Nuklei Talamiċi Anterjuri: Sottostrat Kritiku Għall-Memorja Assoċjata Magħquda Mhux Spazjali fil-Firien Parti 2

2|MATERJALI U METODI

2.1|Annimali u kundizzjonijiet tad-djar

Firien irġiel Long-Evans (12-il xahar; medja ta’ 630 g) kienu miżmuma fi gruppi ta’ tlieta jew erbgħa f’gaġeġ Makrolon (48 28 22 ċm) fuq ċiklu maqlub ta’ 12-h dawl-dlam (dwal mixgħula fit-8 pm). ).

L-ittestjar tal-imġieba seħħ fil-fażi mudlama taċ-ċiklu tad-dawl, ħames sessjonijiet fil-ġimgħa; osservazzjonijiet ikkonfermaw li l-firien kienu relattivament aktar attivi matul il-fażi mudlama. Il-firien inżammu f'85% tal-piż tal-ġisem b'xejn bl-ilma ad libitum; l-ikel kien ad libitum qabel u wara l-kirurġija għall-irkupru wara l-operazzjoni.

Il-kirurġija hija l-proċess tat-trattament tal-mard u t-titjib tas-saħħa fiżika. Il-proċess ta 'rkupru wara l-kirurġija jeħtieġ attenzjoni speċjali. Minbarra l-irkupru fiżiku, tħossok tajjeb jeħtieġ ukoll li tiffoka fuq l-irkupru tal-memorja. Hemm konnessjoni qawwija bejn l-irkupru wara l-operazzjoni u l-memorja.

Matul l-operazzjoni, fatturi bħar-rispons għall-avversità tal-ġisem u l-effetti ta 'drogi anestetiċi spiss jaffettwaw il-funzjoni tal-memorja tal-moħħ. Wara li l-ġisem jirkupra, agħti attenzjoni biex iżżomm dieta tajba, eżerċizzju moderat u rqad adegwat. Matul il-perjodu ta 'rkupru barra l-isptar, trid tkompli tevita attivitajiet eċċessivi u żżomm stat komdu tal-ġisem.

Minbarra d-drawwiet ta 'għajxien, aġġustamenti psikoloġiċi raġonevoli huma wkoll ta' għajnuna biex jirrestawraw is-saħħa u l-memorja. Irrilassa lilek innifsek, żomm moħħ paċifiku, u għinek taġġusta ruħek għall-irkupru tal-memorja. Fl-istess ħin, għandek tipparteċipa b'mod attiv f'attivitajiet rikreattivi u tikkomunika mal-qraba u l-ħbieb biex iżżomm moħħok attiv u ttejjeb l-abbiltajiet konjittivi u tal-memorja tiegħek. Din l-attività tista’ tiżdied gradwalment u tista’ ssir bażikament darba fil-ġimgħa.

Fil-qosor, il-proċess ta 'rkupru wara l-kirurġija jeħtieġ attenzjoni kollha. Iż-żamma ta 'drawwiet ta' għajxien tajbin u aġġustamenti psikoloġiċi għandha rwol importanti ħafna fil-promozzjoni tal-irkupru fiżiku u l-irkupru tal-memorja. Ejjew niffaċċjawha b'mod pożittiv, b'kunfidenza u tama sħiħa. Għandna bżonn intejbu l-memorja, u Cistanche deserticola jista 'jtejjeb b'mod sinifikanti l-memorja, minħabba li Cistanche deserticola jista' wkoll jirregola l-bilanċ ta 'newrotrasmettituri, bħal żieda fil-livelli ta' acetylcholine u fatturi ta 'tkabbir. Dawn is-sustanzi huma importanti ħafna għall-memorja u t-tagħlim. Barra minn hekk, Laħam jista 'wkoll itejjeb il-fluss tad-demm u jippromwovi l-kunsinna ta' ossiġnu, li jista 'jiżgura li l-moħħ jirċievi biżżejjed nutrijenti u enerġija, u b'hekk itejjeb il-vitalità u r-reżistenza tal-moħħ.

Ikklikkja taf modi biex ittejjeb il-funzjoni tal-moħħ

Il-proċeduri kollha kkonformaw mal-linji gwida approvati mill-Kumitat tal-Etika tal-Annimali tal-Università ta 'Canterbury. Erba' gruppi ta' firien ġew stabbiliti permezz ta' assenjazzjoni każwali wara familjarizzazzjoni ta' qabel il-kirurġija fil-labirint tad-driegħ radjali (RAM) u r-runway. L-erba 'gruppi kienu leżjonijiet ATN bilaterali withor mingħajr traċċa bejn riħa u stimuli oġġett meta mħarrġa fil-kompitu paired-assoċjat u l-korrispondenti żewġ gruppi Sham-leżjoni.

