Alginate Oligosaccharide Ittaffi t-Tixjiħ Kardijaku kkaġunat mid-D-galactose permezz tar-Regolamentazzjoni tal-Funzjoni U l-Integrità tal-Mitokondrija Mijokardijaka fil-Ġrieden

Jekk jogħġbok ikkuntattjaoscar.xiao@wecistanche.comgħal aktar informazzjoni

Astratt

It-tixjiħ huwa fattur ta' riskju kruċjali għall-iżvilupp ta' mard kardjovaskulari relatat mal-età. Għalhekk, il-mekkaniżmi molekulari tat-tixjiħ u interventi ġodda kontra t-tixjiħ jeħtieġ li jiġu studjati fil-fond. Alginate oligosaccharide (AOS) jippossjedi attivitajiet farmakoloġiċi għoljin u effetti ta 'benefiċċju. L-istudju tagħna sar biex jinvestiga jekk AOS jistax jintuża bħala mediċina kontra t-tixjiħ biex ittaffi x-xjuħija tal-car-diac. Ġrieden li qed jixjieħu C57BL/6J indotti minn D-galactose (D-gal) ġew stabbiliti b'injezzjoni taħt il-ġilda ta 'D-gal (200 mg-kg'-d') għal 8 ġimgħat. AOS (50,100 u 150 mg;kg'l.d') ġew amministrati intragastrikament għall-aħħar 4 ġimgħat. Bħala riżultat, AOS evita disfunzjoni kardijaka fi ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal, inkluż frazzjoni ta 'ejection parzjalment ippreservata (EF fil-mija) u tqassir frazzjonali (FS fil-mija).cistanche benefíciosAOS inibit ir-regolazzjoni 'l fuq indotta minn D-gal ta' peptidi natriuretiċi A (ANP), peptide natriuretiku tal-moħħ (BNP) u markaturi ta 'tixjiħ p53 u p21 b'mod dipendenti fuq id-doża. Biex jiġu esplorati aktar il-mekkaniżmi potenzjali li jikkontribwixxu għall-effett protettiv kontra t-tixjiħ tal-AOS, ġie analizzat il-kompromess mitokondrijali relatat mal-età. Id-dejta tagħna indikat li l-AOS itaffu t-tixjiħ kardijaku indott minn D-gal billi tejbet il-biogen-esis mitokondrijali, iżżomm l-integrità mitokondrijali u ttejjeb it-tneħħija effiċjenti ta 'mitokondrija indebolita. AOS naqqas ukoll il-produzzjoni ROS u l-istatus ta 'stress ossidattiv, li, min-naħa tiegħu, inibixxi aktar il-mitokondrija kardijaka milli tinqered. Flimkien, dawn ir-riżultati juru li l-AOS jista’ jkun aġent terapewtiku effettiv biex itaffu t-tixjiħ tal-qalb.

KLIEM EWLENIN

oligosaccharide alġinat, tixjiħ kardijaku, D-galactose, mitokondrija, stress ossidattiv

1|INTRODUZZJONI

It-tixjiħ jista 'jiġi definit b'mod wiesa' bħala l-akkumulazzjoni dipendenti fuq iż-żmien ta 'ħsara ċellulari, li tikkawża t-tnaqqis funzjonali progressiv ta' tessuti u organi.¹ B'mod ġenerali, bidliet fil-qalb relatati mal-età jinkludu prinċipalment ipertrofija ventrikulari tax-xellug, fibrożi mijokardijaka miżjuda u insuffiċjenza kardijaka.Cistanche Estratt Kontra r-RadjazzjoniIt-tixjiħ huwa fattur ta’ riskju kruċjali għall-iżvilupp ta’ mard kardjovaskulari relatat mal-età, li jwassal għal prevalenza akbar ta’ mard kardjovaskulari fil-popolazzjoni li qed tixjieħ.23 Għalhekk, huma meħtieġa b’mod urġenti strateġiji ta’ trattament aktar effettivi għat-trattament tal-insuffiċjenza kardijaka kkawżata mit-tixjiħ. .

Jekk jogħġbok ikklikkja hawn biex tkun taf aktar

L-alġinat huwa polisakkarid naturali derivat mill-alka estratt minn alka kannella. Alginate oligosaccharide(AOS) huwa prodott minn de-polimerizing alginate, li għandu vantaġġi uniċi multipli bħal solubbli fl-ilma, mhux tossiku, mhux immunoġeniku u bijodegradabbli. AOS teżerċita attivitajiet bijoloġiċi promettenti. Dan l-oligosaccharide jippossjedi proprjetajiet newroprotettivi, ipolipidemiċi, anti-ossidattivi, 'anti-infjammatorji,' anti-aggregatorji,' kontra t-tumur,10 kontra l-batterji u immunoregolatorji, " kif ukoll irażżnu l-obeżit๠u attivitajiet ta' prodott aħħari avvanzat ta' glycation (AGE) .4 Notevolment, ma ġew esplorati l-ebda stud-ies l-abbiltà ta 'AOS li jipproteġi kontra tixjiħ kardijaku.

