Metodu Effettiv Biex Titratta Fibrożi Renali
Mar 17, 2022
għal aktar informazzjoni:ali.ma@wecistanche.com
Parti Ⅰ: Il-proteina tar-retikulu endoplasmiku TXNDC5 tippromwovi l-fibrożi renali billi tinforza s-sinjalar TGF fil-fibroblasti tal-kliewi
Yen-Ting Chen, Pei-Yu Jhao & et al.
Introduzzjoni
Fibrożi renali, ikkaratterizzat minn tubulointerstizjalifibrożiu sklerożi glomerulari, hija manifestazzjoni patoloġika komuni tal-biċċa l-kbira, jekk mhux kollha, tipi ta 'kronikakliewimard(CKD)(1). Il-progressjoni tarenalifibrożif’pazjenti b’CKD twassal għat-telf gradwali ta’kliewifunzjoni, li fl-aħħar mill-aħħar jista' jirriżulta f'mard tal-kliewi fl-aħħar stadju (ESRD) li jeħtieġ dijaliżi jewkliewitrapjant (2). Filwaqt li determinanti molekulari multipli u mogħdijiet intwerew li jikkontribwixxu għall-proċess ta 'fibrożi tal-kliewi, trasformazzjoni tal-fattur tat-tkabbir-beta (TGF- ) ġeneralment jitqies bħala r-regolatur ewlieni tal-fibroġenesi renali (3). Wara korriment lill-kliewi, ċelluli epiteljali tubulari b'età ta 'ħsara (TECs) huma arrestati fil-fażi G2/M u inixxu ammonti kbar ta' TGF- , li jikkawżaw l-attivazzjoni u t-trasformazzjoni ta 'fibroblasti tal-kliewi adjaċenti f'myofibroblasts (4-6). Myofibroblasts attivati, li jidhru mill-espressjoni ta 'a-smooth muscle actin (an SMA), huma proliferattivi ħafna u jipproduċu proteini ta' matriċi extraċellulari (ECM) bħall-collagen fibrillari, elastin, fibronectin, u CCN2 (komunement magħrufa bħala fattur tat-tkabbir tat-tessut konnettiv, CTGF)(7,8). Matul l-istadji bikrija tal-ħsara fil-kliewi,fibrożiinbeda bħala rispons fiżjoloġiku adattiv u awtolimitat li jgħin fit-tiswija tat-tessut u jżomm l-integrità strutturali (9). Madankollu, wara ħsara kronika ripetuta tal-kliewi, l-attivazzjoni u l-proliferazzjoni ta 'myofibroblasts jippersistu, li jirriżultaw fi produzzjoni u akkumulazzjoni eċċessiva ta' ECM, li jwasslu għal telf ta 'parenkima tal-kliewi funzjonali u fl-aħħar mill-aħħar, insuffiċjenza tal-kliewi (1O,11).
Ikklikkja għal Cistanche para que sirve għall-mard tal-kliewi
Minkejja l-avvanzi fil-mediċina moderna, ftit terapiji kliniċi huma ppruvati effettivi kontrafibrożi tal-kliewi. Inibituri tal-enżimi li jikkonvertu anġjotensin (ACEIs) u imblokkaturi tar-riċetturi tal-anġjotensin (ARBs), pereżempju, intwerew li jnaqqsu l-proteinurja, itejburenalifibrożi, u tnaqqas il-progress tal-CKD (12,13). Pentoxifylline, inibitur tal-fosfodiesterase mhux speċifiku, min-naħa l-oħra, intwera li jinibixxi l-espressjoni ECM u CCN2 indotta minn TGF- 1-, li jwassal għal tubulointerstizjali attenwat.fibrożi(14). L-użu ta 'ACEIs u ARBs, madankollu, huwa limitat mill-effetti ipotensivi tagħhom u l-effetti avversi potenzjali bħall-iperkalemija. Barra minn hekk, la l-ACELs/ARBs u lanqas it-trattament tal-pentoxifylline ma jistgħu jwaqqfu l-progressjoni ta’renalifibrożiu CKD(15,16). Huwa, għalhekk, imperattiv li jiġu identifikati medjaturi ġodda jew mogħdijiet li huma kritiċi għall-patoġenesi tarenalifibrożibiex tiżviluppa terapewtiċi effettivi kontra CKD (mard kroniku tal-kliewi).
