS ġew ipproċessati b'softwer Xcalibur (verżjoni 3.0.63) żviluppat minn Thermo Fisher Scientific.

Estrazzjoni ta' metaboliti mill-esperimenti ta' ko-kultura.

Il-kontenut kollu tal-ko-kultura in vitro inqatgħu f'biċċiet żgħar u ttrasferiti għal flixkun Erlenmeyer. L-estrazzjoni saret bl-użu tal-metanol. Il-garafini ġew ivvibrati għal siegħa f'banju ultrasoniku u ffiltrati bil-vakwu. Is-solvent tneħħa taħt pressjoni mnaqqsa u l-estratt finali nħażen f'-20 grad.

Għal ko-kultura in vivo, il-qxur tal-larinġ inqatgħu (2 cm × 2 cm) fiż-żona ta 'interface bejn il-mikro-organiżmi, u l-estrazzjoni saret b'5mL ta' metanol għal 1h fil-banju ultrasoniku. L-estratti ġew iffiltrati, imnixxfa taħt N2, u maħżuna f'-20 grad.

Analiżi tal-Ispettrometrija tal-Massa (MS).

Estratti ġew dilwiti fil-metanol u analizzati fuq Thermo Scientific QExactive® Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer. L-analiżi saru fil-mod pożittiv b'medda m/z ta' 115–1500, il-vultaġġ kapillari ta' 3.4 kV, temperatura kapillari tad-daħla ta' 280 grad, S-lenti 100V. Ġew injettati 5 µL tal-kampjun. Fażi stazzjonarja: Kolonna Termo Xjentifika Accucore C18 2.6 µm (2.1mm×100mm). Fażi mobbli: 0.1 fil-mija aċidu formiku (A) u aċetonitrile (B). Profil tal-eluent (A/B): 95/5 sa 2/98 fi żmien 15min, żomm għal 5min, sa 95/5 fi żmien 1.2min u żomm għal 7.8min. Il-ħin totali tal-ġirja kien 29min għal kull ġirja u r-rata tal-fluss, kienet 0.2mLmin-1. Volum ta 'injezzjoni: 5 µL.MS/MS twettqu mid-dissoċjazzjoni indotta mill-ħabta (CID) b'medda m/z ta' 100-800 u l-enerġija tal-ħabta varjat minn 10 sa 50V. Il-kampjuni ġew infużi direttament b'elettrospray b'rata ta 'fluss ta' 5.0 µL min-1. Id-dejta tal-MS u tal-MS/MS ġiet ipproċessata bis-softwer Xcalibur (verżjoni 3.0.63) żviluppat minn Thermo Fisher Scientific.

SUPPLIMENT TA' BENEFIĊĊJU TA' CISTANCHE: TITJIB L-IMMUNITÀ

Separazzjoni tal-metaboliti (analiżi HPLC).

Is-separazzjonijiet tal-metaboliti sekondarji nkisbu permezz ta' kolonna Phenomenex Luna 5µm Phenyl-Hexyl (25{{10}}×4.6mm) u HPLC LC-20AT ta' prominenza SHIMADZU, mgħammra b'CBM{{6} }Modulu xarabank tal-komunikazzjoni, SPD-M20A photodiode array detector, u SIL-20Autosampler. Fażi mobbli: ilma (0.1 fil-mija aċidu formiku) (A) u aċetonitrile (B). Profil tal-eluent (A/B): 65/35 sa 50/50 fi żmien 50 min, sa 40/60 fi żmien 20 min. Il-ħin totali tal-ġirja kien 70 min u r-rata tal-fluss ta '1.0 ml min-1. Il-volum tal-injezzjoni kien 5µL. Purifikazzjoni HPLC preparattiva twettqet fuq kolonna Phenomenex Luna 5µm Phenyl-Hexyl (250 × 10mm) bl-użu ta 'Waters 1525 Binary HPLC Pump mgħammra b'Waters 2998 Photodiode Array Detector u Waters Fraction Collector III bl-użu tal-istess kundizzjonijiet tal-gradjent ottimizzati. Ir-rata tal-fluss kienet issettjata għal 4.7mLmin-1 u l-volum tal-injezzjoni kien 200 µL.