Il-mitokondrija huma organelli b'membrana doppja u jservu funzjonijiet multipli fil-bijoenerġija ċellulari u l-metaboliżmu.14 Il-qalb hija domanda ta 'enerġija għolja u organu ta' kontenut mitokondrijali għoli. Il-mitokondrija tal-qalb jiġġeneraw 90 fil-mija tal-ATP u għandhom rwol vitali fiż-żamma ta 'qalb b'saħħitha.cistanche herbaDisfunzjoni mitokondrijali, li tista 'tħaffef il-proċess ta' tixjiħ fil-mammiferi, hija waħda mill-mekkaniżmi l-aktar importanti ta 'xjuħija. kontroll mill-awtofaġija, tnaqqis fil-potenzjal tal-membrana mitokondrijali (MMP), alterazzjonijiet fid-dinamika mitokondrijali, żieda fil-formazzjoni ta’ speċijiet ta’ ossiġnu reattiv (ROS) u akkumulazzjoni ta’ mutazzjonijiet fid-DNA mitokondrijali (mtDNA).17 Minħabba l-biogen-esis aktar baxx u t-tneħħija mnaqqsa, kombinazzjoni ta 'ħsara miżjuda u tiġdid imnaqqas fil-mitokondrijali tista' eventwalment tikkontribwixxi għall-proċess ta 'tixjiħ.18,17 Barra minn hekk, id-disfunzjoni mitokondrijali progressiva tirriżulta f'żieda fil-produzzjoni ta' ROS u stress ossidattiv, li mbagħad jikkawżaw aktar deterjorament mitokondrijali u ħsara ċellulari u fl-aħħar mill-aħħar jikkontribwixxu għal disfunzjoni kardijaka relatata mal-età.20

Cistanche jista 'anti-aging

Mudelli ta’ annimali li qed jixjieħu indotti minn D-galactose (D-gal) intużaw ħafna biex jistudjaw mekkaniżmi ta’ tixjiħ u effetti kontra t-tixjiħ tad-drogi.21 L-amministrazzjoni kronika ta’ ammont kbir ta’ D-gal tikkawża disturbi fil-metaboliżmu taċ-ċelluli u korriment taċ-ċelluli li jaċċelleraw il- proċess ta 'tixjiħ u eventwalment jikkawża bidliet strutturali u funzjonali fis-sistema kardjovaskulari.22 Għalhekk, fl-istudju attwali, aħna stabbilixxa l-mudell ta' tixjiħ tal-ġurdien indott minn D-gal biex nevalwaw b'mod sistemiku l-attività ta 'tixjiħ kontra l-qalb ta' AOS u ninvestigaw aktar il-mekkaniżmu sottostanti possibbli.

2|MATERJALI U METODI

2.1|Drogi u reaġenti

D-galactose inkiseb minn Sigma-Aldrich. AOS inxtara minn Qingdao BZ Oligo Biotech Co., Ltd. Il-kit ta 'assay ta' Malondialdehyde (MDA) inkiseb minn Jiancheng Bioengineering Institute. Antikorpi poliklonali tal-fenek kontra BNP, PGC-1a, p67-phox u gp91-phox inkisbu minn Abcam Inc. Antikorpi monoklonali tal-fenek kontra peptidi natriuretiċi A (ANP) u SIRT3 u Antikorpi monoklonali tal-ġrieden kontra p53 inkisbu minn Abcam Inc. Antikorpi poliklonali tal-fenek kontra beclin-1 u p-mTOR inxtraw minn Cell Signaling Technology. Antikorp poliklonali tal-fenek kontra p21 u antikorp monoklonali tal-ġrieden kontra p47-phox inkisbu minn Santa Cruz Biotechnology, Inc. Antikorpi poliklonali tal-fenek kontra mTOR inxtraw minn Proteintech Group, Inc. Kit ta' estrazzjoni mitokondrijali u JC{{14} } kit tal-analiżi tal-potenzjal tal-membrana mitokondrijali nxtraw minn Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd TIANamp Genomic DNA kit inkiseb minn Tiangen Biotech (Beijing) CO., LTD.tkabbir tal-pene cistancheIl-kit PCR tas-sonda tal-mtDNA tal-ġurdien inxtara minn Beijing Tiandz Gene Technology CO., Ltd Inxtraw Goat Anti-Rabbit IgG (H＋L) (peroxidase/HRP konjugat) u Goat Anti-Mouse IgG (H plus L) (peroxidase/HRP konjugat) minn Elabscience Biotechnology Co., Ltd. Il-kimiċi u r-reaġenti l-oħra kollha nxtraw minn fornituri kummerċjali standard sakemm ma jkunx speċifikat mod ieħor.

2.2|Annimali

Ġrieden maskili C57BL/6J ta' ġimgħa 8-(20±2gbodyweight,n=40) inkisbu minn Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co, LTD. Il-ġrieden kollha ġew mitmugħa b'dieta normali u miżmuma f'ċiklu ta' 12-siegħa dawl/12-siegħa skur taħt kundizzjonijiet speċifiċi ħielsa minn patoġeni (SPF) fiċ-Ċentru tal-Annimali tal-Laboratorju tad-Dipartiment Mediku tal-Università ta' Qingdao . Il-proċeduri sperimentali kollha fuq l-annimali kienu konformi mal-'Gwida għall-Kura u l-Użu ta' Annimali tal-Laboratorju'pubblikat mill-politika tas-Servizz Nazzjonali tas-Saħħa tal-Istituti Nazzjonali tal-Istati Uniti u dwar il-Kura Umana u l-Użu tal-Annimali tal-Laboratorju. Il-protokolli ta 'studju ġew approvati mill-Kumitat dwar l-Etika ta' Esperimenti fuq l-Annimali ta 'l-Università ta' Qingdao (numru ta 'approvazzjoni: QYFYWZLL25840).

2.3|Mudell ta 'tixjiħ indott minn D-gal u amministrazzjoni tad-droga

Il-ġrieden kienu maqsuma b'mod każwali f'ħames gruppi (n =8 kull grupp): kontroll, D-gal, D-gal flimkien ma' AOS b'doża baxxa (D-gal flimkien ma' AOS-50), D-gal plus gruppi ta’ AOS ta’ doża medja (D-gal flimkien ma’ AOS-100) u D-gal flimkien ma’ doża għolja ta’ AOS (D-gal flimkien ma’ AOS-150). It-tixjiħ ġie indott fil-ġrieden C57BL/6J permezz ta 'injezzjoni taħt il-ġilda ta' D-gal (200 mg/kg, Sigma-Aldrich) għal 8 ġimgħat.23,24 Il-ġrieden ta 'kontroll ingħataw injezzjoni taħt il-ġilda ta' ilma sterili ekwivalenti. Erba' ġimgħat wara l-injezzjoni ta' D-gal, il-gruppi D-gal flimkien ma' AOS-50, D-gal flimkien ma' AOS-100 u D-gal flimkien ma' AOS-150 ġew amministrati intragastrikament ma' AOS ( 50, 100 u 150 mg-kg2-d'l) għal 4 ġimgħat oħra, rispettivament. Il-ġrieden tal-grupp ta 'kontroll u tal-grupp D-gal irċevew amministrazzjoni intragastrika ta' salina ekwivalenti.