Riċentement, identifikajna dominju ta 'thioredoxin li fih 5 (TXNDC5), proteina arrikkita bil-fibroblasti residenti ER bl-attività enżima ta' proteina disulfide isomerażi (PDI), bħala medjatur kritiku tal-qalb.fibrożi(17). Aħna wrejna li TXNDC5 eċċessiv jippromwovi l-iżvilupp tal-qalbfibrożipermezz ta' attivazzjoni ta' fibroblast kardijaku dipendenti fuq ir-redox u produzzjoni ta' ECM. It-tħassir ġenetiku ta 'Txndc5 ittejjeb il-qalbfibrożiu disfunzjoni kontrattili indotta minn agonist fil-ġrieden (17). Ibbażat fuq ir-rwol essenzjali osservat ta’ TXNDC5 fil-fibroġenesi mijokardijaka, ipotizzajna li TXNDC5 jista’ jikkontribwixxi wkoll b’mod kritiku għall-iżvilupp tat-tessut.fibrożif'organi mhux kardijaċi, partikolarmentfibrożi tal-kliewi.
Fl-istudju preżenti, urejna li TXNDC5 kien regolat ħafna kemm fil-kliewi fibrotiċi tal-bniedem kif ukoll tal-ġrieden, speċifikament fil-fibroblasti tal-kliewi li jxerrdu l-collagen. It-tħassir globali ta 'Txndc5 attenwat b'mod notevoli l-estent ta'renalifibrożif'mudelli multipli ta 'ġrieden ta' ħsara fil-kliewi. B'mod mekkaniku, urejna li TXNDC5 eċċessiv, indott minn TGF- 1 permezz tal-mogħdija tal-istress ER dipendenti ATF6-, iżidrenalifibrożibilli tippromwovi l-attivazzjoni/proliferazzjoni tal-fibroblast tal-kliewi u l-produzzjoni tal-ECM permezz ta 'stabbilizzazzjoni u regolazzjoni 'l fuq ta' TGF-riċettur tat-tip I (TGFBR1). B'mod importanti, urejna li l-induzzjoni ta' tħassir speċifiku għall-fibroblasti ta' Txndc5 tejbet b'mod effettiv l-iżvilupp u l-progressjoni ta'fibrożi tal-kliewiindott minn diversi tipi ta 'korrimenti fil-ġrieden, li jissuġġerixxi li l-immirar ta' TXNDC5 jista 'jkun approċċ ġdid u b'saħħtu biex jittrattarenalifibrożiu jippreservawkliewifunzjoni.
Figura 1. TXNDC5 kien irregolat b'mod sinifikanti fil-kliewi fibrotiċi tal-ġrieden u kampjuni tal-kliewi minn pazjenti b'CKD( mard kroniku tal-kliewi).
(A) Tbajja IHC (n=3) u (B) immunoblots (n=6) wrew li l-espressjoni tal-proteina ta 'TXNDC5 kienet regolata 'l fuq fil-kliewi fibrotiċi tal-ġrieden indotti minn UUO jew uIRI, meta mqabbla ma' kliewi kontralaterali (CL) . Skala bar: 50 μm.
(C) RT-PCR kwantitattiv wera li t-traskrizzjoni ta 'Txndc5 kienet regolata 'l fuq fil-kliewi fibrotiċi tal-ġrieden indotti minn UUO u uIRI (n=4-7).
(D) Analiżi mill-ġdid tad-dejta tal-mikroarray fuq kampjuni tal-kliewi umani minn pazjenti b'CKD (GSE66494) wrew li TXNDC5, COL3A1, u FN1 kienu regolati b'mod sinifikanti fit-tessuti tal-kliewi minn pazjenti CKD (kontroll b'saħħtu n=8, CKD n {{{ 6}}). Għal A–C, id-dejta hija rappreżentattiva ta' 3 repliki sperimentali indipendenti jew aktar.