Spettroskopija NMR.

Twettqu esperimenti 1H NMR, 13C NMR, u 2D fuq Bruker Avance III 500 (1H 500.13MHz u 13C 125.7MHz) u Bruker Avance III 600 (1H 600.17MHz). Kloroform dewterat (CDCl3; 7.23 ppm), dimethyl sulfoxide (DMSO; 2.50 ppm u 39.51 ppm), u tetramethylsilane (TMS; 0.0 ppm) intużaw bħala solvent u referenza interna. Ċaqliq kimiċi (δ) ġew espressi f'(ppm) u l-kostanti tal-akkoppjar (J) f'Hertz (Hz).

Analiżi ta' Netwerking Molekulari.

Inħoloq netwerk molekulari għall-metaboliti ta 'P. citrinum bl-użu tal-fluss tax-xogħol onlajn f'Netwerking Molekulari Soċjali ta' Prodotti Naturali Globali (GNPS) (http://gnps.ucsd.edu). Id-dejta ġiet iffiltrata billi tneħħew il-qċaċet MS/MS kollha fi ħdan plus /-17 Da tal-prekursur m/z. L-ispettri MS/MS ġew iffiltrati bit-tieqa billi għażlu biss l-ogħla 6 quċċati fit-tieqa plus /-50Da matul l-ispettru kollu. Id-dejta mbagħad ġiet miġbura ma 'MS-Cluster b'tolleranza tal-massa ġenitur ta' 0.2 Da u tolleranza ta 'jone framment MS/MS ta' 0.2Da biex jinħolqu spettri ta' kunsens. Barra minn hekk, spettri ta 'kunsens li kien fihom inqas minn 2 spettri ġew mormija. Imbagħad inħoloq netwerk fejn it-truf ġew iffiltrati biex ikollhom punteġġ tal-cosine 'l fuq minn 0.65 u aktar minn 2 qċaċet imqabbla. Truf ulterjuri bejn żewġ nodi nżammu fin-netwerk biss jekk kull wieħed min-nodi deher fl-aqwa 10 nodi l-aktar simili rispettivi ta 'xulxin. L-ispettri fin-netwerk imbagħad ġew imfittxija kontra l-libreriji spettrali tal-GNPS. L-ispettri tal-librerija ġew iffiltrati bl-istess mod bħad-dejta tal-input. Il-logħbiet kollha miżmuma bejn l-ispettri tan-netwerk u l-ispettri tal-librerija kienu meħtieġa li jkollhom punteġġ ogħla minn 0.5 u mill-inqas 5 peaks imqabbla.

Assays antifungali.

Soluzzjoni stokk tal-estratt tal-ko-kultura ġiet ippreparata fil-metanol u dilwita aktar f'PDA għall-konċentrazzjoni ta '0.5mgmL-1. 15mL tas-soluzzjoni riżultanti tferra 'f'dixx Petri segwit bit-tilqim ta' 15ul ta 'soluzzjoni ta' 105 spori mL-1 P. digitatum fuq iċ-ċentru tal-pjanċa tal-agar. Sar ukoll analiżi ta' kontroll. Il-pjanċi ġew inkubati fid-dlam f'25 grad għal 96 siegħa. Għalantifungalianaliżi, 2.5mL ta 'PDA ġew supplimentati b'6, 9, u 10 (400µgmL-1 ), u kull soluzzjoni ġiet imferra' ġo 6-mikroplate sew. 5ul ta 'soluzzjoni ta' 105 spori mL-1 P. digitatum ġiet imlaqqma fuq iċ-ċentru ta 'kull pjanċa tal-agar. Kontrolli negattivi saru fi tliet kopji. Il-mikroplate ġiet inkubata fid-dlam f'25 grad għal 96 siegħa. Għad-determinazzjoni tal-konċentrazzjoni minima inibitorja (MIC) tal-komposti 1 u 4, sar analiżi ta' dilwizzjoni tal-brodu mikro kif rakkomandat mill-Istitut tal-Istandards Kliniċi u tal-Laboratorju (2008)24 bi ftit modifiki. Soluzzjonijiet tal-ħażniet ta '1 u 4, ġew ippreparati fl-ilma (5 fil-mija metanol) u dilwiti aktar fil-midja IVA f'firxa ta' konċentrazzjonijiet għal 600 µg mL-1 sa 1 µg mL-1. 195 ul ta 'kull soluzzjoni ġew trasferiti għal 96-mikroplate sew segwita bl-inokulazzjoni ta' 5 ul ta 'soluzzjoni ta' 105 spori mL-1 P. digitatum. L-analiżi saru f'żewġ kopji u l-kontrolli fi tliet kopji. Itraconazole (100 µgmL-1) intuża bħala kontroll pożittiv. Twettqu kontrolli negattivi bil-metanol f'IVA. Il-mikroplates ġew inkubati fid-dlam f'25 grad għal 96 siegħa.