Id-daqsijiet tal-kampjun finali kienu (1) Sham-No Trace=7 (jiġifieri grupp ta' leżjoni ta' Sham bl-ebda intervall bejn stimoli ta' riħa u oġġetti użati fil-kompitu assoċjat ta' paired); (2) Sham-Trace=7 (Grupp Shamlesion mogħti traċċa 10-s bejn il-preżentazzjoni tar-riħa u l-istimoli tal-oġġett); (3) ATN-Nru Traċċa=8;u (4) ATN-Traċċa=9. Ratwa addizzjonali ta' leżjoni ATN kienet eskluża minħabba li ma ssodisfax il-kriterji tal-leżjoni (ara hawn taħt).

2.2|Kirurġija

Il-firien ġew anestetizzati b'isoflurane (induzzjoni 4%; manutenzjoni 2.5%) u mqiegħda f'apparat stereotassiku b'vireg tal-widnejn atraumatiċi (Kopf, Tujunga, CA). Theincisor bar kien issettjat għal 7.5 mm taħt il-linja interawrali biex timminimizza l-ħsara tal-fornix.

F'kull emisfera, żewġ infużjonijiet kienu diretti lejn in-nukleu anteroventral (AV; ta 'fuq u t'isfel), u infużjoni waħda kienet diretta lejn in-nukleu anteromedial (AM). Kull kirurġija wżat koordinati ta' quddiem u ta' wara (AP) wieħed relattivi għad-distanza Bregma-Lambda ta' far individwali (il-valuri kollha f'mm). Għal leżjonijiet AV, il-koordinati AP kienu: 2.20 għal B–L 6.9–7.2; 2.25 għal B–L 7.3 sa 7.6; 2.30 għal B–L Akbar minn jew ugwali għal 7.7. L-infużjonijiet AV saru f'5.68 u 5.73 taħt id-dura u 1.52 laterali għal-linja tan-nofs.

L-infużjoni AM saret {{0}}.1 mm aktar 'il quddiem mill-koordinata AV, f'5.76 taħt id-dura u 1.16 laterali; l-ewwel leżjoni AM saret wara li tlestew l-AVinfużjonijiet kollha u bdiet kontralaterali għall-aħħar leżjoni AV. 0.15 M N-methyl-d-aspartate (NMDA; Sigma, CastleHill, NSW) fi 0.1 M phosphate buffer (pH 7.20) ġie infuż f'kull sit f'0.04 ul kull minuta permezz ta' 2.5-siringa ulHamilton (Reno, NV, USA) bl-użu ta' pompa ta' mikro infużjoni (Stoelting, Wood Dale, IL).

L-AV sitesper emisfera rċeviet {{0}}.12 u 0.10 ul għas-siti dorsali u ventrali, rispettivament; 0.06 ul intuża għal kull sit AM. Il-labra tas-siringa baqgħet in situ għal 3 min kull naħa, wara l-infużjoni.
Kirurġiji ta' leżjoni finta użaw l-istess proċedura, iżda l-labra tbaxxiet għal 1 mm' il fuq mis-siti ta' fuq tal-leżjoni AV u AM b'noinfużjoni mogħtija.

2.3|Ħidmiet tal-imġieba

RAM ta 'tmien dirgħajn ikkonfermat l-indeboliment tal-memorja spazjali fil-firien b'leżjoni ATN wara l-kirurġija. Intuża apparat tar-runway biex iħarreġ lill-firien fuq il-kompiti kollha mhux spazjali, jiġifieri, diskriminazzjoni sempliċi ta 'riħa u oġġett sempliċi u kompiti assoċjati ta' riħa-oġġett u riħa-traċċa-oġġett.

Qabel l-operazzjoni, il-firien ristretti għall-ikel kienu abitwati mar-RAM bi tmien dirgħajn, deskritti hawn taħt, biex jirkupraw 0.1 g biċċiet taċ-ċikkulata (Foodfirst LTD Auckland, NZ) u jadattaw għall-ftuħ u l-għeluq tal-bibien tad-driegħ. F'runway aħmar tal-Perspex (Figura 1), il-firien kienu wkoll iffurmati biex ipoġġu l-imnieħer għatu tal-plastik abjad ċirkolari ta' 2-ċm li kien 10 ċm 'il fuq mil-livell tal-art u fiċ-ċentru ta' sponża rqiqa fuq inserzjoni ċara tal-Perspex li kienet imwaħħla ma' il-ħajt tat-tarf.