2.4|Ekokardjografija

L-ekokardjografija saret fuq ġrieden anestetizzati bl-użu ta' Vevo2100(VisualSonics) bi transducer 30-MHz fit-tmiem tal-esperiment. Il-parametri li ġejjin tkejlu kif deskritt qabel: frazzjoni ta’ ejection ventrikulari tax-xellug (EF) u tqassir frazzjonali tal-ventrikulari tax-xellug (FS).25

2.5|Analiżi istoloġika

Il-kampjuni tal-qalb ġew iffissati b'4 fil-mija paraformaldehyde għal 24 siegħa u mbagħad inkorporati fil-paraffin u maqtugħin f'sezzjonijiet ħxuna ta' 4-um. H&E u t-tbajja’ trikromju ta’ Masson intużaw biex jivviżwalizzaw l-arkitettura tal-qalb u l-fibrożi kardijaka, rispettivament. Il-flieli ġew eżaminati taħt mikroskopju tad-dawl invertit (TE 200, Nikon). Id-dejta korrispondenti ġiet analizzata u kkalkulata minn investigaturi li kienu blinded għall-assenjazzjoni tal-grupp ta 'trattament.

2.6|Mikroskopija elettronika ta' trażmissjoni

L-ultrastruttura tal-mitokondrija ġiet iddeterminata bl-użu ta 'analiżi tal-mikroskopija elettronika tat-trasmissjoni. Wara l-istudju preċedenti, 26 tessut ventrikulari tax-xellug frisk inqatgħu fi blokki ta '1 mm³ u ġew iffissati fi 2.5 fil-mija glutaraldehyde għal sagħtejn f'4 gradi. Wara li ġew iffissati wara f'1 fil-mija tetrossidu tal-osmju għal sagħtejn f'temperatura tal-kamra, it-tessuti ventrikulari tax-xellug ġew deidrati imbagħad inkorporati fir-reżina. Sezzjonijiet ultrarqaq serjali (30-40 nm) inġabru fuq grilji tar-ram u finalment imtebbgħin b'0.5 fil-mija uranyl acetate segwit minn 1 fil-mija taċ-ċitrat taċ-ċomb. L-analiżi ultrastrutturali ta 'sezzjonijiet imtebba' ġiet determinata taħt mikroskopija elettronika ta' trażmissjoni Tecnai G2 12 (FEI Co.).

2.7|Determinazzjoni tal-potenzjal tal-membrana mitokondrijali (MMP).

Il-potenzjal tal-membrana mitokondrijali tkejjel bl-użu tat-tbajja' immunofluworexxenti JC-1 u ċ-ċitometrija tal-fluss. Tis-sues friski tal-qalb intużaw biex jippreparaw sezzjonijiet iffriżati jew estratt il-mitokondrija. Sezzjonijiet iffriżati ntużaw għal tbajja immunofluworexxenti JC-1 skont il-protokoll tal-manifattura.cistanche salsa benefiċċjiIl-fluworexxenza ġiet iddeterminata f'eċitazzjoni/emissjoni 485/580 nm (aħmar) u eċċitazzjoni/emissjoni 485/530 nm (aħdar) bl-użu ta' mikroskopju tal-fluworexxenza.

Barra minn hekk, il-mitokondrija ġew iżolati minn tessut frisk tal-qalb bl-użu tal-kit ta 'estrazzjoni mitokondrijali skond il-metodu ppubblikat minn Peng et al?'Mitokondrija estratt imbagħad intużaw biex tiġi detect l-integrità ta' l-MMP permezz tal-kejl ta 'l-intensità fluworexxenti ta' JC{ {2}}. Fil-qosor, il-mitokondrija ġew inkubati b'JC-1 f'JC-1 Assay Buffer għal 10min f'temperatura tal-kamra. Carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone ġie applikat biex ifixkel l-MMP u serva bħala kontroll pożittiv wara l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-kampjuni ġew analizzati f'488 u 575 nm permezz ta 'ċitometrija tal-fluss bl-użu tas-Software CellQuest (Becton Dickinson).

2.8|Kejl tan-numru tal-kopja mtDNA

In-numru tal-kopja tad-DNA mitokondrijali tkejjel b'PCR kwantitattiv f'ħin reali (qPCR). Fil-qosor, it-tessuti tal-qalb ġew omoġenizzati u neħħew proteini u RNAs bl-użu ta 'proteinażi K u RNaseA. Id-DNAs totali ġew estratti mill-kit tad-DNA Ġenomika TIANamp u mbagħad ikkwantifikati minn QuickDrop Spectrophotometer minn Apparat Molekulari (Holliston, MA). Il-kit PCR tas-sonda mtDNA tal-ġurdien intuża biex jamplifika l-mtDNA tal-kampjun permezz tas-Sistema ta 'Sejbien tal-PCR tal-Fluworexxenza (Hangzhou Bioer Technology Co. Ltd). In-numru tal-kopja tal-mtDNA ġie kkalkulat mill-kurva tal-kontroll pożittiv tal-qPCR skont il-protokoll tal-manifattur.