Mikroskopija tal-iskannjar bil-lejżer konfokali.

Wara l-perjodu ta 'inkubazzjoni, il-pjastri tal-mikroskopji tneħħew mid-dixx Petri. Il-kampjuni ta' ko-kultura in vitro ġew imtebba' b'Aħmar tal-Kongo (0.25 fil-mija w/v fl-ilma) għal 20 minuta u maħsula fil-qosor f'ilma distillat. Il-kampjuni ġew analizzati b'mikroskopju Leica TCS SP5. L-eċċitazzjoni kienet mil-linja ta 'emissjoni ta' 543nm tal-laser He-Ne, u nġabar dawl emess bejn 570 u 680nm.

BENEFIĊĊJUCISTANCHE: TITJIB L-IMMUNITÀ

Riżultati u diskussjoni

MSI jiżvela antifungali potenzjali fl-interazzjoni bejn P. digitatum u P. citrinum.

Biex screen għal ġoddaantifungalikomposti bil-potenzjal li jipproteġu l-frott taċ-ċitru u jikkontrollaw il-mard ta 'wara l-ħsad, applikajna strateġija ta' ko-kultura li tinvolvi P. digitatum u patoġenu ieħor taċ-ċitru, P. citrinum. Il-kokultura hija strateġija ispirata min-natura li fiha l-kompetizzjoni bejn il-mikro-organiżmi tista 'tinduċi l-produzzjoni ta' metaboliti ġodda. F'xogħol preċedenti, il-ko-kultivazzjoni bejn Trichophyton rubrum u Bionectria ochroleuca indotta l-produzzjoni ta 'analogu sulfated ġdid ta' PS-990, li jissuġġerixxi li dan il-kompost jiġi sulfatat aktar matul l-interazzjoni fungali26. Ukoll, eżempju ieħor ta' kompost derivat mill-interazzjoni tal-fungi huwa t-tetrapeptide cyclo-(L-leucyl-trans-4-hydroxy-L-prolyl-D-leucyl-trans{-4-hydroxy-L-proline) iżolat mill-brodu tal-kokultura ta' Phomopsis sp. K38 u Alternaria sp. E33; it-tetrapeptide ċikliku wera attività inibitorja minn moderata għal għolja kontra fungi fitopatoġeniċi meta mqabbla mal-fungiċida kummerċjali triadimefon27. Għalhekk, esperimenti ta 'ko-kultivazzjoni huma approċċ vijabbli biex jinstabu komposti li jistgħu jinibixxu l-fitopatoġeni taċ-ċitru prinċipali, speċjalment, il-moffa ħadra kkawżata minn P. digitatum.