Kienu wkoll iffurmati biex jimbuttaw (bl-użu ta’ imnieħer jew sida) oġġett imwaħħal fuq wara tal-bażi tiegħu mal-quċċata ta’ bir tal-ikel li kien imdaħħal fiċ-ċentru ta’ blokka tal-injam ta’ 5 8.5 3 ċm. L-ikel kien fih biċċiet taċ-ċikkulata (u kellu ikel inaċċessibbli taħt l-irqas). L-oġġett użat għat-taħriġ minn qabel ma reġax intuża. Wara l-kirurġija, il-firien ta 'rkupru ġew familjari mill-ġdid kemm mar-RAM kif ukoll mar-runway.

2.4|Memorja tax-xogħol spazjali fir-RAM

Wara l-operazzjoni, il-memorja tax-xogħol spazjali ġiet ittestjata bl-użu tar-RAM li jinsab fiċ-ċentru ta 'kamra mingħajr tieqa (3 3 m). Il-labirint kellu ċentru ċentrali tal-injam miżbugħ bil-griż ta’ 35 ċm wisa’ bi tmien dirgħajn tal-aluminju (65 ċm tul 8.6 ċm wiesa’, b’bordijiet ta’ 4.5 ċm għoli), mgħollija 67.5 ċm ‘il fuq mill-art tal-kamra. Ħitan ċari tal-Perspex (19 ċm tul u 25 ċm għoli) estiżi tul naħa waħda ta 'kull driegħ mill-buttun biex jipprevjenu l-firien milli jaqbżu bejn id-dirgħajn.

Bir ta' l-injam iswed għall-ikel (5 8.5 3 cm), b'ikel inaċċessibbli taħt, tqiegħed fit-tarf ta' kull driegħ. prova. Bibien ċari tal-perspexguillotine, li jistgħu jittellgħu minn taħt il-buttun permezz ta 'sistema ta' taljola, ikkontrollaw aċċess għall-armi tar-raġel.

Għaxar ijiem konsekuttivi ta 'taħriġ formali fir-RAM kienu użati biex jittestjaw il-memorja tax-xogħol spazjali. Il-far tpoġġa fil-buttun ċentrali, u 10 sekondi wara, it-tmien dirgħajn kollha nfetħu, u l-far tħalla jagħmel għażla definita bħala ż-żewġ saqajn ta' wara fuq limitu tad-driegħ. Ladarba l-far kien daħal f'driegħ, il-bibien kollha ingħalqu, u kien limitat għad-driegħ għal 15 s irrispettivament minn jekk għamilx għażla korretta.

Il-far ġie mbagħad permess lura fiċ-ċentru ċentrali u miżmum hemm għal 10 sekondi qabel ma l-bibien kollha reġgħu nfetħu biex jippermettu għażla oħra tad-driegħ. Il-prova ikkonkludiet meta r-rathad żar it-tmien fergħat kollha, 20 għażla ta 'driegħ kienu saru jew 10 min kienu għaddew.

2.5|Ħidmiet mhux spazjali: Diskriminazzjoni sempliċi u tagħlim assoċjat

Kemm id-diskriminazzjoni sempliċi kif ukoll il-kompiti assoċjati f'pari użaw l-istess runway aħmar tal-Perspex (93 26 26 cm) imqiegħda fuq mejda 75-ċm għolja (Figura 1). Ir-runway tista 'tiġi diviża bi tliet bibien li jistgħu jitneħħew vertikalment (redPerspex, 26 26 ċm) li ntgħażlu abbażi tal-kompitu speċifiku tal-imġieba. Fir-rigward tal-familjarizzazzjoni, l-isponża rqiqa 6.5 6 8 mm bl-għatu fiċ-ċentru tagħha żammet premju tal-ikel taċ-ċikkulata (Figura 1).

L-isponża kienet imwaħħla ma' bieb li jista' jitneħħa fir-runway (għall-kompiti assoċjati flimkien) jew mal-ħajt tat-tarf tar-runway (għall-kompitu ta' diskriminazzjoni sempliċi). Intuża sponża doorplus differenti għal kull riħa, li kienet infuża maġenb ir-reċipjent b'5 ml ta 'żejt tal-ġirasol imħallat ma' 20 ul ta 'Żjut Essenzjali ta' sustanza New Zealand.

