Diskriminazzjoni Kimika u Ġenetika ta' Cistanches Herba Ibbażata fuq UPLC-QTOF/MS u Barcoding tad-DNA

Kuntatt: emily.li@wecistanche.com

Sihao Zheng, Xue Jiang, Labin Wu, Zenghui Wang, u Linfang Huang *

Astratt

ĊistanċiHerba (Rou Cong Rong), magħrufa bħala "ġinseng tad-deżert", għandha effett kurattiv impressjonanti fuq is-saħħa u n-nutrizzjoni, speċjalment fit-tisħiħ tal-kliewi biex issaħħaħ il-yang. Madankollu, iż-żewġ oriġini tal-pjanti ta 'Cistanches Herba,Cistanche deserticolauCistanche tubulosa, ivarjaw f'termini tal-azzjoni farmakoloġika ukimikakomponenti. Biex tiddiskrimina l-oriġini tal-pjanti taĊistanċiHerba, sistema ta 'metodu kombinat ta'kimikauġenetiku–It-teknoloġija UPLC-QTOF/MS u l-barcode tad-DNA – l-ewwel ġew impjegati f’dan l-istudju. Ir-riżultati indikaw li tliet komposti markaturi potenzjali (isomer ta 'campneoside II, cistanoside C, u cistanoside A) inkisbu biex jiddiskriminaw iż-żewġ oriġini permezz ta' analiżi PCA u OPLS-DA. Il-barcode tad-DNA ppermettiet li tiddistingwi żewġ oriġini b'mod preċiż. Siġra NJ wriet li żewġ oriġini miġbura f'żewġ clades. Is-sejbiet tagħna juru li ż-żewġ oriġini ta 'ĊistanċiHerba jippossjedi differentikimikakompożizzjonijiet uġenetikuvarjazzjonijiet. Din hija l-ewwel evalwazzjoni rrappurtata ta’ żewġ oriġini ta’Cistanches Herba, u s-sejba se tiffaċilita l-kontroll tal-kwalità u l-applikazzjoni klinika tagħha.

Ikklikkja hawn biex tikseb aktar informazzjoni dwar Cistanche

Introduzzjoni

ĊistanċiHerba (Rou Cong Rong), magħrufa bħala "ġinseng tad-deżert", toriġina minn zkuk sukkulenti mnixxfin ta'Cistanchedeserticola YC Ma u Cistanche tubulosa (Schrenk) Wig skond il-Farmakopea Ċiniża (edizzjoni 2010), u hija popolari għat-tonifikazzjoni tagħha tal-kliewi-yin, li tibbenefika l-essenza tal-ħajja u l-musrana rilassata. Bħalissa, Cistanches Herba hija mqassma prinċipalment f'deżerti niexfa u sħan fil-majjistral taċ-Ċina, partikolarment fil-provinċji ta 'Xinjiang u Inner Mongolia. Madankollu, iż-żewġ oriġini ta 'Cistanches Herba huma differenti f'termini ta' attività farmakoloġika tagħhom ukimikakomponenti. Tu et al. investiga d-decoction ta’ tlietaCistanchespeċi (C. deserticola, C. tubulosa, Cistanche salsa) u sabet li C. tubulosa wera l-inqas effett fil-mudell tal-ġurdien b'defiċjenza Yang [1]. Zhang et al. qabbel l-attività farmakoloġika bejn C. deserticola, C. tubulosa, u C. salsa, u sabet li dawn l-ispeċi kellhom funzjonijiet mediċinali bħal tolleranza kontra l-għeja u l-ipoksja, iżda mhux bl-istess mod [2]. Riċerka preċedenti rrappurtat il-kimikakomponent u indikat id-differenza takimikakomponent u kontenut għall-oriġini tal-pjanti taĊistanċiHerba [3]. Fir-rigward tal-applikazzjoni klinika u ċ-ċirkolazzjoni tas-suq, bħala toniku, C. tubulosa intuża tradizzjonalment bħala aġent li jippromwovi ċ-ċirkolazzjoni tad-demm u fit-trattament ta 'impotenza, sterilità, lumbago, dgħjufija tal-ġisem fil-Ġappun [4]–[8].

Konsegwentement, huwa ta’ sinifikat kbir li jiġu diskriminati żewġ oriġini ta’ĊistanċiHerba għall-kontroll tal-kwalità u l-applikazzjoni klinika. Madankollu, m'hemm l-ebda fokus ta 'riċerka fuq id-diskriminazzjoni ta' żewġ oriġini ta 'Cistanches Herba. Ħafna metodi riċerkati, inklużi mikroskopija, ultravjola, u skoperta infra-aħmar, metodu ta 'repetizzjonijiet ta' sekwenza inter-sempliċi ntużaw biex jidentifikaw il-ġeneru ta 'Cistanches, iżda mhux biss għal żewġ oriġini speċjalment [9]–[20]. Hawnhekk, aħna flimkien utilizzatikimikau tekniki molekulari biex jiddistingwu żewġ oriġini ta 'ĊistanċiHerba, UPLC-QTOF/MS (kromatografija likwida ultra-prestazzjoni flimkien ma 'spettrometrija tal-massa tal-ħin tat-titjira quadrupole) u barcoding tad-DNA. UPLC-QTOF/MS jipprovdi informazzjoni aktar malajr u b'mod effiċjenti meta mqabbel ma 'tekniki oħra. Is-selettività u s-sensittività għolja ta 'UPLC-QTOF/MS irriżultaw fl-applikazzjoni tagħha kemm għal analiżi kwantitattiva kif ukoll kwalitattiva, kif ukoll fl-analiżi tal-metaboliti u l-identifikazzjoni ta' komposti kumplessi fil-Mediċina Tradizzjonali Ċiniża [21]–[22]. Analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA) u projezzjoni ortogonali għal analiżi diskriminanti ta 'struttura moħbija (OPLSDA) huma żviluppati wkoll biex jidentifikaw komposti ta' markatur potenzjali. Barcode tad-DNA, teknoloġija ta 'markatur molekulari aktar faċli u universali, juża framment tad-DNA biex jidentifika speċi jew ġeneri. Huwa oġġettiv, aktar preċiż, u aktar faċli biex jitwettaq minn metodi ta 'identifikazzjoni tradizzjonali u teknoloġiji oħra ta' markatur molekulari. Barra minn hekk, id-DNA barcoding ġie applikat b'suċċess biex jiġu identifikati annimali u pjanti, inklużi pjanti mediċinali [23]–[26].