Fil-ko-kultivazzjoni mwettqa kemm fil-medja oranġjo (in vivo) u sintetiċi (in vitro) aħna viżwalment osservajna inibizzjoni tat-tkabbir fuq distanza twila bejn P. citrinum u P. digitatum. F'interazzjoni fungi, ġeni siekta jistgħu jiġu attivati ​​u metaboliti ta 'ħsara jistgħu jitneħħew minn sieħeb għall-ieħor16,28. Il-metaboliti indotti minn Tese huma ġeneralment lokalizzati fiż-żona ta 'konfrontazzjoni f'midja solida ta' ko-kulturi16. Madankollu, approċċi regolari użati biex jinstabu u jiċċaraw metaboliti bħal spettrometrija tal-massa akkoppjata ma 'kromatografija likwida (LC-MS) jew gass (GC-MS) ma jipprovdux informazzjoni dwar id-distribuzzjoni spazjali tal-molekuli.

L-informazzjoni dwar id-distribuzzjoni spazjali molekulari tista’ tinkiseb permezz ta’ immaġini tal-ispettrometrija tal-massa (MSI), għodda b’saħħitha li tiġġenera immaġini għal kull jone misjub fl-ispettru tal-massa16. L-użu ta 'MSI biex jifhmu s-sistemi mikrobjali u l-metaboliti sekondarji tagħhom mhuwiex ġdid u studji, fejn din it-teknika ġiet applikata b'suċċess, jistgħu jinstabu fil-letteratura30. Pereżempju, MSI ġiet applikata biex tinvestiga l-interazzjoni bejn Bacillus subtilis 3610 u Streptomyces coelicolor A3. L-immaġini DESI tal-kokultura batterjali żvelaw 57 sinjal lokalizzati spazjalment għal kolonji batterjali, li wasslu għall-identifikazzjoni ta 'xi metaboliti sekondarji bħal surfactin u plipastatin31. Barra minn hekk, l-analiżi MSI wriet ukoll li S. coelicolor għandu l-produzzjoni ta 'ċerti metaboliti sekondarji inibiti fil-preżenza ta' B. subtilis, li tiżvela interazzjoni bejn batterji31.

Għalhekk, biex tiskopri l-metaboliti sekondarji involuti fl-interazzjoni bejn il-patoġeni taċ-ċitru, applikajna DESI-MSI direttament fuq il-wiċċ tal-agar tal-ko-kultura, biex Ħares id-diffużjoni ta 'komposti fiż-żona ta' konfrontazzjoni. Sinjali MSI nkisbu għal joni [M plus H] plus f'm/z 519.1857, m/z 503.1908, m/z 475.1590, m/z 460.1960, m/z 459.1645, m/z 625.3942, m/z 625.3942, m/z 60, m/z 60. z 527.2862, m/z 511.2894 u m/z 448.2938 (Figuri S1-S10). Aħna osservajna li l-joni kollha msemmija ġew skoperti u kkonċentrati fiż-żona ta 'konfrontazzjoni bejn il-fungi (Fig. 1). Dawn il-komposti jistgħu jkunu relatati mal-interazzjoni fungus-fungus u jistgħu jkunu potenzjalment aġenti antimikrobiċi ġodda. Il-joni f'm/z 625, 609, 527, 511, u 448 ġew prodotti minn P. citrinum, filwaqt li joni f'm/z 519, 503, 475, 460, u 459, dehru li kienu kontroattakk ta' P. digitatum , li tiżvela gwerra kimika bejn dawn iż-żewġ patoġeni taċ-ċitru. Te joni misjuba in vitro permezz ta 'analiżi MSI ġew skoperti wkoll fl-estratti tal-ko-kulturi in vivo (Figuri. S11-S20) bl-użu ta' larinġ bħala sottostrat (Fig. 2).

Biex tikkaratterizza l-metaboliti involuti fl-interazzjoni, inkiseb estratt ta 'ko-kultura minn esperiment ta' kultivazzjoni ta 'scale-up u l-komposti ta' interess, misjuba inizjalment permezz ta 'analiżi MSI, ġew iżolati minn HPLC preparattiv u kkaratterizzati permezz ta' spettrometrija tal-massa tandem u analiżi NMR.