Għall-pannelli kollha, id-dejta hija ppreżentata bħala medja ± SEM. *P < {{0}}.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001="" b'2-test="" t-naħat="" (a–c)="" jew="" mann-="" test="" ta'="" whitney="">
Riżultati
TXNDC5 kien regolat b'mod sinifikanti fil-kliewi fibrotiċi tal-bniedem u tal-ġrieden. Biex tinvestiga l-involviment potenzjali ta 'TXNDC5 fil-patoġenesi ta'fibrożi tal-kliewi, aħna l-ewwel iddeterminajna l-livelli ta 'espressjoni tal-proteini tagħha fit-tessuti tal-kliewi tal-ġrieden fibrotiċi indotti minn ostruzzjoni ureteral unilaterali (UUO), korriment unilaterali ta' iskemija-riperfużjoni (uIRI), jew bl-amministrazzjoni ta 'aċidu foliku (FA). Studji immunoistokimika wrew żidiet notevoli fl-intensità tat-tbajja’ TXNDC5 fis-sezzjonijiet tal-kliewi mit-3 mudelli tal-ġrieden kollha ta’renalifibrożi(Figura 1A u Figura Supplimentari 1A; materjal supplimentari disponibbli onlajn ma 'dan l-artikolu; https://doi.org/10.1172/JCI143645DS1). Immunoblotting u traskrizzjoni inversa kwantitattiva PCR(RT-PCR) wrew ukoll upregulation sinifikanti tal-livelli ta 'espressjoni ta' proteina (Figura 1B) u traskrizzjoni (Figura 1C u Figura Supplimentari 1B) ta 'TXNDC5 fil-kliewi tal-ġurdien fibrotiċi. B'mod konsistenti ma' dawn ir-riżultati, analiżi mill-ġdid tad-dejta tal-mikroarray miksuba minn kampjuni ta' bijopsija renali ta' pazjenti b'CKD (GSE66494) (18) wriet li l-livelli ta' espressjoni ta' TXNDC5 (b'2.24 darbiet, P<0.001), as="" well="" as="" of="" markers="" for="">fibrożi tal-kliewibħal COL3A1 u FN, żdiedu wkoll b'mod sinifikanti fil-kampjuni tal-kliewi minn pazjenti b'CKD meta mqabbla ma 'dawk minn kontrolli b'saħħithom (Figura 1D u Figura Supplimentari 1C). Meħuda flimkien, l-upregulation osservata tal-espressjoni TXNDC5/Txndc5 fil-kliewi fibrotiċi tal-bniedem/ġurdien u l-korrelazzjoni pożittiva tagħha mal-ġeni fibroġeniċi tal-proteina ECM jissuġġerixxu rwol potenzjali ta’ TXNDC5 fil-patoġenesi ta’fibrożi tal-kliewi.
Figura 2. TXNDC5 kien regolat ħafna f'fibroblasti tal-kliewi, iżda mhux f'TECs, ċelloli endoteljali, jew podoċiti, tal-kliewi fibrotiċi.
(A u C) JEKK it-tbajja’ ta’ TXNDC5 (aħmar) fuq sezzjonijiet ta’ kliewi fibrotiċi indotti minn UUO fil-ġrieden Col1a 1-GFPTg wera li TXNDC5 kien espress prinċipalment f’fibroblasti tal-kliewi li jagħtu l-kollaġen (aħdar), kemm fil-kortiċi renali kif ukoll fil-medulla (n=6). In-nuklei taċ-ċelluli kienu mtebbgħin b'DAPI (blu). Skala bar: 100 μm.
(B) IF tbajja ta' TXNDC5 (aħdar) fuq is-sezzjoni tal-kliewi fibrotiċi indotti minn UUO fil-ġrieden Cdh16-Cre, NPHS2-Cre, u Tie2-Cre/ERT2 tdTomato. In-nuklei taċ-ċelluli kienu mtebbgħin b'DAPI (blu). Skala bar: 100 μm.
(D) Grafika pie biex turi l-proporzjon ta 'ċelluli TXNDC5 flimkien ma' tipi differenti ta 'ċelluli tal-kliewi fil-kliewi fibrotiċi indotti minn UUO.