2.9|Sejbien in situ tal-produzzjoni ROS

Kif deskritt qabel, tbajja 'fluworexxenza DHE twettqet biex jevalwaw il-livell in situ tal-produzzjoni ROS.2³ Fil-qosor, tessuti tal-qalb friski ġew inkorporati fil-kompost OCT u mbagħad immedjatament iffriżati bl-użu ta' kriostat fi -20 grad. It-tessuti tal-qalb iffriżati nqatgħu fi slides istoloġiċi 6-um ħxuna. Flieli tal-qalb ġew maħsula b'1xphosphate-buffered saline (PBS) u mbagħad inkubati b'soluzzjoni DHE (5 umol/L) f'kamra umidifikata protetta mid-dawl f'37 grad għal 30 minuta. Wara l-inkubazzjoni, is-sezzjonijiet trasversali tal-qalb ġew laħlaħ b'1 × PBS. Fl-aħħarnett, immaġini nkisbu b'mikroskopju fluworexxenti, u l-intensità tal-fluworexxenza ġiet ikkwantifikata permezz ta 'softwer ImageJ minn tester blind.

2.10|Kejl tal-perossidazzjoni tal-lipidi

Bħala l-prodotti sekondarji ewlenin ta 'ossidazzjoni tal-perossidazzjoni tal-lipidi, il-konċentrazzjoni tal-malondialdehyde (MDA) fis-serum u l-omoġenati tal-qalb ġiet imkejla skont l-istruzzjoni tal-kit tal-Assaġġi MDA (Jiancheng Bioengineering Institute).

2.11|Analiżi Western blot

It-tessuti tal-qalb ġew omoġenizzati f'RIPA buffer li kien fih inibituri ta' phos-phatase u protease u ċentrifugati f'12 00 rpm f'4 gradi għal 20 minuta. Imbagħad, is-supernatant inġabar għal esperimenti sussegwenti. Il-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet iddeterminata bl-użu ta' kit ta' analiżi tal-proteina BCA. Ammonti ugwali ta 'proteini tqiegħdu f'10 fil-mija ġel SDS-PAGE u trasferiti għal membrani PVDF (Roche). Il-membrani ġew imblukkati bis-soluzzjoni tas-siġillar għal siegħa u inkubati b'antikorpi primarji korrispondenti f'4 gradi matul il-lejl. Imbagħad, il-membrani ġew maħsula f'TBS-T u inkubati bl-antikorpi sekondarji xierqa. Sussegwentement, il-membrani ġew maħsula f'TBS-T u viżwalizzati bl-użu tar-reaġenti ECL Western blotting de-tection (Bio-Rad). L-espressjoni tal-proteina ġiet ikkwantifikata permezz ta 'analiżi densitometrika ta' meded bl-użu ta 'softwer ImageJ. Il-proteina tad-dar GAPDH intużat bħala kontroll tat-tagħbija. Ir-rati ta' dilwizzjoni tal-antikorpi primarji u sekondarji ġew murija kif ġej: ANP(1:1000),BNP(1:2000),p53(1:1000),p21 (1:1000),PGC-1 a (1:1000),SIRT3(1:1000),beclin-1(1:1000),p-mTOR(1:1000),mTOR (1:1000),p47-phox( 1:500),p67-phox(1:1000),gp91-phox(1:2000), GAPDH (1:2000), Mogħoż Kontra l-Fenek IgG (H ＋ L)(perossidażi /HRP konjugat) (1:5000) u Mogħoż Anti-Mouse lgG (H＋L) (peroxidase/HRP konjugat) (1:5000).

2.12|Analiżi statistika

Id-dejta ġiet espressa bħala medja ±SEM.Statistikament sinifikanti ġiet iddeterminata bl-ANOVA one-way segwit mit-test post hoc ta' Student-Newman Keuls (SNK).P<.05 was="" considered="" to="" be="" statistically="">

3|RIŻULTATI

3.1|Effetti ta 'AOS fuq il-funzjoni kardijaka u l-espressjoni ta' markaturi tat-tixjiħ fil-ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal

L-ekokardjografija ntużat biex tanalizza l-funzjoni kardijaka tal-ġrieden. Ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal urew tnaqqis sinifikanti fil-mija EF u fil-mija FS. Madankollu, AOS ipprevjeni b'mod sinifikanti disfunzjoni kardijaka fil-ġrieden li qed jixjieħu kkaġunati minn D-gal, inkluż fil-mija EF parzjalment ippreservat u fil-mija FS (Figura 1A-C). Kif muri fil-Figura 1D-G, ma kien hemm l-ebda differenza statistika fir-rata tal-qalb bejn kull grupp. Il-ġrieden D-galactose kellhom tendenza li jżidu LVEDD (dijametru ventrikulari tax-xellug tat-tmiem tad-dijastoliku) u LVPWd (ħxuna tal-ħajt ta 'wara tal-ventrikulari tax-xellug fit-tarf tad-dijastole), iżda ma kien hemm l-ebda differenza statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-ġrieden ta' kontroll. Madankollu, LVESD (dijametru tat-tarf sistoliku ventrikulari tax-xellug) żdied b'mod sinifikanti fil-ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal, u AOS naqas LVESD b'mod dipendenti fuq id-doża. L-espressjoni ta 'ANP u BNP fit-tessut tal-qalb ġiet determinata minn Western blot biex tivverifika aktar il-funzjoni kardijaka tal-ġrieden f'kull grupp. Kif muri fil-Figura 1H-I, il-livelli ta 'ANP u BNP żdiedu b'mod sinifikanti fil-ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal, u AOS naqas b'mod sinifikanti l-livelli ta' ANP u BNP f'man-ner dipendenti mid-doża. Din id-dejta indikat li AOS ipprevjeni disfunzjoni kardijaka fil-ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal. Barra minn hekk, skoprejna l-espressjoni tal-proteini tal-markaturi tat-tixjiħ p53 u p21. Kif mistenni, l-espressjoni tal-proteini p53 u p21 żdiedet b'mod sinifikanti fit-tessuti tal-qalb ta 'ġrieden li qed tixjieħ indotti minn D-gal, u AOS naqqas b'mod sinifikanti l-espressjoni p53 u p21 b'mod dipendenti mid-doża (Figura 1J-K).