Permezz tal-mases eżatti miksuba mill-analiżi DESI-MSI (Tabella 1), kien possibbli li tiġi kkonfermata l-preżenza ta 'alkalojdi indol prodotti minn P. digitatum. Ioni [M flimkien ma' H] flimkien ma' m/z 519.1857, m/z 503.1908, m/z 475.1590, m/z 460.1960 u m/z 459.1645 li jikkorrispondu rispettivament għal tryptoquialanine A (1), tryptoquialanine (C2), tryptoquialanine (C) 3), 15-dimetil-2-epi-fumiquinazoline A (4) u deoxytryptoquialanone (5) (strutturi kimiċi rappreżentati fil-Fig. 3). Dawn il-komposti huma parti mill-mogħdija bijosintetika tat-tryptoquialanines32 u qabel kienu skoperti waqt analiżi DESI-MSI ta 'larinġ infettati bil-marda tal-moffa ħadra23. Il-kompost 1 kien irrappurtat bħala l-metabolit sekondarju ewlieni prodott minn P. digitatum33. Madankollu, it-tħassir ta 'dak il-ġene, responsabbli li jirregola l-bijosintesi 1, wera li 1 mhuwiex involut fil-patoġeniċità ta' P. digitatum kontra ċ-ċitru peress li l-kapaċità ta 'infezzjoni tal-mutanti ma ġietx mibdula34. Ir-rwol bijoloġiku eżatt tat-tryptoquialanines għadu mhux magħruf34 u dan l-istudju jipprovdi attività bijoloġika ġdida tat-tryptoquialanines bl-involviment ta 'dawn l-alkalojdi fl-interazzjoni fungali. L-MS/MS tal-jone [M plus H] plus f'm/z 625.3951 wasslu għal frammenti f'm/z 594.3533, 576.3427, 449.2430, u 431.2325 (Fig. S21), l-istess mudell ta 'frammentazzjoni miksub għal citrinin A (6) fi studju li jinvolvi ko-kultura bejn P. citrinum u Pseudoalteromonas sp. OT5919. Ukoll, id-database GNPS ssuġġeriet li l-jone f'm / z 625 jista 'jkun citrinin A. Te tandem ispettru tal-massa miksub għal dan il-kompost maqsuma ħames frammenti in komuni ma' l-ispettru tal-massa tandem ta '6 depożitati fid-database (Fig. S22). Barra minn hekk, jaqsam mudell ta 'frammentazzjoni MS/MS simili ma' citrinin A rrappurtat minn Moree et al. (2014). Citrinadins kienu rrappurtati li huma prodotti ogħla f'sitwazzjonijiet ta 'ko-kultura u kkonċentrati f'interfaces ta' ko-kultura, li jissuġġerixxu rispons difensiv ta 'P. citrinum kontra mikro-organiżmi oħra Analiżi ta' netwerking molekulari tal-komposti iżolati żvelat li citrinin ieħor huwa involut fil-kokultura. interazzjoni. Aħna osservajna li l-jone f'm/z 609, misjub inizjalment mill-analiżi MSI, huwa miġbur fl-istess raggruppament ta 'kompost 6 (m/z 625) (Fig. S23), li jissuġġerixxi li dan il-kompost huwa metabolit bħal citrinin. F'analiżi ta' netwerking molekulari, metaboliti relatati huma miġbura fl-istess raggruppamenti peress li għandhom spettru MS/MS simili.

Il-massa eżatta miksuba għall-jone [M plus H] plus f'm/z 609.4010 tikkorrispondi għal kompost bil-formula molekulari C35H53N4O5. Il-mudell tal-frammentazzjoni wassal għal frammenti f'm/z 578.3583, 464.2905, 451.2586, u 433.2482 (Figura Supplimentari S24). 1 H NMR u 1 H-1 H COZY spettri miksuba għall-metabolit purifikat (Figuri S25-S26 u Tabella S1) urew sinjali simili ta 'deoxycitrinadin A sintetizzat li kien irrappurtat minn Bian et al. (2013)37. Is-sinjal karatteristika ta 'l-epossidu f'δH 4.0 kien nieqes f'dan id-derivattiv u sinjal għall-idroġenu vynilic seta' jiġi osservat f'δH 6.9, li jindika n-nuqqas tal-grupp ta 'epossidu u l-preżenza ta' rabta doppja meta mqabbla ma 'citrinin A37. Hija l-ewwel darba li deoxycitrinadin A (7) huwa rrappurtat fil-letteratura bħala metabolit sekondarju prodott minn mikroorganiżmu.