L-għan ta’ din ir-riċerka huwa li tiġi stabbilita sistema ta’ metodu xjentifiku, UPLC-QTOF/MS magħquda u barcoding tad-DNA, għad-diskriminazzjoni ta’ żewġ oriġini tal-pjanti ta’ĊistanċiHerba.

Materjali u metodi

Dikjarazzjoni etika

Aħna nikkonfermaw li l-istudji fuq il-post ma involvewx speċi fil-periklu jew protetti. Il-koordinati tal-GPS ġew inklużi fl-informazzjoni tal-kampjun, jekk jogħġbok ara t-tabella 1."

Tabella 1 Kampjuni ta'Cistanchedeserticola u Cistanche tubulosa.

WLMQ fisser belt Wu Lu Mu Qi; GJH fisser Gan Jia Hu; HBKSEMG fisser Hoboksar Mongol Awtonoma County; KLMY fisser belt Ke La Ma Yi; BDJLSM fisser Badain Jaran Deżert; ALSZQ kienet tfisser Alxa Left Banner; DSX fisser kontea Dong San; CL kienet tfisser il-kontea ta’ Ce Le; MF kienet tfisser il-kontea ta’ Min Feng; HT fisser kontea He Tian.

Materjali tal-pjanti u reaġenti

Zkuk sukkulenti taĊistanċiHerba nġabret mir-reġjuni tad-deżert selvaġġ fil-Mongolja ta 'ġewwa, il-Provinċji ta' Qinghai, ir-Reġjun Awtonomu ta 'Xinjiang Uygur, ir-Repubblika Popolari taċ-Ċina (Tabella 1) f'Mejju 2012. Il-kampjuni tar-riċerka nġabru kollha f'reġjuni tad-deżert selvaġġ, mhux f'art privata, fejn ma kienu meħtieġa l-ebda permessi speċifiċi. L-identitajiet botaniċi taz-zkuk ġew ikkonfermati minn Dr Linfang Huang. Kampjuni ta’ vawċers ġew depożitati fl-Istitut tal-Iżvilupp tal-Pjanti Mediċinali. Aċetonitrile ta 'grad ta' kromatografija likwida ta 'prestazzjoni għolja (HPLC) (Merck KGaA, Darmstadt, il-Ġermanja) u aċidu formiku (Tedia, USA) ġew utilizzati għall-analiżi UPLC. L-ilma dejonizzat ġie purifikat bl-użu ta 'sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Kollha l-oħrakimiċikienu ta’ grad analitiku.

Preparazzjoni tal-kampjun

ĊistanċiKampjuni ta' Herba (1.0 g, 65-malji) ġew trasferiti fi flask koniku ta' 50-mL, u ġew miżjuda 50 mL ta' 70 fil-mija metanol. Wara t-tixrib għal 30 min, saret ultrasonikazzjoni (35 kHz) f'temperatura tal-kamra għal 30 min. Wara ċ-ċentrifugazzjoni f'10,000 rev/min għal 10 min, is-supernatant inħażen f'4 gradi u ffiltrat minn membrana ta' 0.22-μm qabel l-injezzjoni fis-sistema UPLC-QTOF/MS għall-analiżi.

UPLC-QTOF/MS

Għall-analiżi UPLC, intużaw is-sistemi/parametri li ġejjin: Sistema Waters Acquity (Waters) mgħammra b'pompa binarja ta' konsenja tas-solvent, auto-sampler u PDA detector konness ma' stazzjon tad-dejta Waters Empower 2; ultrasonikazzjoni (250 W, 50 kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Zhejiang, iċ-Ċina); u mudell ta' bilanċ analitiku elettroniku AB135-2 (Mettler-Toledo., Greifensee, Zurich, l-Isvizzera). Kolonna Waters Acquity UPLC BEH C18 (1.7 µm, 2.1×100 mm, Waters) u kolonna ta' protezzjoni Waters C18 (l-istess materjal, ilmijiet) ġew użati u miżmuma fi 30 grad. Il-fażi mobbli kienet 0.1 fil-mija soluzzjoni milwiema ta 'aċidu formiku (A) u aċetonitrile (B) bi programm gradjent kif ġej: 0-3 min, 10-22 fil-mija B; 3–4 min, 22–23 fil-mija B; 4–6 min, 23–35 fil-mija B; 6–8 min, 35–37 fil-mija B; 8–11 min, 37–42 fil-mija B; 11–12 min, 42–48 fil-mija B; 12-15 min, 48 fil-mija –50 fil-mija B b'rata ta 'fluss ta' 0.3 mL/min. Il-volum tal-injezzjoni kien 5 µL.

L-analiżi UPLC/MS saret fuq sistema QTOF Synapt G2 HDMS (Waters, Manchester, UK) mgħammra b'sors ta 'jonizzazzjoni elettrospray (ESI) operat fil-modalità ta' jone negattiv. N2 intuża bħala l-gass tad-desolvation. It-temperatura tad-desolvazzjoni ġiet issettjata għal 45{{10}} grad b'rata ta 'fluss ta' 800 L/h, u t-temperatura tas-sors ġiet issettjata għal 120 grad. Il-vultaġġi kapillari u tal-koni ġew issettjati għal 2500 u 40 V, rispettivament. Id-dejta nġabret bejn 50–1200 Da b'ħin ta' skanjar ta' 0.1-s u dewmien ta' interskanjar ta' 0.01-s fuq ħin ta' analiżi ta' 15-min. L-argon intuża bħala l-gass tal-ħabta fi pressjoni ta '7.06661023 Pa. Id-dejta kollha tal-MS inġabret bl-użu tas-sistema LockSpray biex tiżgura l-eżattezza u r-riproduċibilità tal-massa. Il-jone [MH]- ta 'leucine-enkephalin f'm/z 554.2615 intuża bħala l-massa tal-lock fil-mod ESI negattiv.

Data UPLC-QTOF/MS għalĊistanċiKampjuni ta' Herba ġew analizzati biex jiġu identifikati varjabbli diskriminanti potenzjali. Is-sejba tal-ogħla livelli, l-allinjament u l-iffiltrar tad-dejta mhux ipproċessata ES twettqu bl-użu tal-maniġer tal-applikazzjonijiet Marker Lynx, verżjoni 4.1 (Waters, Manchester, UK). Il-parametri użati kienu kif ġej: ħin ta' żamma (tR) ta' 0–15 min, il-massa ta' 50–1200 Da, tolleranza ta' ħin ta' żamma ta' 0.02 min, u massa tolleranza ta '0.02 Da. Intużaw tliet kampjuni replikati miġbura minn kull post ġeografiku (n = 3). Total ta '6, 339 varjabbli intużaw biex jinħoloq il-mudell.