Id-dejta hija rappreżentattiva ta' 3 repliki sperimentali indipendenti jew aktar. Id-dejta f'C hija ppreżentata bħala medja ± SEM.
TXNDC5 kien arrikkit ħafna f'fibroblasti tal-kliewi li jagħtu l-kollaġen fil-kliewi fibrotiċi. Tipi multipli ta 'ċelluli tal-kliewi ġew implikati fil-proċess tal-fibrogenesis tal-kliewi. Wara korrimenti fil-kliewi, fibroblasti renali residenti (19) u perivaskulari (20) intwerew li jiddifferenzjaw f'myofibroblasts attivi u jirriżultaw fl-akkumulazzjoni ta 'ECM. Ġew irrappurtati wkoll TECs u ċelloli endoteljali li jikkontribwixxu għall-iżvilupp ta 'fibrożi tal-kliewipermezz ta’ transizzjoni epiteljali u endoteljali għal mesenkimali, rispettivament (10,21). Biex tiddetermina t-tipi ta’ ċelluli fejn TXNDC5 kien espress matul il-proċess tal-kliewifibrożi, linji multipli tal-ġurdien reporter li jippermettu t-tikkettar tal-fluworexxenza tal-fibroblasti tal-kliewi(Colla1-GFP', GFP immexxi minn Collal enhancer/promoter, ref.22), TECs(Cdh16-Cre ROSA26- tdTomato), ċelluli endoteljali (Tie2-Cre/ERT2 ROSA26-tdTomato), u podoċiti (NPHS2-Cre ROSA26-tdTomato) kienu suġġetti għal UUO, uIRI, jew Trattament FA biex jinduċifibrożi tal-kliewi. Tbajja bl-immunofluworexxenza (IF) tas-sezzjonijiet tal-kliewi minn dawn l-annimali żvelat li TXNDC5 kien notevolment upregulated u kolokalizat ħafna ma 'fibroblasti tal-kliewi pożittivi għall-GFP u li jagħtu l-kollaġen fil-kliewi tal-ġrieden fibrotiċi indotti minn UUO (81 fil-mija) (Figura 2, A u C) , uIRI (76.8 fil-mija), u trattament FA (73.4 fil-mija) (Figura Supplimentari 2, A u B).Fi kliewi fibrotiċi indotti minn UUO, TXNDC5 kien espress sporadikament biss f'TECs (5.94 fil-mija), podoċiti (0.63 fil-mija ), u ċelluli endoteljali (2.05 fil-mija ) (Figura 2, B u D). Analiżi ta 'flowcytometry ta' fibroblasts iżolati minn kliewi tal-ġrieden soġġetti għal UUO żvelat espansjoni notevoli fil-fibroblasti tal-kliewi TXNDC5 * kif ukoll upregulation sinifikanti ta 'TXNDC5 f'dawn iċ-ċelloli, meta mqabbla ma 'dawk minn kliewi ta' kontroll kontralaterali (Figura Supplimentari 2C). L-arrikkiment qawwi osservat ta’ TXNDC5 fil-fibroblasti tal-kliewi f’fibrotiċi jissuġġerixxi li TXNDC5 jista’ jikkontribwixxi għalfibrożi tal-kliewibilli tirregola l-attività/imġieba ta’ dawn iċ-ċelloli fibroġeniċi li jxerrdu l-kollaġen.