Mases eżatti miksuba minn DESI-MSI għal joni [M plus H] plus f'm/z 527.2862 u 511.2894 indikat komposti bil-kompożizzjoni elementali ta 'C28H38N4O6 u C28H38N4O5, rispettivament. MS/MS żvelat li l-jone f'm/z 511 għandu struttura simili meta mqabbel ma 'm/z 527, ħlief minn assenza ta' atomu ta 'ossiġnu. Il-frammentazzjoni tal-jone f'm/z 527 wassal għal frammenti m/z 281, 247, 219, 182, u 120 (Fig. S27), filwaqt li jone f'm/z 511 ċeda għal m/z 265, 247, 219, 166 , u 120 (Fig. S30). L-istess mudell ta 'frammentazzjoni kien irrappurtat għas-sekwenza tat-tetrapeptides Phe-Val-Val-Tyr (8) ta' Penicillium canescens. Madankollu, it-tetrapeptides 8 u Phe-Val-Val-Phe (9) ġew irrappurtati reċentement bħala metaboliti sekondarji prodotti minn Penicillium roqueforti. Analiżi 1 H u 13C NMR tal-komposti iżolati (Figuri S28–S32 u Tabelli S2-S3) ikkonfermaw ir-riżultati miksuba permezz ta’ MS/MS, u kkonkludew li joni f’m/z 527 u m/z 511 jikkorrispondu għal 8 u 9, rispettivament. Il-produzzjoni ta 'dawn it-tetrapeptides fil-gwerra kimika fungali mhix sorprendenti minħabba li peptidi żgħar huma magħrufa għall-attività antimikrobika tagħhom40. Dan huwa l-ewwel rapport ta '8 u 9 bħala metaboliti sekondarji ta' P. citrinum. Għal jone [M plus H] plus f'm/z 448.2938, il-massa eżatta ssuġġeriet kompost bil-formula molekulari C28H38N3O2, l-istess kompożizzjoni tal-metabolit sekondarju chrysogenamide A (10) (żball =-4.6 ppm). Il-kompost 10 kien iżolat u l-analiżi 1 H u 13C NMR (Figuri S33–S34 u Tabella S4) ikkonfermaw l-istruttura tiegħu; huwa l-ewwel rapport li chrysogenamide A huwa involut f'interazzjoni fungali. Il-kompost 10 kien irrappurtat l-ewwel darba bħala metabolit sekondarju ta’ Penicillium chrysogenum Nru 005, fungus endofitiku assoċjat mal-pjantaCistanche deserticola. Ukoll, 10 ġie rrappurtat bħala metabolit sekondarju ta 'razza P. citrinum42. L-istrutturi tal-metaboliti prodotti minn P. citrinum huma rappreżentati fil-Fig. 4.

Assays antifungali.