3.2|Effett ta 'AOS fuq bidliet istopatoloġiċi kardijaċi fi ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal

Biex jiġu investigati l-bidliet fl-arkitettura mijokardijaka tal-ġrieden, slajds tat-tessut tal-qalb kienu mtebbgħin b'ematoxylin u eosin (H&E). Kif muri fil-Figura 2A, meta mqabbla mal-ġrieden ta 'kontroll, ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal urew arkitettura mijokardijaka anormali, prinċipalment ikkaratterizzata minn arranġament diżordinat ta' kardjomijoċiti u spazju interċellulari miżjud bejn iċ-ċelloli. L-amministrazzjoni ta 'AOS naqqset b'mod sinifikanti l-arranġament diżordinat u l-ispazju bejn il-kardjomijoċiti. It-tbajja 'H&E wriet ukoll li ż-żona tal-kardjomijoċiti ventrikulari tax-xellug żdiedet b'mod sinifikanti fil-ġrieden li qed tixjieħ indotti minn D-gal, u t-trattament AOS naqqas b'mod sinifikanti ż-żona tal-kardjomijoċiti b'mod dipendenti fuq id-doża (Figura 2B, D).

Sabiex jiġi ċċarat il-grad ta 'fibrożi kardijaka, twettqet it-tbajja' tri-chrome ta' sezzjonijiet trasversali tal-qalb ta 'Masson. Kif muri fil-Figura 2C, E, l-akkumulazzjoni tal-kollaġen fir-reġjuni interstizjali u perivaskulari tal-mijokardju żdiedet b'mod drammatiku fil-ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal. Madankollu, meta mqabbel mal-grupp D-gal, it-trattament AOS naqqas b'mod sinifikanti l-perċentwal taż-żona tal-kollaġen b'mod dipendenti fuq id-doża (Figura 2C, E). Din id-dejta ssuġġeriet li AOS ipprevjeni bidliet morfoloġiċi indotti minn D-gal u fibrożi kardijaka fil-ġrieden C57BL/6J.

3.3|Effett ta 'AOS fuq l-ultrastruttura mitokondrijali tal-qalb ta' ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal

Imbagħad użajna l-mikroskopija elettronika tat-trażmissjoni biex niskopru l-alterazzjoni tal-ultrastruttura mitokondrijali tal-qalb. Kif muri fil-Figura 3, il-mitokondrija tal-kardjomijoċiti tal-ġrieden ta 'kontroll kienu strutturalment normali u wrew cristae u matriċi ċara li kienet tidher b'mod ċar. Madankollu, xi mitokondrija tal-kardjomijoċiti tal-ġrieden D-gal ġew imkabbra, nefħa u telf parzjali ta 'cristae, u t-trattament AOS impedixxa l-qerda tal-ultras-struttura mitokondrijali tal-qalb fi ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal.

3.4|Effett ta 'AOS fuq l-MMP kardijaku ta' ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal

Bħala determinant importanti tal-istat funzjonali tal-mitokondrija, l-MMP tkejjel bl-użu ta' tbajja ta' fluworexxenza JC-1 u ċitometrija tal-fluss. B'mod ġenerali, meta l-potenzjal tal-membrana tal-mitokondrija huwa għoli, JC-1 jaggrega fil-mitokondrija u jarmi fluworexxenza ħamra, filwaqt li JC-1 jeżisti bħala monomeru fiċ-ċitosol u jarmi fluworexxenza ħadra meta mitokondrija b'potenzjal baxx ta' membrana.29 Allura il-proporzjon ta 'fluworexxenza ħamra għal fluworexxenza ħadra jista' jirrifletti l-intensità ta 'MMP. Kif muri fil-Figura 4A-B, ir-riżultat tat-tbajja’ ta’ fluworexxenza JC-1 indika li l-livell ta’ MMP kardijaku fil-ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal kien drammatikament aktar baxx minn dak fil-ġrieden ta’ kontroll, u l-amministrazzjoni ta’ AOS protetta kontra D- tnaqqis medjat mill-galattożju tal-MMP. Fil

3.5|Effett ta 'AOS fuq il-bijoġenesi mitokondrijali u l-espressjoni tal-proteina awtofaġika fil-qlub tal-ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal

Aħna użajna Western blot biex niddeterminaw l-espressjoni tal-proteina tal-markatur tal-bijoġenesi mi-tokondrijali PGC-1a. Kif mistenni, kien osservat tnaqqis sinifikanti fl-espressjoni tal-proteina PGC-1o fit-tessuti tal-qalb ta' ġrieden li qed jixjieħu kkaġunati minn D-gal, u AOS żied b'mod sinifikanti l-espressjoni ta' PGC-1a f'mod dipendenti mid-doża. mod (Figura 5A-B). Studji wrew li SIRT3 għandu rwol importanti fiż-żamma tal-bijoenerġija mitokondrijali. Għalhekk, skoprejna aktar l-espressjoni SIRT3 fit-tessuti tal-qalb. Ir-riżultat tagħna wera li tnaqqis sinifikanti fl-espressjoni tal-proteina SIRT3 fi ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal, u AOS żiedu b'mod sinifikanti l-espressjoni tal-proteina SIRT3 b'mod dipendenti mid-doża (Figura 5C-D). Barra minn hekk, ir-riżultat tal-PCR tas-sonda mtDNA wera li n-numru tal-kopja mtDNA naqas b'mod sinifikanti fil-ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal, u AOS żied b'mod sinifikanti n-numru tal-kopja mtDNA b'mod dipendenti fuq id-doża (Figura 5E). Din id-dejta indikat li l-AOS irregola l-bijoġenesi mito-kondrijali fil-ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal.

Imbagħad użajna Western blot biex niddeterminaw l-espressjoni u l-fosforilazzjoni ta 'regolaturi kritiċi tal-awtofaġija fit-tessuti tal-qalb. Kif muri fil-Figura 5F-I, tnaqqis sinifikanti fl-espressjoni tal-proteina beclin-1 u żieda sinifikanti fil-fosforilazzjoni mTOR kienu osservati fit-tessuti tal-qalb ta 'ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal. Kif mistenni, AOS żied b'mod sinifikanti l-espressjoni ta' beclin-1 u naqqas il-fosforilazzjoni ta' mTOR b'mod dipendenti mid-doża.