Barcode tad-DNA: estrazzjoni tad-DNA, amplifikazzjoni tal-PCR, u sekwenzar

Kampjuni meħuda minn zkuk imnixxfin imlaħħam ta 'C. deserticola u C. tubulosa (30 mg) ġew jingħorok għal 2 minuti bi frekwenza ta' 30 r/s. Id-DNA ġie estratt skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur (Tiangen). Speċifikament, il-protokoll ġie modifikat b'tali mod li l-kloroform ġie sostitwit b'taħlita ta 'kloroform: alkoħol isoamyl (24∶1 fl-istess volum), u soluzzjoni buffer GP2 b'isopropanol (l-istess volum). It-trab jingħorok tpoġġa f'tubi eppendorf ta '1.5 ml, żied 700 µL 65 grad imsaħħan minn qabel GP1 u 1 µL -mercaptoethanol biex jitħallat bl-użu ta' vortiċi għal 10-20 s, u inkubat għal 60 minuta f'65 grad; Żieda ta '700 µL taħlita ta' kloroform: alkoħol isoamyl (24∶1), ċentrifuga għal 5 minuti f'12000 rpm (∼13400×g); Pipetta s-supernatant għal tubu ġdid, żid 700 µL isopropanol, ħallat għal 15–20 minuta; Ibdel it-taħlita kollha fil-kolonna spin CB3 u ċċentrifuga għal 40 s f'12000 rpm; Armi l-filtrat u żżid 500 µL GD (iżżid etanol anidru kwantitattiv qabel l-użu), ċentrifuga f'12000 rpm għal 40 s; jarmi l-filtrat u żżid 700 µL PW (iżżid etanol anidru kwantitattiv qabel l-użu) biex taħsel il-membrana, ċentrifuga għal 40 s f'12000 rpm; Armi l-filtrat u żżid 500 µL PW, ċentrifuga għal 40 s f'12000 rpm; Armi l-filtrat u ċċentrifuga għal 2 minuti f'12000 rpm biex tneħħi l-buffer tal-ħasil residwu PW; It-trasferiment tal-kolonna spin CB3 f'tubu eppendorf nadif ta' 1.5 ml, u t-tnixxif f'temperatura tal-kamra għal 3–5 minuti; Iċċentrifuga għal 2 minuti f'12000 rpm biex tikseb id-DNA totali. Primers għal polymerase chain reaction (PCR) kienu bbażati fuq sekwenzi rrappurtati qabel [4], [5]. Taħlitiet ta' reazzjoni tal-PCR kien fihom 2-μL mudell tad-DNA, 8.5-μL ddH2O, 12.{5-μL 2× Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co., China), 1/{ {57}}μL 'l quddiem/reverse (F/R) primers (2.5 µM), f'volum finali ta' 25 µL. L-amplifikazzjoni tal-PCR saret kif deskritt minn Kress et al. [4]. Il-primer tar-reazzjoni tal-PCR kienu fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (5′-3′) u rev ​​TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (5′-3′). Il-prodotti tal-PCR ġew separati u skoperti permezz ta 'elettroforesi tal-ġel agarose 1 fil-mija. Il-prodotti tal-PCR ġew ippurifikati skont il-protokoll tal-manifattur u suġġetti direttament għal sekwenzar.

Allinjament u analiżi tas-sekwenza

Is-sekwenzi ITS u ITS2 inġabru mid-database GenBank. Is-sekwenzi mis-sekwenzjar tal-kampjuni ġew sottomessi għad-database tal-GenBank (In-numri ta 'Adeżjoni kienu elenkati fit-tabella 1), immuntati b'CodonCode Aligner 3.7.1 (CodonCode Co., USA), u allinjati bl-użu ta' ClustalW. Kimura 2-Distanzi tal-parametri (K2P), kontenut GC tal-bażi, u siġar Neighbor-joining (NJ) ġew ikkalkulati u mibnija bl-użu tal-MEGA 5.05 bil-metodu Bootstrap (kampjunar mill-ġdid 1000) u l-mudell K2P [27]. Gap tal-barcoding (reġjun spacer li kien iffurmat bejn intra- u inter-speċifikuġenetikuvarjazzjonijiet) u l-effiċjenza tal-identifikazzjoni (l-abbiltà tal-identifikazzjoni għat-tqabbil tal-barcodes differenti) ġew imfassla u kkalkulati abbażi tal-metodu rrappurtat minn Meyer u Paulay [28].

Riżultati

Assenjazzjoni tal-quċċata tentattiva mill-UPLC-QTOF/MS

Kromatogrammi rappreżentattivi ta' C. deserticola u C. tubulosa minn żoni ta' produzzjoni differenti huma murija fil-Figura 1. Il-kromatogramma tal-marki tas-swaba' indikat xebh fostĊistanċiKampjuni tal-Ħerba. Ġew skoperti total ta '23 quċċata tal-massa kwalifikata u 16-il quċċata ġew identifikati billi tqabbel il-ħinijiet ta' żamma u l-ispettri tal-massa ma 'dawk irrappurtati qabel (Tabella 2) [29]–[35]. Il-qċaċet 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22, u 23 ġew identifikati b’mod tentattiv bħala cistanoside F, mussaenoside acide, cistanbuloside C1/C2, campneoside II , isomer ta’ campneoside II, echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside, syringalide A-3′{- -L-rhamnopyranoside, cistanoside C, 2′-acetylacteosid, osmanthuside B, cistanoside D, tubuloside B, u cistancinenside A, rispettivament.Kimikakostitwenti ġew determinati li huma primarjament phenylethanoid glycosides (PhGs), filwaqt li kompost wieħed, mussaenoside acide, kien iridoid polysaccharide. PhGs huma l-komposti attivi ewlenin f'termini ta 'trattament ta' defiċjenza tal-kliewi, u effetti antiossidanti u newroprotettivi [36].

Figura 1 Il-kromatogrammi rappreżentattivi ta' C. deserticola u C. tubulosa.

Fuq in-naħa tax-xellug kien hemm il-kromatogrammi ta’ C. deserticola miġbura minn postijiet differenti; in-naħa tal-lemin kienet il-kromatogrammi ta 'C. tubulosa miġbura minn postijiet differenti. Din il-figura turi d-differenzi bejn dawn iż-żewġ oriġini filkimikaprofili.