TXNDC5 kien kemm essenzjali kif ukoll biżżejjed biex jinduċi l-attivazzjoni, il-proliferazzjoni u l-produzzjoni tal-ECM tal-fibroblasti tal-kliewi. Sussegwentement, iddeterminajna r-rwol funzjonali ta 'TXNDC5 fil-fibroblasti tal-kliewi. Fibroblasti primarji tal-kliewi umani (HKFs) stimulati b'TGF- 1(10 ng/mL) wrew upregulation qawwija fil-livelli ta' espressjoni tal-proteina (Figura 3A) u traskrizzjoni (Figura 3B) ta' TXNDC5, kif ukoll tal-periostin tal-markatur tal-attivazzjoni tal-fibroblasti u proteini ECM (COL1Al, fibronectin, u CCN2). Knockdown ta' TXNDC5 bi shRNA attenwat b'mod sinifikanti TGF- 1-proteina/mRNA indotta r-regolazzjoni 'l fuq tal-periostin u proteini ECM multipli f'HKFs (Figura 3, A u B). Barra minn hekk, it-trattament TGF1 saħħaħ l-attività proliferattiva ta 'HKFs, li ġiet abrogata kompletament permezz ta' knockdown TXNDC5 (Figura 3D). Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li TXNDC5 huwa essenzjali għall-attivazzjoni, il-proliferazzjoni u l-produzzjoni tal-ECM indotti minn TGF- 1-HKF. L-espressjoni żejda ta 'TXNDC5, min-naħa l-oħra, irriżulta f'regolazzjoni 'l fuq immarkata ta' periostin, COL1A1, u fibronectin (Figura 3C), kif ukoll żieda fl-attività proliferattiva (Figura 3E) f'HKFs. B'mod kollettiv, dawn ir-riżultati juru li TXNDC5, downstream ta' TGF- 1, huwa kemm essenzjali kif ukoll biżżejjed biex jippromwovi l-attivazzjoni, il-proliferazzjoni, u l-produzzjoni tal-ECM tal-fibroblasti tal-kliewi.
Figura 3. Knockdown ta 'attivazzjoni HKF attenwata ta' TGF- 1-indotta u produzzjoni ECM ta 'TXNDC5; espressjoni żejda ta 'TXNDC5 kienet biżżejjed biex tiskatta l-attivazzjoni tal-HKF u l-produzzjoni tal-ECM.
(A) Proteina u (B) livelli ta 'espressjoni ta' traskrizzjoni ta 'markatur ta' attivazzjoni tal-fibroblast (periostin) u proteini ECM (COL1A1, fibronectin, u CCN2) żdiedu fil-kontroll (Scramble) HKFs wara TGF - 1 (10 ng/mL) trattament. Il-knockdown ta 'TXNDC5 attenwat ir-regolazzjoni 'l fuq ta' dawn il-markaturi fibroġeniċi indotti minn TGF - 1 f'HKFs (n=5-10).
(C) L-espressjoni żejda ta 'TXNDC5 kienet biżżejjed biex tinduċi regolazzjoni 'l fuq tal-markatur ta' attivazzjoni tal-fibroblast (Periostin) u proteini ECM (COL1A1, fibronectin) f'HKFs (n=3-10).
(D) It-trattament ta 'TGF- 1 (10 ng/mL) żied l-attività ta' proliferazzjoni ċellulari ta 'HKFs, li ġiet abrogata minn knockdown TXNDC5.
(E) Espressjoni żejda ta 'TXNDC5 żiedet l-attività ta' proliferazzjoni ċellulari ta 'HKFs. F'D u E, n=10. Id-dejta hija rappreżentattiva ta' 3 repliki sperimentali indipendenti jew aktar.
Għall-pannelli kollha, id-dejta hija ppreżentata bħala medja ± SEM. Is-sinifikat statistiku tad-differenzi għal 2 gruppi ġiet iddeterminata b'test t ta' 2-sided u fost 3 gruppi jew aktar ġiet iddeterminata bl-użu ta' 1-mod ANOVA, segwit mit-testijiet post hoc ta' Sidak. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>
Tħassir globali ta' Txndc5 protett kontra l-kliewi b. Biex tiddetermina r-rekwiżit ta 'TXNDC5 fl-iżvilupp ta'fibrożi tal-kliewiin vivo, WT u Tndc5-/ġrieden kienu soġġetti għal trattament UUO, uIRI, u FA. Picrosirius aħmar u t-tbajja trichrome ta 'Masson fuq is-sezzjonijiet tal-kliewi wrew estensivirenalifibrożifil-ġrieden WT wara UUO (Figura 4A), uIRI (Figura 5A), u l-amministrazzjoni ta 'FA (Figura 3A Supplimentari). It-tħassir globali ta 'Txndc5 naqqas b'mod sinifikanti l-estent ta'renalifibrożifit-3 mudelli kollha ta 'ħsara fil-kliewi (Figura 4A, Figura 5A, u Figura Supplimentari 3A).