Investigajna l-antifungalil-attività tal-metaboliti prodotti fil-ko-kultura u P. digitatum ġiet imlaqqma f'agar media li fiha estratt ta' ko-kultura. Meta mqabbel mal-kontroll, osservajna tnaqqis ta '67 fil-mija fit-tkabbir radjali P. digitatum (Fig. S35), li jindika li l-metaboliti involuti fil-gwerra fungali għandhom potenzjal bħala aġenti antifungali. Biex nikkonferma din l-ipoteżi, ittestjajna l-komposti iżolati u osservajna li l-komposti 6, 9, u 10 (400 µg mL-1 ) naqqsu 48 fil-mija, 41 fil-mija, u 61 fil-mija tat-tkabbir radjali P. digitatum, rispettivament, meta mqabbla mal-kontroll (Fig. 5), li tikkonferma l-attività antifungali. Citrinadins instabu li huma involuti fir-rispons ta 'P. citrinum kontra mikro-organiżmi oħra f'ko-kulturi, iżda r-rwol bijoloġiku tagħhom f'ambjenti bijoloġiċi għadu mhux magħruf sa din id-data19. Il-kompost 6 ġie ttestjat għall-attività tal-ulċera Anti-Buruli fuq Mycobacterium ulcerans MN209, iżda ma ġie osservat l-ebda MIC interessanti43; ukoll, attività ta' ċitotossiċità ta' 6 kontra ċ-ċelluli tal-lewkimja u tal-karċinoma kienet irrappurtata44. Ir-riżultati tagħna huma l-ewwel rapport ta 'attività antimikrobika ta' citrinadins fil-letteratura u jistgħu jipprovdu l-ewwel għarfien dwar ir-rwol bijoloġiku ta 'dawn il-komposti f'interazzjonijiet fungali-fungali. Barra minn hekk, chrysogenamide A qatt ma kien irrappurtat bħala aġent antimikrobiku sa issa. Il-kompost 10 wera effett protettiv fuq in-newroċiti kontra l-mewt taċ-ċelluli indotta mill-istress ossidattiv41, madankollu, l-ebda attività bijoloġika oħra għal 10 ma ġiet irrappurtata fil-letteratura. Assays antifungali li japplikaw D-Phe-L-Val-D-Val-L-Tyr wrew li dan it-tetrapeptide għandu attività inibitorja kontra sottotitli B. u l-fitopatoġenu tas-sojja Fusarium virguliforme38. B'kuntrast, l-ebda inibizzjoni ta 'E. coli, B. subtilis, u S. cerevisiae fil-preżenza ta' D-Phe-L-Val-D-Val-L-Tyr jew D-Phe-L-Val-D-Val-L -Phe kien osservat39. L-attività antifungali tat-tryptoquialanines ġiet evalwata wkoll peress li dawn il-komposti dehru li kienu rispons kimiku ta 'P. digitatum kontra P. citrinum fil-gwerra kimika. Tryptoquialanines 1 u 4 ġew ittestjati u żvelaw attività antifungali kontra P. citrinum. Il-komposti 1 u 4 kellhom MIC ta '300µgmL-1, li jinibixxu l-produzzjoni tal-ispori ta' P. citrinum (Fig. S36). Sa fejn nafu tagħna, huwa l-ewwel rapport ta 'attività antimikrobika tat-tryptoquialanines. Riċentement, 1 intwera bħala kompost insettiċida kontra Ae. larva aegypti23; l-attività antifungali tista 'tipprovdi aktar fehim dwar ir-rwol tat-tryptoquialanines fl-ambjent taċ-ċitru-patoġenu ladarba dawn il-komposti mhumiex meħtieġa għall-virulenza ta' P. digitatum.

BENEFIĊĊJUCISTANCHE: Kontra l-batterja

Il-gwerra kimika tbiddel il-ħajt taċ-ċelluli ta 'P. digitatum fil-kokultura.