Tabella 2 Komposti identifikati b'mod tentattiv minn C. deserticola u C. tubulosa.

PCA ta' C. deserticola u C. tubulosa

PCA kien impjegat biex jiddistingwi kampjuni ta 'speċi ta' pjanti differenti. Il-PCA huwa metodu ta' analiżi tad-dejta multivarjata mhux sorveljat li għandu l-għan li jħaffef ix-xebh u/jew id-differenzi fi ħdan id-dejta multivarjata tal-kompożizzjoni tal-metaboliti sekondarji [37]. Il-mudell PCA b'żewġ komponenti ammonta b'mod kumulattiv għal 46.04 fil-mija tal-varjazzjoni (PC1, 36.43 fil-mija; PC2, 9.61 fil-mija). Il-Figura 2 turi li 24 kampjun ġew miġbura f'żewġ gruppi fil-punteġġi PCA mpinġija skont l-oriġini tal-ispeċi, li jindika li l-kompożizzjoni kimika ta 'C. deserticola u C. tubulosa kienet differenti b'mod sinifikanti.

Figura 2 PCA ta 'C. deserticola u C. tubulosa.

Dawn il-kampjuni ġew miġbura f'żewġ gruppi skont l-oriġini tal-ispeċi tagħhom, li indika li l-kompożizzjoni kimika bejn C. deserticola u C. tubulosa kienet differenti b'mod sinifikanti.

OPLS-DA u identifikazzjoni tal-markatur

Biex tidentifika l-potenzjalkimikamarkaturi għad-diskriminazzjoni taż-żewġ speċi, l-S-plot ta 'OPLS-DA ġie ġġenerat (Fig. 3). Fl-S-plot, kull punt jirrappreżenta par joni wieħed tR–m/z. L-assi X u Y jirrappreżentaw il-kontribuzzjoni u l-kunfidenza tal-jone, rispettivament; iktar ma tkun 'il bogħod id-distanza tal-par tal-jone t R–m/z minn żero, iktar ikun kbir il-kontribuzzjoni/kunfidenza ta' dan il-jone għad-differenza bejn iż-żewġ gruppi. Għalhekk, il-jone tR–m/z li jipponta lejn iż-żewġt itruf tal-'S' jirrappreżenta l-markaturi karatteristiċi bl-ogħla kunfidenza f'kull grupp.

Figura 3 OPLS-DA (S-plot) ta 'C. deserticola u C. tubulosa.

Plott wieħed jirrappreżenta par joni tR–m/z wieħed. Dawn il-plottijiet kwadri kienu l-kimikajoni markatur misjuba li jiddistingwu żewġ oriġini. Il-plots kwadri fit-tielet kwadrant kienu l-joni li jimmarkaw kimiċi b'kontribuzzjoni u kunfidenza ogħla f'C. deserticola, u l-plots kwadri fl-ewwel kwadrant kienu l-joni li jimmarkaw kimiċi b'kontribuzzjoni u kunfidenza ogħla f'C. tubulosa.

Ir-riżultati OPLS-DA wrew li UPLC-QTOF/MS jistgħu jintużaw biex jiddistingwu C.deserticolaminn C.tubulosa(Fig. 3). Total ta’ sitt markaturi kredibbli u sinifikanti ġew determinati biex jiffaċilitaw id-diskriminazzjoni ta’ dawn il-gruppi (Tabella 3). L-identitajiet ta 'tliet markaturi potenzjali ġew assenjati b'mod tentattiv. Il-komponenti korrelatati ma 'dawn it-tliet jonji ġew identifikati b'mod tentattiv bħala iżomeri ta' campneoside II, cistanoside C, u cistanoside A. Il-komposti markaturi a, b, u c jistgħu jintużaw biex jiddistingwu ż-żewġ speċi ta 'pjanti, bħala l-intensitajiet tal-jone ta' a u b fi C.deserticolakien ogħla milli f'C. tubulosa (Fig. 4A, 4B), u l-markatur c seta 'jinstab f'C. tubulosa, iżda mhux f'C. deserticola (Fig. 4C).

Figura 4 Intensitajiet tal-joni tal-markaturi a, b u c.

L-intensitajiet tal-jone tal-jone markatur a u b f'C. deserticola kienu ogħla minn dak f'C. Tubulosa, u l-jone markatur c seta' jiġi skopert f'C. tubulosa, iżda ma setax jiġi skopert f'C. deserticola.

Tabella 3 Marer tR–m/z joni pari fl-S-plot.

Barcode tad-DNA: informazzjoni tas-sekwenza u effiċjenza ta 'identifikazzjoni

Informazzjoni dwar is-sekwenza kienet murija fit-Tabella 4. Il-medjaġenetikuid-distanza ta' psbA-trnH (0.1732) kienet akbar miż-żewġ reġjuni l-oħra (0.{0740, 0.1197) b'mod sinifikanti. Il-kontenut medju ta' GC ta' psbA-trnH (20.64 fil-mija) kien iżgħar miż-żewġ reġjuni l-oħra (55.00 fil-mija, 55.00 fil-mija). Għalkemm ir-rata ta 'suċċess ta' ITS u ITS2 ma nkisbetx f'dan l-istudju, ir-reġjun psbA-trnH wettaq tajjeb fl-amplifikazzjoni u s-sekwenzjar tal-PCR (100 fil-mija, 87.23 fil-mija). L-effiċjenza tal-identifikazzjoni nkisbet permezz tal-analiżi BLAST1 u l-metodu tal-eqreb distanza, u rriflettiet prinċipalment ir-rata ta 'suċċess tal-barcodes. Ir-reġjun psbA-trnH kien ogħla b'mod ċar miż-żewġ barcodes l-oħra fl-effiċjenza ta 'identifikazzjoni bbażata fuq żewġ metodi. In-nuqqas ta 'sekwenzi huwa x'aktarx ir-raġuni li r-reġjun tal-ITS wera effiċjenza ta' identifikazzjoni ta '100 fil-mija bbażata fuq il-metodu BLAST1, u 0 ibbażat fuq il-metodu tal-eqreb distanza.

Tabella 4 Effiċjenza ta' identifikazzjoni ta' tliet loci bl-użu ta' metodi differenti għall-identifikazzjoni tal-ispeċi.