L-irwejjaħ kienu tal-lumi u tal-qronfol għall-kompiti assoċjati flimkien, u l-kannella u l-ġir għall-kompiti ta 'diskriminazzjoni sempliċi, jew bil-maqlub fi gruppi kontrobilanċjati. Oġġetti ħfief u viżwalment distinti (Figura 1) kienu mwaħħla permezz ta 'ċappetta fuq wara tal-bażi tagħha mal-parti ta' fuq tal-ikel tajjeb sabiex far ikun jista 'faċilment imbotta l-oġġett lura (jew imnieħer jew sida) biex tfittex thewell għal premju tal-ikel.

Qafas tal-injam (għoli 1.8 m mill-art wiesa' 1.3 m), miksi b'purtieri suwed, magħluq in-naħat kollha taż-żona tat-test biex jitnaqqsu l-indikazzjonijiet spazjali waqt l-ittestjar.

Id-diskriminazzjonijiet sempliċi (ir-riħa biss; l-oġġett biss) u l-kompiti assoċjati f'pari użaw proċedura 'go/no-go'.

L-ewwel prova għal kull sessjoni bdiet billi trażżan il-far fiż-żona tal-bidu għal 120 s biex jerġa 'jikklimatizza mal-maze; provi sussegwenti użaw 20 s f'din iż-żona tal-bidu. Allrats irċieva 12-il prova massed kull sessjoni ta 'kuljum, b'sixgo (ppremjati) u sitt provi no-gos (mhux ippremjati) f'ordni apsewdo-randomizzata. Mhux aktar minn tliet go jew tliet no-go provi twettqu konsekuttivament f'sessjoni.

L-ebda wieħed mill-erba 'pari differenti ta' stimoli ta' riħa-oġġett ma kien ripetut fuq provi konsekuttivi. Oġġetti korretti fil-kompiti ta 'diskriminazzjoni sempliċi u pari ta' stimolu korretti fil-kompiti assoċjati f'pari kienu kontrobilanċjati bejn il-firien.

Għad-diskriminazzjoni sempliċi tar-riħa, rispons kien definit bħala imnieħer poke fil-kappa fiċ-ċentru ta ' l-isponża theodorised; ixxomm l-isponża biss kien ikkunsidrat bħala rispons mhux-go. L-ikel kien dejjem preżenti fil-kap fiċ-ċentru tal-isponża għall-kompiti assoċjati riħa-oġġett par; l-aspett go/no-go hawnhekk jirreferi għal jekk l-oġġett ġie mbuttat biex jiżvela jekk premju tal-ikel kienx taħtu, fit-tarf tar-runway.

Għall-oġġetti, rispons kien definit bħala kwalunkwe imbottatura b'imnieħer jew saqpa li tmejjel l-oġġett lura. Latency minn meta l-aħħar bieb tneħħa u meta l-far jinteraġixxi mar-riħa (poke imnieħer fl-għatu; għal diskriminazzjoni sempliċi ta’ riħa) jew ma’ l-oġġett (imbuttat lura fuq iċ-ċappetta, għal diskriminazzjoni sempliċi ta’ oġġetti u kompiti assoċjati f’pari) kienet imkejjel bl-użu ta' stopwatch kwiet (Dick Smith, New Zealand).

L-osservatur kien bilqiegħda fil-purtieri u ħdejn ir-runway biex iħaddem il-bibien u jirreġistra l-imġieba. Prova kienet innominata bħala 'korretta' jekk il-far irrisponda f'inqas minn 8 s fuq il-prova jew ma rrispondux qabel 8 s fuq provi mhux-go.

2.6|Diskriminazzjonijiet sempliċi

Nofs il-firien irċevew taħriġ fil-kompitu ta 'diskriminazzjoni sempliċi ta' riħa segwit mid-diskriminazzjoni ta 'oġġett sempliċi u viċi versa għan-nofs l-ieħor. Ġiet irreġistrata l-latenza bejn il-Bieb X (Figura 1a) u l-interazzjoni mal-oġġett tar-riħa fl-aħħar tar-runway. Il-firien kienu mħarrġa fuq il-kompitu sempliċi ta' diskriminazzjoni ta' riħa u oġġetti sempliċi sakemm laħqu l-kriterju (80% korretti fuq 2 ijiem konsekuttivi).