Figura 4. Tħassir ta 'fibrożi renali attenwata Txndc5 indotta minn UUO.
(A) Tbajja ħamra Picrosirius (top 2 pannelli) u tbajja trichrome ta 'Masson (qiegħ 2 pannelli) ta' sezzjonijiet tal-kliewi minn ġrieden WT u Txndc5-710 ijiem wara UUO. Bar graphs tar-riżultati kwantitattivi ta' Picrosirius aħmar u ż-żoni tat-tbajja trikromju ta' Masson huma murija fuq il-lemin (n=5-10). Skala bar∶ 100 μm.
(B) Immaġini SHG tat-taqsimiet tal-kliewi minn WT u Txndc5-/ġrieden 10 ijiem wara UUO. Ir-riżultati kwantitattivi ta 'żoni pożittivi għall-SHG urew żieda fl-akkumulazzjoni ta' collagen fibrillari (aħdar) f'WT iżda mhux fil-kliewi Txndc5mice wara korriment.
Għal kull waħda mis-sezzjonijiet tal-kliewi immaġni għal SHG, inkisbet immaġini TPEF biex turi l-profil tat-tessut skennjat (kulur aħmar fil-pannelli tal-qiegħ) (n=3). Scale bar: 50 um. (C) Immunoblots wrew livelli ta 'espressjoni ta' proteina ta 'markatur ta' attivazzjoni tal-fibroblast (Periostin) u ECM (COL1A1) fl-estratt tal-kliewi sħaħ minn WT u Txndc5-/ġrieden 10 ijiem wara UUO (n= 3-6). Id-dejta hija rappreżentattiva ta' 3 jew aktar repliki sperimentali indipendenti.
Għall-pannelli kollha, id-dejta hija ppreżentata bħala medja± SEM. Is-sinifikat statistiku tad-differenzi fost 3 gruppi jew aktar ġiet iddeterminata bl-użu ta' 1-mod ANOVA, segwit mit-testijiet post hoc ta' Sidak.**P<><>
Biex tikkwantifika l-kollaġen fibrilari patoġeniku (tip I u II) speċifikament u biex tiġi evitata stima żejda ta 'żoni fibrotiċi b'metodi ta' tbajja tradizzjonali, mikroskopija tat-tieni ġenerazzjoni armonika (SHG), sistema ġdida ta 'immaġni tat-tessut ottiku li tippermetti viżwalizzazzjoni ta' fibrillari, iżda mhux mhux fibrillari, collagen fl-organi fibrotic(23,24), kien impjegat biex jivvaluta l-firxa tafibrożifil-WT u Tndc5 flimkien mal-kliewi tal-ġurdien wara korriment. B'mod konsistenti mar-riżultati msemmija hawn fuq, il-mikroskopija SHG wriet żidiet notevoli fid-depożizzjoni tal-collagen fibrillari fil-kliewi WT wara trattament UUO (Figura 4B), uIRI (Figura 5B), u FA (Figura Supplimentari 3B), li l-firxa tagħhom tnaqqset b'mod sinifikanti f'Txndc{{ 4}}/ġrieden (Figura 4B, Figura 5B, u Figura Supplimentari 3B).
B'mod konsistenti mar-rispons fibrotiku attenwat ta 'wara l-ħsara fil-kliewi Txndc5mouse osservati minn studji tal-immaġini, it-tħassir ta' Tendc5 ttaffi wkoll ir-regolazzjoni 'l fuq tal-ġeni tal-proteini ECM, inklużi Collar, Eln, Fnl, u Ccn2 fil-kliewi tal-ġrieden wara l-ħsara (Figura Supplimentari 3, CE). Immunoblots ta 'lysates tat-tessut kollu tal-kliewi wrew ukoll livell imnaqqas ta' proteina ta 'ECM(COLIA1) u markatur ta' attivazzjoni tal-fibroblast (periostin) f'Txndc5-/ġrieden meta mqabbla ma 'ġrieden WT wara UUO u uIRI (Figura 4C u Figura 5C).
Figura 5. Tħassir tal-fibrożi renali mtejba Txndc5 indotta minn ulRI.