Biex tinvestiga l-azzjoni tal-metaboliti sekondarji matul il-fungaliinterazzjoni, kampjuni ta 'ko-kultura ġew imtebba' b'Aħmar tal-Kongo u osservati permezz ta' mikroskopija tal-iskannjar tal-laser konfokali. Aħmar tal-Kongo huwa komunement użat biex itebba l-polisakkaridi li fihom konnessjonijiet 1,4 bħal, pereżempju, il-fungalikomponent tal-ħajt taċ-ċellula chitin45,46. P. digitatum hyphae ġew osservati fiż-żona ta 'konfrontazzjoni (kampjun) u mqabbla ma' hyphae 'l bogħod għar-reġjun tal-interface (kontroll) (Fig. S37). Ifei ta 'kontroll kienu mtebbgħin b'mod omoġenju bl-Aħmar tal-Kongo filwaqt li l-ife fir-reġjun tal-interface urew mudell ta' tbajja' mibdul (Fig. 6), b'irqajja irregolari. Inkisbu mudelli ta 'tbajja simili għal fungi mutanti knockout li fihom il-ġeni mħassra kellhom rwol fl-organizzazzjoni tal-ħajt taċ-ċelluli; bħala riżultat, il-mutanti wrew ħitan taċ-ċelluli difettużi u tbajja irregolari25,46,47. Madankollu, tbajja anormali b'Calcofluor White kienet osservata għal P. ostreatus P89 ittrattat b'36 grad; temperatura għolja mibdula distribuzzjoni chitin u l-integrità tal-ħajt taċ-ċelluli48. Din id-dejta turi li P. digitatum hyphae, f'kuntatt mal-metaboliti mxerrda matul il-ko-kultura, għandhom ħajt taċ-ċelluli difettuż peress li l-Kongo Red jiltaqa 'ma' strutturi tal-ħajt taċ-ċelluli fungali. Il-ħajt taċ-ċelluli fungali huwa mira attraenti ta 'antimikrobiċi minħabba li mhumiex preżenti fiċ-ċelloli tal-mammiferi49,50. Bħala konklużjoni, l-analiżi tal-mikroskopija u l-analiżi antifungali jsaħħu li l-metaboliti involuti fl-interazzjoni fungali għandhom potenzjal bħalaantifungaliaġenti u jistgħu jkunu l-mekkaniżmu fin-natura li dawn il-fitopatoġeni żviluppaw biex jikkompetu kontra mikro-organiżmi oħra għall-ospitanti (Fig. 7).

Konklużjonijiet

It-tfittxija għal antimikrobiċi naturali ġodda hija qasam promettenti fir-riċerka tal-prodotti naturali li tikkonċerna l-impatt ekonomiku tal-mard ta’ wara l-ħsad fuq l-agrikoltura madwar id-dinja. Barra minn hekk, id-dehra ta 'razez ta' fungi reżistenti għall-fungiċidi tagħmel l-iskoperta ta 'ġoddaantifungaliaġenti biex jissostitwixxu komposti sintetiċi estremament importanti. Bl-użu ta 'ko-kultivazzjoni bejn fitopatoġeni li jikkompetu għall-istess ospitanti, P. digitatum u P. citrinum, osservajna interazzjoni fungali. Permezz tat-teknika MSI, skoprejna metaboliti sekondarji defused għaż-żona ta 'interface bejn il-mikro-organiżmi. Tryptoquialanines, citrinadins, chyrsogenamide A u tetrapeptides urew attività antifungali kbira, li tikkonferma li l-kokulturi u t-teknika MSI huma taħlita tajba fit-tfittxija ta 'antimikrobiċi naturali ġodda.

Sa din id-data, ma kien hemm l-ebda informazzjoni dwar l-interazzjoni bejn il-fungi patoġeniċi taċ-ċitru. Id-dejta tagħna żvelat komposti li għandhom rwol fl-ekoloġija mikrobjali taċ-ċitru. Barra minn hekk, urejna li l-metaboliti studjati għandhom potenzjal kbir bħalaantifungaliaġenti peress li l-ħitan taċ-ċelluli fungali huma wieħed mill-miri ewlenin taantifungalikomposti. L-użu tal-komposti identifikati bħala antifungali naturali minflok fungiċidi sintetiċi għandu jiġi investigat aktar. Dan id-dokument jiftaħ possibbiltajiet ġodda ta 'riċerka u jikkontribwixxi għas-saħħa ambjentali u tal-bniedem, jgħin fit-tfittxija għal strateġiji aktar sikuri għall-agrikoltura permezz tal-użu ta' komposti miksuba minn sorsi naturali.

BENEFIĊĊJUSUPPLIMENT TA' CISTANCHE: TITJIB L-IMMUNITÀ