Għall-ħidma ta' diskriminazzjoni sempliċi tar-riħa, ġiet ippreżentata riħa waħda f'kull prova. Ir-rata kellha tiddiskrimina liema minn żewġ irwejjaħ kienet imqabbla ma 'premju tal-ikel ippreżentat fl-isponża fit-tarf tal-Kompartiment B (Figura 1a).

Fil-kompitu sempliċi ta 'diskriminazzjoni ta' oġġetti, oġġett wieħed ġie ppreżentat fuq kull prova fit-tmiem tal-Kompartiment B (mhux muri fil-Figura 1). Therat kellha titgħallem liema minn żewġ oġġetti kien imqabbel ma 'premju tal-ikel ippreżentat taħt l-oġġett.

2.7|Ħidmiet assoċjati flimkien (traċċa u bla traċċa) Dawn il-kompiti użaw tqassim ġdid ta' bibien li jistgħu jitneħħew vertikalment (Figura 1). Il-firien tgħallmu liema miż-żewġ tqabbil riħa-oġġett ikun ippremjat (eż. Riħa 1 + Oġġett A u Riħa 2 + Oġġett B) u liema akkoppjamenti ma ġewx ippremjati (jiġifieri Riħa 1 + Oġġett B u Riħa 2 + Għan A).

Irrispettivament mit-tqabbil, il-firien dejjem irċivew premju għall-preżentazzjoni tar-riħa meta permess fit-tieni kompartiment tar-runway. Dan kien il-kompartiment C għall-kundizzjoni 'mingħajr traċċa' li fiha l-Kompartiment A ma kienx użat u l-Kompartiment B kien il-kompartiment tal-bidu. Ir-riħa kienet fit-tarf tal-Kompartiment B għall-kundizzjoni ta' 'traċċa', li għaliha ntuża l-Kompartiment A bħala l-kaxxa tal-bidu.

Il-firien f'kundizzjoni ta' traċċa kienu soġġetti għal dewmien ta' 10- bejn il-preżentazzjonijiet tar-riħa u l-istimoli tal-oġġett, billi nżammu fil-Kompartiment Ċ, filwaqt li l-firien fil-kundizzjoni ta' mingħajr traċċa kienu esposti għall-oġġett immedjatament wara l-interazzjoni tagħhom mar-riħa (wara tiekol il-premju). Fiż-żewġ kundizzjonijiet ta 'traċċa u ta' ebda traċċa, aħna rreġistrajna l-latenza biex jaqsmu l-Kompartiment D, minn meta BiebZ tneħħiet sakemm il-far interaġixxa mal-oġġett jew żamm milli jinteraġixxi miegħu għal 8 sekondi.

Żewġ gruppi ta’ firien (Sham-lesion u ATN-lesion) ġew imħarrġa fuq ħidmiet assoċjati b’pari ta’ l-odour-oġġett (gruppi Nru Traċċa), u żewġ gruppi korrispondenti ġew imħarrġa fuq il-kompitu ta’ paired-assoċjat ta’ theodour-traċċa-oġġett (gruppi ta’ Traċċa) sakemm kriterju milħuq (80% provi korretti fuq 3 ijiem) jew massimu ta '50 jum.

2.8|Test taż-żamma ta' wara l-akkwist

Iż-żamma tal-kompitu paired-assoċjat għal kwalunkwe far saret 5 ijiem wara li laħqet il-kriterju jew wara 50 jum ta 'taħriġ. Din is-sessjoni użat 12-il prova massed ppremjati/mhux ippremjati f'ġurnata waħda b'mod identiku kif użat qabel għal dak il-far.

2.9|Istoloġija

2.9.1|Perfużjoni u ġbir tat-tessuti

Fit-3 ijiem qabel it-test taż-żamma, firien waħedhom kienu familjari ma’ gaġġa nadifa vojta għal 90 minuta f’kamra mudlama u kwieta. Immedjatament wara l-aħħar prova fit-test tal-intenzjoni, il-far tqiegħed fil-gaġġa tiegħu fil-kamra familjari u mudlama kwieta 90 min qabel il-perfużjoni.