(A) Picrosirius aħmar tbajja (top 2 pannelli) u Masson's trichrome tbajja (qiegħ 2 pannelli) ta 'sezzjonijiet tal-kliewi minn WT u Txndc5-7ġrieden 28 jum wara ulRI.Bar graphs tar-riżultati kwantitattivi ta' Picrosirius aħmar u trikromju ta 'Masson iż-żoni tat-tbajja huma murija fuq il-lemin (n=6). Skala bar∶ 100 μm.
(B) Immaġini SHG tat-taqsimiet tal-kliewi mill-ġrieden WT u Txndc5-28 jum wara ulRI. Ir-riżultati kwantitattivi ta 'żoni pożittivi għall-SHG urew żieda fl-akkumulazzjoni ta' collagen fibrillari (aħdar) f'WT iżda mhux fil-kliewi Txndc5mice wara korriment. Għal kull waħda mis-sezzjonijiet tal-kliewi immaġini għal SHG, inkisbet immaġini TPEF biex turi l-profil tat-tessut skennjat (kulur aħmar fil-pannelli tal-qiegħ) (n=3). Scale bar∶50 μm.
(C) Immunoblots wrew livelli ta 'espressjoni ta' proteina ta 'markatur ta' attivazzjoni tal-fibroblast (Periostin) u ECM (COL1A1) fl-estratt tal-kliewi sħaħ minn WT u Txndc5 / ġrieden 28 jum wara ulRI (n =5-9). Id-dejta hija rappreżentattiva ta' 3 repliki sperimentali indipendenti jew aktar.
Għall-pannelli kollha, id-dejta hija ppreżentata bħala medja ± SEM. Is-sinifikat statistiku tad-differenzi fost 3 jew aktar gruppi ġiet iddeterminata bl-użu ta'1-mod ANOVA, segwit mit-testijiet post hoc ta' Sidak.*P<><><>
Biex tiġi eskluża l-possibbiltà li TXNDC5 espress f’tipi oħra ta’ ċelluli tal-kliewi bħal TECs, podoċiti, u ċelluli endoteljali xorta jistgħu jikkontribwixxu għall-iżvilupp ta’renalifibrożi, aħna iġġeneraw ġrieden knockout kondizzjonali Txndc5 speċifiċi għal TECs (Cdh16-cre*Txcndc5i, jew Txndc5Epeko), podocytes (NPHS2-cre*Txndc5/n, jew Tendc5Podxko), u ċelloli endoteljali (Tie{{{ 7}}cre/ERT2*Tendc5/, jew Txndc5Endo.eko).F'esperimenti li jużaw ġrieden Txndc5Pieko u Txndc5 Poio-cko, Txndc5Wmicewerużat bħala kontrolli; f'esperimenti fuq ġrieden Txndc5EMio-eko, it-tħassir ta 'Txndc5 ġie indott bl-użu ta' tamoxifen kif deskritt fil-Figura 9A, fejn ġrieden Tie2-Cre/ERT2 ittrattati b'tamoxifen intużaw bħala kontrolli. It-tħassir immirat ta' Txndc5 f'TECs, podoċiti jew ċelloli endoteljali, madankollu, ma kellux impatt fuq il-firxa ta'fibrożi tal-kliewiindott minn UUO jew FA (Figura Supplimentari 6, BE). Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li TXNDC5 espress f'TECs, podoċiti, u ċelloli endoteljali jikkontribwixxu ftit, jekk xejn, għall-patoġenesi ta'kliewifibrożi.