Analiżi ta 'diverġenza ġenetika bl-użu ta' sitt parametri

Intużaw sitt parametri biex janalizzaw il-varjazzjoni intra-speċifika u d-diverġenza interspeċifika bl-użu ta 'tliet barcodes (Tabella 5). Id-differenza sinifikanti bejn varjazzjonijiet inter-u intra-speċifiċi kienet indikattiva tal-utilità tal-barcodes tad-DNA. Hawnhekk, id-distanza interspeċifika minima ta 'tliet barcodes kienet kollha ogħla mid-distanza intraspeċifika massima. Barra minn hekk, ir-reġjun psbA-trnH kellu distanza intraspeċifika massima akbar u distanza interspeċifika medja miż-żewġ barcodes l-oħra, li jindika li r-reġjun psbA-trnH wettaq tajjeb fid-diskriminazzjoni taż-żewġ oriġini ta 'ĊistanċiHerba.

Tabella 5 Analiżi tad-diverġenza speċifika interbygenus u l-varjazzjoni intra-speċifika ta 'tliet barcodes.

Analiżi tad-distakk tal-barcode biex tidentifika C. deserticola u C. tubulosa....

Id-distakk tal-barcode jippreżenta l-varjazzjoni notevoli ta 'inter-u intra-speċi u juri distribuzzjonijiet separati, li ma jikkoinċidux bejn kampjuni intra- u inter-speċifiċi. F'dan l-istudju (Fig. 5), il-firxa tad-distanza ġiet issettjata għal 0–0.45, minħabba li l-akbar distanza K2P ta' psbA-trnH bejn C. deserticola u C. tubulosa kienet qrib {{ {11}}.45. It-tliet barcodes urew lakuni distinti fid-distribuzzjonijiet ta 'varjazzjoni intra- u inter-speċifiċi. Barra minn hekk, id-distakk ta 'psbA-trnH kien ikbar b'mod sinifikanti miż-żewġ barcodes l-oħra. Għalhekk, ir-reġjun psbA-trnH jista 'jkun barcode ideali għad-diskriminazzjoni ta' żewġ oriġiniĊistanċiHerba.

Figura 5 Distribuzzjoni relattiva ta 'diverġenza inter-speċifiku u varjazzjoni intra-speċifika fi tliet barcodes.

Tliet barcodes ta 'ITS2, ITS, psbA-trnH ġew analizzati għad-distribuzzjoni relattiva ta' diverġenza inter-speċifika u varjazzjoni intra-speċifika bejn C. deserticola u C. tubulosa ibbażata fuq il-K2Pġenetikudistanza.

Siġra li tgħaqqad il-ġirien (NJ).

Siġra NJ turi r-relazzjoni bejn l-ispeċi u tiffaċilita d-determinazzjoni tar-raggruppament tagħhom. F'dan l-istudju, is-siġra NJ ta 'tliet barcodes inbniet ibbażata fuq il-mudell K2P (Fig. 6). Ir-riżultati wrew li żewġ oriġini ta 'ĊistanċiHerba miġbura f'żewġ kladi separatament. Għalhekk, is-siġra NJ iddistingwit b'mod ċar bejnC. deserticola u C. tubulosa.

Figura 6 Siġra NJ ta 'C. deserticola u C. tubulosa bi tliet barcodes.

Inbnew siġra NJ ta 'C. deserticola u C. tubulosa bi tliet barcodes. Il-punteġġi bootstrap (1000 replika) huma murija (Akbar minn jew ugwali għal 50 fil-mija) għal kull fergħa. C. deserticola u C. tubulosa kienu miġbura f'żewġ kladi b'mod ċar.

Diskussjoni u Konklużjonijiet

ĊistanċiHerba huwa materjal mediċinali importanti li jintuża b'mod komuni biex jitrawwem il-komunità Ażjatika [38]. Madankollu, iż-żewġ oriġini ta 'Cistanches Herba, C. deserticola u C. tubulosa, għandhom kompożizzjonijiet kimiċi u attivitajiet farmakoloġiċi differenti rispettivament. Fl-istess ħin, iż-żewġ oriġini huma differenti fl-applikazzjoni klinika u fis-suq tal-komoditajiet. Il-klassifikazzjoni ta'Cistanchehuwa konfuż u sostituti massivi u adulteranti għargħar is-suq minħabba n-nuqqas ta 'riżorsi u ambjent ta' tkabbir speċjali għal Cistanches Herba. Il-Ġenus ta 'Cistanche huwa aċċettat li jinkludi erba' speċi u varjant wieħed: C. deserticola, C. tubulosa, C. Sinensis, C. salsa, u C. salsa var. albiflora [39]. Riċerkaturi fil-Ġappun qiesu l-oriġini ta’ Cistanches Herba bħala C. salsa [40]–[43], filwaqt li kien identifikat bħala C. deserticola minn Tu [44]–[46]. Għalhekk, huwa konfuż fil-klassifikazzjoni ta 'Cistanche, u huwa diffiċli li jiġu diskriminati ż-żewġ oriġini ta' Cistanches Herba.