Il-firien kienu anestetizzati b'mod profond b'pentobarbital tas-sodju (125 mg/kg) u mxerrda transkardjali b'salina segwit b'paraformaldehyde [4% PFA f'0.1 M phosphate buffer (PB)] biex jiffissa l-moħħ. L-imħuħ ġew imwaħħla wara f'4% PFA segwit minn minimu ta' 48 siegħa f'soluzzjoni fit-tul (20% glycerol f'0.1 M PB). Sezzjonijiet koronali 40-μm inġabru bl-użu ta 'mikrotomu tal-iffriżar (Thermo Fisher, UK) u maħżuna f'soluzzjoni krijo-protettiva (30% glycerol, 30% ethylene glycol f'0.1 M PB) f'20 C sakemm tiġi pproċessata għall-immunoistokimika.

Is-sezzjonijiet tal-koronali nġabru f'żewġ serje separati. L-ewwel serje qabdet sezzjonijiet konsekuttivi f'ħames krijovjali għall-immunoistokimika (jiġifieri wieħed minn kull ħamsa). Din is-serje inkludiet blokk anterjuri ta’ sezzjonijiet mill-kortiċi prefrontali saż-żona septal (bejn wieħed u ieħor {{0}}.7 sa 0.6 mm minnBregma) u blokk posterjuri mit-thalamus medjodorsali (madwar 3.5 mm minn Bregma) sal-kawdali kortiċi retrosplenjali.

It-tieni serje maqbudin sezzjonijiet konsekuttivi għall-verifika tal-leżjoni. Dawn is-sezzjonijiet inġabru f'erba' krijovjali minn immedjatament qabel l-ATN sat-thalamus medjodorsali ta' wara (madwar 0.6 sa 3.5 mm minn Bregma).

2.9.2|Tbajja Neu-N u ATN-lesionverification

Sezzjonijiet li jżommu f'wiċċ l-ilma madwar ir-reġjun ATN ġew maħsula (3 10 min) fi 0.1 M phosphate-buffered saline with Triton-X (0.2%; PBSTx) qabel inkubazzjoni f'buffer endoġenu li jimblokka perossidasi għal 30 min [1% idroġenu perossidu (H2O2), 50% metanol (CH3OH) f'2% PBSTx].

It-taqsimiet ġew inkubati matul il-lejl f'4 C inanti-NeuN antikorp primarju (1:5000; monoclonal-MouseCat# MAB377; Millipore, California USA) f'PBSTx b'1% serum normali tal-mogħoż (NGS; Life Technologies, NZ).

Il-buffer tal-antikorpi żejjed tneħħa b'PBSTx u segwit minn inkubazzjoni f'antikorp sekondarju tal-mogħoż bijotinilat kontra l-ġrieden (1:1000 Cat# BP-9200-50: VectorLaboratories, California USA) matul il-lejl f'4 C f'PBSTx u 1% NGS. It-taqsimiet tqiegħdu f'ExtrAvidin (peroxidase konjugat; 1:1000; Sigma, NSW Awstralja), PBSTxand 1% NGS għal 2 sigħat f'temperatura tal-kamra.

Biex tneħħi l-eċċess ta 'ExtrAvidin u Triton X{{0}}, is-sezzjonijiet inħaslu f'PBS, PB, u mbagħad Tris buffer (pH 7.4 f'H2 distillat0) biex jippreparaw is-sezzjonijiet għall-viżwalizzazzjoni b'diaminobenzidine ippreparat frisk ( DAB 0.05%; Sigma, f'0.01% H2O2 fil-buffer Tris).

Ir-reazzjoni DAB (madwar 5 min) twaqqfet bl-użu ta' buffer Tris (1 10 min wash), u s-sezzjonijiet tqiegħdu f'PB f'4 C matul il-lejl qabel l-immuntar fuq slides ġelatinizzati u jitħallew jinxef. Il-pjastri ġew deidratati permezz ta 'alkoħol gradat (70%-100%) qabel ma ġew ikklerjati inxylene u mmuntati b'DPX (06522; Sigma-Aldrich) u coverslip.

In-numru ta' ċelluli Neu-N-pożittivi fl-ATN intuża biex jiddetermina l-firxa tal-leżjoni. Dan uża sezzjonijiet kemm mill-emisferi tax-xellug kif ukoll tal-lemin għal kull waħda minn erba' 40-μm sezzjonijiet madwar l-ATN u ż-żona kkwantifikata bl-użu ta' ImageJ (NIH, USA). It-tbajja' taċ-ċelluli NeuN-pożittivi ġiet fotografata f'5 għanijiet fuq mikroskopju wieqfa LeicaDM6 B u kamera DFC7000T (Leica Microsystems, il-Ġermanja).