It-tħassir ta 'Txndc5 fil-fibroblasti tal-kliewi jipproteġi kontra l-apoptosi TEC bi tweġiba għal ħsara fil-kliewi. Fil-proċess tarenalifibrożi, TECs feruti jitilfu l-funzjoni mitokondrijali u l-polarità apikobażali, segwiti minn apoptożi u mewt taċ-ċelluli (30). Biex tinvestiga jekk it-tħassir ta 'Txndc5 ikollu impatt fuq l-apoptosi ta' TECs bi tweġiba għal korriment, wettaqna tbajja 'TUNEL fuq WT u Txndc5-kilwa tal-ġurdien sezzjonijiet 10 ijiem wara UUO. In-numru ta 'TECs apoptotiċi żdied b'mod sinifikanti fil-kliewi fibrotiċi indotti mill-UUO tal-ġrieden WT, filwaqt li t-tħassir ta' Txndc5 attenwat il-firxa ta 'TECapoptosis. Ġie rrappurtat li fibroblasti tal-kliewi attivati jistgħu jinduċu apoptożi TEC permezz ta 'effetti parakrini (31). Minħabba li Tendc5 bilkemm huwa espress f'TECs, huwa probabbli li l-apoptosi mnaqqsa tat-TEC osservata fil-ġrieden Txndc5-7wara UUO ma kinitx effett awtonomu taċ-ċelluli iżda pjuttost sekondarja għal tnaqqis interstizjali.fibrożiu għalhekk ftit sinjali proapoptotiċi minn fibroblasti tal-kliewi tal-madwar. B'mod konsistenti ma 'din l-ipoteżi, it-tħassir speċifiku tal-fibroblast ta' Txndc5 (Tendc5kO) attenwat l-apoptożi tat-TEC sa punt simili għal dak osservat f'Txndc5-/ġrieden 10 ijiem wara UUO (Supplimentari). B'kuntrast mat-tnaqqis osservat fit-TECapoptosis, in-numru ta' F4/80-makrofaġi pożittivi u ċelluli endoteljali CD{31-pożittivi kienu komparabbli fil-kliewi tal-ġrieden WT u Txndc{5-, bi jew mingħajr UUO, li jissuġġerixxi li t-tħassir ta' Txndc5 ma jkollhiex impatt fuq l-infiltrazzjoni tal-makrofagi jew densità kapillari peritubulari fil-kliewi tal-ġurdien. Meħuda flimkien, din id-dejta tissuġġerixxi li l-effetti reno-protettivi tat-tħassir ta’ Txndc5 jirriżultaw minn interstizjali tubulari mnaqqsa.fibrożiu apoptosi TEC, mingħajr ma taffettwa d-densità kapillari renali jew makrofaġi.
Tħassir indott ta 'Tendc5 fil-fibroblasti renali naqqset il-progressjoni ta' stabbilitfibrożi tal-kliewi. Biex jiġi ddeterminat jekk l-immirar ta 'Txndc5 fil-kliewi jistax ikun ta' benefiċċju meta stabbilitrenalifibrożi, It-tħassir ta’ Txndc5 fil-fibroblasti tal-kliewi kien indott fi ġrieden Txndc5eko 10 ijiem wara UUO, punt ta’ żmien meta estensivrenalifibrożijistgħu jiġu osservati. F'dawn l-esperimenti, ġew użati ġrieden Colla2-Cre ittrattati bit-tamoxifen bħala kontrolli. Kif muri, ġrieden Colla2-Cre u Tcndc5eko kellhom firxa simili tarenalifibrożi10 ijiem wara UUO qabel il-kura b'tamoxifen. Ħdax-il jum wara l-injezzjoni tamoxifen, madankollu, il-firxa tal-fibrożi renali kompliet timxi 'l quddiem fil-ġrieden ta' kontroll (erja fibrotika żdiedet minn 5.1 fil-mija għal 10.6 fil-mija), filwaqt li l-progressjoni ta 'kliewifibrożikien kważi mwaqqaf (żona fibrotika mibdula minn 5.3 fil-mija għal 6.9 fil-mija) fil-ġrieden Txndc5eko. Immunoblotting wera wkoll upregulation attenwata b'mod notevoli ta 'CCN2, periostin, u TGFBR1 fil-ġrieden Txndc5eko meta mqabbla ma' ġrieden ta 'kontroll bejn D10 u D21 wara UUO. Dawn ir-riżultati juru li t-tħassir intervent ta’ Txndc5 fil-fibroblasti tal-kliewi jnaqqas b’mod sinifikanti l-progressjoni ta’fibrożi tal-kliewi, li jissuġġerixxi li l-immirar in vivo ta 'TXNDC5 jista' jkun approċċ terapewtiku ġdid u qawwi biex ittejjebkliewifibrożiu biex inaqqas il-progressjoni tas-CKD.