Metodi tradizzjonali għall-kontroll tal-kwalità taĊistanċiHerba huma identifikazzjoni morfoloġika [47], [48], identifikazzjoni mikroskopika [49] u TLC (Thin-Layer Chromatography) [50], [51], FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) [14], HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ) [52], [53]. Metodi morfoloġiċi u mikroskopiċi jistgħu faċilment jiddifferenzjaw speċi minn ġeneri jew familji differenti li għandhom differenzi kbar fil-karatteristiċi morfoloġiċi u mikroskopiċi, filwaqt li huwa diffiċli li tiddistingwi speċi aħwa. TLC u FTIR jistgħu jiddiskriminaw b'mod ċar speċi li għandhom tipi differenti ta' kompożizzjonijiet kimiċi, filwaqt li huwa diffiċli li jiġi ddeterminat il-kimikakomponent u kontenut. L-HPLC tintuża prinċipalment biex tiddistingwi speċi b'differentikimikakontenut tal-elementi, madankollu, il-ħin tal-analiżi huwa itwal u s-sensittività hija relattivament aktar baxxa meta mqabbla mal-UPLC. B'mod korrispondenti, it-teknoloġija UPLC-QTOF/MS kienet aktar mgħaġġla u aktar preċiża fid-determinazzjoni tal-kompożizzjoni kimika minn metodi kimiċi oħra. Metodi ta 'identifikazzjoni molekulari juru tajjeb fid-diskriminazzjoni bbażata fuq il-ġenetikuvarjazzjoni, bħal SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) [54], AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) [55], [56]. Madankollu, dawn il-metodi molekulari mhumiex faċli biex joperaw u mhumiex universali. B'mod korrispondenti, il-barcode tad-DNA jista 'jiddiskrimina l-ispeċi b'mod aktar universali, malajr u b'mod preċiż minn metodi molekulari oħra. Għall-ispeċi mill-istess ġeneru u qribġenetikurelazzjoni, dawk il-metodi waħedhom jistgħu ma jaħdmux tajjeb fl-identifikazzjoni. Hawnhekk, aħna kkombinaw UPLC-QTOF/MS u DNA barcoding fl-identifikazzjoni ta 'C. deserticola u C. tubulosa u evalwajna l-markaturi kimiċi u molekulari li jippermettulhom li jiġu diskriminati. Ġew skoperti 23 quċċata tal-massa kwalifikata u 16 ġew identifikati bl-użu ta 'UPLC-QTOF/MS, u tliet komposti ta' markatur potenzjali nstabu l-ewwelnett li jiffaċilitaw id-diskriminazzjoni ta 'żewġ oriġini mill-analiżi PCA u OPLS-DA. Barra minn hekk, erba 'indikaturi ġew evalwati mit-teknoloġija tal-barcode tad-DNA f'termini tal-kapaċità tagħhom li jiddifferenzjaw żewġ oriġini: effiċjenza fl-identifikazzjoni, effiċjenza ġenetika, distakk tal-barcode, u analiżi tas-siġar NJ. Ir-reġjun psbA-trnH kien appoġġjat bħala barcode tad-DNA adattat għad-diskriminazzjoni ta 'C. deserticola u C. tubulosa.

Bħala konklużjoni, aħna l-ewwel stabbilixxa molekulari ġdid ukimikametodu analiżi magħquda għal diskriminazzjoni u kontroll tal-kwalità f'żewġ oriġini ta 'ĊistanċiHerba. Barcode tad-DNA jista 'jiddiskrimina żewġ oriġini fiġenetikuvarjazzjoni u jawtentika l-ispeċi b'mod universali u preċiż; It-teknoloġija UPLC-QTOF/MS tista' tanalizza l-kompożizzjoni kimika biex tevalwa l-kwalità tal-materjali mediċinali malajr u b'mod preċiż. Il-metodu magħqud tal-barcode tad-DNA u t-teknoloġija UPLC-QTOF/MS jiggarantixxu l-identifikazzjoni ta 'sorsi multipli ta' materjali mediċinali b'mod aktar preċiż u xjentifikament u jista 'jservi bħala metodu għall-identifikazzjoni ta' speċi jew ġeneri oħra ta 'konfużjoni fil-klassifikazzjoni.

Dikjarazzjoni ta' Finanzjament

L-istudju kien appoġġjat minn għotjiet mill-Fondazzjoni Nazzjonali tax-Xjenza Naturali taċ-Ċina (Nru. 81274013, websajt: www.nsfc.gov.cn). Il-finanzjaturi ma kellhom l-ebda rwol fid-disinn tal-istudju, il-ġbir tad-dejta, u l-analiżi, id-deċiżjoni li jippubblikaw, jew il-preparazzjoni tal-manuskritt.

Referenzi

1. Tu PF, Lou ZC, Li SC, Wang CS, Jiang WY, et al. (1996) Tqabbil dwar in-nutrizzjoni tal-kliewi u yang li jsaħħaħ l-effikaċja ta 'tliet speċi differenti ta' herbadistanzi. Ġurnal ta 'materjali mediċinali Ċiniżi 19: 420-421. [Google Scholar]

2. Zhang Y, Wu H, Wang SN, Zheng HC (1994) Tqabbil fuq il-funzjonijiet ta 'nutrizzjoni tal-kliewi u ta' tisħiħ yang ta 'tliet speċi differenti ta' cistanches herba. China Journal of Chinese Materia Medica 19: 169–171. [PubMed] [Google Scholar]

3. Lei L, Song ZH, Tu PF (2003) Avvanzi fir-riċerka ta 'kimikakostitwenti fil-pjanti taCistancheHoffing. et Link. Drogi Tradizzjonali u Veġetali Ċiniżi 34: 473–476. [Google Scholar]

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S, et al. (2006) Phenylethanoid oligoglycosides u oligosugars acylated b'attività vasorelaxant minn Cistanche tubulosa. Bioorg Med Chem 14: 7468–7475. [PubMed] [Google Scholar]

5. Shimoda H, Tanaka J, Takahara Y, Takemoto K, Shan SJ, et al. (2009) L-effetti ipokolesterolemiċi tal-estratt ta 'Cistanche tubulosa, mediċina mhux raffinata tradizzjonali Ċiniża, fil-ġrieden. Am J Chin Med 37: 1125–1138. [PubMed] [Google Scholar]

6. Yamada P, Iijima R, Han J, Shigemori H, Yokota S, et al. (2010) Effett inibitorju ta 'acteoside iżolat minnCistanchetubulosa fuqkimikarilaxx ta' medjatur u produzzjoni ta' ċitokini infjammatorji minn ċelluli RBL-2H3 u KU812. Planta Med, 1512–1518. [PubMed]

7. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Matsuda H, et al. (2010) Acylate phenylethanoid oligoglycosides b'attività epatoprotective mill-pjanta tad-deżertCistanchetubulosa. Bioorg Med Chem 18: 1882–1890. [PubMed] [Google Scholar]

8. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, et al. (2010) Iridoid u acyclic monoterpene glycosides, kankanosides L, M, N, O, u P minn Cistanche tubulosa. Chem Pharm Bull (Tokyo) 58: 1403–1407. [PubMed] [Google Scholar]

9. He YP, Yin ZZ, Tu PF, Lou ZC (1997) Identifikazzjoni u stħarriġ ta 'droga mhux raffinata kummerċjali ta' herba cistanchis. Ġurnal ta 'materjali mediċinali Ċiniżi 20: 117-122. [PubMed] [Google Scholar]

10. Zhu SY (2001) Identifikazzjoni farmakognostika ta 'Cistanche tubulosa speċi konfuża ta'Cistanchedeserticola. Ġurnal ta 'materjali mediċinali Ċiniżi 24: 24-25. [PubMed] [Google Scholar]

11. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG, et al. (2013) Identifikazzjoni mikroskopika ta 'tliet herba cistanches f'Xin Jiang. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881–883. [Google Scholar]