3.6|Effett ta 'AOS fuq il-produzzjoni ta' ROS u stress ossidattiv fil-qlub tal-ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal

Aħna ddeterminajna l-produzzjoni ta 'ROS fil-qlub billi tuża t-tbajja' DHE fluores-cence. Kif muri fil-Figura 6A-B, sibna li l-intensità tal-fluworexxenza DHE tal-kardjomijoċiti ventrikulari tax-xellug tjiebet b'mod sinifikanti fil-ġrieden li qed tixjieħ indotti minn D-gal, u AOS naqqas b'mod sinifikanti l-intensità tal-fluworexxenza DHE tal-kardjomijoċiti ventrikulari tax-xellug.

Biex tinvestiga l-effett ta 'AOS fuq l-istatus ta' stress ossidattiv fil-qlub ta 'ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal, użajna Western blot biex niddeterminaw l-espressjoni tal-proteina ta' NADPH oxidase fit-tessuti tal-qalb. Is-subunità NADPH oxidase p47-phox,p67-phox u gp91-phox espressjoni żdiedet b'mod sinifikanti fil-ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal. Madankollu, AOS naqqas l-espressjoni ta 'dawk is-subunitajiet NADPH oxidase b'mod dipendenti mid-doża (Figura 6C-D).

Peress li l-MDA huwa meqjus bħala bijomarkatur preżunt għall-perossidazzjoni tal-lipidi f'organiżmi ħajjin, barra minn hekk, skoprejna konċentrazzjoni ta 'MDA biex nevalwaw l-istatus ta' stress ossidattiv in vivo. Kif muri fil-Figura 6E-F, żieda fl-istatus ta 'stress ossidattiv fil-ġrieden li qed tixjieħ indotti minn D-gal ġiet ikkonfermata b'konċentrazzjoni ogħla ta' MDA fis-serum u omoġenati tal-qalb. L-amministrazzjoni ta' AOS naqqset il-livelli ta' MDA b'mod dipendenti fuq id-doża meta mqabbla mal-grupp D-gal. B'mod kollettiv, din id-dejta indikat li AOS naqqas b'mod sinifikanti l-produzzjoni ta 'ROS u l-istatus ta' stress ossidattiv fil-ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal.

4|DISKUSSJONI

It-tixjiħ huwa bidliet sistemiċi kroniċi u relatati ma 'multi-organi ta' l-organiżmu. Iż-żieda fil-mard kardjovaskulari relatat mal-età u l-piż finanzjarju konsegwenti saru sfida dinjija predominanti.30,31 Għalhekk, il-mekkaniżmi molekulari tat-tixjiħ tal-qalb jeħtieġ li jiġu studjati fil-fond, u interventi ġodda kontra t-tixjiħ se jkunu ta’ sinifikat kbir f’ it-titjib tal-medda tas-saħħa kif ukoll id-dewmien tal-insuffiċjenza kardijaka kkawżata mit-tixjiħ.

L-alġinat huwa kopolimeru lineari ta 'polisakkaridi estratt mill-alka tal-baħar kannella. Minħabba l-piż molekulari għoli u l-vis-cosity tiegħu, huwa diffiċli għall-alġinat li jaqsam il-membrani taċ-ċelluli u l-ostakli bijoloġiċi, li jillimita l-utilizzazzjoni tiegħu. AOS, derivat mill-idroliżi tal-alġinat, ġibed attenzjoni dejjem akbar minħabba l-piż molekulari u l-viskożità aktar baxxi tiegħu. AOS huwa kompost li jinħall fl-ilma, mhux tossiku, mhux immunoġeniku u bijodegradabbli u għandu attivitajiet bijoloġiċi ħafna aħjar mill-alġinat.' L-evidenza tissuġġerixxi li AOS, bħala oligosaccharide antiossidant, għandu l-abbiltajiet li jipproteġi mard newrodeġenerattiv u kardjotossiċità akuta ta' doxorubicin billi jinibixxi l-istress tar-retikulu endoplasmiku u l-istress ossidattiv.5 Studji riċenti wrew li AOS derivat mill-baħar juri attività bijoloġika promettenti fit-tnaqqis. iperlipidae-mia, ipergliċemija u pressjoni għolja u trażżin tal-obeżità.27 Madankollu, il-kapaċità ta 'AOS li tipproteġi kontra t-tixjiħ ma ġietx murija.

Studji preċedenti jindikaw li l-qalb li qed tixjieħ tesibixxi karatteristiċi his-toloġiċi u funzjonali uniċi, inkluż mudellar mill-ġdid tal-qalb progressiv u riżerva kardijaka li tiddeterjora. . Mudelli ta’ tixjiħ prematur ikkawżat minn D-gal juru fenotipi simili ta’ alterazzjonijiet kardijaċi meta mqabbla ma’ tixjiħ naturali f’annimali gerriema.*4 F’dan l-istudju, urejna li ġrieden li qed tixjieħ indotti minn D-gal urew arkitettura mijokardijaka anormali u akkumulazzjoni akbar ta’ kollaġen fl-interstizjali tal-mijokardju. u reġjuni perivaskulari, u l-amministrazzjoni ta 'AOS inibit ir-rimodelazzjoni tal-qalb indotta minn D-gal fil-ġrieden C57BL/6J. Sadanittant, sibna li AOS ipprevjeni disfunzjoni kardijaka fi ġrieden li qed jixjieħu kkaġunati minn D-gal, inklużi EF fil-mija u FS fil-mija ppreservati parzjalment, u naqqas l-espressjoni ta 'ANP u BNP. L-ekokardjografija ntużat ukoll biex tanalizza l-bidliet fl-istruttura tal-qalb tal-ġrieden. Il-ġrieden D-galactose kellhom tendenza li jżidu l-LVEDD u l-LVPWd, iżda ma kien hemm l-ebda differenza statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-ġrieden tal-kontroll. Madankollu, LVESD żdied b'mod sinifikanti fil-ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal, u AOS naqas LVESD b'mod dipendenti fuq id-doża. Ir-raġuni għal dan il-fenomenu tista 'tkun li l-mudell ta' tixjiħ aċċellerat jimita D-galactose għandu żmien ta 'mudellar relattivament qasir, li prinċipalment jaffettwa l-funzjoni mitokondrijali kif muri hawn taħt u jwassal għal dis-funzjoni tal-qalb. Kienu qed iseħħu bidliet kbar fl-istruttura tal-qalb iżda ma rriżultawx f'differenzi statistikament sinifikanti. Barra minn hekk, id-dejta tagħna wriet ukoll li l-amministrazzjoni tal-AOS naqqset b'mod sinifikanti l-espressjoni tal-markaturi p53 u p21 tat-tixjiħ b'mod dipendenti fuq id-doża. Biex jiġu esplorati aktar il-mekkaniżmi possibbli li jikkontribwixxu għall-kapaċità protettiva kontra t-tixjiħ tal-AOS, ġiet analizzata l-kompromess mitokondrijali relatat mal-età.