L-għadd awtomatizzat taċ-ċelloli nkiseb permezz ta' ImageJ (softwer ta' analiżi tal-immaġni, Istitut Nazzjonali tas-Saħħa, NIH, USA). Iż-żona ta' madwar in-newroni fir-reġjun ATN intgħażlet manwalment u l-immaġini ġew ikkonvertiti għal {{0}}skala ta' griż bit, l-isfond ġie mnaqqas (rolling=40), ikkonvertit għal maskra u ġiet applikata l-funzjoni tal-konfini tal-ilma, u ċ-ċelloli newronali kollha 'l fuq mil-limitu ('MaxEntropy' threshold, ċirkolarità 0.5–1.0) ġew magħduda.

Il-limitu ta 'skoperta kien l-istess għas-sezzjonijiet kollha. Nuklei awtomatizzati ta' ċelluli mtebbgħin NeuN ġew magħduda f'disa 'mill-firien sham (ħamsa fil-grupp Sham-Trace u erbgħa fil-grupp Sham-No Trace) biex jesprimu l-għadd taċ-ċelluli fl-ATN.

L-għadd awtomatizzat ta' nuklei mtebbgħin NeuN ta' ċelloli meħlusa fil-firien kollha b'leżjoni ATN tqabbel mal-għadd medju ta' ċelloli NeuN osservati fil-firien sham. Leżjonijiet aċċettabbli kienu definiti bħala li jilħqu l-kriterju ta 'telf ta' 50% ta 'ċelluli fl-ATN, b'minimu ta' 25% għal kull emisfera. Dan huwa konsistenti mal-kriterji tal-leżjoni ATN fi studji preċedenti (Mitchell & Dalrymple-Alford, 2005, 2006; Perryet al., 2018).

2.9.3|Zif268 immunoistokimika

Sezzjonijiet li jżommu f'wiċċ l-ilma ġew ipproċessati b'mod simili għal NeuN, iżda inkubati f'antikorp primarju poliklonali tal-fenek Zif268 (Egr-1; 1:1000 Cat# sc-110; Santa CruzBiotechnology, USA) għal 72 siegħa f' 4 C f'PBSTx b'1% NGS, segwit minn inkubazzjoni f'antikorp sekondarju tal-mogħoż antifenek bijotinilat (1:1000: Vector LaboratoriesBA-1000) matul il-lejl f'PBSTx u 1% NGS.

Wara l-viżwalizzazzjoni DAB (18-il minuta), it-tbajja’ taċ-ċelluli pożittivi ta’ Zif268-f’kull reġjun ta’ interess ġiet fotografata b’objettiv 10 b’mikroskopju tad-dawl (Leica, il-Ġermanja). Inkisbu għadd awtomatizzat taċ-ċelloli permezz ta’ImageJ ( NIH, USA) bl-istess mod bħaċ-ċelloli NeuNpositive, ħlief iċ-ċirkolarità ġiet stabbilita għal 0.65–1.0.

L-għadd ta' ċelloli Zif268-pożittivi għar-reġjuni kollha użaw l-istess algoritmu ta' limitu, b'bejn żewġ u sitt sezzjonijiet għal kull reġjun ta' interess f'kull far ikkwantifikat. Intuża l-għadd medju ta' ċelluli Zif268-pożittivi għal kull mm2 tul is-sezzjonijiet (miż-żewġ emisferi) f'reġjun ta' interess.

2.10|Analiżi tad-dejta

Twettqet ANOVA bl-użu ta' Statistica (v13; Dell Inc.) biex jiġu ttestjati differenzi medji fl-erba' gruppi ta' firien (Sham-No Trace, Sham-Trace, ATN-No Trace u ATNTrace). Fatturi ta 'miżuri ripetuti ġew miżjuda għal jiem (RAM u diskriminazzjoni sempliċi), blokki ta' provi (kompiti assoċjati flimkien), u għadd ta 'Zif268 f'reġjuni jew sottoreġjuni ta' interess relatati.

L-ANOVA kemm għall-kompiti ta 'RAM u ta' diskriminazzjoni sempliċi qabbel erba 'gruppi biex jikkonferma li ż-żewġ gruppi ta' leżjoni Sham u żewġ gruppi ta 'leżjoni ATN kienu konsistenti ma' xulxin, iżda innota li ma kien hemm l-ebda komponent ta 'traċċa fir-RAM jew kompiti ta' diskriminazzjoni sempliċi. Kemm għal diskriminazzjoni sempliċi kif ukoll għal kompiti assoċjati f'pari fir-runway, intużat trasformazzjoni reċiproka tad-dejta tal-latency fi provi individwali biex tiġi żgurata l-omoġenità tal-varjanza.