12. Zhang M, Fu XL, Wang SY (2004) Identifikazzjoni mikroskopika ta 'Herba Cistanches kummerċjali b'teknika ta' immaġini diġitali. Ġurnal ta 'materjali mediċinali Ċiniżi 27: 400-402. [PubMed] [Google Scholar]

13. Li JS, Yao ZQ, Yu MX (2000) Studju dwar l-identifikazzjoni tal-herbacistanchesu adulteranti. Shizhen Medicine and Materia Research 11: 317–318. [Google Scholar]

14. Xu R, Sun SQ, Liu YG, Chen J, Liu TN, et al. (2010) Studji spettroskopiċi FTIR u 2D-IR fuq sorsi differenti ta' herbacistanches. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 30: 897–900. [PubMed] [Google Scholar]

15. Chen J, Sun SQ, Xu R, Liu YG, Yu J, et al. (2009) Identifikazzjoni ta 'Cistanche deserticola minn Boschniakla rossica u Cynomorium songaricum bl-użu ta' FTIR u spettroskopija IR ta 'korrelazzjoni bidimensjonali. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 29: 1502–1507. [PubMed] [Google Scholar]

16. Yang HC, Xia PX, Huang JX, Yuan HZ (2008) Studju dwar marki tas-swaba' HPLC ta'Cistanchedeserticola. Pharm Care & Res 8: 255–257. [Google Scholar]

17. Xie JN, Zhao MB, Wu FW, Tu PF (2005) Marki tas-swaba kromatografiċi ta 'Cistanche deserticola minn HPLC. Drogi Tradizzjonali u Veġetali Ċiniżi 36: 268–271. [Google Scholar]

18. Han JP, Song JY, Liu C, Chen J, Qian J, et al. (2010) Identifikazzjoni taCistanchespeċi (Orobanchaceae) ibbażata fuq sekwenzi tar-reġjun interġeniku plastid psbA-trnH. Acta Pharmaceutica Sinica 45: 126–130. [PubMed] [Google Scholar]

19. Shi HM, Wang J, Wang MY, Tu PF, Li XB (2009) Identification of Cistanche Species byKimikau Inter-sempliċi Sekwenza Irrepeti marki tas-swaba. Biol. Pharm. Bull. 32: 142–146. [PubMed] [Google Scholar]

20. Han LF, Yiadom MB, Liu EW, Zhang Y, Li W, et al. (2012) Karatterizzazzjoni Strutturali u Identifikazzjoni ta 'Glycosides Phenylethanoid minnĊistanċideserticola YC Ma minn UHPLC/ESI-QTOF- MS/MS. Analiżi fitokimika 23: 668–676. [PubMed] [Google Scholar]

21. Jiang X, Huang LF, Wu LB, Wang ZH, Chen SL (2012) UPLC-QTOF/MS Analiżi ta 'Alkalojdi f'Cotis Chinensis Franch ipproċessat tradizzjonali. Evid Based Complement Alternat Med 2012: 942384. [Artiklu PMC ħieles] [PubMed] [Google Scholar]

22. Wu LB, Jiang X, Huang LF, Chen SL (2013) Investigazzjoni tat-Teknoloġija ta 'l-Ipproċessar tal-werqa ta' Loquat (Eriobotrya japonica) permezz ta 'Kromatografija Likwida Ultra-Performance- Quadrupole Spettrometrija tal-Massa tal-Ħin tat-Titjira Magħquda mal-Kimometrija. PLoS ONE 8: e64178. [Artiklu bla PMC] [PubMed] [Google Scholar]

23. Hebert PD, Ratnasingham S, Waard JR (2003) Barcoding tal-ħajja tal-annimali: cytochrome c oxidase subunit 1 divergence fost speċi relatati mill-qrib. Proc. R. Soc. Londra. B. 270 Suppl 1S96–99. [Artiklu bla PMC] [PubMed] [Google Scholar]

24. Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, Waard JR (2003) Identifikazzjonijiet bijoloġiċi permezz tal-barcodes tad-DNA. Proc Biol Sci., 270 313: 321. [artiklu b'xejn PMC] [PubMed] [Google Scholar]

25. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005) Użu ta 'barcodes tad-DNA biex jiġu identifikati pjanti tal-fjuri. Proc Natl Acad Sci. 102: 8369–8374. [Artiklu bla PMC] [PubMed] [Google Scholar]

26. Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J, et al. (2010) Validazzjoni tar-reġjun ITS2 bħala barcode tad-DNA ġdid għall-identifikazzjoni ta 'speċi ta' pjanti mediċinali. PLoS One 5: e8613. [Artiklu bla PMC] [PubMed] [Google Scholar]

27. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, et al. (2011) MEGA5: Evoluzzjonarju MolekulariĠenetikaAnaliżi bl-użu ta 'Probabbiltà Massima, Distanza Evoluttiva, u Metodi ta' Parsimonija Massima. Mol Biol Evol 28: 2731–2739. [Artiklu bla PMC] [PubMed] [Google Scholar]

28. Meyer CP, Paulay G (2005) DNA barcoding: żball rati bbażati fuq kampjunar komprensiv. PLoS Biol 3: e422. [Artiklu bla PMC] [PubMed] [Google Scholar]

29. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Studji dwar il-Kostitwenti Cistanchis Herba. IV. Iżolament u Strutturi ta 'Żewġ Phenylpropanoid Glycosides Ġodda, Cistanosides C u D. Chem Pharm Bull 32: 3880-3885. [Google Scholar]

30. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studji dwar il-Kostitwenti ta' Cistanchis Herba. VI. Iżolament u Strutturi ta' Glycoside Iridoid Ġdid, 6-Deoxyeatalpol. Chem Pharm Bull 33: 3645–3650. [Google Scholar]

31. Jiang Y, Li SP, Wang YT, Chen XJ, Tu PF (2009) Differenzjazzjoni ta’ HerbaĊistanċibil-marki tas-swaba' bi kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja–detezzjoni ta' array dajowd–spettrometrija tal-massa. Ġurnal tal-Kromatografija A 1216: 2156–2162. [PubMed] [Google Scholar]

32. Han LF, Boakye YM, Liu E, Zhang Y, Li W, et al. (2012) Karatterizzazzjoni Strutturali u Identifikazzjoni ta 'Glycosides Phenylethanoid minn Cistanches deserticola YC Ma minn UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. Phytochem Anal 23: 668–676. [PubMed] [Google Scholar]