Il-qalb fiha bosta mitokondrija bbażati fuq id-domanda straordinarja tagħha għal ATP. Il-mitokondrija jiġġeneraw ATP permezz ta 'fosforilazzjoni ossidattiva ta' aċidi grassi u karboidrati. Barra minn hekk, ir-radikali ħielsa huma wkoll iġġenerati kontinwament matul dan il-proċess. Ta’ min jinnota li l-omeostasi mitokondrijali hija vitali għaż-żamma tal-funzjoni u l-vijabbiltà tal-kardjomijoċiti.3 grad Tabilħaqq, studji indipendenti fil-qalb li qed tixjieħ urew li l-mitokondrija tal-kardjomijoċiti jiddgħajjef matul ix-xjuħija.3738 L-analiżi morfometrika ultrastrutturali ta’ annimali gerriema li qed jixjieħu. mijokardju juri l-preżenza ta 'mitokondrija mkabbra u nefħa, bil-ma-trix derangement u telf ta' cristae." F'dan l-istudju, meta mqabbla mal-ġrieden ta 'kontroll, xi mitokondrija kardjomijoċiti tal-ġrieden D-gal kienu mkabbra, nefħa u telf parzjali ta' cristae. It-trattament AOS itaffu l-qerda tal-ultrastruttura mitokondrijali kardijaka fi ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal. B'mod parallel, D-gal indotta tnaqqis sinifikanti fil-livell ta 'MMP kardijaku, u l-amministrazzjoni ta' AOS protetta kontra D-gal medjata. tnaqqis tal-MMP Dawn ir-riżultati indikaw li l-AOS waqqaf il-mitokondrija tal-qalb milli tinqered fil-ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal.

Ġie nnutat li proċessi mitokondrijali kompromessi multipli huma implikati fil-patoġenesi tal-qalb anzjana, inkluża l-alterazzjoni tal-bijoġenesi mitokondrijali u t-tneħħija. Sadanittant, disfunzjoni mitokondrijali u tneħħija indebolita ta 'mi-tokondrija meqruda, min-naħa tagħhom, iżidu l-vulnerabbiltà għal korriment mill-istress tal-qalb anzjana." koattivatur 1a (PGC-1a), li huwa kritiku għaż-żamma tal-omeostażi tal-enerġija, intwera li għandu rwol ewlieni fir-regolazzjoni tal-bijoġenesi u l-funzjoni mitokondrijali.4 Espressjoni u attività mnaqqsa tal-PGC-1a ġew marbuta għat-tixjiħ tal-kar-diac u l-iżvilupp ta' insuffiċjenza tal-qalb."2 Studju preċedenti juri li l-attivazzjoni tal-p53 relatata mal-età tirriżulta direttament f'kompromess mi-tokondrijali permezz tat-trażżin ta' diversi regolaturi ewlenin tal-bijoġenesi mitokondrijali, inkluż PGC-1a. 43 Linji akkumulati ta' evidenza jissuġġerixxu wkoll li l-attivazzjoni ta' PGC-1o b'intervent farmakoloġiku jew ġenetiku tipprevjeni l-bidliet fil-qalb relatati mat-tixjiħ." Sirtuins (SIRTs) huma rikonoxxuti bħala regolaturi mhux dispensabbli tal-proċess tat-tixjiħ. SIRT3, lokalizzat fil-matriċi mitokondrijali, għandu rwol importanti fiż-żamma tal-bijoenerġetika mitokondrijali, il-modulazzjoni tal-metaboliżmu mitokondrijali u r-regolazzjoni tal-lifes-pan.Sirt3deficiency intwera li twassal għal anormalitajiet kardijaċi u tfixkel il-bijoenerġetika mitokondrijali fil-ġrieden. 45 F'dan l-istudju, urejna li kien osservat tnaqqis sinifikanti fl-espressjoni tal-proteini PGC-1a u SIRT3 fit-tessuti tal-qalb ta' ġrieden li qed jixjieħu kkaġunati minn D-gal, u AOS żied b'mod sinifikanti l-PGC-1a u l-espressjoni tal-proteina SIRT3 b'mod dipendenti mid-doża. Barra minn hekk, ir-riżultat tal-PCR tas-sonda mtDNA wera li n-numru tal-kopja mtDNA kien tnaqqis sinifikanti fil-ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal, u AOS żied b'mod sinifikanti n-numru tal-kopja mtDNA b'mod dipendenti fuq id-doża. Meħuda flimkien, din id-dejta indikat li AOS irregola b'mod 'l fuq il-bijoġenesi mitokondrijali fil-ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal.