Fi kwalunkwe jum tat-test mogħti, il-latenzi trasformati ġġeneraw latenza medja għal kull waħda mis-sitt provi mhux ippremjati u s-sitt provi ppremjati. Għall-kompiti ta' diskriminazzjoni sempliċi, analiznajna l-punteġġ medju tad-differenza fil-latenza (il-medja tal-provi ppremjati nieqsa l-medja tal-provi mhux ippremjati) iżda mhux il-provi ppremjati u mhux ippremjati separatament minħabba nuqqas ta' ħażna tad-dejta.

It-tliet miżuri ta 'latenza kienu disponibbli għall-kompiti tal-memorja assoċjati f'pari (provi mhux ippremjati, provi ppremjati u differenza ta' latenza). Biex nikkunsidraw paraguni multipli u biex nibbilanċjaw l-iżbalji tat-Tip I u tat-Tip II, użajna l-livell ta’ sinifikat ta’ p < 0.02 għal analiżi tal-imġiba peress li kien hemm tliet miżuri relatati fil-kompitu assoċjat ma’ par (provi mhux ippremjati, provi ppremjati). u differenza ta' latenza medja).

Kien hemm sitt analiżi primarji għal reġjuni ta 'interess għall-espressjoni ta' Zif268, is-sinifikat f'dawn l-analiżi kien stabbilit għal p < 0.01. It-testijiet Posthoc Newman–Keuls (NK) evalwaw id-differenzi bejn il-gruppi. Intużat analiżi sempliċi tal-effetti ewlenin meta kien hemm interazzjonijiet sinifikanti li jinvolvu fatturi ta' miżuri ripetuti.

3|RIŻULTATI

3.1|Verifika tal-leżjoni

Kollha minbarra wieħed mit-18-il firien b'leżjonijiet ATN issodisfaw il-kriterju apriori ta '50% ħsara bilaterali lill-ATN u minimu ta' 25% għal kull emisfera. Il-ħsara bilaterali medjana kienet 76% fiż-żewġ gruppi ta' leżjonijiet ATN (firxa: ATN-Nru Traċċa, 61%-93%; ATN-Traċċa, 63%-93%; Figura 2). Il-far eskluż kellu leżjoni sodisfaċenti f'emisfera waħda biss (48% totali, 75% tax-xellug u 20% tal-lemin).

Il-Figura 2d turi li l-għadd ta' NeuN għan-newroni ATN fil-firien b'leżjoni ATN (M=3388, SD=2024) kienu kollha ferm taħt il-valuri misjuba fil-firien b'leżjoni finta (M=15, 339, SD=1065; dan l-għadd kien simili għal dak irrapportat minn Frost et al., 2020). Tmienja mis-17-il fer tal-leżjoni (erbgħa fil-grupp Trace u erbgħa fil-grupp No-Trace) ma kellhom l-ebda ħsara la lin-nuklei medjodorsali tal-thalamus (MD) jew reunions/rhomboid (Re/Rh), u kien hemm relattivament ftit ħsara lil dawn l-istrutturi f'disa' firien li fadal b'leżjonijiet.

Meta seħħet ħsara lill-MD, kien fl-aspetti ta 'quddiem li jinsabu ħdejn l-ATN. Għalhekk, il-ħsara MD ġiet evalwata minn bejn wieħed u ieħor {{0}}.72 sa +2.10 mm minn Bregma, fejn varjat minn 0% sa 41% ta’ telf ta’ ċelloli madwar l-intier kollu. grupp (medjan=21%). Meta seħħet ħsara Re/Rh, kienet ukoll ħdejn ir-reġjun ATN, għalhekk ġiet evalwata bejn wieħed u ieħor 1.08 sa 2.04 mm minn Bregma, fejn varja minn 0% sa 33% (medjan=6%). Innota li dawn il-valuri ta 'perċentwali ta' korriment ma jirrappreżentawx ir-reġjuni MD u Re/Rh kollha, minħabba li r-reġjuni ta 'wara taż-żewġ nuklei kienu intatti fil-firien kollha tal-leżjoni ATN.

For more information:1950477648nn@gmail.com