33. Li L, Tsao R, Yang R, Liu CM, Young JC, et al. (2008) Iżolament u purifikazzjoni ta 'phenylethanoid glycosides minn Cistanche deserticola permezz ta' kromatografija kontra-kurrent b'veloċità għolja. Kimika tal-Ikel 108: 702–710. [PubMed] [Google Scholar]

34. Lu DY, Zhang JY, Yang ZY, Liu HM, Li S, et al. (2013) Analiżi kwantitattiva taĊistanċiHerba bl-użu ta 'kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja flimkien ma 'skoperta ta' diode array u spettrometrija tal-massa b'riżoluzzjoni għolja flimkien ma 'metodi kimometriċi. J Sep Sci 26: 1945–1952. [PubMed] [Google Scholar]

35. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studji dwar il-Kostitwenti Cistanchis Herba. V. Iżolament u Strutturi ta 'Żewġ Phenylpropanoid Glycosides Ġodda, Cistanoside E u F. Chem Pharm Bull 33: 1452–1457. [Google Scholar]

36. Jiang Y, Tu PF (2009) Analiżi ta 'kimikakostitwenti fl-ispeċi Cistanche. J Chromatogr A 1216: 1970–1979. [PubMed] [Google Scholar]

37. Masssart DL, Vandeginste BGM, Deming SN, Michotte Y, Kaufman L (1988) Data handling fix-xjenza u t-teknoloġija. Kimometriċi: ktieb ta 'test.

38. Huang LF, Zheng SH, Wu LB, Jiang X, Chen SL (2014) Ekotipi ta’Cistanchedeserticola ibbażata fuqkimikakompożizzjoni u karatteristiċi molekulari. SCIENTIA SINICA Vitae 44: 318–328. [Google Scholar]

39. Tu PF, Jiang Y, Guo YH (2011) riċerka u żvilupp tal-industrija tal-herba cistanches. Ġurnal tal-farmaċewtika Ċiniża 46: 882–887. [Google Scholar]

40. Kobayashi H, Oguchi H, Takizawa, Miyase T, Ueno A, et al. (1987) phenylethanoid glycosides ġodda minnCistanchetubulosa (SCHRENK) Ganċ. f. I. Chem Pharm Bull 35: 3309–3314. [Google Scholar]

41. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Studji dwar il-kostitwenti ta' Cistanchis herba III. Chem Pharm Bull 32: 3009–3014. [Google Scholar]

42. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Studji dwar il-kostitwenti ta' Cistanchis herba IV. Chem Pharm Bull 32: 3880–3885. [Google Scholar]

43. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studji dwar il-kostitwenti ta' Cistanchis herba VI. Chem Pharm Bull 33: 3645–3650. [Google Scholar]

44. Moriya A, Tu PF, Karasawa D, Arima H, Deyama T, et al. (1995) Studji farmakognostiċi ta 'Cistanchis Herba (I). Nat Med 49: 383–393. [Google Scholar]

45. Moriya A, Tu PF, Karasawa D, Arima H, Deyama T, et al. (1995) Studji Phamacognostical ta 'Cistanchis Herba (II). Nat Med 49: 394–400. [Google Scholar]

46. ​​Liu XM, Jiang Y, Sun YQ, Xu XW, Tu PF (2011) Studju dwarkimikakostitwenti ta'Cistanchedeserticola. Chin Pharm J 46: 1053–1058. [Google Scholar]

47. Gu XY, Wang X (2013) Identifikazzjoni bejn il-Pjanti Oriġinali ta 'RouCongRong u Varjetajiet Konfużi. Ġurnal tal-Punent tal-Mediċina Tradizzjonali Ċiniża 26: 17-18. [Google Scholar]

48. Zhang HJ, Ding XF Identifikazzjoni ta 'Cistanche deserticola u adulteranti. Shizhen Medicine and Materia Research, 183.

49. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG, et al. (2013) riċerka ta 'identifikazzjoni mikroskopika ta' tliet tipi ta 'Cistanche oriġinaw mill-provinċja ta' Xinjiang. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881–883. [Google Scholar]

50. Huang M, Liu G (2004) Riċerka ta 'identifikazzjoni ta'Cistanchedeserticola u Cynomorium songaricum. HuBei ġurnal tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża. 26: 54–55. [Google Scholar]

51. Liu YG, Xu R, Wang W, Liu TN, Chen J (2009) Progress tar-riċerka dwar il-kontroll tal-kwalità u l-valutazzjoni ta 'Cistanche deserticola YC Ma. Xjenza u Teknoloġija Dinjija- Modernizzazzjoni tal-Mediċina Tradizzjonali Ċiniża. 11: 439–444. [Google Scholar]

52. Ma ZG (2011) Differenzjazzjoni ta 'Cistanche Sinensis G.Beck u Herba Cistanches ipproċessati minn marki tas-swaba' HPLC. Chin. Pharm J. 46: 899–902. [Google Scholar]

53. Huang LX, Wang YE, Shi MH, Jia XG, Xie X, et al. (2011) Riċerka tal-marki tas-swaba HPLC taCistanchetubulosa. Xinjiang ġurnal tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża. 29: 54–56. [Google Scholar]

54. Chen P, Guo YH, Wang BM, Zhai ZX (2006) SDS-PAGE ta 'proteini solubbli f'erba' pjanti ta 'Cistanche Hoffing. Et Link. Drogi Tradizzjonali u Veġetali Ċiniżi 37: 1399–1402. [Google Scholar]

55. Xu R, Chen J, Chen SL, Liu TN, Na R (2007) AFLP Analiżi dwar id-diversità tar-riżorsi tal-ġermoplasma f'Cistanche deserticola kkultivata u selvaġġa. Drogi Tradizzjonali u Veġetali Ċiniżi 38: 1703–1707. [Google Scholar]

56. Gan XY, Li M, Ma HA, Song YX (2011) Studju dwar varjazzjoni intraspeċifika ta'Cistanchedeserticola YCMa bl-użu ta' markaturi molekulari AFLP. Ortikultura tat-Tramuntana, 141–143.

Artikoli minn PLoS ONE huma pprovduti hawnhekk bil-kortesija tal-Librerija Pubblika tax-Xjenza

PLoS Wieħed. 2014; 9(5): e98061.

Ippubblikat online 2014 Mejju 22. doi: 10.1371/journal.pone.0098061

PMCID: PMC4031141

PMID: 24854031