Kif innutat hawn fuq, it-tneħħija effiċjenti tal-mitokondrija indebolita hija vitali għaż-żamma tal-omeostasi tal-kardjomijoċiti. Il-mekkaniżmu magħruf li bih il-mitokondrija jinqalbu huwa permezz tal-awtofaġija. Huwa propost li l-awtofaġija għandha rwol kritiku fir-regolazzjoni tal-omeostażi kardijaka fl-istat bażali kif ukoll bħala reazzjoni għall-istress.46,47 Madankollu, l-awtofaġija hija ġeneralment irregolata 'l isfel fil-qalb li qed tixjieħ. Livell aktar baxx ta 'awtofaġija matul il-proċess ta' tixjiħ inaqqas id-degradazzjoni ta 'organelli meqruda u pro-teins tossiċi u jinduċi l-akkumulazzjoni ta' mitokondrija disfunzjonali u anormali, li eventwalment jirriżultaw f'disfunzjoni kardijaka globali. Intwera li l-istimulazzjoni tal-awtofaġija ttejjeb il-funzjoni kardijaka f'mudelli ta' annimali gerriema billi tneħħi l-mitokondrija li ma tiffunzjonax, u b'hekk tottimizza l-ambjent ċellulari ġenerali u eventwalment ittaffi l-patoloġija assoċjata mat-tixjiħ fil-qalb. tessuti ta 'ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal, u AOS tejbu b'mod sinifikanti l-livell ta' awtofaġija b'mod dipendenti fuq id-doża. Dawn il-bidliet wrew li AOS tejbet it-tneħħija effiċjenti ta 'mitokondrija indebolita relatata mal-età permezz ta' awtofaġija li tirregola 'l fuq. Kif diskuss qabel, il-biċċa l-kbira tal-produzzjoni ta 'ROS, ġġenerata minn kumplessi tal-katina tat-trasport tal-elettroni mitokondrijali (ETC), isseħħ bħala prodott sekondarju ta' fosforilazzjoni ossidattiva mitokondrijali. ta' ROS, isaħħaħ il-ħsara kkawżata mir-radikali ħielsa u eventwalment iwassal għal spirali progressiv ta 'feedback ta' tħassir mitokondrijali. . Minbarra l-ETC, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase hija sorsi extramitokondrijali maġġuri ta 'ROS, li jistgħu jkunu responsabbli għal stress ossidattiv matul il-proċess ta' tixjiħ u jaggravaw il-ħsara ossidattiva lill-mitokondrija. Minbarra dawn il-mekkaniżmi, studju reċenti wera wkoll li ġenerazzjoni aktar baxxa ta 'ROS mitokondrijali tikkontribwixxi biex tipproduċi livell baxx ta' ħsara fi stat stabbli ta 'mtDNA. ġenerali jikkontribwixxi għall-lonġevità superjuri tagħhom. Rapport reċenti juri li l-inibitur NADPH oxidase jrażżan disfunzjoni mitokon-drijali fin-nukleu cochlear ventrali tal-firien li qed jixjieħu indotti minn D-gal. L-MDA huwa meqjus bħala bijomarkatur preżunt għall-perossidazzjoni tal-lipidi f'organiżmi ħajjin, u l-konċentrazzjoni ta 'MDA tista' tintuża biex tevalwa l-istatus ta 'stress ossidattiv in vivo. F'dan l-istudju, sibna li l-amministrazzjoni ta 'AOS attenwat il-produzzjoni ta' ROS, irregolat 'l isfel l-espressjoni ta' NADPH oxidase u naqqset il-livell ta 'MDA fi ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal. Ir-riżultati attwali tagħna ssuġġerew li AOS naqqas b'mod effiċjenti l-istatus ta 'stress ossidattiv fil-ġrieden li qed jixjieħu indotti minn D-gal, li jista' jkun fattur protettiv importanti ieħor għal AOS biex ittaffi l-ħsara mitokondrijali.

Fl-istudju preżenti, l-ewwel iċċaraw li AOS ittaffi t-tixjiħ kardijaku indott minn D-gal permezz tat-titjib tal-bijoġenesi mitokondrijali, iż-żamma tal-integrità mitokondrijali u t-tisħiħ tat-tneħħija effiċjenti ta 'mitokondrija indebolita fil-ġrieden C57BL/6J. Barra minn hekk, AOS inaqqas ukoll il-produzzjoni ROS u l-istat tal-istress ossidattiv, li, min-naħa tagħhom, ikomplu jinibixxu l-mitokondrija kardijaka milli tinqered. AOS jista' jkun aġent terapewtiku effettiv biex itaffi x-xjuħija tal-qalb. F'dan l-istudju, użajna biss ġrieden maskili u ma għamilniex differenzi ta' sess ta' amine fuq l-effetti ta' AOS.Huwa interessanti ħafna li molekula ta' adeżjoni interċellulari speċifika għaċ-ċelluli dendritiċi -3-ligand li jaqbad mhux integrin (DC-SIGN) 1 (DSCL1, aġent anti-infjammatorju) trattament inaqqas il-polarizzazzjoni tal-makrofagi u disfunzjoni dijastolika fil-qalb tal-ġurdien femminili li qed tixjieħ iżda mhux maskili.52 Dan id-dokument jissuġġerixxi li jkun ta 'sinifikat kbir li jitqabblu d-differenzi tas-sess fi studji futuri.

Bħala konklużjoni, is-sejbiet tagħna ssuġġerew li AOS ttaffi t-tixjiħ kardijaku indott minn D-gal permezz tar-regolazzjoni tal-funzjoni u l-integrità tal-mitokondrija mijokardijaka fil-ġrieden. AOS juri firxa wiesgħa ta' attivitajiet bijoloġiċi promettenti u jista' jkun aġent terapewtiku effettiv biex itaffu t-tixjiħ tal-qalb.

Dan l-artikolu huwa estratt minn J Cell Mol Med. 2021;25:7157–7168. wileyonlinelibrary.com/journal/jcmm|7157